JP2013513378A - 腫瘍退縮性ラブドウイルス - Google Patents

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Abstract

本発明の実施形態には、抗癌療法薬としてのマラバウイルス及びその使用に関連する組成物及び方法が含まれる。そのようなラブドウイルスは、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞殺傷特性を有する。
【選択図】 なし

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００９年１２月１０日提出の米国特許仮出願第６１／２８５４６１号の優先権を主張する。
本発明は、一般的にはウイルス学及び医学に関する。ある種の態様では、本発明は、腫瘍退縮性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウイルス、特に腫瘍退縮性ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）に関する。
いくつかのウイルスは多種多様な腫瘍細胞においてインビトロで複製し腫瘍細胞を殺傷することが明らかにされている（シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス（Ｕｎｎｏ ｅｔ ａｌ．、２００５）；センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（Ｋｉｎｏｈ ｅｔ ａｌ．、２００４）；コクサッキー（Ｃｏｘａｃｋｉｅ）ウイルス（Ｓｈａｆｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４）；ヘルペスシンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルス（Ｍｉｎｅｔａ ｅｔ ａｌ．、１９９５）；パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（Ａｂｓｃｈｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．、２００６）；アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（Ｈｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．、２０００）；ポリオ（Ｐｏｌｉｏ）ウイルス（Ｇｒｏｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０００）；ニューカッスル病（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス；水疱性口内炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．、２０００）；麻疹（Ｍｅａｌｅｓ）ウイルス（Ｇｒｏｔｅ ｅｔ ａｌ．、２００１）；レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）（Ｃｏｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９９８）；レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（Ｌｏｇｇ ｅｔ ａｌ．、２００１）；ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）（Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．、１９９９）；及びインフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、２００１））。さらに、そのようなウイルスは、癌の動物モデルの治療において有効性を実証している。
癌を治療する付加的療法の必要性が残っている。
新規の腫瘍退縮性プラットフォーム及びマラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルスを遺伝的に操作する組換えシステムが本明細書に記載されている。マラバ二重変異体（「ＤＭ」）が作製されており、免疫適格性でもヒト異種移植でも、複数の腫瘍モデルにおける全身送達により安全性及び有効性を実証している。
いくつかの新たに同定されたラブドウイルスは、特定の癌又は癌細胞株を殺傷するのにＶＳＶよりもはるかに効率的である。その上、ＶＳＶ及びＶＳＶの弱毒化された（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）変異体は神経毒性があり、げっ歯類及び霊長類にＣＮＳ病態を引き起こす。いくつかのラブドウイルスはＣＮＳに感染せず（すなわち、Ｍｕｉｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ ａｎｄ Ｂａｈｉａ Ｇｒａｎｄｅ：Ｋｅｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６）、一層受け入れられる安全性プロファイルを示している。さらに、新規のラブドウイルスに基づく療法を使用して、原発でも二次でも、ＣＮＳの癌を治療することが可能である。本発明のラブドウイルス（及び／又は他の腫瘍溶解剤（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ））を続けて使用して、特定の治療ウイルス（複数可）に対する宿主免疫応答を迂回することが可能である。これにより長期治療が可能になり有効性が改善されると考えられる。
本発明の実施形態には、抗癌治療薬としてのラブドウイルス及びその使用に関連する組成物及び方法が含まれる。そのようなラブドウイルスは、インビトロ及びインビボにおいて腫瘍細胞殺傷特性を有する。
本明細書で使用されるように、ラブドウイルスはマラバウイルス又はマラバウイルスの操作されたバリアントであることが可能である。本明細書に記載されるウイルスは他のラブドウイルスと組み合わせて使用することが可能である。他のラブドウイルスには、以下のウイルス又はそのバリアント：カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルス、コカール（Ｃｏｃａｌ）ウイルス、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス、ピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス、水疱性口内炎アラゴ（Ａｌａｇｏａｓ）ウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス、ボテケ（Ｂｏｔｅｋｅ）ウイルス、カルチャキ（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ）ウイルス、エル（Ｅｅｌ）ウイルスアメリカン（Ａｍｅｒｉｃａｎ）、グレーロッジ（Ｇｒａｙ Ｌｏｄｇｅ）ウイルス、ユロナ（Ｊｕｒｏｎａ）ウイルス、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ウイルス、クワッタ（Ｋｗａｔｔａ）ウイルス、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｙａ）ウイルス、マルペススプリング（Ｍａｌｐａｉｓ Ｓｐｒｉｎｇ）ウイルス、マウントエルゴンコウモリ（Ｍｏｕｎｔ Ｅｌｇｏｎ ｂａｔ）ウイルス、ペリネ（Ｐｅｒｉｎｅｔ）ウイルス、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス、ファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）、バイアグランデ（Ｂａｈｉａ Ｇｒａｎｄｅ）ウイルス、ミュアスプリング（Ｍｕｉｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ）ウイルス、リードランチ（Ｒｅｅｄ Ｒａｎｃｈ）ウイルス、ハートパーク（Ｈａｒｔ Ｐａｒｋ）ウイルス、フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）ウイルス、カメセ（Ｋａｍｅｓｅ）ウイルス、モスケイロ（Ｍｏｓｑｕｅｉｒｏ）ウイルス、モスリル（Ｍｏｓｓｕｒｉｌ）ウイルス、バルー（Ｂａｒｕｒ）ウイルス、フクオカ（Ｆｕｋｕｏｋａ）ウイルス、カーンキャニオン（Ｋｅｒｎ Ｃａｎｙｏｎ）ウイルス、コルビッソン（Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎ）ウイルス、ルダンテック（Ｌｅ Ｄａｎｔｅｃ）ウイルス、キューラリバ（Ｋｅｕｒａｌｉｂａ）ウイルス、コネチカット（Ｃｏｎｎｃｃｔｉｃｕｔ）ウイルス、ニューミント（Ｎｅｗ Ｍｉｎｔｏ）ウイルス、ソーグラス（Ｓａｗｇｒａｓｓ）ウイルス、チャコ（Ｃｈａｃｏ）ウイルス、セナマドレイラ（Ｓｅｎａ Ｍａｄｕｒｅｉｒａ）ウイルス、ティンボ（Ｔｉｍｂｏ）ウイルス、アルムピウォー（Ａｌｍｐｉｗａｒ）ウイルス、アルアク（Ａｒｕａｃ）ウイルス、バンゴラン（Ｂａｎｇｏｒａｎ）ウイルス、ビンボ（Ｂｉｍｂｏ）ウイルス、ビベンスアーム（Ｂｉｖｅｎｓ Ａｒｍ）ウイルス、ブルークラブ（Ｂｌｕｅ ｃｒａｂ）ウイルス、チャールビル（Ｃｈａｒｌｅｖｉｌｌｅ）ウイルス、コースタルプレインズ（Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ）ウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）ウイルス、ガルバ（Ｇａｒｂａ）ウイルス、ゴサス（Ｇｏｓｓａｓ）ウイルス、ハンプティドゥー（Ｈｕｍｐｔｙ Ｄｏｏ）ウイルス、ジョインジャカカ（Ｊｏｉｎｊａｋａｋａ）ウイルス、カンナマンガラム（Ｋａｎｎａｍａｎｇａｌａｍ）ウイルス、コロンゴ（Ｋｏｌｏｎｇｏ）ウイルス、コールピンヤ（Ｋｏｏｌｐｉｎｙａｈ）ウイルス、コトンコン（Ｋｏｔｏｎｋｏｎ）ウイルス、ランジャ（Ｌａｎｄｊｉａ）ウイルス、マニトバ（Ｍａｎｉｔｏｂａ）ウイルス、マルコ（Ｍａｒｃｏ）ウイルス、ナソウル（Ｎａｓｏｕｌｅ）ウイルス、ナバロ（Ｎａｖａｒｒｏ）ウイルス、ガインガン（Ｎｇａｉｎｇａｎ）ウイルス、オークベール（Ｏａｋ−Ｖａｌｅ）ウイルス、オボジャング（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ）ウイルス、オイタ（Ｏｉｔａ）ウイルス、オウァンゴ（Ｏｕａｎｇｏ）ウイルス、パリークリーク（Ｐａｒｒｙ Ｃｒｅｅｋ）ウイルス、リオグランデシクリッド（Ｒｉｏ Ｇｒａｎｅ ｃｉｃｈｌｉｄ）ウイルス、サンジンバ（Ｓａｎｄｊｉｍｂａ）ウイルス、シグマ（Ｓｉｇｍａ）ウイルス、スリプル（Ｓｒｉｐｕｒ）ウイルス、スイートウォーターブランチ（Ｓｗｅｅｔｗａｔｅｒ Ｂｒａｎｃｈ）ウイルス、チブロガルガン（Ｔｉｂｒｏｇａｒｇａｎ）ウイルス、キシブレマ（Ｘｉｂｕｒｅｍａ）ウイルス、ヤタ（Ｙａｔａ）ウイルス、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）、アデレードリバー（Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、ベリマー（Ｂｅｒｒｉｍａｈ）ウイルス、キンバレー（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ）ウイルス又はウシ流行熱（Ｂｏｖｉｎｅ ｅｐｈｅｍｅｒａｌ ｆｅｖｅｒ）ウイルスのうちの１つ又は複数が含まれる。ある種の態様では、ラブドウイルスはジマラブドウイルス（Ｄｉｍａｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（昆虫細胞にも哺乳動物細胞にも感染することができるラブドウイルスとして定義される）のスーパーグループのことを指すことが可能である。特定の実施形態では、ラブドウイルスはＶＳＶではない。特定の態様では、ラブドウイルスは、カラジャスウイルス、マラバウイルス、ファーミントン、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスであり、そのバリアントを含む。これらのウイルスのうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５又はそれよりも多い数は、すべての整数又はその間の範囲を含めて、特許請求の範囲から特に除外することが可能である。
本発明の一実施形態には、マラバウイルスのＭ又はＧタンパク質に対して少なくとも又は最大でも２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９、１００％（その間のすべての範囲及び百分率を含む）のアミノ酸同一性を有するバリアントＭ及び／又はＧタンパク質をコードする腫瘍退縮性マラバウイルスを含む方法及び組成物が含まれる。ある種の態様では、マラバＧタンパク質のアミノ酸２４２は変異されている。追加の態様では、Ｍタンパク質のアミノ酸１２３は変異されている。さらに追加の態様では、Ｇタンパク質（配列番号５）のアミノ酸２４２とＭタンパク質（配列番号４）のアミノ酸１２３の両方が変異されている。アミノ酸２４２は、アルギニン（Ｑ２４２Ｒ）又はそのウイルスを弱毒化する他のアミノ酸で代用することが可能である。アミノ酸１２３は、トリプトファン（Ｌ１２３Ｗ）又はそのウイルスを弱毒化する他のアミノ酸で代用することが可能である。ある種の態様では、２つの別々の変異が個別に、正常な健康細胞においてウイルスを弱毒化する。変異体を組み合わせると、ウイルスは腫瘍細胞においてその野生型ウイルスよりも毒性が強くなる。したがって、マラバＤＭの治療指数は予想外に増加される。
本発明の方法及び組成物は、腫瘍退縮性又は複製欠損ウイルスなどの第二の治療ウイルスを含むことが可能である。腫瘍退縮性は典型的には、癌細胞を殺傷する、溶解する又は癌細胞の増殖を停止することができる作用薬のことである。腫瘍退縮性ウイルスに関しては、この用語は、癌細胞においてある程度複製することができ、その死滅、溶解（腫瘍退縮）又は癌細胞増殖の休止を引き起こし、典型的には、非癌細胞に対しては最小の毒性効果しかないウイルスのことである。第二のウイルスには、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ラブドウイルス、ラブドウイルス等が含まれるが、これらに限定されない。他の態様では、組成物は薬剤的に許容される組成物である。組成物は、化学療法剤、放射線療法剤又は免疫療法剤などの第二の抗癌剤も含み得る。
本発明の追加の実施形態には、細胞を本明細書に記載される単離された腫瘍退縮性ラブドウイルス組成物に接触させるステップを含む過剰増殖細胞を殺傷する方法が含まれる。
さらに追加の方法には、本明細書に記載される腫瘍退縮性ラブドウイルス組成物の有効量を投与するステップを含む癌患者の治療が含まれる。
本発明のある種の態様では、細胞は患者に含まれていてもよく、過剰増殖細胞、腫瘍性細胞、前癌性細胞、癌性細胞、転移性細胞又は転移した細胞でもよい。ラブドウイルス（たとえば、マラバウイルス）は、少なくとも１つのラブドウイルス又はラブドウイルスを含む治療計画若しくは組成物による殺傷に感受性の細胞を有する患者に投与することが可能である。治療組成物の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれよりも多いラブドウイルス若しくは組換えラブドウイルスを単独で又は様々な組合せで用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれよりも多い回数行うことができる。投与される組成物は、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４又はそれよりも多いウイルス粒子又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を有することが可能である。投与は、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は鼻腔内投与によることが可能である。ある種の態様では、組成物は、全身的に、特に血管内投与（注射、灌流等を含む）により投与される。本発明の方法は、第二の治療ウイルスなどの第二の抗癌療法を施すステップをさらに含むことが可能である。ある種の態様では、治療ウイルスは腫瘍退縮性ウイルス、より具体的にはマラバウイルスであることが可能である。他の態様では、第二の抗癌剤は、化学療法剤、放射線療法剤、免疫療法剤、手術又は同種のものである。
本発明の実施形態には、抗癌療法剤として異種Ｇタンパク質を含むラブドウイルス（偽型ウイルス）及びその使用に関連する組成物及び方法が含まれる。そのようなラブドウイルスは、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞殺傷特性を有する。したがって、本明細書に記載されるマラバウイルスは、その上、異種Ｇタンパク質を会合させることによりさらに改変され得る。本明細書で使用されるように、異種Ｇタンパク質には、ラブドウイルスＧタンパク質が含まれる。ラブドウイルスには、以下のウイルス又はそのバリアント：カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス、コカールウイルス、イスファハンウイルス、マラバウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス、ボテケウイルス、カルチャキウイルス、エルウイルスアメリカン、グレーロッジウイルス、ユロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルペススプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、ペリネウイルス、ツパイウイルス、ファーミントン、バイアグランデウイルス、ミュアスプリングウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダースウイルス、カメセウイルス、モスケイロウイルス、モスリルウイルス、バルーウイルス、フクオカウイルス、カーンキャニオンウイルス、コルビッソンウイルス、ルダンテックウイルス、キューラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドレイラウイルス、ティンボウイルス、アルムピウォーウイルス、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ブルークラブウイルス、チャールビルウイルス、コースタルプレインズウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス、コールピンヤウイルス、コトンコンウイルス、ランジャウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソウルウイルス、ナバロウイルス、ガインガンウイルス、オークベールウイルス、オボジャングウイルス、オイタウイルス、オウァンゴウイルス、パリークリークウイルス、リオグランデシクリッドウイルス、サンジンバウイルス、シグマウイルス、スリプルウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、チブロガルガンウイルス、キシブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス、ベリマーウイルス、キンバレーウイルス又はウシ流行熱ウイルスのうちの１つ又は複数を含むことになる。ある種の態様では、ラブドウイルスはジマラブドウイルス（昆虫細胞にも哺乳動物細胞にも感染することができるラブドウイルスとして定義される）のスーパーグループを指すことが可能である。特定の態様では、ラブドウイルスは、カラジャスウイルス、マラバウイルス、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスであり、そのバリアントを含む。
本発明の追加の実施形態には、腫瘍退縮性マラバウイルス組成物を投与する又は細胞を腫瘍退縮性マラバウイルス組成物に接触させるステップを含む過剰増殖細胞を殺傷する方法が含まれる。さらに追加の方法には、そのようなウイルス組成物の有効量を投与するステップを含む、癌患者を治療することが含まれる。
本発明のある種の態様では、細胞は患者に含まれていてもよく、過剰増殖細胞、腫瘍性細胞、前癌性細胞、癌性細胞、転移性細胞又は転移した細胞でもよい。本発明のウイルスは、少なくとも１つのウイルス又はウイルスを含む治療計画若しくは組成物による殺傷に感受性の細胞を有する患者に投与することが可能である。治療組成物の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれよりも多いウイルスを単独で又は様々な組合せで用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれよりも多い回数行ってもよい。投与される組成物は、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４又はそれよりも多いウイルス粒子又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を有することが可能である。投与は、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は鼻腔内投与によることが可能である。ある種の態様では、組成物は、全身的に、特に血管内投与（注射、灌流等を含む）により投与される。本発明の方法は、第二の治療ウイルスなどの第二の抗癌療法を施すステップをさらに含むことが可能である。特定の態様では、治療ウイルスは、本明細書に記載されるマラバウイルスなどの腫瘍退縮性ウイルスであることが可能である。他の態様では、第二の抗癌剤は、化学療法剤、放射線療法剤、免疫療法剤、手術又は同種のものである。
本発明の他の実施形態は、本出願全体で考察される。本発明の一態様に関して考察されるいかなる実施形態も、本発明の他の態様に同様に当てはまり、逆も同様に当てはまる。詳細な説明と実施例のセクションにおける実施形態は、本発明のすべての態様に適用可能である本発明の非限定的実施形態であると理解される。
用語「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」若しくは「妨げる（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又はこれら用語のいかなる変形も、特許請求の範囲及び／又は明細書において使用される場合、所望の結果、たとえば、癌の治療を達成するいかなる測定可能な減少又は完全な抑制も含む。所望の結果には、癌状態若しくは過剰増殖状態又は癌に関連する症状の寛解、減少、緩徐化又は根絶の他にも生活の改善された質又は延命が含まれるが、これらに限定されない。
単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、「１つ」を意味することがあるが、この単語は「１つ又は複数の」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は１より多い」の意味とも一致する。
本出願全体を通じて、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値が、その値を決定するのに用いられている装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
特許請求の範囲における用語「又は（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを指すことを明確に示されていなければ、又は代替物が互いに排他的でなければ、「及び／又は」を意味するために使用される。但し、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）において使用されるように、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇのどんな形でも）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などのｈａｖｉｎｇのどんな形でも）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇのどんな形でも）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇのどんな形でも）は包括的であり又は制限がなく、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。
本発明の他の目的、特長及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明及び具体的例は、本発明の具体的実施形態を示す一方で、図のみにより与えられる。その理由は、本発明の精神と範囲内の様々な変化及び改変は、この詳細な説明から当業者には明らかとなるからである。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある種の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図のうちの１つ又は複数を参照することによりさらによく理解されることができる。
新規のラブドウイルスマラバが癌細胞における高ウイルス生産性を示すことを示す図である。１つのステップ増殖曲線を使用して、ＡではＮＣＩ Ｈ２２６細胞、ＢではＳＮＢ１９細胞におけるマラバ、カラジャス、ファーミントン及びバイアグランデのウイルス生産性を定量化した。マラバは、両細胞株においてその他のウイルスと比べて高い力価まで一貫して複製する。 マラバ変異体が癌細胞におけるその殺傷力を保持するが、正常細胞上では弱毒化されることを示す図である。（Ｂ）本単一変異体（Ｌ１２３Ｗ、Ｖ２２１Ｙ、Ｑ２４２Ｒ）及び二重変異体（Ｑ２４２Ｒ Ｌ１２３Ｗ）の様々な変異部位の概要を説明する腫瘍溶解剤としてのマラバゲノム操作マラバの図。（Ｃ）Ｇ及びＭタンパク質の変異はマラバのＧＭ３８細胞を殺傷する能力を減弱する。生存率アッセイは、マラバ及び指示されたマラバ変異体の感染の７２時間後にＧＭ３８細胞において実施された。（Ｄ）操作してＬ１２３Ｗ変異をＱ２４２Ｒマラバ変異体内に入れると、プラークサイズは野生型表現型に戻る。プラークアッセイは、野生型マラバ、単一及びＤＭバリアントが感染したＳＮＢ１９細胞において実施された。直径が測定され、以下の式Ａ＝ＴＴｒ２を使用してプラーク面積が計算された。（Ｅ）マラバ及びマラババリアントは、種々の腫瘍細胞株において高度に溶解性である。野生型マラバ及びマラババリアントの感染４８時間後のＰＣ３、ＥＳ２、Ａ５４９及びＳＷ６２０細胞の画像。（Ｆ）ＷＴマラバ及びマラババリアントが感染した細胞は、生存率についてレサズリンを使用してアッセイされた。生存率は、マラバ及びそのバリアントの感染４８時間後にはすべての処置された細胞株において劇的に減少している。 マラバ変異体が、インターフェロン産生をブロックするその能力の点で異なることを示す図である。ＰＣ−３細胞にマラババリアントを感染させ、その上清を使用してベロ細胞をそれに続く野生型マラバウイルスの感染から保護した。（Ａ）Ｑ２４２Ｒ変異体は野生型マラバに類似してインターフェロンをブロックする。（Ｂ）Ｌ１２３Ｗ変異体、Ｖ２２１Ｙ変異体、マラバΔＭ５１及び二重変異体Ｌ１２３Ｗ−Ｍ／Ｑ２４２Ｒ−Ｇは、ＰＣ３細胞への感染に続いてインターフェロンを産生させる。（Ｃ）ｒマラバは、ＩＦＮ−βの核／細胞質輸送をブロックする。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡ誘導は、ｑＲＴＰＣＲにより決定される場合、ｒマラバ又はマラバＱ２４２Ｒが感染した後は細胞質画分では検出されない。Δ５１Ｍ、Ｌ１２３Ｗ及びマラバＤＭが感染した細胞は、感染に続いて細胞質においてＩＦＮ−β ｍＲＮＡ誘導を示す。 マラバＤＭの全身送達が、同系及び異種移植マウス腫瘍モデルで効果的であることを示す図である。（Ａ）マラバＤＭは、ＣＴ−２６両側性腫瘍モデルの治療に効果的である。（ｉ）ＤＭＧＦＰ及びＤＭ−ＦＬＵＣはＩＶ注入（５×１０８ｐｆｕ）２４時間後腫瘍部位において選択的に複製する。（ｉｉ）マラバＤＭ処置後の両側性ＣＴ２６腫瘍を有するＢａｌｂ／Ｃマウスの耐久性生存。（ｉｉｉ）腫瘍体積は隔週ごとに計算された。エラーバーはＳＥＭを示す。（ｉｖ）マラバＤＭ及び対照での処置前及び処置後に測定されたマウス体重。エラーバーはＳＥＭを示す。（Ｂ）播種性ＣＴ−２６腫瘍の全身処置。（ｉ）ＣＴ−２６肺腫瘍は、腫瘍移植後１０日目にＰＢＳ、カラジャスウイルス又はマラバＤＭのいずれかを静脈内に処置された。１７日目に動物は屠殺され、肺画像が撮像された。（ｉｉ）マラバＤＭの６静脈内用量（５×１０８ｐｆｕ／用量）を用いた効果的腫瘍処置。（Ｃ）マラバＤＭは、ヒト卵巣（ＥＳ−２）異種移植モデルにおいて効果的である（ＩＰ注射、１×１０４ｐｆｕ／用量）。（ｉ）ＩＶＩＳ画像は、ウイルス処置に続く急速な腫瘍縮小を示している。（ｉｉ）生物発光フラックスプロットは、ウイルス処置応答における腹腔腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の著しい減少を定量化している。（ｉｉｉ）カプランマイヤープロットは、ウイルス処置後の増強された生存を示している。（Ｄ）マラバＤＭは、ＥＳ−２異種移植腫瘍の処置においてＶＳＶ Δ５１よりも優れている（ＩＶ注射、１×１０５〜１×１０７ｐｆｕ／用量）。（ｉ−ｉｉ）カプランマイヤープロットは、ＶＳＶ Δ５１と比べたマラバＤＭで処置された動物の増強された生存を示している。 ＮＣＩ６０細胞パネル上のラブドウイルス媒介細胞殺傷を示す図である。ＮＣＩ６０細胞由来の細胞は９６ウェルプレートに培養密度９０％まで蒔かれた。これらの細胞に、指示される通りに様々なラブドウイルスを対数希釈で感染させた。腫瘍溶解剤として操作されたマラバウイルスの感染４８時間及び９６時間後、単層は洗浄され、固定され、１％クリスタルバイオレット溶液で染色された。染色された単層は、それに続いて１％ＳＤＳ水溶液中に可溶化され、均一なライセートを作製した。吸光度は５９５ｎｍで読み取られ、生存細胞についてスコアー化した。ＭＯＩ ＥＣ５０は、図に示される範囲にスコアー化された。
本発明の態様は、いくつかの種類又は型のラブドウイルス（たとえば、マラバウイルス）又は偽型ラブドウイルスによる癌細胞の殺傷に基づいている。これら腫瘍退縮性ラブドウイルス及び組換えラブドウイルスの利点のいくつかには、以下の、（１）本発明のラブドウイルスの抗体は、世界の大半の集団にはめったに存在しない、（２）ラブドウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、パルボウイルス、レトロウイルス及びＨＳＶなどの他の腫瘍退縮性ウイルスよりも迅速に複製する、（３）ラブドウイルスは高力価まで増殖し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過可能である、（４）腫瘍退縮性ラブドウイルス及びその組換え体は広い宿主範囲を有し、多くの異なった型の癌細胞に感染することができ、特定の細胞上の受容体に限定されない（たとえば、コクサッキー、麻疹、アデノウイルス）、（５）本発明のラブドウイルスは遺伝子操作を受け入れられる。（６）ラブドウイルスは細胞質生活環も有しており、宿主細胞の遺伝物質に組み込まれることはなく、これによりさらに都合のよい安全性プロファイルが与えられる、が挙げられる。
本明細書に記載されるように、新規の腫瘍退縮性ウイルスは、効果的なウイルスベースの癌療法を構築するための基盤としての役割を果たすことが確認された。強力な腫瘍退縮性効果に寄与する特性のあるウイルスを求めて、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）がスクリーニングされた。全身送達は予測される投与法であり、臨床的背景において播種性癌を治療する際の１つの有益な面である。ある種の態様では、ウイルスは静脈内に送達され、不同性の腫瘍部位で感染を開始することができる。効果的療法に対するインビボ制限の１つは、腫瘍床へのウイルス送達が限定的であり得るおそれがあると仮定されている。実際、それより下ではウイルスがマウスモデルにおける腫瘍にまで効果的に送達されない用量閾値が観察されており、これらの用量では効果的ではなかった（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．、２００３）。したがって、本発明者らは低い感染多重度（「ＭＯＩ」）で腫瘍細胞を殺傷し、急速に複製し、多数の子孫を産生して腫瘍床感染の確率及び規模を最大にすることができるウイルスを見つけることに関心をもった。この目的のために、広く一連の腫瘍細胞を低いＭＯＩで殺傷することができるウイルスを同定するためのマルチウェルプレートアッセイを設計した。ＭＯＩアッセイの後に、もっとも強力なウイルスが増殖速度論及びバーストサイズについてアッセイされた。マラバウイルスが有望な候補として同定された。
マラバ（配列番号１）及びカラジャス（ＣＲＪ）（配列番号７）の完全ゲノム配列が得られた。
マラバウイルスが候補として同定されると、本発明者らは、ウイルスの腫瘍選択性を改善するための遺伝子操作実験を行った。変化する環境におけるＲＮＡウイルス適応度をモニターするための実験において２つの興味を引く変異が最初に同定された。以前の報告では、Ｌ１２３ＷとＨ２４２Ｒ（マラバではＱ２４２Ｒ）の両方ともＢＨＫ２１細胞においてＶＳＶ複製を個別に増加することができた。さらに、２つの変異の組合せはこの適応度表現型を保持することが報告された。Ｌ１２３Ｗ／Ｑ２４２Ｒ変異は、ウイルスに少なくとも３ｌｏｇ（一部の腫瘍細胞上でＥＣ５０＜１０−３ＭＯＩ；ＧＭ３８線維芽細胞上でＥＣ５０＝３ＭＯＩ）の治療指数をもたらす。Ｑ２４２Ｒ及びＬ１２３Ｗ変異は、正常線維芽細胞上では弱毒化する。Ｌ１２３Ｗ変異は、ΔＭ５１及びＶ２２１Ｙとほぼ同じように機能して、核／細胞質輸送をブロックする能力に欠損があり、それによって宿主ＩＦＮ転写カスケードを阻害すると思われる。本発明者が知る限りでは、これは、ヒト先天性免疫防御を緩和することにおけるマトリックスタンパク質のこの領域の役割を初めて実証したものである。以前、この領域の変異はウイルスｍＲＮＡの翻訳に影響を与えることが報告されている（Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．、２００６）。Ｑ２４２Ｒ変異は正常細胞のマラバウイルス細胞溶解を激しく減少させるが、ＩＦＮ非依存的な形で減少させる。これらの特性は強力な腫瘍選択性の基盤を形成し、この新規のマラバベースの腫瘍退縮性ウイルスプラットフォームの治療指数を著しく増加させる。
インビトロ結果から予想されるように、マラバＤＭバリアントは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの静脈内に送達される場合、野生型ウイルスよりも有意に毒性が低かった。最大耐量（「ＭＴＤ」）の大きさはＷＴウイルスの１００倍であった。このために、ＭＴＤのはるか下の投薬でも、両腫瘍モデルにおいて著しい腫瘍縮小を達成することができた。たとえば、ＣＴ２６モデルでは、マラバＤＭウイルスの６用量は、すべてのマウスにおいて完全で耐久性のある治療法を提供するのに十分であった。臨床的背景において特に重要なことに、マラバＤＭが、全身送達によるヒト異種移植腫瘍と免疫適格性同系腫瘍モデルの両方の治療に効果的であった。ウイルス複製は、静脈内注射に続くＣＴ２６腫瘍モデルの腫瘍部位で実証され、有効性に貢献するものとしてのウイルス媒介腫瘍退縮性と一致していた。実際、マラバＤＭは、ＥＳ２異種移植モデルにおいて以前の候補ＶＳＶ ΔＭ５１よりも効果が高いと思われた。これは、マラバＤＭが腫瘍細胞を殺傷することでは実にＷＴウイルスよりも効果が高いことを実証するインビトロデータと一致する。いくつかの研究では、宿主免疫応答が腫瘍退縮性ウイルス有効性において正と負の役割を果たしていることが決定的に実証されている（Ｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ａｌｔｏｍｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｃｈｉｏｃｃａ、２００８）。
本発明の実施形態には、マラバウイルス又は偽型ラブドウイルス及び抗癌療法としてのその使用に関連する組成物及び方法が含まれる。
Ｉ．ラブドウイルス科（ラブドウイルス）
原型ラブドウイルスは狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）であり、このウイルス科ではもっともよく研究されている。これらのウイルスは類似の形態を共有しているが、その生活環、宿主範囲及び病態は非常に異なっている。ラブドウイルスは、非分割型（−）センスＲＮＡゲノムを有する弾丸形ウイルスの科である。哺乳動物、魚、昆虫及び植物に感染する２５０を超えるラブドウイルスが知られている。
ラブドウイルス科には、カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス（ＡＦ１２８８６８／ｇｉ：４５８３４３６、ＡＪ８１００８３／ｇｉ：５７８３３８９１、ＡＹ８７１８００／ｇｉ：６２８６１４７０、ＡＹ８７１７９９／ｇｉ：６２８６１４６８、ＡＹ８７１７９８／ｇｉ：６２８６１４６６、ＡＹ８７１７９７／ｇｉ：６２８６１４６４、ＡＹ８７１７９６／ｇｉ：６２８６１４６２、ＡＹ８７１７９５／ｇｉ：６２８６１４６０、ＡＹ８７１７９４／ｇｉ：６２８６１４５９、ＡＹ８７１７９３／ｇｉ：６２８６１４５７、ＡＹ８７１７９２／ｇｉ：６２８６１４５５、ＡＹ８７１７９１／ｇｉ：６２８６１４５３）、コカールウイルス（ＡＦ０４５５５６／ｇｉ：２８６５６５８）、イスファハンウイルス（ＡＪ８１００８４／ｇｉ：５７８３４０３８）、マラバウイルス（配列番号１〜６）、カラジャスウイルス（配列番号７〜１２、ＡＹ３３５１８５／ｇｉ：３３５７８０３７）、ピリウイルス（Ｄ２６１７５／ｇｉ：４４２４８０、Ｚ１５０９３／ｇｉ：６１４０５）、水疱性口内炎アラゴウイルス、ＢｅＡｎ１５７５７５ウイルス、ボテケウイルス、カルチャキウイルス、エルウイルスアメリカン、グレーロッジウイルス、ユロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルペススプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス（ＤＱ４５７１０３／ｇｉ｜９１９８４８０５）、ペリネウイルス（ＡＹ８５４６５２／ｇｉ：７１８４２３８１）、ツパイウイルス（ＮＣ＿００７０２０／ｇｉ：６６５０８４２７）、ファーミントン、バイアグランデウイルス（配列番号１３〜１８）、ミュアスプリングウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダースウイルス（ＡＦ５２３１９９／ｇｉ：２５１４０６３５、ＡＦ５２３１９７／ｇｉ：２５１４０６３４、ＡＦ５２３１９６／ｇｉ：２５１４０６３３、ＡＦ５２３１９５／ｇｉ：２５１４０６３２、ＡＦ５２３１９４／ｇｉ：２５１４０６３１、ＡＨ０１２１７９／ｇｉ：２５１４０６３０）、カメセウイルス、モスケイロウイルス、モスリルウイルス、バルーウイルス、フクオカウイルス（ＡＹ８５４６５１／ｇｉ：７１８４２３７９）、カーンキャニオンウイルス、コルビッソンウイルス、ルダンテックウイルス（ＡＹ８５４６５０／ｇｉ：７１８４２３７７）、キューラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドレイラウイルス、ティンボウイルス、アルムピウォーウイルス（ＡＹ８５４６４５／ｇｉ：７１８４２３６７）、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ブルークラブウイルス、チャールビルウイルス、コースタルプレインズウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス（ＡＹ８５４６４３／ｇｉ：７１８４２３６３）、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス（ＤＱ４５７１００／ｇｉ｜９１９８４７９９核タンパク質（Ｎ）ｍＲＮＡ、部分的ｃｄ）、コールピンヤウイルス、コトンコンウイルス（ＤＱ４５７０９９／ｇｉ｜９１９８４７９７、ＡＹ８５４６３８／ｇｉ：７１８４２３５４）、ランジャウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソウルウイルス、ナバロウイルス、ガインガンウイルス（ＡＹ８５４６４９／ｇｉ：７１８４２３７５）、オークベールウイルス（ＡＹ８５４６７０／ｇｉ：７１８４２４１７）、オボジャングウイルス（ＤＱ４５７０９８／ｇｉ｜９１９８４７９５）、オイタウイルス（ＡＢ１１６３８６／ｇｉ：４６０２００２７）、オウァンゴウイルス、パリークリークウイルス（ＡＹ８５４６４７／ｇｉ：７１８４２３７１）、リオグランデシクリッドウイルス、サンジンバウイルス（ＤＱ４５７１０２／ｇｉ｜９１９８４８０３）、シグマウイルス（ＡＨ００４２０９／ｇｉ：１６８０５４５、ＡＨ００４２０８／ｇｉ：１６８０５４４、ＡＨ００４２０６／ｇｉ：１６８０５４２）、スリプルウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、チブロガルガンウイルス（ＡＹ８５４６４６／ｇｉ：７１８４２３６９）、キシブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス（Ｕ１０３６３／ｇｉ：６００１５１、ＡＦ２３４９９８／ｇｉ：１０４４３７４７、ＡＦ２３４５３４／ｇｉ：９９７１７８５、ＡＹ８５４６３５／ｇｉ：７１８４２３４８）、ベリマーウイルス（ＡＹ８５４６３６／ｇｉ：７１８４２３５０）、キンバレーウイルス（ＡＹ８５４６３７／ｇｉ：７１８４２３５２）、又はウシ流行熱ウイルス（ＮＣ＿００２５２６／ｇｉ：１００８６５６１）が含まれるが、これらに限定されない。
Ａ．ラブドウイルスゲノム
典型的には、ラブドウイルスゲノムはおよそ１１〜１５ｋｂであり、（−）センスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のおよそ５０ヌクレオチド３’リーダー及びおよそ６０ヌクレオチド非翻訳５’領域を含む。典型的には、ラブドウイルスｖＲＮＡは５つのタンパク質をコードする５つの遺伝子を有する。ラブドウイルスは、各遺伝子の末端に保存されたポリアデニル化シグナルを、５つの遺伝子のそれぞれの間に短い遺伝子間領域を有する。すべてのラブドウイルスは、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ、ＮＳとも名付けられる）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び大タンパク質（Ｌ）をコードする少なくとも５つの遺伝子を含有する。典型的には、これらの遺伝子はマイナス鎖ｖＲＮＡ上で以下の通りに順序付けられている：３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−（Ｘ）−Ｌ−５’（配列番号２９）。遺伝子の順序は、合成されるタンパク質の割合を指示するので、重要である。ラブドウイルスゲノムのいかなる操作も、典型的には、高いレベルで感染し複製する能力を維持するために少なくとも５つの転写ドメインを含むことになる。ラブドウイルスは、プラスセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写のための内在性ＲＮＡポリメラーゼを有する。Ｘ遺伝子はすべてのラブドウイルスに存在するわけではない。Ｘ遺伝子は魚感染性造血壊死ウイルス（ジェンバンク ＤＱ１６４１０３／ｇｉ｜７６２６２９８１；ＤＱ１６４１０２／ｇｉ｜７６２６２９７９；ＤＱ１６４１０１／ｇｉ｜７６２６２９７７；ＤＱ１６４１００／ｇｉ｜７６２６２９７５；ＤＱ１６４０９９／ｇｉ｜７６２６２９７３；ＡＢ２５０９３５／ｇｉ｜１１２８２１１６５；ＡＢ２５０９３４／ｇｉ｜１１２８２１１６３；ＡＢ２５０９３３／ｇｉ｜１１２８２１１６１；ＡＢ２５０９３２／ｇｉ｜１１２８２１１５９；ＡＢ２５０９３１／ｇｉ｜１１２８２１１５７；ＡＢ２５０９３０／ｇｉ｜１１２８２１１５５；ＡＢ２５０９２９／ｇｉ｜１１２８２１１５３；ＡＢ２５０９２８／ｇｉ｜１１２８２１１５１；ＡＢ２５０９２７／ｇｉ｜１１２８２１１４９、Ｇタンパク質コードヌクレオチド配列を記載している）、ウシ流行熱ウイルスにおける非構造糖タンパク質及び狂犬病ウイルスにおける偽遺伝子において見出された非構造タンパク質をコードする。追加の（Ｘ）遺伝子はラブドウイルスゲノム上の異なる位置に見出されている。感染細胞におけるＭタンパク質の合成は細胞にとっては細胞壊死性であり、最終的には細胞死をもたらすことになる。
ラブドウイルスの感染はウイルス／宿主に応じて変化するが、大半は直接接触、たとえば、動物咬傷又は媒介昆虫よる狂犬病の感染、により伝えられる。インビボでは長い潜伏期間があるが、これは培養中のウイルス複製の速度論には反映されない。Ｇタンパク質スパイクは宿主細胞の表面上で受容体に結合し、ウイルスは、Ｇタンパク質により媒介されるエンドサイトーシス及び小胞の膜との融合により細胞に進入する。
特定の理論に制限されるつもりはないが、ラブドウイルスの受容体分子は、特定のタンパク質ではなくリン脂質又は炭水化物であると考えられている。ラブドウイルス複製は細胞質で起こり、ＬとＮＳタンパク質の両方が転写には必要であり、どちらも単独では機能しない。５つの単シストロン性ｍＲＮＡが産生され、５’末端でキャップされ３’末端でポリアデニル化され、それぞれがメッセージの５’末端にｖＲＮＡの３’末端由来のリーダー配列を含有している。これらのｍＲＮＡは、ウイルスゲノム中のＯＲＦの連続転写により作製され、遺伝子間配列が、各遺伝子間のポリメラーゼによる転写の終結及び再開始の原因であり、したがって、別々の転写物が産生されることが明らかにされている。
子孫ｖＲＮＡは（＋）センス中間体から作製される。ゲノムはＬ＋Ｐポリメラーゼ複合体（転写におけるのと同様に）により複製されるが、追加の宿主細胞因子も必要になる。これらの事象すべてが、ウイルス「工場」として作用し特徴的な細胞質封入体として現れる細胞質中の部分で起こることはラブドウイルスの特徴である。
Ｂ．ウイルスタンパク質バリアント
ある種の実施形態では、マラバウイルス又はラブドウイルスは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及び／又はＬタンパク質のうちの１つ又は複数のバリアントを含むことになる。本発明のある種の態様では、これらのウイルスタンパク質バリアントは治療ウイルス又はタンパク質性組成物に含めることが可能であり、このタンパク質性組成物は下でさらに定義される。タンパク質性組成物には、ウイルス粒子及び１つ又は複数のウイルスタンパク質成分を有する他の組成物が含まれる。これらポリペプチドバリアント（複数可）は、宿主細胞範囲、宿主細胞特異性、非標的細胞又は器官に対する毒性、複製、標的細胞に対する細胞傷害性、癌細胞の殺傷、癌細胞の停滞、感染力、製造パラメータ、ウイルス粒子のサイズ、ウイルス粒子の安定性、インビボクリアランス、免疫反応性等などの１つ又は複数の生理学的又は生物学的特徴の改変のために操作される又は選択されることが可能である。これらポリペプチドバリアントは、様々な突然変異誘発法を含む当技術分野で公知の多種多様な方法論を使用することにより操作することが可能である。ある種の態様では、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及び／又はＬタンパク質はウイルスに対して異種性であることが可能である（たとえば、ＶＳＶはイスファハンＧタンパク質又はそのバリアントを含み得る）。
Ｃ．組換えラブドウイルス
組換えラブドウイルスは、（１）完全にｃＤＮＡ、又は（２）ヘルパー細胞にトランスフェクトされるｃＤＮＡの組合せ、又は（３）感染性若しくは非感染性組換えラブドウイルスのどちらかを産生するのに必要な残りの成分若しくは活性をトランスで提供するミニウイルスをさらに感染させる、細胞にトランスフェクトされたｃＤＮＡを使用して、産生することが可能である。これらの方法（たとえば、ミニウイルス、ヘルパー細胞株又はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）のうちのいずれかを使用して、必要とされる最小限成分は、（１）ラブドウイルスＮタンパク質によるゲノム（又はアンチゲノム）ＲＮＡのキャプシド形成、及び（２）ゲノム又はアンチゲノム（複製中間体）ＲＮＡ等価物の複製のためのシス作用性シグナルを含有するＲＮＡ分子である。
複製エレメント又はレプリコンにより、本発明者らは、５’及び３’末端にラブドウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列を最小限含有するＲＮＡの鎖を意味する。ゲノムの意味では、リーダーは３’末端にあり、トレーラーは５’末端にある。これら２つの複製シグナル間に置かれるどんなＲＮＡも順に複製されることになる。リーダー及びトレーラー領域は、Ｎタンパク質によるキャプシド形成のために並びに転写及び複製を開始するのに必要なポリメラーゼ結合のために、最小のシス作用エレメントをさらに含有しなければならない。
操作されたラブドウイルスを調製するために、Ｇ遺伝子を含有するミニウイルスは、リーダー領域、トレーラー領域及びＧタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始及び終結シグナルを有するＧ遺伝子も含有すると考えられる。ミニウイルスがＭ遺伝子をさらに含むならば、Ｍタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始及び終結シグナルも存在していなければならない。
操作されたラブドウイルスゲノム内に含有されるどんな遺伝子でも、遺伝子は、それらの遺伝子の発現及びタンパク質産物の産生を可能にすることになる適切な転写開始及び終結シグナルに隣接していると考えられる。特に異種遺伝子は、典型的には天然から単離されたラブドウイルスによりコードされておらず又はラブドウイルスコード領域、たとえば、キメラＧタンパク質を、その領域が典型的に見出されない位置に、形で又は状況で含有している遺伝子である。
「非感染性」操作されたラブドウイルスを産生するためには、操作されたラブドウイルスは、最小のレプリコンエレメント並びにＮ、Ｐ及びＬタンパク質を有していなければならず、Ｍ遺伝子を含有していなければならない（一例はΔＧ又はＧなし構築物であり、この構築物はＧタンパク質のコード領域を欠いている）。これにより、細胞から出芽するが、非感染性粒子であるウイルス粒子が産生される。「感染性」粒子を産生するためには、ウイルス粒子は、付着タンパク質又は受容体リガンドの使用を通じてなどの、ウイルス粒子結合及び融合を媒介することができるタンパク質をさらに含んでいなければならない。ラブドウイルスの天然の受容体リガンドはＧタンパク質である。
「適合性の細胞」又は「宿主細胞」は、組換えラブドウイルスの構築を可能にすると考えられる任意の細胞を意味する。感染性ウイルス粒子を調製するための１つの方法は、適切な細胞株（たとえば、ＢＨＫ細胞）に先ず、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９８６）或いはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ３若しくはＳＰ６ポリメラーゼなどの他の適切なバクテリオファージポリメラーゼ（Ｕｓｄｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９３又はＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９０参照）をコードする等価物を感染させることである。次に、細胞に、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含有する個々のｃＤＮＡをトランスフェクトさせる。これらのｃＤＮＡは、組換えラブドウイルス粒子を構築するためのタンパク質を提供することになる。細胞は、当技術分野で公知のどんな方法（たとえば、リポソーム、エレクトロポレーション等）によってもトランスフェクトさせることが可能である。
ラブドウイルスゲノムＲＮＡ等価物を含有する「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」も細胞株にトランスフェクトされる。感染性組換えラブドウイルス粒子が感染細胞においては溶解性であることを意図される場合、Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＬタンパク質をコードする遺伝子の他にも任意の異種核酸セグメントが存在しなければならない。感染性組換えラブドウイルス粒子が溶解性であることを意図されていない場合、Ｍタンパク質をコードする遺伝子はポリシストロン性ＤＮＡに含まれない。「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」とは、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする遺伝子を含有する少なくとも転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。組換えラブドウイルスポリシストロン性ＤＮＡは、タンパク質バリアント若しくはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子又は治療核酸も含有し得る。代わりに、最初に産生されたウイルス粒子又はその断片が最初に会合するどんなタンパク質もトランスで供給し得る。
企図されている別の実施形態は、レポータータンパク質又は蛍光タンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質及びその誘導体、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等）、Ｎ−Ｐ−Ｌ若しくはＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子及び／又は融合タンパク質をコードする遺伝子或いは治療核酸を含むポリシストロン性ｃＤＮＡである。企図されている別のポリシストロン性ＤＮＡは、タンパク質バリアントをコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、治療核酸及び／又はＮ−Ｐ−Ｌ遺伝子若しくはＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子を含有し得る。
組換えラブドウイルスを作製する第一ステップは、ｃＤＮＡ由来のゲノム又はアンチゲノム等価物であるＲＮＡの発現である。次に、ＲＮＡはＮタンパク質によりパッケージングされ、その後Ｐ／Ｌタンパク質により複製される。このようにして産生されるウイルスは回収することが可能である。Ｇタンパク質は、組換えＲＮＡゲノムになければ、典型的にはトランスで供給される。Ｇタンパク質もＭタンパク質もなければ、両方ともトランスで供給される。
「非感染性ラブドウイルス」粒子を調製するためには、その手法は、細胞にトランスフェクトされたポリシストロン性ｃＤＮＡがラブドウイルスのＮ、Ｐ及びＬ遺伝子のみを含有することになる以外は上記と同じでもよい。非感染性ラブドウイルス粒子のポリシストロン性ｃＤＮＡは、レポータータンパク質をコードする遺伝子又は治療核酸をさらに含有し得る。Ｇタンパク質をコードする遺伝子を欠く組換えラブドウイルスを産生する方法に関する追加の説明に関しては、Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）を参照されたい。
１．ウイルスを産生する細胞の培養
トランスフェクトされた細胞は、通常、所望の温度で少なくとも２４時間、通常約３７℃でインキュベートされる。非感染性ウイルス粒子では、上清が収集され、ウイルス粒子が単離される。感染性ウイルス粒子では、ウイルスを含有する上清が収穫されて新鮮な細胞に移される。新鮮な細胞はおよそ４８時間インキュベートされ、その上清が収集される。
２．組換えラブドウイルスの精製
用語「単離」又はラブドウイルスを「単離する」は、ウイルス粒子を培養し、ほとんど細胞残渣が残らないように精製するプロセスを意味する。一例は、ビリオン含有上清を採取し、それを０．１〜０．２ミクロンポアサイズフィルター（たとえば、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させて、ウイルス及び細胞残渣を取り除くことになる。代わりに、ビリオンは、ショ糖密度勾配などの勾配を使用して精製することが可能である。次に、組換えラブドウイルス粒子はペレット化され、望まれるどのような賦形剤又は担体にも再懸濁されることが可能である。力価は、特定のタンパク質に特異的な抗体を使用する間接免疫蛍光法により決定することが可能である。
３．ｃＤＮＡ及びミニウイルス又はヘルパー細胞株を使用して組換えラブドウイルスを作製する方法
「ミニウイルス」も「ヘルパー細胞」（「ヘルパー細胞株としても知られる」）も同じものを提供し、ラブドウイルスビリオン構築のためのラブドウイルスタンパク質の供給源を提供する。ラブドウイルスミニウイルスの一例は、Ｓｔｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９５）により報告されているように、Ｇ及びＭタンパク質のみを発現するＶＳＶミニウイルスである。ヘルパーウイルス及びミニウイルスは、ラブドウイルスタンパク質の遺伝子をコードするトランスフェクトされたＤＮＡからは産生されないラブドウイルスタンパク質を提供する方法として使用される。
ミニウイルスを使用する場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを提供するために上記のワクシニアウイルスを細胞に感染させる。所望のポリシストロン性ＲＮＡ並びにＮ、Ｐ及びＬ遺伝子を含有するプラスミドを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションミックスはおよそ３時間後に取り除かれ、細胞には約１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）でミニウイルスを感染させる。ミニウイルスは欠損したＧ及び／又はＭタンパク質を供給する。細胞にトランスフェクトされたポリシストロン性ＲＮＡは、感染性組換えラブドウイルスが望まれるのか、又は非感染性組換えラブドウイルスが望まれるかどうかに依拠することになる。
代わりに、ミニウイルスを使用すれば、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子を提供することができる。ミニウイルスを使用すれば、Ｎ、Ｐ及びＬに加えてＭタンパク質も産生することができる。ミニウイルスはＧタンパク質も産生することができる。
ヘルパー細胞株を使用する場合、欠損しているラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子はヘルパー細胞株により産生される。ヘルパー細胞株は、野生型Ｇタンパク質をコードしていない組換えラブドウイルスを産生するために、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＧタンパク質を有する。タンパク質は、組換えウイルスゲノムの一部ではない遺伝子又はＤＮＡから発現される。これらのプラスミド又は他のベクター系は、細胞株のゲノムに安定的に組み込まれている。次に、タンパク質は、細胞質中のレプリコンからではなく、細胞のゲノムから産生される。次に、ヘルパー細胞株は、ヘルパーウイルスにより発現されないその他のラブドウイルス遺伝子を含有するポリシストロン性ＤＮＡ及びプラスミドｃＤＮＡをトランスフェクトさせることが可能である。使用されるポリシストロン性ＲＮＡは、感染性組換えラブドウイルスが望まれるのか、又は非感染性組換えラブドウイルスが望まれるかどうかに依拠することになる。他の方法では、欠損している遺伝子産物（たとえば、Ｇ及び／又はＭ）の供給は上記の通りに実現されることになる。
ＩＩ．ウイルス組成物
本発明は、過剰増殖細胞又は新生細胞（たとえば、癌細胞）並びに患者における過剰増殖状態又は新生状態（たとえば、癌）の研究及び治療に有利であるラブドウイルスに関する。本発明は、神経毒性が減少しているラブドウイルス、たとえば、マラバウイルスなどのラブドウイルスに関する場合があるが、これに限定されない。ある種の態様では、ウイルスは癌細胞に対する使用のために望ましい特性を有し、同時に最初に単離されたウイルス又はＶＳＶよりも非癌細胞に対して毒性が弱い又は非毒性であるように、１つ若しくは複数のタンパク質成分（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及び／若しくはＬタンパク質）又はＶＳＶのゲノムとは異なる（すなわち、アミノ酸若しくはヌクレオチドレベルで少なくとも若しくは最大で１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０％同一である）核酸ゲノムをコードする若しくは含有する、並びに／或いは野生型ウイルス又はウイルスタンパク質と比べた場合、１つ若しくは複数の変異又は変形で構築されているラブドウイルス。下に記載される教唆は、本発明の方法及び組成物を実行するためのプロトコールの様々な例を提供する。教唆は、バイオセレクション（ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）又は組換えＤＮＡ又は核酸技術を使用して変異ウイルス又はバリアントウイルスを作製するための背景を提供する。
Ａ．タンパク質性組成物
本発明のタンパク質性組成物には、ウイルス粒子及びウイルス粒子を含む組成物の他にも単離されたポリペプチドが含まれる。ある種の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス（たとえば、マラバウイルス）、偽型又は腫瘍退縮性ラブドウイルス（癌細胞を溶解する、殺傷する若しくは癌細胞の増殖を遅延させるラブドウイルス）を作製する又は単離することに関する。ある種の実施形態では、ラブドウイルスは、ラブドウイルスタンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及び／若しくはＬ）のポリペプチドバリアント及び／又は治療ポリペプチドをコードする治療核酸を含むように操作されることになる。本発明の他の態様は、１つ又は複数の機能的ポリペプチド又はタンパク質を欠くラブドウイルスの単離を含む。他の実施形態では、本発明は、薬剤的に許容可能な製剤の一部としてのタンパク質性組成物と組み合わせた又はタンパク質性組成物内に含まれるラブドウイルス及びその使用に関する。
本明細書で使用されるように、「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーを含む分子のことである。いくつかの実施形態では、野生型バージョンのタンパク質又はポリペプチドが用いられるが、本発明の多くの実施形態では、ウイルスタンパク質又はポリペプチドのすべて又は一部は、ウイルスを患者の治療にとりさらに有用にするために、欠けている又は変更されている。上記の用語は本明細書では互換的に使用してもよい。「改変されたタンパク質」又は「改変されたポリペプチド」又は「バリアントタンパク質」又は「バリアントポリペプチド」とは、野生型又は基準タンパク質又はポリペプチドに関してその化学構造又はアミノ酸配列が変更されているタンパク質又はポリペプチドのことである。いくつかの実施形態では、改変されたタンパク質又はポリペプチドは少なくとも１つの改変された活性又は機能を有する（タンパク質又はポリペプチドは複数の活性又は機能を有していてもよいことを認識している）。改変された活性又は機能は、野生型タンパク質若しくはポリペプチドにおけるその活性若しくは機能又はそのようなポリペプチドを含有するウイルスの特徴に関して何か他の点（たとえば、感染特異性）で縮小される、減少される、除去される、増強される、改善される又は変更されていてもよい。改変されたタンパク質若しくはポリペプチドは、１つの活性又は機能に関して変更されていてよいが、それでも他の点では野生型又は非変更活性又は機能を保持していることが企図されている。代わりに、改変されたタンパク質は完全に非機能的でもよく、又はその同族核酸配列は、フレームシフト又は他の改変の結果として、ポリペプチドがもはや全く発現されない、トランケートされる又は異なるアミノ酸配列を発現するように、変更されていることもある。
ある種の実施形態では、組換えタンパク質又はポリペプチドのサイズは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００又はもっと多くのアミノ分子残基及びそこで引き出せるいかなる範囲でも含み得るが、これらに限定されない。ポリペプチドは、ポリペプチドをその対応する非変更形態よりも短くするトランケーションにより、又は変更されたタンパク質をさらに長くし得る融合若しくはドメインシャフリングにより改変され得る。
本明細書で使用されるように、「アミノ分子」とは、当業者には公知であると考えられる任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体又はアミノ酸模倣物のことである。ある種の実施形態では、タンパク質性分子の残基は連続しており、どんな非アミノ酸分子もアミノ分子残基の配列に割り込むことはない。他の実施形態では、配列は１つ又は複数の非アミノ分子部分を含むことがある。特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基の配列は、１つ又は複数の非アミノ分子部分が割り込むことがある。したがって、用語「タンパク質性組成物」は、自然に合成されたタンパク質中の２０の一般的アミノ酸のうちの少なくとも１つ又は少なくとも１つの改変された若しくは珍しいアミノ酸を含むアミノ分子配列を包含する。
タンパク質性組成物は、標準分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質性化合物の単離、又はタンパク質性物質の化学的合成を含む、当業者に公知のどんな技法によっても作製し得る。様々なラブドウイルス遺伝子又はゲノムのヌクレオチド及びポリペプチド配列はすでに開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースに見出し得る。１つのそのようなデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のジェンバンク及びＧｅｎＰｅｔデータベースであり、これはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でインターネットによりアクセスすることが可能である。これらの公知の遺伝子及びウイルスのコード領域は、本明細書に開示される又は当業者に公知であると考えられる技法を使用して増幅する及び／又は発現し得る。
Ｂ．機能的側面
本出願がウイルスタンパク質又はポリペプチドの機能又は活性に言及する場合、他の方法で明確に述べられていなければ、それは生理学的条件下でのウイルスタンパク質又はポリペプチドの活性又は機能に言及することを意味する。たとえば、Ｇタンパク質は、特定の細胞型の結合及び感染の特異性及び効率に関与している。どの分子がこの活性を有するのかの決定は、感染力アッセイ、タンパク質結合アッセイ、プラークアッセイ等などの当業者にはよく知られているアッセイを使用して達成し得る。
Ｃ．ウイルスポリペプチドのバリアント
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、置換、挿入又は欠失バリアントであり得る。ウイルスポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、野生型若しくは非変更ポリペプチド又は他の基準ポリペプチドと比べた場合、ポリペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００又はそれよりも多い非連続若しくは連続アミノ酸（すなわち、セグメント）に影響を与え得る。ラブドウイルスによりコードされる様々なポリペプチドは、本明細書に開示されているウイルスごとにジェンバンク受託番号及び関連する公開データベースエントリーを参照することにより確認することができ、ラブドウイルス科に関連するジェンバンクエントリーはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
欠失バリアントは、天然、非変更又は野生型タンパク質のうちの１つ又は複数の残基を欠く。個々の残基は欠失させることが可能であり、又はドメイン（たとえば、触媒ドメイン若しくは結合ドメイン）のすべて若しくは一部を欠失させることが可能である。停止コドンをコード核酸配列に導入して（置換又は挿入により）トランケートされたタンパク質を作製し得る。挿入変異体は典型的には、ポリペプチドにおける非末端点への物質の付加を含み、特定種の挿入物は、標的タンパク質の関連する部分の代わりに関連するタンパク質の相同な又は類似する部分を含むキメラポリペプチドである。これには、免疫反応性エピトープ又は単に１つ若しくは複数の残基の挿入が含まれ得る。末端付加、典型的には融合タンパク質と呼ばれるが、も作製し得る。
置換バリアントは典型的には、タンパク質内の１つ又は複数の部位での１つのアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含有し、他の機能若しくは特性の喪失とともに又は喪失なしで、ポリペプチドの１つ又は複数の特性を調節するように設計し得る。置換は保存的でもあり得る、すなわち、１つのアミノ酸が類似する形状及び電荷のアミノ酸と置き換えられる。保存的置換は当技術分野では周知であり、たとえば、アラニンからセリン、アルギニンからリジン、アスパラギンからグルタミン又はヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸からアスパラギン酸、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミン、イソロイシンからロイシン又はバリン、ロイシンからバリン又はイソロイシン、リジンからアルギニン、メチオニンからロイシン又はイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又はメチオニン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニン、及びバリンからイソロイシン又はロイシンへの変化が挙げられる。代わりに、置換は、ポリペプチドの機能又は活性が影響を受けるように、非保存的でもよい。非保存的変化は典型的には、非極性又は非荷電アミノ酸に代わって極性又は荷電アミノ酸を、及びその逆などの、残基を化学的に似ていない残基で置き換えることを含む。
用語「機能的に等価なコドン」は、アルギニン又はセリンに対する６個のコドンなどの同じアミノ酸をコードするコドンを指すのに、及び生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンを指すのにも本明細書では使用される（下の表１参照）。
アミノ酸及び核酸配列は、追加のＮ末端アミノ酸若しくはＣ末端アミノ酸又は５’若しくは３’配列などの追加の残基を含み得るが、それでも基本的には、ある種の生物学的活性を有することを含む本明細書に説明される通りであることも理解されるであろう。末端配列の付加は、たとえば、コード領域の５’若しくは３’部分のどちらかに隣接する様々な非コード配列を含み得る、又は遺伝子内に存在することが知られている様々な内部配列、すなわち、イントロンを含み得る核酸配列に特に当てはまる。
以下は、等価な又は改良さえされた分子を作製するためのＮ、Ｐ、Ｌ、Ｍ又はＧタンパク質のアミノ酸の変化に基づく考察である。たとえば、ある種のアミノ酸は、たとえば、抗体の抗原結合領域又は基質分子上の結合部位などの、構造を有する相互作用結合能力のはっきりと認識できる喪失なしでタンパク質構造内の他のアミノ酸の代わりに用い得る。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはそのタンパク質の相互作用能力及び性質であるために、ある種のアミノ酸置換はタンパク質配列において及び根底にあるＤＮＡコード配列において行われるが、類似の特性を有するタンパク質を産生することが可能である。したがって、下で考察されるように、対象の生物学的有用性又は活性のはっきりと認識できる喪失なしで、ラブドウイルスのＤＮＡ配列において様々な変化を行い得ることが発明者らにより企図されている。
そのような変化を加える際に、アミノ酸のハイドロパシー指標を検討することができる。生物学的機能をタンパク質に与える際のハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野では広く理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は得られるタンパク質の二次構造に寄与し、今度はこの二次構造がタンパク質と他の分子、たとえば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を定義することが認められている。
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行うことが可能であることも理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（参照により本明細書に組み込まれる）は、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その近接するアミノ酸の親水性により支配されるが、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられており、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。アミノ酸は類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに用いられ、それでも生物学的に等価な及び免疫学的に等価なタンパク質を産生することが可能である。そのような変化では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換は特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにとりわけ好ましい。
上で概説されたように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、たとえば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。様々な前述の特徴を考慮に入れる例となる置換は当業者には周知であり、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。
ＩＩＩ．核酸分子
本発明は、ウイルスタンパク質又はポリペプチドのすべて又は一部を発現することができる細胞から単離可能なポリヌクレオチドを含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、ある種の特性及び／又は特徴を有するウイルス又はウイルスポリペプチド、たとえば、偽型ポリペプチド若しくはウイルス又はラブドウイルスポリペプチド若しくはウイルスを作製するために特異的に変異した又は変更されたウイルスゲノムのすべて又は一部に関する。ポリヌクレオチドは、ウイルスのアミノ酸配列若しくは異種アミノ酸配列のすべて若しくは一部を含有するペプチド若しくはポリペプチドをコードし得る、又は、そのようなウイルスポリペプチドをコードしていないし、少なくとも１つの機能若しくは活性が付加されている、増加されている、縮小されている、減少されている若しくは欠けているウイルスポリペプチドをコードしていないように操作され得る。組換えタンパク質は発現している細胞から精製されて活性なタンパク質を生じることが可能である。ラブドウイルスメンバーのゲノムは、ＮＣＢＩデータベース中のジェンバンク受託番号に又は類似のデータベースに見出すことができ、ゲノムはそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．天然の又は改変されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本明細書で使用されるように、用語「ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸セグメント」とは、単離されていて全ゲノムＤＮＡ又は他の汚染物質のないＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸分子のことである。したがって、ポリペプチドをコードする核酸セグメントとは、野生型、多形性又は変異体ポリペプチドコード配列を含有するが、ゲノム核酸（複数可）から単離される、又は精製されてゲノム核酸（複数可）がない核酸セグメントのことである。用語「核酸セグメント」に含まれるのは、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドよりも小さい核酸セグメント及び、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等を含む組換えベクターである。
本出願で使用されるように、用語「ラブドウイルスポリヌクレオチド」は、少なくとも１つのラブドウイルスポリペプチドをコードする偽型又はラブドウイルス核酸分子を指すことが可能である。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは単離されていて他の核酸がない。同様に、マラバウイルス、カラジャスウイルス、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスポリヌクレオチドは、他の核酸から単離されているマラバウイルス、カラジャスウイルス、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスポリペプチドをコードする核酸分子のことである。「ラブドウイルスゲノム」又はマラバウイルス、カラジャスウイルス、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスゲノムとは、宿主細胞に提供されて、ヘルパーウイルス又は他の因子をトランスで供給する補完するコード領域の存在下で又は非存在下で、ウイルス粒子を生じることができるＶＳＶ又は核酸分子のことである。ゲノムは、野生型又は非変更ウイルスと比べた場合、組換え的に変異されていても変異されていなくてもよい。
用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてＲＮＡを使用して調製されるＤＮＡのことである。完全な又は部分的なゲノム配列が好まれる場合もあり得る。
所与の種由来の特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するが、にもかかわらず、同じタンパク質をコードする天然のバリアントにより表わされ得ることも企図されている（上の表１参照）。
同様に、単離された若しくは精製された野生型又は改変されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、他の天然に存在する遺伝子又はタンパク質コード配列から実質的に単離された野生型又は変異ポリペプチドコード配列及び、ある種の態様では、調節配列を含むＤＮＡセグメントのことである。この点に関しては、用語「遺伝子」は、簡略化のために、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする核酸単位（正しい転写、翻訳後修飾又は局在化に必要とされるどんな配列でも含む）を指すために使用される。当業者に理解されることになるように、この機能的用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列並びにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質及び変異体を発現する又は発現するように構成され得るさらに小さな操作された核酸セグメントが含まれる。天然の又は改変されたポリペプチドのすべて又は一部をコードする核酸は：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１０９５、１１００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、９０００、１００００、又はそれよりも多いヌクレオチド、ヌクレオシド又は塩基対の連続する核酸を含有し得る。
特定の実施形態では、本発明は、そのアミノ酸配列内に、天然ポリペプチドに一致する又は基本的に対応する連続するアミノ酸配列を含む野生型又は変異ラブドウイルスポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列を組み込んでいる単離された核酸セグメント及び組換えベクターに関する。用語「組換え体」は、ポリペプチド又は特定のポリペプチドの名称と合わせて使用することができ、これは一般に、インビトロで操作されている核酸分子又はそのような分子の複製された産物である核酸分子から産生されるポリペプチドのことである。
他の実施形態では、本発明は、そのアミノ酸配列内に、１つ又は複数のラブドウイルスポリペプチドに一致する又は基本的に対応する連続するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチドをコードする核酸配列を組み込んでいる単離された核酸セグメント及び組換えベクターに関する。
本発明で使用される核酸セグメントは、コード配列自体の長さとは無関係に、その全体の長さがかなり変動するように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメント等などの他の核酸配列と組み合わせ得る。したがって、ほぼどんな長さの核酸断片も用いられ、その全長は好ましくは目的とする組換え核酸プロトコールにおける調製及び使用の容易さにより制限されることが企図されている。
本発明の核酸構築物は、任意の供給源由来の完全長ポリペプチド（複数可）をコードする、又はコード領域の転写物がトランケートバージョンを表すように、ポリペプチド（複数可）のトランケートされた若しくは改変されたバージョン、たとえば、トランケートされたラブドウイルスポリペプチドをコードし得ることが企図されている。次に、トランケートされた転写物はトランケートされたタンパク質に翻訳され得る。代わりに、核酸配列は、たとえば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾又はターゲティング若しくは有効性などの治療効果を可能にする追加の異種コード配列を有する完全長ポリペプチド配列をコードし得る。上で考察されるように、タグ又は他の異種ポリペプチドを、改変されたポリペプチドコード配列に付加することができ、「異種」とは、改変されたポリペプチドと同じではなく、天然に存在するウイルスと会合しているのも、天然に存在するウイルスによりコードされているのも見つかっていないポリペプチド又はそのセグメントのことである。
非限定的例では、ラブドウイルスＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ又はＬ遺伝子などの、特定のウイルスセグメントと同一の又は相補的なヌクレオチドの連続するストレッチを含む１つ又は複数の核酸構築物が調製され得る。核酸構築物は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、から少なくとも１，０００，０００ヌクレオチド長の他にもさらに大きなサイズ、最大で染色体サイズ及び染色体サイズ（すべての中間長及び中間範囲を含む）を含む構築物であり得る。本明細書で使用される「中間長」及び「中間範囲」は、引用された値を含む又は引用された値間の任意の長さ又は範囲（すなわち、そのような値を含む及びそのような値間のすべての整数）を意味することは容易に理解されるであろう。
本発明で使用される核酸セグメントは、改変されたポリペプチドをコードする改変された核酸を包含する。そのような配列は、核酸配列及びこのようにコードされたタンパク質内に天然に存在することが知られているコドン重複性及び機能的同等性の結果として生じ得る。代わりに、機能的に同等性のタンパク質又はペプチドは、交換されているアミノ酸の特性の考察に基づいてタンパク質構造の変化を操作することができる組換えＤＮＡ技術の適用によって作製し得る。人が設計する変化は、部位特異的変異誘発法の適用により導入されて、たとえば、タンパク質の抗原性若しくはその欠如に改良点を導入する、タンパク質を与えられる対象に対してタンパク質の毒性効果をインビボで減少する、又はタンパク質若しくはそのようなタンパク質を含むウイルスを含む任意の治療の有効性を増加させ得る。
ある種の他の実施形態では、本発明は、その配列内に本明細書において同定された（及び／又は参照により組み込まれる）配列中に示される核酸配列由来の連続する核酸配列を含む単離された核酸セグメント及び組換えベクターに関する。しかし、そのような配列は変異されて、野生型に関してその活性が変更されているタンパク質産物を生じ得る。
本発明は、これらの同定された配列の特定の核酸及びアミノ酸配列に限定されないことも理解されるであろう。したがって、組換えベクター及び単離された核酸セグメントは、ラブドウイルスコード領域それ自体、基本コード領域に選択された変更若しくは改変を坦持するコード領域を様々に含み得る、又は核酸セグメントはそれにもかかわらずラブドウイルスコード領域を含むさらに大きなポリペプチドをコードし得る、又は変異アミノ酸配列を有する生物学的に機能的な同等のタンパク質若しくはペプチドをコードし得る。
本発明の核酸セグメントは、ウイルスの治療効果を増加するラブドウイルスの生物学的に機能的な同等物、又はバリアント又は変異体であるラブドウイルスタンパク質又はペプチドをコードすることが可能である。そのような配列は、核酸配列及びこのようにコードされたタンパク質内に天然に存在することが知られているコドン重複性及び機能的同等性の結果として生じ得る。代わりに、機能的に同等性のタンパク質又はペプチドは、交換されているアミノ酸の特性の考察に基づいてタンパク質構造の変化を操作することができる組換えＤＮＡ技術の適用によって作製し得る。人が設計する変化は、部位特異的変異誘発法の適用により導入することができ、たとえば、ウイルスタンパク質の癌細胞結合に改良点を導入する。
Ｂ．ラブドウイルスポリヌクレオチドの変異誘発
様々な実施形態では、ラブドウイルスポリヌクレオチドは変更される又は変異誘発され得る。変更又は変異には、挿入、欠失、点変異、反転等が含まれ得、ある種のタンパク質若しくは分子機構の調節、活性化及び／又は不活化を生じる他にも遺伝子産物の機能、位置若しくは発現を変更する、特に遺伝子産物を非機能的にし得る。ラブドウイルスのすべて又は一部をコードするポリヌクレオチドの変異誘発は、用いられた場合には、種々の標準変異原性法により実現され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１）。変異は、それによって生物の量又は構造に変化が生じるプロセスである。変異は、単一遺伝子のヌクレオチド配列の改変、遺伝子又は全ゲノムのブロックを含むことが可能である。単一遺伝子の変化は、ＤＮＡ配列内の単一ヌクレオチド塩基の除去、付加若しくは置換を伴う点変異の結果であり得、又は多数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失を伴う変化の結果であり得る。
１．ランダム変異誘発
ａ．挿入変異誘発
挿入変異誘発は、公知の核酸断片の挿入による遺伝子の不活化に基づいている。挿入変異誘発はある種の核酸断片の挿入を伴うので、生み出される変異は一般に、機能獲得変異ではなく機能喪失変異である。しかし、機能獲得変異を生み出す挿入の例がいくつかある。挿入変異誘発は、標準分子生物学技法を使用して実現し得る。
ｂ．化学的変異誘発
化学的変異誘発は、様々な程度の表現型重症度を有する全種類の変異を見つける能力などのある種の利点を提供し、実施するのが容易で安価である。大多数の化学発癌剤がＤＮＡに変異を生成する。ベンゾ［ａ］ピレン、Ｎ−アセトキシ−２−アセチルアミノフルオレン及びアフラトキシンＢ１は細菌及び哺乳動物細胞においてＧＣからＴＡへの塩基転換を引き起こす。ベンゾ［ａ］ピレンは、ＡＴからＴＡへのなどの塩基置換も生じることが可能である。Ｎ−ニトロソ化合物は、ＧＣからＡＴへの塩基転換を生じる。ｎ−ニトロソウレアへの曝露により誘導されるチミンのＯ４位のアルキル化により、ＴＡからＣＧへの塩基転換を生じる。
ｃ．放射線変異誘発
生体分子は電離放射線により分解される。入射エネルギーの吸着によりイオン及びフリーラジカルが形成され一部の共有結合が切断される。放射線損傷に対する感受性は分子間で、同じ分子の異なった結晶形間できわめて変化しやすいように思われる。感受性は全蓄積線量に、及び線量率（フリーラジカルが存在すると、それが引き起こす分子損傷はフリーラジカルの自然な拡散速度に、したがって実時間に依拠するので）にも依拠する。損傷は試料をできる限り冷やすことにより減少され抑制される。電離放射線は、一般に線量率に比例してＤＮＡ損傷を引き起こす。
本発明では、用語「電離放射線」は、十分なエネルギーを有する又は電離（電子を獲得する若しくは失う）を生じるのに十分なエネルギーを生み出すことが可能な粒子又は光子を含む放射線を意味する。例となる好ましい電離放射線はＸ線である。所与の細胞において又は特定の分子のために必要な電離放射線の量は一般に、その細胞若しくは分子の性質又は変異標的の性質に依存する。放射線の有効量を決定するための手段は当技術分野では周知である。
ｄ．インビトロ走査変異誘発
ランダム変異誘発はまたエラープローンＰＣＲを使用して導入し得る。変異誘発の速度は、鋳型の希釈を用いた複数のチューブにおいてＰＣＲを実施することにより増加し得る。１つの特に有用な変異誘発法は、側鎖相互作用の喪失の効果を決定することができ、同時にタンパク質高次構造における大規模な混乱の危険性を最小限に抑えるように、いくつかの残基をアミノ酸アラニンで個別に置き換えるアラニン走査変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
インビトロ走査飽和変異誘発は、（ｉ）リガンド結合特異性を調節する残基の同定、（ｉｉ）活性を保持するアミノ酸及び所与の位置で活性を無効にするアミノ酸の同定に基づくリガンド結合のより良い理解、（ｉｉｉ）活性部位又はタンパク質サブドメインの全体的可塑性の評価、（ｉｖ）結合の増加をもたらすアミノ酸置換の同定を含む大量の構造機能情報を得るための迅速な方法を提供する。
２．部位特異的変異誘発
構造誘導部位特異的変異誘発は、タンパク質−リガンド相互作用の精査及び操作のための強力なツールを表す（Ｗｅｌｌｓ、１９９６；Ｂｒａｉｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。技法は、選択されたＤＮＡに１つ又は複数のヌクレオチド配列変化を導入することによる配列バリアントの調製及び試験を提供する。
Ｃ．ベクター
ラブドウイルスゲノムに変異を発生させるために、天然の及び改変されたポリペプチドはベクターに含まれる核酸分子によりコードされ得る。用語「ベクター」は、外来性核酸配列を複製することができる細胞に導入するために外来性核酸配列を挿入することが可能な担体核酸分子を指すのに使用される。核酸配列は「外来性」であることが可能であり、これは、核酸配列がベクターが導入されようとしている細胞にとって外来性であり、又は該配列が細胞内の配列に相同であるが、宿主細胞核酸内の配列が通常では存在しない位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス及び植物ウイルス）並びに人工染色体（たとえば、ＹＡＣ）が含まれる。当業者であれば、標準組換え技法によりベクターを構築する知識を身に付けているであろう。それらの技法はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載されており、両方の文献は参照により本明細書に組み込まれる。
改変されたＮタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｇタンパク質又はＬタンパク質などの改変されたポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグ又はターゲティング分子などの非改変ポリペプチド配列をコードし得る。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．、１９８５）、一連のヒスチジンをコードするベクター並びに後の精製及び分離又は切断のためのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の作製に使用するためのｐＧＥＸベクターが含まれる。ターゲティング分子は、改変されたポリペプチドを、対象の身体内の特定の器官、組織、細胞又は他の位置に向ける分子である。代わりに、ターゲティング分子は、ある種の細胞型、たとえば、癌細胞のために、ラブドウイルスなどの生物のトロピズムを変更する。
用語「発現ベクター」とは、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターのことである。いくつかの場合に、ＲＮＡ分子はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、たとえば、アンチセンス分子又はリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含有することが可能であり、この用語は、特定の宿主生物内の作動可能に連結されたコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列のことである。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も同様に果たし下に記載されている核酸配列を含有し得る。
１．プロモーター及びエンハンサー
「プロモーター」は、核酸配列のうち転写開始及び転写速度が制御される領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子に結合する遺伝エレメントを含有し得る。語句「作動可能的に位置している」、「作動可能的に共役している」、「作動可能的に連結している」、「制御下の」及び「転写制御下の」は、プロモーターが、その配列の転写開始及び／又は発現を制御する核酸配列に関して正確な機能的位置及び／又は配向にあることを意味する。プロモーターは「エンハンサー」と合わせて使用されても使用されなくてもよく、この用語は核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列のことである。
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られるような、遺伝子又は配列に天然に付随しているプロモーターであってよい。そのようなプロモーターは、「内在性」と呼ぶことが可能である。同様に、エンハンサーはその配列の下流又は上流のどちらかに位置している核酸配列と天然に付随しているエンハンサーであってよい。代わりに、コード核酸セグメントを、その自然環境においては核酸配列と通常は付随していないプロモーターのことである組換え又は異種プロモーターの制御下に置くことによりある種の利点が得られることになる。組換え又は異種エンハンサーも、その自然環境においては核酸配列と通常は付随していないエンハンサーのことである。そのようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び他の任意の原核細胞、ウイルス細胞又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然には存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／又は発現を変更する変異を含有するプロモーター又はエンハンサーが含まれ得る。
プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、本明細書に開示される組成物に関連して、組換えクローニング及び／又はＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して配列を生成し得る（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号参照、これら特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体等などの非核オルガネラ内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も同様に用いられることが企図されている。
当然ではあるが、発現のために選択された細胞型、オルガネラ及び生物における核酸セグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを用いることが重要であり得る。分子生物学の当業者であれば、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー及び細胞型の組合せの使用を知っており、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。用いられるプロモーターは、構成的、組織特異的、細胞選択的（すなわち、他の細胞と比べてある細胞型でのほうが高活性である）、誘導性並びに／又は、組換えタンパク質及び／若しくはペプチドの大規模生産において有利であるなどの導入された核酸セグメントの高レベル発現を指示するのに適した条件下で有用であり得る。プロモーターは異種でも内在性でもよい。
本発明の状況において、遺伝子の発現を調節するいくつかのエレメント／プロモーターを用い得る。この一覧は、発現の促進に関与する可能な限りのあらゆるエレメントを網羅することではなく、単にその例となることを目的としている。特定の刺激に応答して活性化することが可能な核酸配列の領域である誘導性エレメントの例も提供される。プロモーター／エンハンサー（参考文献）には、免疫グロブリン重鎖（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｇｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ａｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６、１９８７；Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８４；Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｐｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、免疫グロブリン軽鎖（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９８４）、Ｔ細胞受容体（Ｌｕｒｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｒｅｄｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、ＨＬＡ ＤＱ α及び／又はＤＱ β（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、βインターフェロン（Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、インターロイキン−２（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、インターロイキン−受容体（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、ＭＨＣクラスＩＩ ５（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ＭＨＣ クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲα（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、β−アクチン（Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）（Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｈｏｒｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、プレアルブミン（トランスサイレチン）（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、エラスターゼＩ（Ｏｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）（Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｃｕｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、コラゲナーゼ（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、アルブミン（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｔｒｏｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９、１９９０）、α−フェトプロテイン（Ｇｏｄｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｃａｍｐｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、γ−グロビン（Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｐｅｒｅｚ−Ｓｔａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、β−グロビン（Ｔｒｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、ｃ−ｆｏｓ（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、ｃ−ＨＡ−ラス（Ｔｒｉｅｓｍａｎ、１９８６；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．、１９８５）、インスリン（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．、１９８５）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）（Ｈｉｒｓｈ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、α１−アンチトリプシン（Ｌａｔｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、マウス及び／又はＩ型コラーゲン（Ｒｉｐｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４及びＧＲＰ７８）（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ラット成長ホルモン（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６）、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）（Ｅｄｂｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、トロポニンＩ（ＴＮ Ｉ）（Ｙｕｔｚｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（Ｐｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（Ｋｌａｍｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９９０）、ＳＶ４０（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｓｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｆｉｒａｋ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｉｍｂｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｋａｄｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｏｎｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｋｕｈｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、ポリオーマ（Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９７５；Ｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．、１９８０；Ｋａｔｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．、１９８０、１９８１；Ｔｙｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｄａｎｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ．、１９８３；ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９８４；Ｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｓａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、レトロウイルス（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８２、１９８３；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８２；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３、１９８４ａ、ｂ、１９８８；Ｂｏｓｚｅ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｍｉｋｓｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｃｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｔｈｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｃｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｃｈｏｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｒｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、．１９８９）、パピローマウイルス（Ｃａｍｐｏ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｅ、１９８３；Ｓｐａｌｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｃｒｉｐｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｇｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、ヘパティティスＢウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）（Ｂｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｊａｍｅｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｓｈａｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｓｐａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｖａｎｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、ヒューマンイムノデフィシェンシーウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（Ｍｕｅｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｈａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｂｅｒｋｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｌａｓｐｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８４；Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８６）並びにギボンエイプロイケミアウイルス（Ｇｉｂｂｏｎ Ａｐｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）が含まれる。
誘導性エレメント（エレメント／インデューサー（参考文献））には、ＭＴ ＩＩ／ホルボールエステル（ＴＮＦＡ）、重金属（Ｐａｌ ｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８２；Ｈａｓ ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｓｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｍａｇａｎａ ｅｔ ａｌ、１９８７；Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７ｂ；ＭｃＮｅａｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ＭＭＴＶ（マウスママリーツーモアウイルス（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ））／グルココルチコイド（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｍａｊｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９８４；Ｐｏｎｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、β−インターフェロン／ポリ（ｒＩ）ｘ、ポリ（ｒｃ）（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３）、アデノウイルス５ Ｅ２／Ｅ１Ａ （Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８４）、コラゲナーゼ／ホルボールエステル（ＴＰＡ）（Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７ａ）、ストロメライシン／ホルボールエステル（ＴＰＡ）（Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７ｂ）、ＳＶ４０／ホルボールエステル（ＴＰＡ）（Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７ｂ）、マウスＭＸ遺伝子／インターフェロン、ニューキャッスル病ウイルス（Ｈｕｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、ＧＲＰ７８ 遺伝子／Ａ２３１８７（Ｒｅｓｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、α−２−マクログロブリン／ＩＬ−６（Ｋｕｎｚ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ビメンチン／血清（Ｒｉｔｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ＭＨＣクラスＩ遺伝子 Ｈ−２κｂ／インターフェロン（Ｂｌａｎａｒ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、ＨＳＰ７０／Ｅ１Ａ、ＳＶ４０大Ｔ抗原（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．、１９８９、１９９０ａ、１９９０ｂ）、プロリフェリン／ホルボールエステル−ＴＰＡ（Ｍｏｒｄａｃｑ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、腫瘍壊死因子／ＰＭＡ（Ｈｅｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）及び甲状腺刺激ホルモンα遺伝子／甲状腺ホルモン（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）が含まれる。
組織特異的又は組織選択的（すなわち、別の細胞と比べた場合ある細胞でのほうが大きな活性を有するプロモーター）プロモーター又はエレメントの同一性の他にもその活性を特徴付けるアッセイは、当業者には周知である。そのような領域の例には、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９９）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．１９９８）、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９８）、Ｄ１Ａドパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９７）、インスリン様増殖因子ＩＩ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９７）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）及びＳＭ２２αプロモーターが含まれる。
本発明と組み合わせて使用することが可能である追加のウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー及び誘導性プロモーター／エンハンサーは本明細書に収載されている。さらにいかなるプロモーター／エンハンサー組合せ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢの通りに）でも、オリゴ糖プロセシング酵素、タンパク質フォールディングアクセサリータンパク質、選択可能マーカータンパク質又は対象の異種タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を推進するために使用することが可能である。代わりに、癌遺伝子療法（表２）又は腫瘍のターゲティング（表３）のための組織特異的プロモーターは、本発明の核酸分子と一緒に用い得る。
２．開始シグナル及び内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもコード配列の効率的翻訳のために必要とされることがある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接する配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む、外来性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者であればこれを決定して必要なシグナルを提供することは容易にできるであろう。開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするには所望のコード配列のリーディングフレームの「インフレーム」でなければならない。外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然のものでも合成のものでも可能である。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを包含することにより増強され得る。
本発明のある種の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して多重遺伝子又はポリシストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して配列内部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルス族の２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）の他に哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ、１９９１）も記載されている。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結することが可能である。多重オープンリーディングフレームは一緒に転写させ、それぞれがＩＲＥＳにより分離されており、ポリシストロン性メッセージを作り出すことが可能である。ＩＲＥＳエレメントのせいで、各オープンリーディングフレームは効率的翻訳のためにリボソームに到達可能である。多重遺伝子は、単一メッセージを転写する単一プロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現することが可能である（米国特許第５，９２５，５６５号及び米国特許第５，９３５，８１９号参照、これら特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
３．マルチクローニング部位
ベクターはマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことが可能であり、この部位はベクターを消化するために標準組換え技術と合わせてどれでも使用することができる複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８及びＣｏｃｅａ、１９９７参照、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断のことである。これらの制限酵素の多くが市販されている。そのような酵素の使用は当業者により広く理解されている。ベクターは、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して直線化される又は断片化されて、外来性配列をベクターにライゲートさせることができるようになる場合が多い。「ライゲーション」とは、互いに連続していてもしていなくてもよい２つの核酸断片間にリン酸ジエステル結合を形成するプロセスのことである。制限酵素及びライゲーション反応を含む技法は、組換え技術分野の当業者には周知である。
４．終結シグナル
本発明のベクター又は構築物は、一般に少なくとも１つの終結シグナルを含むことになる。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終結に関与するＲＮＡ配列で構成されている。したがって、ある種の実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終わらせる終結シグナルが企図されている。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するのにインビボで必要になることがある。
ラブドウイルスを含む、マイナスセンスＲＮＡウイルスでは、終結はＲＮＡモチーフにより規定される。
本発明における使用のために企図されているターミネーターには、たとえば、たとえば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、又はたとえば、ＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス終結配列を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の又は当業者には公知のどんな転写ターミネーターでも含まれる。ある種の実施形態では、終結シグナルは、配列トランケーションのせいでなどの転写可能な又は翻訳可能な配列が欠けていることがあり得る。
５．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物発現では、発現には典型的に、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが含まれることになる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実行に成功することにきわめて重要であるとは考えられていない、及び／又はそのような配列はいずれも用いられ得る。好ましい実施形態には、便利であり及び／又は様々な標的細胞においてよく機能することが知られているＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び／又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は転写物の安定性を高め得る又は細胞質輸送を促進し得る。
６．複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖するために、ベクターは、複製が開始される特定の核酸配列である１つ又は複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）を含有し得る。代わりに、宿主細胞が酵母の場合には、自己複製配列（ＡＲＳ）を用いることが可能である。
７．選択可能及びスクリーニング可能なマーカー
本発明のある種の実施形態では、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、発現ベクターにマーカーを含むことによりインビトロ又はインビボで同定し得る。そのようなマーカーがあれば細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞を容易に同定することができると考えられる。一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。正の選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであり、負の選択可能マーカーはその存在がその選択を妨げるマーカーである。正の選択可能マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含むと、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、たとえば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は有用な選択可能マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、その基礎が比色分析である、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーも企図されている。代わりに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔＫ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を利用し得る。当業者であれば、多分ＦＡＣＳ分析と合わせて、免疫マーカーを用いる方法も知っているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であるとは考えられていない。選択可能及びスクリーニング可能なマーカーの追加の例は当業者には周知である。
Ｄ．宿主細胞
本明細書で使用されるように、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は互換的に使用し得る。これらの用語はすべて、ありとあらゆるその後の世代であるその子孫も含む。計画的な又は偶発性の変異のせいで、すべての子孫が同一というわけではないことは理解されている。異種核酸配列を発現させるという状況では、「宿主細胞」とは、原核細胞又は真核細胞のことであり、ベクターを複製する及び／又はベクターによってコードされた異種遺伝子を発現させることができるいかなる形質転換性生物も含まれる。宿主細胞は、（外来性ポリペプチドを発現しなければベクターとしての資格はない）ベクター又はウイルスのレシピエントとして使用することが可能であり、これまで使用されてきた。宿主細胞は「トランスフェクト」される又は「形質転換」され得、これら用語は、改変されたタンパク質コード配列などの外来性核酸が宿主細胞に移入される又は導入されるプロセスのことである。形質転換された細胞には、最初の対象細胞及びその子孫が含まれる。
宿主細胞は、所望の結果がベクターの複製であるのかベクターにコードされた核酸配列の一部若しくはすべての発現であるのかに応じて、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物由来であってよい。数多くの細胞株及び培養物が宿主細胞としての使用に利用することが可能であり、生きた培養物及び遺伝子材料のための保管所としての役割を果たす組織（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）であるアメリカ培養細胞株保存機関（ＡＴＣＣ）を通じて入手することが可能である。適切な宿主は、当業者であればベクターの骨格及び所望の結果に基づいて決定することが可能である。たとえば、プラスミド又はコスミドは、多くのベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することが可能である。ベクター複製及び／又は発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞には、ＤＨ５α、ＪＭ１０９及びＫＣ８の他にもＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞及びＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）ゴールド細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などのいくつかの市販の細菌宿主が含まれる。代わりに、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２などの細菌細胞はファージウイルスの宿主細胞として使用することが可能である。適切な酵母細胞には、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）及びピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。
ベクターの複製及び／又は発現のための真核宿主細胞の例には、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ及びＰＣ１２が含まれる。様々な細胞型及び生物由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者には知られていると考えられる。同様に、ウイルスベクターは、真核宿主細胞又は原核宿主細胞のどちらか、特にベクターの複製又は発現に対して許容的である細胞と合わせて使用し得る。
一部のベクターは、それが原核細胞でも真核細胞でも複製される及び／又は発現されるのを可能にする制御配列を用い得る。当業者であれば、上記の宿主細胞すべてをインキュベートして、維持しベクターの複製を可能にする条件をさらに理解していると考えられる。ベクターの大規模生産の他にもベクターによりコードされている核酸及びその同族ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの生産を可能にすると考えられる技法及び条件も理解され知られている。
Ｅ．発現系
上で考察された組成物の少なくともすべて又は一部を含む数多くの発現系が存在する。原核生物及び／又は真核生物ベースの系は、本発明と一緒に使用するために用いて、核酸配列又はその同族ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを産生することが可能である。多くのそのような系は、市販されており広く入手可能である。
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、米国特許第５，８７１，９８６号及び米国特許第４，８７９，２３６号（これら特許文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているなどの異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生じることが可能であり、たとえば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）からＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０の商品名で及びＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）からＢＡＣＰＡＣＫ（商標）ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭの商品名で購入することができる。
本発明の開示された発現系に加えて、発現系の他の例には、合成エクジソン誘導性受容体を含むＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）誘導性哺乳動物発現系又はそのｐＥＴ発現系、大腸菌発現系が含まれる。誘導性発現系の別の例はＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手可能であり、これはＴ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系、すなわち、完全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導性哺乳動物発現系を坦持している。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）は、ピキアメタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現系と呼ばれる酵母発現系も供給しており、この系はメチロトローフ酵母ピキアメタノリカにおける組換えタンパク質の高レベル産生を目的としている。当業者であれば、核酸配列又はその同族ポリペプチド、タンパク質若しくはペプチドを生成するために発現構築物などのベクターを発現させる方法は知っていると考えられる。
Ｆ．核酸検出
ポックスウイルスタンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドの発現を指示する際のその使用に加えて、本明細書に開示される核酸配列は他にも種々の使用法がある。たとえば、本明細書に開示される核酸配列には、核酸ハイブリダイゼーションを含む実施形態のためのプローブ又はプライマーとしての有用性がある。核酸配列は、本発明の診断法又はスクリーニング法において使用し得る。ラブドウイルス又はラブドウイルスポリペプチドモジュレーターをコードする核酸の検出は本発明に包含されている。
１．ハイブリダイゼーション
１３から１００ヌクレオチド、好ましくは１７から１００ヌクレオチドの長さ、又は本発明のいくつかの態様では、最大１〜２キロ塩基若しくはそれよりも多い長さのプローブ又はプライマーを使用すれば、安定でもあり選択性でもある二重鎖分子の形成が可能になる。得られるハイブリッド分子の安定性及び／又は選択性を増加するには、２０塩基の長さよりも大きな連続するストレッチにわたり相補的配列を有する分子が一般に好まれる。ハイブリダイゼーションのためには、２０から３０ヌクレオチド、又は望まれる場合にはさらに長い１つ若しくは複数の相補的配列を有する核酸分子を設計するほうが一般に好まれるであろう。そのような断片は、たとえば、化学的手段により断片を直接合成することによって、又は選択された配列を組換え産生のための組換えベクター内に導入することによって、容易に調製し得る。
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡの相補的ストレッチを用いて二重鎖分子を選択的に形成する又は試料由来のＤＮＡ若しくはＲＮＡの増幅にプライマーを供給するその能力のせいで使用し得る。想定される適用に応じて、標的配列に対するプローブ又はプライマーの異なる程度の選択性を達成するためには異なるハイブリダイゼーション条件を用いたくなるであろう。
高選択性を必要とする適用では、比較的高い厳密性の条件を用いてハイブリッドを形成したいと典型的には望むことになる。たとえば、約５０℃から約７０℃の温度で約０．０２Ｍから約０．１０Ｍ ＮａＣｌにより提供されるなどの比較的低い塩及び／又は高温度条件である。そのような高厳密性条件は、プローブ又はプライマーと鋳型又は標的鎖間のミスマッチをたとえあってもほとんど許容しないし、特定の遺伝子を単離するのに又は特定のｍＲＮＡ転写物を検出するのに特に適していると考えられる。条件は、増加する量のホルムアミドを添加することによりさらに厳密にすることが可能である。
ある種の適用、たとえば、部位特異的変異誘発では、より低い厳密性条件のほうが好まれることは認識されている。これらの条件下では、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする鎖の配列が完全に相補的ではなく、１つ又は複数の位置でミスマッチしていても、起こり得る。条件は、塩濃度を増加する及び／又は温度を下げることにより厳密性を低くし得る。たとえば、中程度の厳密性条件は、約３７℃から約５５℃の温度で約０．１から０．２５Ｍ ＮａＣｌにより提供され、低厳密性条件は、約２０℃から約５５℃の範囲の温度で約０．１５Ｍから約０．９Ｍ 塩により提供され得る。ハイブリダイゼーション条件は、所望の結果に応じて、容易に操作することが可能である。
他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、たとえば、およそ２０℃から約３７℃の温度で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭジチオスレイトールの条件下で達成され得る。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、およそ４０℃から約７２℃の範囲の温度で、およそ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むことができるであろう。
ある種の実施形態では、本発明の定義された配列の核酸を、ハイブリダイゼーションを判定するための標識などの適切な手段と組み合わせて用いるのが有利になる。検出することが可能である蛍光、放射性、酵素的又はアビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む、多種多様な適切な指標手段は当技術分野では公知である。好ましい実施形態では、放射性又は他の環境に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識又はウレアーゼ、アルカリホスファターゼ若しくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることを望み得る。酵素タグの場合、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、視覚的に又は分光光度的に検出可能である検出手段を提供するのに用いることが可能である比色指示基質は公知である。
一般に、本明細書に記載されるプローブ又はプライマーは、対応する遺伝子の発現を検出するための、ＰＣＲ（商標）の場合と同じように、溶液ハイブリダイゼーションにおいての他に固相を用いる実施形態においても、試薬として有用になることが想定されている。固相を含む実施形態では、試験ＤＮＡ（又はＲＮＡ）は選択されたマトリックス又は表面に吸着される又は別の方法で付着される。次に、この固定された一本鎖核酸は、所望の条件下で選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供される。選択された条件は特定の状況に依拠することになる（たとえば、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ等に応じて）。対象の特定の適用のためのハイブリダイゼーション条件の最適化は当業者には周知である。ハイブリダイズした分子を洗浄して非特異的結合プローブ分子を取り除いた後、結合した標識の量を決定することによりハイブリダイゼーションは検出され及び／又は定量化される。代表的固相ハイブリダイゼーション法は、米国特許第５，８４３，６６３号、米国特許第５，９００，４８１号及び米国特許第５，９１９，６２６号に開示されている。本発明の実行において使用し得る他のハイブリダイゼーション法は、米国特許第５，８４９，４８１号、米国特許第５，８４９，４８６号及び米国特許第５，８５１，７７２号に開示されている。これらの特許のうちの関連する部分及び本明細書の本セクションにおいて特定される他の参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
２．核酸の増幅
増幅のための鋳型として使用される核酸は、標準的方法論に従って細胞、組織又は他の試料から単離され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１）。ある種の実施形態では、鋳型核酸を実質的には精製せずに全細胞又は組織ホモジネート又は生物学的液体試料上で分析は実施される。核酸はゲノムＤＮＡ又は分画された若しくは全細胞ＲＮＡでもよい。ＲＮＡが使用される場合、先ずＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換するのが望ましいことがある。
本明細書で使用される用語「プライマー」は、鋳型依存性プロセスにおいて新生核酸の合成を刺激することができるいかなる核酸も包含することが意図されている。典型的には、プライマーは１０から２０及び／又は３０塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであるが、もっと長い配列を用いることが可能である。プライマーは二本鎖及び／又は一本鎖形態で供給され得るが、一本鎖形態のほうが好ましい。
本明細書で同定された遺伝子の配列に対応する核酸に選択的にハイブリダイズするよう設計されたプライマーの対を、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で鋳型核酸に接触させる。所望の適用に応じて、プライマーに完全に相補的である配列へのハイブリダイゼーションのみを許すことになる高厳密性ハイブリダイゼーション条件を選択し得る。他の実施形態では、プライマー配列との１つ又は複数のミスマッチを含有する核酸の増幅を可能にする減少された厳密性下でハイブリダイゼーションは起こり得る。ハイブリダイズすると、鋳型プライマー複合体は、鋳型依存性核酸合成を促進する１つ又は複数の酵素に接触させる。複数回の増幅は、「サイクル」とも呼ばれるが、十分な量の増幅産物が生成されるまで行われる。
いくつかの鋳型依存性プロセスは、所与の鋳型試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅させるのに利用可能である。もっともよく知られている増幅法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，８００，１５９号並びにＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８に詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（商標）と呼ばれる）であり、これら文献はそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
増幅されたｍＲＮＡの量を定量化するためには逆転写酵素ＰＣＴ（商標）増幅法を実施してもよく、周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１；国際公開第９０／０７６４１号パンフレット及び米国特許第５，８８２，８６４号参照）。
別の増幅法はリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）であり、欧州特許出願第３２０３０８号に開示されている。この特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。米国特許第４，８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列に結合させるためのＬＣＲに類似する方法を記載している。米国特許第５，９１２，１４８号に開示されているＰＣＲ（商標）及びオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ（ＯＬＡ）に基づく方法も使用し得る。本発明の実行に使用し得る標的核酸配列の増幅のための別の方法は、米国特許第５，８４３，６５０号、米国特許第５，８４６，７０９号、米国特許第５，８４６，７８３号、米国特許第５，８４９，５４６号、米国特許第５，８４９，４９７号、米国特許第５，８４９，５４７号、米国特許第５，８５８，６５２号、米国特許第５，８６６，３６６号、米国特許第５，９１６，７７６号、米国特許第５，９２２，５７４号、米国特許第５，９２８，９０５号、米国特許第５，９２８，９０６号、米国特許第５，９３２，４５１号、米国特許第５，９３５，８２５号、米国特許第５，９３９，２９１号及び米国特許第５，９４２，３９１号、英国特許出願第２２０２３２８号に、並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に開示されており、これら特許文献はそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されているＱベータレプリカーゼも、本発明において増幅法として使用し得る。Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）により記載されている等温増幅も使用することが可能である。米国特許第５，９１６，７７９号に開示されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）も同様に使用可能である。
他の核酸増幅法には、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲを含む、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）が含まれる（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．、１９８９；国際公開第８８／１０３１５号パンフレット、これら文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。欧州特許出願第３２９８２２号は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を周期的に合成することを含む核酸増幅プロセスを開示しており、これは本発明に従って使用し得る。
国際公開第８９／０６７００号パンフレット（参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）は、プロモーター領域／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションそれに続く配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。他の増幅法には、「ＲＡＣＥ」及び「ワンサイディッド（ｏｎｅｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」が含まれる（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０；Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
３．核酸の検出
任意の増幅に続いて、増幅産物を鋳型及び／又は過剰なプライマーから分離する及び／又は単離することが望ましいこともある。一実施形態では、増幅産物は、標準法を使用してアガロース、アガロースアクリルアミド又はポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１）。
核酸の分離は、当技術分野で公知のクロマトグラフ法によっても実施され得る。吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシルアパタイト、分子ふるい、逆相、カラム、ペーパー、薄層及びガスクロマトグラフィーの他にもＨＰＬＣを含む、本発明の実行において使用し得る多くの種類のクロマトグラフィーが存在する。
典型的な視覚化法には、臭化エチジウムを用いるゲルの染色、ＵＶ光下でのバンドの視覚化が含まれる。代わりに、増幅産物が放射性標識又は蛍光定量的標識ヌクレオチドで一体的に標識されている場合、分離された増幅産物は、Ｘ線フィルムに曝露される又は適切な興奮性スペクトル下で視覚化されることが可能である。
特定の実施形態では、検出はサザンブロッティング及び標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによる。サザンブロッティングに関与する技法は当業者には周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１参照）。前述のものの１つの例は、自動化電気泳動及び核酸の移動のための装置及び方法を開示している米国特許第５，２７９，７２１号に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実行において使用し得る他の核酸検出法は、米国特許第５，８４０，８７３号、米国特許第５、８４３，６４０号、米国特許第５，８４３，６５１号、米国特許第５，８４６，７０８号、米国特許第５，８４６，７１７号、米国特許第５，８４６，７２６号、米国特許第５，８４６，７２９号、米国特許第５，８４９，４８７号、米国特許第５，８５３，９９０号、米国特許第５，８５３，９９２号、米国特許第５，８５３，９９３号、米国特許第５，８５６，０９２号、米国特許第５，８６１，２４４号、米国特許第５，８６３，７３２号、米国特許第５，８６３，７５３号、米国特許第５，８６６，３３１号、米国特許第５，９０５，０２４号、米国特許第５，９１０，４０７号、米国特許第５，９１２，１２４号、米国特許第５，９１２，１４５号、米国特許第５，９１９，６３０号、米国特許第５，９２５，５１７号、米国特許第５，９２８，８６２号、米国特許第５，９２８，８６９号、米国特許第５，９２９，２７７号、米国特許第５，９３２，４１３号及び米国特許第５，９３５，７９１号に開示されており、これら特許文献のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
４．他のアッセイ
たとえば、ゲノム核酸、ｃＤＮＡ及び／又はＲＮＡ試料中の変異を検出する遺伝子スクリーニングのための他の方法は、本発明の範囲内で使用し得る。点変異を検出するのに使用される方法には、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（「ＤＧＧＥ」）、制限断片長多型解析（「ＲＦＬＰ」）、化学的又は酵素的切断法、ＰＣＲ（商標）により増幅された標的領域の直接塩基配列決定法（上記参照）、一本鎖高次構造多型解析（「ＳＳＣＰ」）及び当技術分野で周知の他の方法が含まれる。点変異を求めてスクリーニングする１つの方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖における塩基対ミスマッチのＲＮアーゼ切断に基づいている。本明細書で使用されるように、用語「ミスマッチ」は、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＤＮＡ分子における１つ又は複数の不対又はミスペアドヌクレオチドの領域として定義される。したがって、この定義には、挿入／欠失変異の他にも単一又は複数の塩基点変異によるミスマッチが含まれる（たとえば、米国特許第４，９４６，７７３号参照）。本発明の実行において使用し得る欠失、挿入又は置換変異の検出のための別の方法は、米国特許第５，８４９，４８３号、米国特許第５，８５１，７７０号、米国特許第５，８６６，３３７号、米国特許第５，９２５，５２５号及び米国特許第５，９２８，８７０号に開示されており、これら特許文献のそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
Ｇ．遺伝子移入の方法
本発明の組成物の発現を実施する核酸送達のための適切な方法は、本明細書に記載されるように又は当業者に知られていると考えられるように、核酸（たとえば、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むＤＮＡ若しくはＲＮＡ）をオルガネラ、細胞、組織又は生物中に導入することができる実質的にどんな方法でも含むと考えられている。そのような方法には、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる）を含む注入（米国特許第５，９９４，６２４号、米国特許第５，９８１，２７４号、米国特許第５，９４５，１００号、米国特許第５，７８０，４４８号、米国特許第５，７３６，５２４号、米国特許第５，７０２，９３２号、米国特許第５，６５６，６１０号、米国特許第５，５８９，４６６号及び米国特許第５，５８０，８５９号、それぞれの特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）により、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）により、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０）により、ＤＥＡＥデキストラン続いてポリエチレングリコールを使用する（Ｇｏｐａｌ、１９８５）ことにより、直接超音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８７）により、リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．、１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．、１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）により、微粒子銃（国際公開第９４／０９６９９号パンフレット及び国際公開第９５／０６１２８号パンフレット；米国特許第５，６１０，０４２号、米国特許第５，３２２，７８３号、米国特許第５，５６３，０５５号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８７７号及び米国特許第５，５３８，８８０号、各文献は参照により本明細書に組み込まれる）により、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌により（Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号及び米国特許第５，４６４，７６５号、各文献は参照により本明細書に組み込まれる）、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号及び米国特許第５，５６３，０５５号、それぞれの特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）により、又はプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号及び米国特許第４，９５２，５００号、それぞれの文献は参照により本明細書に組み込まれる）により、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．、１９８５）によりなどの核酸の直接送達が含まれるが、これらに限定されない。これらの技法などの技法の適用を通じて、オルガネラ（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）又は生物（複数可）は、安定的に又は一過性に形質転換され得る。
Ｈ．脂質成分及び部分
ある種の実施形態では、本発明は、核酸、ペプチドなどのアミノ酸分子又は別の小分子化合物と会合している１つ又は複数の脂質を含む組成物に関する。本明細書で考察される実施形態のいずれにおいても、分子は、ラブドウイルスポリペプチド又はラブドウイルスポリペプチドモジュレーターのどちらでもよく、たとえば、ラブドウイルスポリペプチドのすべて若しくは一部をコードする核酸、又は代わりにラブドウイルスポリペプチドモジュレーターのすべて若しくは一部をコードするアミノ酸分子でもよい。脂質は、特徴的に水に不溶性であり有機溶媒を用いて抽出可能である物質である。特に本明細書に記載されている化合物以外の化合物は、脂質として当業者には理解されており、本発明の組成物及び方法に包含されている。脂質成分及び非脂質は、共有結合的にも非共有結合的にも互いに付着し得る。
脂質は天然に存在するものでも合成（すなわち、ヒトにより設計された又は作製された）でもよい。しかし、脂質は通常、生体物質である。生体脂質は当技術分野では周知であり、たとえば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、サルファタイド、エーテルとエステル連結脂肪酸を有する脂質及び重合性脂質並びにその組合せが含まれる。
脂質と会合している核酸分子又はペプチドなどのアミノ酸分子は、脂質を含有する溶液中に分散している、脂質と共に溶解している、脂質と共に乳化している、脂質と混合している、脂質に結合している、脂質に共有結合している、懸濁液として脂質中に含有される、又は他の方法で脂質に会合していてもよい。本発明の脂質又は脂質／ウイルスの会合した組成物は、いかなる特定の構造にも限定されない。たとえば、脂質又は脂質／ウイルスの会合した組成物は、溶液中に単に分散していて、多分サイズも形状も均一ではないアグリゲートを形成していてもよい。別の例では、脂質又は脂質／ウイルスの会合した組成物は、ミセルとして二分子層構造中に又は「崩壊した」構造と一緒に存在していてもよい。別の非限定的例では、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）−ポックスウイルス又はスーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）−ウイルス複合体も企図されている。
ある種の実施形態では、脂質組成物は、特定の脂質、脂質型又は薬物、タンパク質、糖、核酸若しくは本明細書に開示される若しくは当業者には公知であると考えられる他の物質などの非脂質成分の約１％、約２％、約３％、約４％約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又はその中で導き出せるいかなる範囲でも含み得る。非限定的例では、脂質組成物は、約１０％から約２０％の中性脂肪、及び約３３％から約３４％のセレブロシド及び約１％のコレステロールを含み得る。したがって、本発明の脂質組成物は脂質、脂質型又は他の成分のいずれも、いかなる組合せでも又は百分率範囲でも含み得る。
ＩＶ．医薬製剤及び治療計画
本発明の実施形態では、マラバウイルス、カラジャスウイルス、ミュアスプリングウイルス及び／又はバイアグランデウイルスなどのラブドウイルスの送達による、癌などの過剰増殖性又は新生物疾患の治療法が企図されている。治療を企図されている癌の例には、肺癌、頭頚部癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、胃腸癌、リンパ腫、新生物発生前病変、肺における新生物発生前病変、結腸癌、メラノーマ、膀胱癌及び、転移性又は全身的に分散した癌を含む、治療し得る他の任意の癌又は腫瘍が含まれる。
医薬組成物の有効量は、一般に、疾患又はその症状の程度を、検出可能的に及び反復して、遅延する、寛解する、減少させる、最小にする又は制限するのに十分な量と定義される。疾患の除去、根絶又は治癒を含むさらに厳密な定義も適用され得る。
好ましくは、患者は、十分な骨髄機能（末梢絶対顆粒球数＞２，０００／ｍｍ３及び血小板数１００，０００／ｍｍ３として定義される）、十分な肝機能（ビリルビン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）並びに十分な腎機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）を有することになる。
Ａ．投与
本発明の方法及び組成物を使用して、細胞を殺傷する、細胞増殖を抑制する、転移を抑制する、腫瘍若しくは組織サイズを減少させる及びその他の点では腫瘍細胞の悪性表現型を逆行させる、停止させる若しくは減少させるためには、一般には、過剰増殖又は新生細胞をポリペプチドをコードするウイルス又は発現構築物などの治療組成物に接触させることになる。投与経路は、当然のことながら、病変の位置及び性質とともに変化し、たとえば、内皮、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、非経口、脈管内、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局部（ｒｅｇｉｏｎａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、直接注入、食餌性並びに経口投与及び製剤が含まれる。
血管状態又は血管疾患に関する治療効果をもたらすためには、血管細胞を治療化合物に接触させることになる。癌の治療又は診断に関して考察される製剤及び投与経路のいずれも、血管疾患及び状態に関しても用い得る。
離散、固形、接近可能な腫瘍については、腫瘍内注入又は腫瘍血管系への注入が企図されている。特に、播種している又は全身的に播種する可能性のある癌については、局所、局部又は全身投与も企図されている。ウイルス粒子は、少なくとも又は最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回注射により投与され得る。
外科的処置の場合には、本発明を手術前に使用して、手術不能な腫瘍を切除しやすくすることができる。代わりに、本発明は、残存又は転移性疾患を治療するために手術時に及び／又はそれ以降に使用し得る。たとえば、切除された腫瘍床に、癌又は癌細胞の治療に有利であるラブドウイルスポリペプチド又はラブドウイルス（変異を宿していることも宿していないこともある）を含む製剤を注入する又は灌流させることができる。灌流は、たとえば、カテーテルを手術部位に埋め込まれたままにしておくことにより、切除後に継続し得る。定期的な術後処置も想定されている。
必要に応じて、たとえば、腫瘍が切除され残存する微視的疾患を除去するために腫瘍床が処置される場合、連続投与も適用され得る。シリンジ又はカテーテル法を介した送達が好まれる。そのような連続灌流は、治療開始に続いて約１〜２時間から、約２〜６時間まで、約６〜１２時間まで、約１２〜２４時間まで、約１〜２日まで、約１〜２週間まで又はさらに長時間の期間行われ得る。一般に、連続灌流を介した治療組成物の用量は、灌流が起きている期間にわたり調整された単回又は複数回注入により与えられる用量に等しいことになる。四肢灌流を使用して、特にメラノーマ及び肉腫の治療において本発明の治療組成物を投与し得ることがさらに企図されている。
治療計画は同様に変化し、多くの場合、腫瘍型、腫瘍位置、疾患進行並びに患者の健康及び年齢に依拠することがある。明らかに、ある種の腫瘍はさらに攻撃的処置を必要とすることになり、同時に、ある種の患者はさらに負担の多いプロトコールを許容できない。臨床医は、治療製剤の知られている有効性及び毒性（あるとすれば）に基づいてそのような決定を下すのに一番適していることになる。
ある種の実施形態では、治療されている腫瘍は、少なくとも最初は、切除可能ではないことがある。治療ウイルス構築物を用いた治療は、周辺部の縮みのせいで、又はある種の特に浸潤性の部分の除去により、腫瘍の切除可能性を増加させ得る。処置に続いて、切除が可能になることがある。切除に続く追加の処置は腫瘍部位の微視的残存疾患を除去するのに役立つことになる。
原発腫瘍又は切除後腫瘍床に対する典型的な治療過程は複数回投与を含むことになる。典型的な原発腫瘍治療は、１、２、３、４、５、６週期間又はさらに長期にわたる１、２、３、４、５、６又はそれよりも多い回数の用量適用を含む。２週計画を１、２、３、４、５、６又はそれよりも多い回数繰返すことができる。治療過程中、計画された投薬を完了する必要性を再評価してもよい。
治療は様々な「単位用量」を含み得る。単位用量は治療組成物の予め定められた量を含有することと定義される。投与される量並びに特定の経路及び製剤は、臨床分野の担当者の技術範囲内にある。単位用量は単回注射として投与する必要はなく、所定の期間にわたる連続注入を含み得る。本発明の単位用量は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）又はウイルス構築物のウイルス粒子を単位として都合よく記載し得る。単位用量は１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３ｐｆｕ又はｖｐ及びそれよりも多い範囲である。代わりに、ウイルスの種類及び到達できる力価に応じて、患者に又は患者の細胞に１〜１００、１０〜５０、１００〜１０００又は最大約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、若しくは１×１０１５又はそれよりも多い感染性ウイルス粒子（ｖｐ）を送達することになる。
Ｂ．注射用組成物及び製剤
本発明において癌又は腫瘍細胞へのラブドウイルスゲノムのすべて又は一部をコードする発現構築物又はウイルスの送達のための好ましい方法は、血管内注射による。しかし、本明細書に開示される医薬組成物は、代わりに、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，６４１，５１５号及び米国特許第５，３９９，３６３号（それぞれの特許文献は特に参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）に記載される通りに、腫瘍内に、非経口的に、静脈内に、動脈内に、皮内に、筋肉内に、経皮的に又は腹腔内にでも投与し得る。
核酸構築物の注入は、発現構築物が注射に必要な特定のゲージの針を通過することができさえすれば、シリンジ又は溶液の注射のために使用される他のどんな方法によっても送達し得る（たとえば、米国特許第５，８４６，２３３号及び米国特許第５，８４６，２２５号参照）。
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの表面活性剤と適切に混合させた水中で調製し得る。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中において及び油中において調製し得る。貯蔵及び使用の通常の条件下で、これら調製物は微生物の増殖を妨げる保存剤を含有している。注射可能な使用に適した剤型には、無菌水溶液又は分散液及び無菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号、この特許文献は特に参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。あらゆる場合に、剤型は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に液体でなければならない。剤型は製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、その適切な混合物、並びに／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることが可能である。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被膜を使用することにより、分散の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び表面活性剤を使用することにより維持し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことが可能である。多くの場合、等張剤、たとえば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいことになる。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物における、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらすことが可能である。
水溶液での非経口投与では、たとえば、溶液は必要があれば適切に緩衝するほうがよく、液体希釈液は先ず十分な生理食塩水又はグルコースで等張になるほうがよい。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることが可能な無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には公知であろう。たとえば、１投与量が１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加される又は提案された注入部位に注射され得る（たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁及び１５７０〜１５８０頁参照）。投与量のある程度の変動は、治療されている対象の状態に応じて必ず起こるものである。投与責任者は、いずれにせよ、個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒト投与では、調製物は、無菌性、発熱性、一般的安全性及び組成物が使用されている国の政府が要求する純度標準を満たすほうがよい。
本明細書で開示される組成物は、中性型又は塩の形で処方され得る。薬剤的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）及び、たとえば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸で形成される酸付加塩が含まれる。遊離のカルボキシル基で形成される塩も、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩から導き出すことが可能である。処方されると、溶液は、投与製剤と適合する方法で、治療上効果的であるような量で投与されることになる。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル等などの種々の剤形で容易に投与される。
本明細書で使用されるように、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒介物、被膜、希釈剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。薬剤的に活性な物質のためのそのような媒体及び作用薬の使用は当技術分野では周知である。任意の従来の媒体又は作用薬が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物中でのその使用が企図されている。補充活性成分も組成物に組み込むことが可能である。
語句「薬剤的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」とは、ヒトに投与された場合、アレルギー反応又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物のことである。タンパク質を活性成分として含有する水性組成物の調製は当技術分野ではよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液として注射液として調製され、注射に先立って、液体の溶液又は液体の懸濁液に適した固体形も調製することが可能である。
Ｃ．組合せ治療
本発明の化合物及び方法は、癌及びアテローム動脈硬化症を含む過剰増殖又は新生物疾患／状態という状況で使用してもよい。ラブドウイルスなどの本発明の組成物を用いる治療の有効性を増加するために、これらの組成物をそうした疾患及び状態の治療において効果的な他の作用薬と組み合わせることが望ましいことがある。たとえば、癌の治療は、本発明の治療化合物と抗癌剤又は手術などの他の抗癌治療を用いて実行され得る。
様々な組合せを用いることができ、たとえば、マラバウイルスなどのラブドウイルスを「Ａ」とし、二次的な抗癌治療を「Ｂ」として、これには第二のラブドウイルス又は他の腫瘍退縮性ウイルスが含まれ得る。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本発明の治療ウイルス又はウイルス構築物の患者への投与は、ウイルス治療の毒性を、あるとすれば、考慮に入れて、その特定の第二の治療を施すための一般的プロトコールに従うことになる。治療周期は必要に応じて繰返されると予想される。様々な標準療法の他にも外科的処置は、記載されている癌又は腫瘍細胞療法と組み合わせて適用し得ることも企図されている。
１．抗癌療法
「抗癌」剤は、たとえば、癌細胞を殺傷する、癌細胞においてアポトーシスを誘導する、癌細胞の増殖速度を減少させる、転移の発生頻度若しくは数を減少させる、腫瘍サイズを減少させる、腫瘍増殖を抑制する、腫瘍若しくは癌細胞への血液供給を減少させる、癌細胞若しくは腫瘍に対する免疫応答を促進する、癌の進行を妨げる若しくは抑制する又は癌に罹った対象の寿命を増加することにより、対象の癌に否定的影響を与えることができる。抗癌剤には、生物剤（生物療法）、化学療法剤及び放射線療法剤が含まれる。さらに一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺傷する又は細胞の増殖を抑制するのに効果的な総量で提供されるであろう。このプロセスは、細胞をウイルス又はウイルス構築物及び作用薬（複数可）又は複数の因子（複数可）に同時に接触させることを含んでいてもよい。これは、細胞を両作用薬を含む単一組成物若しくは薬理学的製剤に接触させることにより、又は細胞を、１つの組成物がウイルスを含みもう一方が第二の作用薬（複数可）を含む、２つの異なる組成物若しくは製剤に同時に接触させることにより達成され得る。
化学療法及び放射線療法剤に対する腫瘍細胞抵抗性は、臨床腫瘍学における大きな問題を表す。現在の癌研究の１つの目標は、化学療法と放射線療法を遺伝子療法と組み合わせることにより、化学療法と放射線療法の有効性を改善する方法を見つけることである。たとえば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系により脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤のガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘導した（Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９２）。本発明の状況では、ポックスウイルス療法を、他のアポトーシス促進性又は細胞周期調節剤に加えて、化学療法的、放射線療法的、免疫療法的又は他の生物学的処置と合わせて同様に使用することができることが企図されている。
代わりに、ウイルス療法は、分から週に及ぶ間隔でもう一方の治療に先行してもよいし後続してもよい。もう一方の作用薬及びウイルスが細胞に別々に適用される実施形態では、それでも作用薬及びウイルスが細胞に対して有利な併用効果を発揮することができるように、かなりの期間が各送達の時刻の間で有効期限が切れないことを一般に確かめることになるであろう。そのような例では、細胞を互いの約１２〜２４時間以内に、さらに好ましくは互いの６〜１２時間以内に、両モダリティに接触させてもよいことが企図されている。いくつかの状況では、治療の期間をかなり延ばすのが望ましいこともあるが、それぞれの投与間で数日（２、３、４、５、６又は７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週）が経過する。
ａ．化学療法
癌療法には、化学的と放射線をベースとする治療の療法との種々の組合せ療法も含まれる。組合せ化学療法には、たとえば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形）、又は前述したものの任意の類似体若しくは誘導バリアントが含まれる。化学療法と生物学的療法の組合せは生化学療法として知られる。
ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし広範に使用されてきた他の因子には、γ線、Ｘ線、プロトンビームとして一般に知られているもの及び／又は腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達が含まれる。マイクロ波及び紫外線照射などの他の種類のＤＮＡ損傷因子も企図されている。これらの因子はすべて、ＤＮＡに、ＤＮＡの前駆体に、ＤＮＡの複製及び修復に、並びに染色体の構築及び維持に広範な損傷をもたらす可能性が非常に高い。Ｘ線の放射線量範囲は、長期間（３〜４週）の１日量５０〜２００レントゲンから単回量の２０００〜６０００レントゲンまでに及ぶ。放射性同位元素の放射線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放射される放射線の強度と種類、及び新生細胞による取込みに依拠する。
用語「接触される」及び「曝露される」は、細胞に適用される場合、治療構築物及び化学療法剤若しくは放射線療法剤が標的細胞に送達される又は標的細胞のすぐ近位に置かれるプロセスを記載するのに本明細書では使用される。細胞殺傷又は停滞を達成するために、両方の作用薬は、細胞を殺傷する又は細胞が分裂するのを妨げるのに有効な総量で細胞に送達される。
ｃ．免疫療法
免疫療法は、一般に、癌細胞を標的にし破壊することを免疫エフェクター細胞及び分子の使用に頼っている。免疫エフェクターは、たとえば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体単独で療法のエフェクターとしての働きをすることがある又は抗体は他の細胞を動員して実際に細胞殺傷をもたらすことがある。抗体は、薬物又は毒素（化学療法、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートされて、単にターゲティング剤として働いてもよい。代わりに、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的に又は間接的に相互作用する表面分子を担っているリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。治療モダリティ、すなわち、ある種のラブドウイルス又はラブドウイルスポリペプチドの直接細胞傷害活性及び抑制又は減少を組み合わせれば、癌の治療において治療効果を与えると考えられる。
免疫療法も併用療法の一部として使用することができる。併用療法のための一般的アプローチは下で考察される。免疫療法の一態様では、腫瘍細胞はターゲティングを受け入れられる、すなわち、大多数の他の細胞上には存在しないあるマーカーを坦持していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、このうちのいずれも本発明の状況ではターゲティングには適切であり得る。一般的腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ及びｐ１５５が含まれる。腫瘍細胞ライセートも抗原性組成物において使用し得る。
免疫療法の別の態様は、制癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの増殖因子が含まれる。タンパク質として又は腫瘍抑制因子と組み合わせた遺伝子送達を使用して、免疫刺激分子を組み合わせると、抗腫瘍効果を増強することが明らかにされている（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．、２０００）。
前に考察したように、現在研究中の又は使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバンド（たとえば、マイコバクテリウム ボビス、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン及び芳香族化合物）（米国特許第５，８０１，００５号及び米国特許第５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ及びＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９８）、サイトカイン療法（たとえば、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ）（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．、１９９８）、遺伝子療法（たとえば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３）（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ及びＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号及び米国特許第５，８４６，９４５号）並びにモノクローナル抗体（たとえば、抗ガングリオシドＧＭ２、抗ＨＥＲ−２、抗ｐ１８５）（Ｐｉｅｔｒａｓ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）である。ハーセプチン（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２−ｎｅｕ受容体をブロックするキメラ（マウス−ヒト）モノクローナル抗体である（Ｄｉｌｌｍａｎ、１９９９）。ハーセプチン及び化学療法を用いる癌の併用療法は、個々の療法よりも効果的であることが明らかにされている。したがって、１つ又は複数の抗癌療法を、本明細書に記載されるラブドウイルス関連療法と一緒に用い得ることが企図されている。
（１）受動免疫療法
癌の受動免疫療法のためのいくつかの異なるアプローチが存在する。アプローチは、以下の、抗体単独の注入、毒素又は化学療法剤と結合させた抗体の注入、放射性同位元素と結合させた抗体の注入、抗イディオタイプ抗体の注入及び最後に骨髄における腫瘍細胞の浄化に広く分類され得る。
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、患者においてほとんど又はまったく副作用を生じないので、受動免疫療法において用いられる。しかし、その適用は、その希少性によりいくらか制限され、今までのところ病巣内に投与されたことがあるだけである。ガングリオシド抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、皮膚再発性メラノーマに罹っている患者の病巣内に投与されたことがある（Ｉｒｉｅ及びＭｏｒｔｏｎ、１９８６）。毎日の又は毎週の病巣内注射に続いて、１０体の患者のうち６体に退縮が観察された。別の研究では、２つのヒトモノクローナル抗体の病巣内注射から中程度の成功が達成された（Ｉｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
２つの異なる抗原に対して向けられる１つを超えるモノクローナル抗体又は多抗原特異性を有する抗体さえも投与するのは有利になることがある。治療プロトコールは、Ｂａｊｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）により記載されたリンホカイン又は他の免疫増強剤の投与も含み得る。ヒトモノクローナル抗体の開発は明細書の別のところに更に詳細に記載されている。
（２）能動免疫療法
能動免疫療法では、抗原ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質又は自己若しくは同種異系腫瘍細胞組成物若しくは「ワクチン」は、一般に異なる細菌アジュバンドと一緒に投与される（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ及びＭｏｒｔｏｎ、１９９１；Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９９０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９９３）。メラノーマ免疫療法では、高いＩｇＭ応答を示す患者はＩｇＭ抗体をまったく示さない又は低いＩｇＭ抗体を示す患者よりも生存がよいことが多い（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２）。ＩｇＭ抗体は一過性の抗体であることが多く、法則に対する例外はガングリオシド又は抗炭化水素抗体であるように思われる。
（３）養子免疫療法
養子免疫療法では、患者の循環するリンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球は、インビトロで単離され、ＩＬ−２などのリンホカインにより活性化され又は腫瘍壊死の遺伝子を形質導入され、再投与される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８；１９８９）。これを達成するために、動物又はヒト患者に、免疫学的に有効量の活性化されたリンパ球を本明細書に記載されるアジュバンド組込み抗原ペプチド組成物と組み合わせて投与することになる。活性化されたリンパ球は、以前に血液又は腫瘍試料から単離され、インビトロで活性化された（若しくは「拡張された」）患者自身の細胞であることがもっとも好ましい。この種の免疫療法は、メラノーマ及び腎癌の退縮のいくつかの症例を生み出しているが、応答者の百分率は応答しなかったものと比べるとわずかであった。
ｄ．遺伝子
さらに別の実施形態では、第二の治療は、治療ポリヌクレオチドがラブドウイルスが投与されるよりも前に、後に又はラブドウイルスが投与されるのと同時に投与される遺伝子療法である。以下の遺伝子産物のうちの１つをコードするベクターと合わせたラブドウイルスの送達は、標的組織に対して併用制癌効果を及ぼすことになる。代わりに、ラブドウイルスは、治療ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとして操作され得る。種々のタンパク質が本発明内に包含されており、その一部は下に記載されている。表４には、本発明と組み合わせたある種の遺伝子療法のために標的にし得る様々な遺伝子が収載されている。
（１）細胞増殖の誘導因子
細胞増殖を誘導するタンパク質は機能に応じて様々な範疇にさらに分類される。これらのタンパク質のすべての共通性は、細胞増殖を調節するその能力である。たとえば、ＰＤＧＦの一種であるシス癌遺伝子は、分泌された増殖因子である。癌遺伝子は増殖因子をコードする遺伝子から生じることはめったになく、現時点では、シスが唯一知られている天然に存在する癌遺伝子増殖因子である。本発明の一実施形態では、細胞増殖の特定の誘導因子に向けられるアンチセンスｍＲＮＡを使用して、細胞増殖の誘導因子の発現を妨げることが企図されている。
（２）細胞増殖の抑制因子
腫瘍抑制癌遺伝子は、過剰な細胞増殖を抑制するように機能する。これらの遺伝子が不活化されると、その抑制活性が破壊されて、非調節増殖をもたらす。腫瘍抑制因子には、ｐ５３、ｐ１６及びＣ−ＣＡＭが含まれる。本発明に従って用いてもよい他の遺伝子には、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合物、ｐ２１／ｐ２７融合物、抗血栓性遺伝子（たとえば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、血管新生に関与する遺伝子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ又はその受容体）及びＭＣＣが含まれる。
（３）プログラムされた細胞死の調節因子
アポトーシス又はプログラムされた細胞死は、正常な胚発生に不可欠なプロセスであり、成人組織において恒常性を維持し発癌を抑制する（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．、１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリー及びＩＣＥ様プロテアーゼは、他のシステムにおけるアポトーシスの重要な調節因子及びエフェクターであることが実証されている。Ｂｃｌ−２タンパク質は、濾胞性リンパ腫と会合しているのが発見されたが、種々のアポトーシス刺激に応答してアポトーシスを制御し細胞生存を増強するのに顕著な役割を果たしている（Ｂａｋｈｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｃｌｅａｒｙ及びＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ及びＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化論的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、現在では、死アゴニスト又は死アンタゴニストとして分類することが可能な関連するタンパク質のファミリーのメンバーであることが認められている。
その発見に続いて、Ｂｃｌ−２は、種々の刺激により誘起される細胞死を抑制するように作用することが明らかにされた。その上、構造的及び配列的相同性を共有するＢｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今でははっきりしている。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２に類似する機能を有する（たとえば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃ１−ｌ、Ａ１、Ｂｆｌ−１）又はＢｃｌ−２機能を妨害し細胞死を促進する（たとえば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが明らかにされている。
ｅ．手術
癌に罹ったヒトのおよそ６０％がある種の手術を受け、この手術には、予防的、診断的又はステージ分類、治癒的並びに緩和的手術が含まれる。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／又は別の療法などの他の療法と合わせて使用し得る癌治療である。
治癒的手術には、癌組織のすべて又は一部が物理的に取り除かれる、切除される及び／又は破壊される切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に取り除くことである。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術及び顕微鏡的に制御された手術（Ｍｏｈｓ’手術）が含まれる。本発明は、表面癌、前癌又は付帯的な量の正常組織の除去と合わせて使用し得ることがさらに企図されている。
癌性細胞、組織又は腫瘍の一部又はすべてを切除すると、身体に腔が形成されることがある。治療は、追加の抗癌療法を用いた領域の灌流、直接注入又は局所的適用により実現され得る。そのような治療は、たとえば、１、２、３、４、５、６若しくは７日ごとに、又は１、２、３、４及び５週ごとに、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２ヶ月ごとに繰り返してもよい。これらの治療は、同様に変化する投与量であり得る。
ｆ．他の作用薬
他の作用薬を、治療の治療効果を改善するために本発明と組み合わせて使用し得ることが企図されている。これらの追加の作用薬には、免疫調節剤、細胞表面受容体及びＧＡＰ結合の上方調節に影響する作用薬、細胞分裂阻害剤及び分化剤、細胞接着の抑制剤、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる作用薬又は他の生物学的作用薬が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ−２及び他のサイトカイン、Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカイン類似物、又はＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ及び他のケモカインが含まれる。細胞表面受容体又はＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４若しくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）などのそのリガンドを上方調節すれば、過剰増殖細胞に対する自己分泌又はパラ分泌効果を確立することにより本発明のアポトーシス誘導能力を増強すると考えられることがさらに企図されている。ＧＡＰ結合の数を上昇させることにより細胞間シグナル伝達が増加すれば、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させると考えられる。他の実施形態では、細胞分裂阻害剤又は分化剤を、治療の抗過剰増殖効果を改善するために本発明と組み合わせて使用することが可能である。細胞接着の抑制剤は本発明の有効性を改善すると企図されている。細胞接着抑制剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）抑制剤及びロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる、抗体ｃ２２５などの他の作用薬は治療効果を改善するために本発明と組み合わせて使用することができることもさらに企図されている。
細胞傷害性化学療法薬の導入に続く癌の治療法には多くの前進が見られている。しかし、化学療法のもたらす結果の１つは、薬物耐性表現型の発生／獲得及び多剤耐性の発生である。薬物耐性の発生は、依然としてそのような腫瘍の治療における大きな障害であり、したがって、ウイルス療法などの代わりのアプローチの必要性が明らかに存在する。
化学療法、放射線療法又は生物学的療法と合わせて使用するための別の種類の療法には、患者の組織が高温（最大１０６°Ｆ）に曝露される手順である温熱療法が含まれる。外部又は内部加熱装置は、局所的、局部的又は全身的温熱療法の適用に関与していてもよい。局所的温熱療法は、腫瘍などの小領域への熱の適用を含む。熱は、身体外の装置から腫瘍を標的にする高周波を用いて外部的に発生させてもよい。内部熱は、細い加熱されたワイヤー又は温水で満たされた中空管、埋め込まれたマイクロ波アンテナ又は無線周波数電極を含む無菌プローブを含み得る。
患者の臓器又は四肢は、磁石などの高エネルギーを発生する装置を使用して実現される局部的療法のために加熱される。代わりに、患者の血液の一部は取り除かれ、内部的に加熱されることになる領域に灌流される前に加熱されてもよい。全身加熱は、癌が体全体に転移した場合にも実行され得る。温水毛布、ホットワックス、誘導コイル及び熱チャンバーをこの目的のために使用してもよい。
ホルモン療法も、本発明と合わせて又はすでに記載されている他のどんな癌療法とでも組み合わせて使用してもよい。ホルモンの使用は、テストステロン又はエストロゲンなどのある種のホルモンのレベルを低下させる又は効果をブロックするために、乳癌、前立腺癌、卵巣癌又は子宮頚癌などのある種の癌の治療において用い得る。この治療は、多くの場合、治療として少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて使用される。
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられるものであり、いかなる形でも本発明を限定することを意図していない。当業者であれば、本発明が、目的を成し遂げ言及されている目標及び利点の他にも本明細書に固有の目的、目標及び利点を成し遂げ、得るのに十分に構成されていることを容易に認識することになる。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を目下代表しており、模範であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されてはいない。特許請求の範囲により定義される本発明の精神の範囲内に包含されるその変化及び他の使用は、当業者であれば思い付くであろう。
Ａ．結果
マラバウイルスは強力な腫瘍退縮性特性をインビトロで示す。ラブドウイルス科は広大であり、遺伝的に及び地理的に多様である。本発明者らは、出発点として哺乳動物細胞内で複製するすでに証明されている能力を有するラブドウイルスのパネルを選択した。強力な腫瘍細胞細胞溶解能力を有するウイルスを同定するインビトロスクリーニングのために７つのウイルスが選択された（表４）。細胞殺傷アッセイは、ＮＣＩ６０腫瘍細胞パネル及びマウス腫瘍株の分類由来の細胞株に対して、９６ウェルフォーマットで実施された（図５）。いくつかの種は、ヒト腫瘍株に対して高度に溶解性であることが示され、試験された大多数の細胞株に対して、ＥＣ５０スコアーはプラーク形成単位（ｐｆｕ）により０．１ ＭＯＩ未満であった。特に、マラバ（Ｔｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．、１９８４）、カラジャス（ＣＲＪ）（Ｔｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．、１９８４）及びファーミントンウイルス（ＦＭＴ）（Ｔｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．、２００２）は、細胞パネルに表されるすべての癌指標由来のヒト腫瘍株を殺傷するのに非常に効果的であるように思われた。注目に値する例外は、結腸腫瘍由来の細胞株を殺傷するのが困難であるＦＭＴウイルスについて観察された。興味深いことに、すべてのラブドウイルスが癌細胞を効率的に殺傷する能力を有するわけではない。ミュアスプリング（ＭＳ）（Ｋｅｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６）、バイアグランデ（ＢＧ）（Ｋｅｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６）、ガインガン（ＮＧＧ）（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９７３）及びチブロガルガン（ＴＩＢ）（Ｃｙｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９８０）などのウイルスが活性を示したのは腫瘍細胞のうちのごくわずかな割合であった。現在、これらのウイルスの制約を支配する機構は依然未知のままである。
これらのウイルスをさらに特徴付けるために、単回ステップ増殖曲線が感受性細胞株（ＳＮＢ１９）の他にも相対的に耐性の細胞株（ＮＣＩ Ｈ２２６）に対して実施されて、複製速度をモニターし、ウイルス破裂サイズを定量化した。本発明者らは、ＢＧウイルスを用いたＮＣＩ Ｈ２２６細胞の感染に続いてウイルスを検出することはできず、このことはＢＧがこの細胞株に対しては細胞溶解性がわずかにすぎないという観察結果と一致している。しかし、ＢＧはＳＮＢ１９細胞上でＦＭＴ及びＣＲＪと類似する程度に複製することができ、再びその細胞溶解性能力と相関していた。ＦＭＴもＣＲＪも、ＮＣＩ Ｈ２２６細胞上でアッセイすると、類似する速度論で及び同等な破裂サイズで子孫を産生した。ＦＭＴはＳＮＢ１９細胞上ではＣＲＪよりも高い力価まで複製するように思われたが、両方とも明らかに、この感受性細胞株の迅速な殺傷をもたらすほど十分な子孫を産生した（図１）。ＭＲＢは、ＳＮＢ１９細胞上でもＮＣＩ Ｈ２２６細胞上でも、その他の３株に等しい又は３株よりも速い速度論で、及びその他のウイルスよりもはるかに高い力価までウイルスを産生した。
ＭＲＢウイルスは、腫瘍株に対する良好な細胞溶解活性、急速なウイルス産生及び大きな破裂（プラーク）サイズを示した。これらはすべてが、良好な腫瘍退縮活性に寄与する特性である。マラバは、さらに開発する腫瘍退縮性ウイルスとして選択された。
マラバウイルス。マラバウイルスを遺伝的に操作するための前奏として、この株の全長ゲノム配列を得るために、「ショットガン」配列決定アプローチが用いられた。これに続く系統発生分析は、ラブドウイルスファミリーの６つの公知の属のメンバーに対してマラバＬタンパク質のアミノ酸配列を配列比較することにより実施された（図２のＡ）。ウイルスは他のラブドウイルスに共通の予想されるゲノム構造を有しており、５つの個別のシストロンがウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ遺伝子の輪郭を描く（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）原因である転写停止／開始配列により分離されている（図２のＢ）。
操作されたマラバウイルス変異体は改良された癌細胞選択性を示す。完全長抗ゲノム配列はＴ７プロモーター推進ベクターに、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子はＣＭＶプロモーター推進発現構築物にクローニングされた。この戦略は、いくつかのマイナス鎖ＲＮＡウイルスの逆遺伝子システムを開発するために使用され成功を収めた（Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５；Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５；Ｎａｋａｙａ ｅｔ ａｌ．、２００１）。こうして得られるウイルスは、ゲノム構築物、すなわち、Ｎ、Ｐ及びＬプラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼを発現しｒマラバＷＴ（組換えマラバ野生型）と名付けられたワクシニアウイルスが前もって感染しているＡ５４９細胞にトランスフェクトすることにより救済された。
本発明者らは、野生型マラバウイルスの腫瘍選択性殺傷特性を改善するために変異を導入した。本発明者らは、ＶＳＶのＭタンパク質においてメチオニン５１が欠失すると、感染細胞においてインターフェロン応答をブロックすることに対してウイルスが不完全になることを以前実証していた（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．、２００３）。同様に、本発明者らは、ＶＳＶ Ｍタンパク質のアミノ酸Ｖ２２１Ｆ及びＳ２２６Ｒで二重変異が起こるとウイルスは宿主ｍＲＮＡの核細胞質輸送をブロックすることができなくなり、それによって宿主細胞にＩＦＮ応答を伝達することが可能になることを明らかにした（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．、２００３）。ＶＳＶのグラスゴー株もそのマトリックスタンパク質にＳ２２６Ｒバリアントを有することを考慮すると、Ｖ２２１Ｆ Ｓ２２６Ｒ二重変異体に対する弱毒化表現型はＶ２２１Ｆ単独での変異から生じ得ることが仮定された。したがって、本発明者らは、できる限り弱毒化されたバリアントとして、ΔＭ５１ マラバ組換えウイルス及びＶ２２１Ｙマラバ変異体株を構築し救済した（図２のＢ）。
伝えられるところによれば、２つの他の変異（Ｍタンパク質Ｌ１２３Ｗ及びＬタンパク質Ｈ２４２Ｒ）はＢＨＫ−２１細胞上でＶＳＶの複製を改善した（Ｓａｎｊｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２００４）。マラバ配列をＶＳＶに対して配列比較すると、対応する変異は、Ｍ及びＬタンパク質のそれぞれマラバ配列中のＬ１２３Ｗ及びＱ２４２Ｒである。組換えマラバウイルスは、Ｍタンパク質Ｌ１２３Ｗ若しくはＧタンパク質Ｑ２４２Ｒ単一変異又はＬ１２３ＷとＱ２４２Ｒの両方を用いて構築された（今後マラバＤＭと呼ばれる）（図２のＢ）。
当ｒマラバＷＴ及び変異体株の細胞傷害性は、操作された変異から生じたどんな弱毒化でも検出し定量化するために、原発性ヒト皮膚線維芽細胞（ＧＭ３８細胞）上で試験された（図２のＣ）。ΔＭ５１マラバウイルスは、ｒマラバＷＴ（ＥＣ５０＝０．０１ ＭＯＩ）と比べてこれら原発性細胞上では弱毒化される（ＥＣ５０＞＞１０ ＭＯＩ）。Ｖ２２１Ｙも弱毒化されるが、ΔＭ５１（ＥＣ５０＝３ ＭＯＩ）よりもわずかに少ない程度である。驚くべきことに、Ｌ１２３ＷとＱ２４２Ｒ変異体の両方も高度には弱毒化された（ＥＣ５０＝３ ＭＯＩ）。さらに、Ｌ１２３ＷとＱ２４２Ｒ変異の両方を組み合わせる二重変異体は、単一変異体と比べた場合等しくは弱毒化され、原発性ヒト線維芽細胞（ＥＣ５０＝３ ＭＯＩ）の７２時間感染後はＥＣ５０が１００倍に増加した。これらの結果は、両変異がウイルスを弱毒化するのではなく、複製を改善すると予想されたことを考慮すると、驚きであった。これらの表現型は同様にプラーク形成と相関していた。ＧＭ３８線維芽細胞の感染に続いて、小さいが検出可能なプラークは、ｒマラバＷＴを用いた感染の１週間後目に見えるようになった。しかし、様々なマラバ単一変異体又はマラバＤＭでは、同じ時間枠をかけてもプラークは目に見えなかった。これは、正常な原発性線維芽細胞上でのＶ２２１Ｙ、Ｌ１２３Ｗ及びマラバＤＭの厳しく弱毒化された性質を再び示した。これとは対照的に、ｒマラバＷＴ、Ｖ２２１Ｙ、Ｌ１２３Ｗ又はマラバＤＭのいずれかを用いた感染のちょうど２４時間に続いて大きなプラークが腫瘍株（ＳＮＢ１９）上で形成された（図２のＤ）。しかし、Ｑ２４２Ｒ変異体はその他の株と比べた場合、もっと小さなプラークをつくり、この変異が腫瘍細胞においても同様にこの株の複製をわずかに損なう可能性があることを示唆している。しかし、興味深いことに、二重変異体は、Ｑ２４２Ｒ変異を含有しているが、悪性細胞上ではそのような損傷をはっきりとは示さなかった（図２のＤ）。
正常な線維芽細胞上での我々の観察結果とは対照的に、悪性細胞株のパネル上でアッセイされた場合は、変異体株のすべてが依然として高度に溶解性のままであった（図２のＥ）。ウイルスへの４８時間曝露後、様々な株の溶解能力はアラマーブルー生体色素を使用して定量化された（図２のＥ）。Ｌ１２３Ｗ株は腫瘍細胞上ではｒマラバＷＴと同じくらい細胞溶解性であると思われ、それによって、ＷＴ株と比べて改善されたインビトロ治療指数を示した。マラバＱ２４２Ｒは、その親のｒマラバＷＴ株よりも細胞溶解性は低いと思われたにもかかわらず、３つの腫瘍株すべてにおいて非常に細胞溶解性であり、我々のプラークサイズ観察結果と一致していた。しかし、二重変異体は、それが宿すＱ２４２Ｒ変異のせいで細胞傷害性には何の損傷も示さなかったのでこの表現型の興味深い逆転を示した。実際、マラバＤＭは一貫して癌細胞株上ではもっとも細胞溶解性が高いと思われ（図２のＥ）、親ＷＴよりもはるかに細胞溶解性が高かった。Ｌ１２３ＷとＱ２４２Ｒの組合せは、癌細胞上でのみ選択的に超毒性であるが正常な線維芽細胞上では依然として弱毒化されているマラバ株を生じる。これは、ウイルスタンパク質産生がＯＶＣＡＲ４ヒト卵巣癌細胞において時間をかけてアッセイされた場合も明白であった（図２のＦ）。ｒマラバＷＴ及びＬ１２３Ｗ株は急速なウイルスタンパク質誘導を示し、Ｑ２４２Ｒ変異体は遅れた。ここでは再びＱ２４２Ｒ Ｌ１２３Ｗ二重変異体マラバは、ウイルスタンパク質速度論において何の損傷も示さなかった。
マラバ変異体は宿主ＩＦＮ抗ウイルス応答をブロックするのに不定に欠陥がある。正常な原発性線維芽細胞において選択的に弱毒化されているいくつかのマラバ変異体株を確立したので、本発明者らは、この弱毒化が先天的免疫妨害の欠陥のせいなのかどうかの理解に努めた。たとえば、ΔＭ５１及びＶ２２１変異は、ウイルスが核／細胞質ｍＲＮＡ輸送をブロックし、それによって宿主ＩＦＮ転写カスケードを抑制することができないようにすることは以前ＶＳＶにおいて明らかにされている。ＰＣ３細胞が偽感染される又はｒマラバＷＴで感染されると、本発明者らはＩＦＮ産生を検出することはできず、先天性免疫応答をブロックする親ウイルスの能力と一致していた（図３のＡ）。予想通りに、ΔＭ５１及びＶ２２１Ｙ変異体はバイオアッセイで測定される場合、ＩＦＮ産生をブロックする能力の欠陥を確かに示した（図３のＢ）。興味深いことに、Ｌ１２３Ｗ変異体もＶ２２１Ｙ変異体と類似する規模までＩＦＮ産生をブロックする能力の欠陥を示した（図３のＢ）。しかし、Ｑ２４２Ｒ変異体は、ＰＣ３細胞においてサイトカイン産生をブロックするその能力がそのＷＴウイルスに類似しており、したがって、この変異体はＩＦＮ妨害に何の欠陥もないと結論付けた。したがって、Ｑ２４２Ｒ変異体の十分な弱毒化は、無関係な宿主ＩＦＮ応答であると思われる。２つの単一変異がマラバＤＭバリアント内で組み合わされると、得られるウイルスはＬ１２３Ｗ単一変異体と区別できなかった（図３のＢ）。さらに、核区画から細胞質へのインタフェロンベータｍＲＮＡ輸送は、ＷＴマラバ又はＱ２４２Ｒ変異体の感染に続いてブロックされることが観察された（図３のＣ）。これらの結果は、ある種のウイルスは、細胞質へのｍＲＮＡ輸送をブロックすることを含むいくつかの機構によりＩＦＮ転写カスケードを抑制することをそのマトリックスタンパク質に頼っていることを示す以前の報告と一致している（Ｆｅｒｒａｎ ａｎｄ Ｌｕｃａｓ−Ｌｅｎａｒｄ、１９９７；Ｔｅｒｓｔｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．、２００３）。これらの結果は、マラバウイルスが同じ戦略を用いることを示している。これとは対照的に、マラバΔＭ５１、Ｌ１２３Ｗ株及びマラバＤＭはすべて、ウイルス感染に続いて細胞質において検出可能なＩＦＮベータｍＲＮＡの「漏出」を示し、ｍＲＮＡ妨害におけるこの欠陥は、バイオアッセイで測定した場合、ＩＦＮ応答をブロックするウイルスの能力と相関していた（図２のＢ）。
マラバＤＭはインビボでは毒性が低くなる。ＬＤ５０及び最大許容用量（ＭＴＤ）は、マラバＷＴ及びいくつかの弱毒化された株について決定された。播種された腫瘍を治療するための投与の所望の治療経路は静脈内投与であるために、マウスは、ＷＴウイルス又は２つの変異体ウイルスを用いて静脈内に用量範囲で処置された。本発明者らは、マラバウイルスがＢａｌｂ／Ｃマウスへの静脈内注射に続いて十分に許容されることを観察した。インビトロデータから予想される通りに（図２のＣ）、マラバＤＭは親のＷＴマラバよりも２対数高いＭＴＤ２を有する（表５）。ＷＴ、Ｖ２２１Ｙ又はＤＭのいずれかの致死用量を受けた動物は、ＣＮＳ感染の兆候を示し、その脳内に顕著なウイルス力価を有していた（データは示されず）。ＭＴＤ未満の用量では、マウスは一般に、ウイルス感染に一致する一過性の体重減少、脱水症状、立毛を示した。これらの症状は感染の３〜４日後に解消し、感染１２日後に屠殺されたこれらのマウスの脳内にウイルスは検出されなかった。
マラバＤＭは同系及び異種移植腫瘍モデルにおいて有効である。本発明者らは、マラバＤＭが癌のインビボマウスモデルにおいて有効であるかどうかを判定しようと努めた。マラバＤＭ株はＧＦＰ又はホタルルシフェラーゼを発現するよう操作され、全身投与に続く皮下ＣＴ２６腫瘍におけるその複製が調べられた。本発明者らは、全動物の生物発光撮像と腫瘍外稙片における蛍光顕微鏡の両方を使用して、マラバＤＭウイルスが腫瘍床に送達され腫瘍組織において複製するのを観察した（図４のＡ（ｉ））。次に、左右両側ＣＴ２６皮下腫瘍モデル上でのマラバＤＭの有効性を調べた（図４のＡ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ））。具体的には、１０〜６００ｍｍ３のサイズに到達した左右両側の腫瘍を有する動物は、２週間毎週３回マラバＤＭを静脈内に処置された。最初の処置の５日後、生理食塩水で処置された対照動物はエンドポイントに到達し、腫瘍は７５０ｍｍ３又はそれよりも大きなサイズに到達していた。しかし、マラバＤＭの全身投与を６回受けた動物は処置に応答し、３５日までの完全な腫瘍後退により動物の１００％において持続的治癒をもたらした（図４のＡ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ））。最後に、静脈内マラバＤＭ処置は動物において十分に許容されており、死亡も最小の病的状態もなかった。立毛、中程度の脱水症状及び一過性の体重減少が観察されたが（図４のＡ（ｉｖ））、すべてが最初の処置から２週間以内に解消した。
本発明者らは、播種された疾患モデルにおいて腫瘍量を減少させるマラバＤＭの有用性も判定しようと努めた。したがって、ＣＴ２６細胞は、播種された肺腫瘍を誘導するためにＢａｌｂ／Ｃマウスの静脈内に注射された。生理食塩水（ＰＢＳ）及びカラジャス処置された動物は大量の腫瘍量を示すが、マラバＤＭ動物は腫瘍量をほとんど又はまったく示さず、正常な肺表現型を示している（図４のＢ（ｉ））。さらに、マラバＤＭは２週間週３回全身に投与された場合、生存の著しい延長ももたらす図４のＢ（ｉｉ）。このデータは皮下モデルにおける観察結果と一致しており、さらに浸潤皮下又は播種された同系腫瘍モデルを効果的に処置するマラバＤＭの効能を示している。
免疫適格性動物におけるウイルス有効性のこれらの研究を補完するために、マラバＤＭは、生物発光ヒトＥＳ−２卵巣異種移植モデルを使用して試験された。きわめて低用量でも（１×１０４ｐｆｕ）、マラバＤＭで処置された動物は腫瘍負荷が著しく減少した（図４のＣ（ｉ〜ｉｉｉ））。これとは対照的に、対照処置されたマウスは、急速に腹水症を発症し、エンドポイントに到達するまで腫瘍量は増加した。低用量及び高用量ウイルスを使用するＥＳ２腫瘍担持マウスの全身処置は、用量依存性腫瘍応答を示した（図４のＤ（ｉ〜ｉｉ））。本発明者らは、以前開発された腫瘍退縮性ウイルス株（ＶＳＶ ΔＭ５１）に対してマラバＤＭを試験し、両用量レベルでマラバＤＭはＶＳＶ ΔＭ５１よりもすぐれた効能を示した。
Ｂ．材料及び方法
細胞株。ヒトＡ５４９肺癌、ヒトＨｅｌａｃｅｒｅｖｉｃａｌ癌、マウスＣＴ２６結腸癌（アメリカ培養細胞株保存機関）、ヒトＧＭ３８原発性線維芽細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）及びｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ、米国国立癌研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から入手したＮＣＩ６０細胞パネル由来の細胞株は、１０％胎仔ウシ血清（Ｃａｎｓｅｒａ、Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）において増殖された。
ＮＣＩ６０細胞パネル。
インビトロ細胞傷害性スクリーン。ＮＣＩ６０細胞パネル由来の細胞は９６ウェルプレートに９０％の集密度まで蒔かれた。これらの細胞に、指示通りに、様々なラブドウイルスを対数希釈で感染させた。感染の９６時間後、単層は洗浄され、固定され、１％クリスタルバイオレット溶液で染色された。染色された単層は続いて１％ＳＤＳ水溶液に溶解され均質なライセートを作製した。吸光度は５９５ｎｍで読み取られ、生存細胞についてスコアー化した。
単一ステップ増殖曲線。ＮＣＩ２２６及びＳＮＢ１９細胞に、１時間で５ｐｆｕ／細胞の感染多重度で指示されたウイルスを感染させた。次に、細胞はＰＢＳで洗浄され、３７℃でインキュベートされた。アリコート（１００μｌ）を時間０、４、８、１２、１６、２４、４８及び７２時間の時点で採取し、ベロ細胞上で力価を測定した。
マラバラブドウイルスの塩基配列決定及びクローニング。マラバラブドウイルスは、ベロ細胞上で増幅され、ＲＮＡは標準技法により精製されたウイルスから単離された（Ｔｒｉｚｏｌ＋ＲＮＡアーゼ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。５’及び３’末端を除いて、ウイルス配列は、ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて得た。３’及び５’末端塩基配列決定は、どちらかの末端へのＴ７ ＤＮＡプライマーのＴ４ ＲＮＡリガーゼ媒介ライゲーション続いてＲＴ−ＰＣＲ及びｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローニングに続いて完了された。ウイルスｃＤＮＡは単回ＲＴ−ＰＣＲ反応で増幅され（ａ＞１１ｋｂｐ断片を生じる）、５’−抗ゲノムリーダー配列の上流にＴ７プロモーターを、３’ターミネーターのすぐ下流に改変されたＨＤＶリボザイム及びＴ７ポリメラーゼ終結シグナル配列を担っている改変されたＬＣ−ＫＡＮベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にクローニングされた。
系統発生解析。Ｌタンパク質アミノ酸配列の筋肉配列比較に基づき、アウトグループとしてのパラミクソウイルス麻疹エドモンストン（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株を使用する、ラブドウイルス間の系統発生的関係。系統樹は、近隣結合法により作製され、ブートストラップ値（分岐節ごとに示される）は１０００系統樹レプリカを使用して推定された。枝長は遺伝子距離に比例している。スケールバーはアミノ酸部位あたりの置換に対応する。
組換えマラバ救済システム。６ウェルプレートにウェルあたり３．０×１０５細胞で播種されたＡ５４９肺癌細胞は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを１０の感染多重度（ＭＯＩ）で２４時間後に、ＯｐｔｉＭｅＭ培地で１．５時間感染させた。ワクシニアウイルスの除去に続いて、各ウェルには、製造業者の使用説明書に従って、リポフェクタミン２０００（ウェルあたり５μＬ）と共に、マラバＮ（１μｇ）、Ｐ（１．２５μｇ）及びＬ（０．２５μｇ）をコードするｐＣＩ−Ｎｅｏ構築物と一緒にＬＣ−ＫＡＮマラバ（２μｇ）をトランスフェクトした。トランスフェクション試薬は５時間後に取り除き、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで置き換えられた。トランスフェクションに続く４８時間で、培地は回収され（２プレートからプールされる）、濾過されて（０．２μｍ）汚染ワクシニアウイルスを除去し、１ｍＬを使用して６ウェルプレートの各ウェルにおいてＳＮＢ−１９グリオブラストーマに感染させた。２４〜４８時間後に目に見える細胞変性効果は救済が成功したことを示しており、これはウイルスＲＮＡを精製し、マラバ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより確かめられた。すべてのウイルスは３回のプラーク精製を受け（ＳＮＢ−１９細胞上で）、その後スケールアップされ、ショ糖クッション上で精製され、１５％グルコースを含有するＰＢＳに再懸濁された。
変異誘発及びマラババリアント。単一のリン酸化変異誘発プライマー（４５〜５５ｂｐ）は、高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）と一緒に使用されて、内部に記載されているＬＣ−ＫＡＮマラバ変異体のパネルを作製した。手短に言えば、ＰＣＲ反応は、酵素のホットスタート添加（９８℃−２分、８０℃保持、酵素添加）及び典型的ＰＣＲ構成（９８℃−１０秒、５５℃−３０秒、３０サイクルを７２℃７分間で）で、１００ｎｇの変異誘発プライマー及び１００ｎｇのＤＮＡ鋳型を用いて実施された。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、０から６％の範囲で２％ずつ増加させて添加された。親プラスミドは、Ｄｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）で消化され（３７℃で１時間）、２５μＬのＤｐｎｌ−消化ＰＣＲ混合物のうちの４μＬを使用して、ＴＯＰ−１０（登録商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。
陽性クローンは、非コード変化制限部位変化の導入（付加する又は除去する）に続いて配列決定によりスクリーニングされた。ここに記載される異なる弱毒化された変異体には、Ｍタンパク質におけるＭｅｔ−５１の失欠（ΔＭ５１）、Ｍタンパク質におけるＬｅｕ−１２３からＴｒｐへ（Ｌ１２３Ｗ）、Ｍタンパク質におけるＶａｌ−２２１からＴｙｒへ（Ｖ２２１Ｙ）、Ｇタンパク質におけるＧｌｎ−２４２からＡｒｇへ（Ｑ２４２Ｒ）並びに二重変異体Ｍタンパク質におけるＬｅｕ−１２３からＴｒｐへ及びＧタンパク質におけるＧｌｎ−２４２からＡｒｇへ（マラバＤＭ）が含まれる。
生存率アッセイ。指示された細胞株は、９６ウェルプレートへ１０，０００細胞／ウェルの密度で蒔かれた。その次の日、細胞に指示されたウイルスを様々な感染多重度（０．０００１〜１０ｐｆｕ／細胞）で感染させた。４８時間インキュベーションに続いて、アラマーブルー（レサズリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））が最終濃度２０μｇ／ｍｌまで添加された。６時間インキュベーション後、吸光度は５７３ｎｍの波長で読み取られた。
プラークアッセイ。ベロ細胞は６ウェル皿のウェルあたり５×１０５細胞の密度で蒔かれた。その次の日、１００μｌの連続ウイルス希釈液が調製され、１時間でベロ細胞に添加された。ウイルス吸着後、２ｍｌのアガロースｏｖｅｒｌａｙが添加された（１対１ １％アガロース対２×ＤＭＥＭ及び２０％ＦＣＳ）。プラークはその次の日に計数された。
インターフェロンバイオアッセイ。ＰＣ−３細胞は、ｒマラバＷＴ、ΔＭ５１、Ｖ２２１Ｙ、Ｌ１２３Ｗ、Ｑ２４２Ｒ又はマラバＤＭを、３ｐｆｕ／細胞の感染多重度で２４時間感染させた。その次の日、上清は４℃で一晩０．２５Ｎ ＨＣｌで酸中和され、続いて０．２５ＮａＯＨを添加してｐＨを７に調整した。ベロ細胞は中和された上清と一緒に２４時間インキュベートされ、それに続いて、０．０００１から１００ｐｆｕ／細胞の範囲の感染多重度でｒマラバＷＴを感染させた。マラバ又は弱毒化された変異体に応答してＰＣ−３細胞により分泌されるいかなるインターフェロンも、それに続いてマラバによる感染からベロ細胞を保護すると考えられる。２４時間後、生存はクリスタルバイオレットアッセイを使用して定量された。手短に言えば、細胞は１％クリスタルバイオレット溶液と一緒にインキュベートされ、洗浄され、乾燥され、１％ＳＤＳに再懸濁されて、５９５ｎｍの波長で読み取られた。
核及び細胞質インターフェロンを検出する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。核及び細胞質ＲＮＡは以載された通りに分離された。手短に言えば、偽処置された又はマラバ、ΔＭ５１、Ｌ１２３Ｗ、Ｑ２４２Ｒ若しくはマラバＤＭが感染したＯＶＣＡＲ４細胞はＰＢＳ中に収穫され、ペレット化され、２００μｌの容解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ショ糖及び１％ＮＰ−４０）に再懸濁された。ライセートは、時折ボルテックスしながら４℃で１０分間インキュベートされた。核は１０００×ｇ、３分間の遠心分離により収集された。上清（細胞質画分）は収集され、核画分は２５０μｌの溶解緩衝液で１度洗浄され、続いてＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して全ＲＮＡ抽出された（製造業者の使用説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ）。ＩＦＮベータｍＲＮＡのＱＲＴＰＣＲは、以載されたプライマーを用いてＱｉａｇｅｎ社製のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して実施された。ＩＦＮ−ベータは、核及び細胞質画分からアッセイされ、同じ区画由来のＨＰＲＴ ｍＲＮＡに正規化された。正規化された値はそれぞれ非感染核及び細胞質画分からの値に再び正規化され、ウイルス感染に続いて、各区画において誘導倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）値を決定した。プロットされた値は、核区画に対する細胞質区画由来の正規化されたｍＲＮＡ誘導の割合を示す。ＱＰＣＲ値はすべてデルタＣＴ法を使用して計算された。
インビボ毒性の決定。３〜５匹のＢａｌｃ／Ｃマウス（生後６〜８週間）の群は、３×１０６ｐｆｕ〜３×１０９ｐｆｕの範囲のウイルスの半対数増加で静脈内に１度注射された。動物は、体重低下、病的状態、立毛、後肢麻痺及び呼吸困難を含む障害の兆候についてモニターされた。
左右両側皮下腫瘍モデル。マウスＣＴ２６結腸癌細胞（３×１０５）は、生後６〜８週間Ｂａｌｃ／Ｃマウスの右側面及び左側面に注射された。腫瘍は１０〜６００ｍｍ３のサイズまで成長させ、続いて、５１ＶＳＶ又はＭＲ−ＳＤＭのどちらかを用量５×１０８ｐｆｕで６合計（週３回）静脈内に注射した。腫瘍は最初の注射後、週２回測定された。動物は、立毛、体重低下、病的状態、後肢麻痺及び呼吸困難についてモニターされた。腫瘍量が７５０ｍｍ３のサイズを超えると、動物は安楽死された。以下の式、（Ｌ×Ｗ２）／２、を使用して腫瘍体積を計算した。
皮下腫瘍モデルにおいてマラバＤＭウイルスを撮像する。マラバＤＭは、それぞれｅＧＦＰ又はホタルルシフェラーゼ（ＦＬＵＣ）において遺伝的に操作することにより、蛍光又は生物発光撮像のために適合された。ＤＭ−ＧＦＰ及びＤＭ−ＦＬＵＣは、皮下ＣＴ−２６腫瘍を担持するＢａｌｂ／Ｃ動物にＩＶ（１×１０８）注射された。感染２４時間後、ＤＭ−ＧＦＰ感染動物は安楽死され、その腫瘍は摘出され、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡下で撮像された。ＤＭ−ＦＬＵＣに感染した動物はルシフェリンを注射され、ＩＶＩＳ Ｘｅｎｏｇｅｎ２００システムを使用してライブ撮像を受けた。
ＣＴ−２６肺腫瘍モデル。肺腫瘍は、生後６〜８週間のＢａｌｂ／Ｃ動物に３×１０５ＣＴ−２６結腸癌細胞を単回静脈内に注射することにより確立された。一般に、安楽死される時点である１６〜１８日目に、マウスは重い呼吸困難、立毛及び背を丸めた表現型を発症する。マウスは、ＰＢＳ、カラジャスでＩＶ処置される又は１０、１２及び１４、１７、１９及び２１日目にマラバＤＭ（５×１０８ｐｆｕ）処置された。一部の動物は１７日目に屠殺され、画像はＮｉｋｏｎ解剖顕微鏡上で撮られた。残っている動物は生存についてモニターされた。
卵巣異種移植モデル。ヒト卵巣ＥＳ−２細胞は、生物発光撮像のために適合され、その時点で、１×１０６ＥＳ−２細胞は、生後６〜８週間の胸腺欠損ＣＤ−１ヌードマウスの腹腔内に注射された。非処置ＣＤ−１動物は約１５から１７日目に腹水症を発症する。腹腔内及び静脈内（尾部静脈）注射は、８、９、１２、１４及び１６日目に、マラバＤＭ又はＶＳＶ Δ５１のｌ×１０４〜１×１０７ｐｆｕを用いて実施された。腫瘍撮像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ２００ＩＶＩＳシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬＳ、ＵＳＡ）を用いて行われた。
統計。プラークサイズ決定では、ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡは、Ｐ値（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を導くためにボンフェローニ多重比較検定を使用して実施された。カプランメイヤープロットでは、生存プロットは、マンテルコックスログランク解析（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して比較された。
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Claims (30)

  1. 配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、又は
    配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質、又は
    配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、並びに、配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質
    を含む弱毒化されたラブドウイルス。
  2. 遺伝子変異が、配列番号５の２４２におけるグルタミンに代わるアルギニン置換、又は配列番号４の１２３におけるロイシンに代わるトリプトファン置換である、請求項１に記載のラブドウイルス。
  3. 配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、又は
    配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質、又は
    配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、並びに、配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質
    をコードする単離された腫瘍退縮性ラブドウイルスに細胞を接触させるステップを含む、過剰増殖細胞を殺傷する方法。
  4. 細胞が患者に含まれている、請求項３に記載の方法。
  5. 細胞が癌細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 癌細胞が転移性癌細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 腫瘍退縮性ラブドウイルスが患者に投与される、請求項４に記載の方法。
  8. 腫瘍退縮性ラブドウイルスが腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、内皮、腫瘍内、皮下、又は鼻腔内投与により投与される、請求項７に記載の方法。
  9. 第二の抗癌療法を施すステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  10. 第二の抗癌療法が第二の腫瘍退縮性ウイルスである、請求項９に記載の方法。
  11. 第二の腫瘍退縮性ウイルスがワクシニア、ヘルペス、麻疹、ニューキャッスル病、アデノウイルス、アルファウイルス、パルボウイルス、又はラブドウイルスである、請求項１０に記載の方法。
  12. 第二の抗癌剤が第二の腫瘍退縮性ラブドウイルスである、請求項１１に記載の方法。
  13. 第二の腫瘍退縮性ラブドウイルスが水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス、コカールウイルス、イスファハンウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス、ボテケウイルス、カルチャキウイルス、エルウイルスアメリカン、グレーロッジウイルス、ユロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルペススプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、ペリネウイルス、ツパイウイルス、ファーミントン、バイアグランデウイルス、ミュアスプリングウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダースウイルス、カメセウイルス、モスケイロウイルス、モスリルウイルス、バルーウイルス、フクオカウイルス、カーンキャニオンウイルス、コルビッソンウイルス、ルダンテックウイルス、キューラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドレイラウイルス、ティンボウイルス、アルムピウォーウイルス、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ブルークラブウイルス、チャールビルウイルス、コースタルプレインズウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス、コールピンヤウイルス、コトンコンウイルス、ランジャウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソウルウイルス、ナバロウイルス、ガインガンウイルス、オークベールウイルス、オボジャングウイルス、オイタウイルス、オウァンゴウイルス、パリークリークウイルス、リオグランデシクリッドウイルス、サンジンバウイルス、シグマウイルス、スリプルウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、チブロガルガンウイルス、キシブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス、ベリマーウイルス、キンバレーウイルス又はウシ流行熱ウイルスである、請求項１２に記載の方法。
  14. 第二の癌療法が化学療法、放射線療法、又は免疫療法である、請求項９に記載の方法。
  15. 配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、又は配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質、又は配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質並びに配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質をコードする単離された腫瘍退縮性ラブドウイルスの有効量を投与するステップを含む、癌患者を治療するための方法。
  16. 腫瘍退縮性ラブドウイルスが、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、内皮、腫瘍内、皮下、又は鼻腔内投与で施される、請求項１５に記載の方法。
  17. 第二の癌療法を施すステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 第二の抗癌療法が第二の腫瘍退縮性ウイルスである、請求項１７に記載の方法。
  19. 第二の腫瘍退縮性ウイルスが、ワクシニア、ヘルペス、麻疹、ニューキャッスル病、アデノウイルス、又はラブドウイルスである、請求項１８に記載の方法。
  20. 第二の抗癌療法が第二の腫瘍退縮性ラブドウイルスを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 第二のラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス、コカールウイルス、イスファハンウイルス、マラバウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス、ボテケウイルス、カルチャキウイルス、エルウイルスアメリカン、グレーロッジウイルス、ユロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルペススプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、ペリネウイルス、ツパイウイルス、ファーミントン、バイアグランデウイルス、ミュアスプリングウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダースウイルス、カメセウイルス、モスケイロウイルス、モスリルウイルス、バルーウイルス、フクオカウイルス、カーンキャニオンウイルス、コルビッソンウイルス、ルダンテックウイルス、キューラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドレイラウイルス、ティンボウイルス、アルムピウォーウイルス、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ブルークラブウイルス、チャールビルウイルス、コースタルプレインズウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス、コールピンヤウイルス、コトンコンウイルス、ランジャウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソウルウイルス、ナバロウイルス、ガインガンウイルス、オークベールウイルス、オボジャングウイルス、オイタウイルス、オウァンゴウイルス、パリークリークウイルス、リオグランデシクリッドウイルス、サンジンバウイルス、シグマウイルス、スリプルウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、チブロガルガンウイルス、キシブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス、ベリマーウイルス、キンバレーウイルス又はウシ流行熱ウイルスである、請求項２０に記載の方法。
  22. 第二の癌療法が化学療法、放射線療法、免疫療法、又は手術である、請求項１７に記載の方法。
  23. 配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、又は
    配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質、又は
    配列番号５のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号５の２４２位にアミノ酸置換を有するＧタンパク質、並びに、配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列及び配列番号４の１２３位にアミノ酸置換を有するＭタンパク質
    をコードする核酸セグメントを有する単離された腫瘍退縮性ラブドウイルスを含む組成物。
  24. 第二の腫瘍退縮性ウイルスをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 第二の腫瘍退縮性ウイルスが、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、アデノウイルス、又はラブドウイルスである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 第二の腫瘍退縮性ウイルスがラブドウイルスである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 第二のラブドウイルスが、カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス、コカールウイルス、イスファハンウイルス、マラバウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス、ボテケウイルス、カルチャキウイルス、エルウイルスアメリカン、グレーロッジウイルス、ユロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルペススプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、ペリネウイルス、ツパイウイルス、ファーミントン、バイアグランデウイルス、ミュアスプリングウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダースウイルス、カメセウイルス、モスケイロウイルス、モスリルウイルス、バルーウイルス、フクオカウイルス、カーンキャニオンウイルス、コルビッソンウイルス、ルダンテックウイルス、キューラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドレイラウイルス、ティンボウイルス、アルムピウォーウイルス、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ブルークラブウイルス、チャールビルウイルス、コースタルプレインズウイルス、ＤａｋＡｒＫ ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス、コールピンヤウイルス、コトンコンウイルス、ランジャウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソウルウイルス、ナバロウイルス、ガインガンウイルス、オークベールウイルス、オボジャングウイルス、オイタウイルス、オウァンゴウイルス、パリークリークウイルス、リオグランデシクリッドウイルス、サンジンバウイルス、シグマウイルス、スリプルウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、チブロガルガンウイルス、キシブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス、ベリマーウイルス、キンバレーウイルス又はウシ流行熱ウイルスである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 組成物が医薬的に許容可能な組成物である、請求項２３に記載の組成物。
  29. 第二の抗癌剤をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 第二の抗癌剤が化学療法的、放射線療法的、又は免疫療法的である、請求項２９に記載の組成物。
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