JP2004525855A - 腫瘍崩壊性ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、通常のヒト病原体ではないウイルスを腫瘍細胞に投与する工程を包含する腫瘍細胞の生存能力を減少させる方法に関する。好ましくは、ウイルスは、正常な細胞がこのウイルスによって影響されない点で異なる感受性を示す。この異なる感受性は、インターフェロンの存在下で目立つ。腫瘍細胞は、ＰＫＲ活性の低レベルまたは無いこと、あるいはＰＫＲ−／−、ＳＴＡＴ１−／−またはＰＫＲ−／−とＳＴＡＴ１−／−の両方によって特徴付けられる。ウイルスは、ラブドウイルスおよびピコルナウイルスからなる群から選択され、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはその誘導体である。

Description

【０００１】
本願は、１９９９年９月１７日に出願された米国特許出願０９／３９７，８７３号からの、米国特許施行規則１．５３（ｃ）（２）のもとで２０００年９月８日における上申書により得られた、１９９９年９月１７日の有効出願日を有する、米国仮特許出願番号＿＿＿＿＿＿＿＿＿の利益を主張する。この内容は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明は、新規癌治療に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞増殖に選択的に感染および阻害するウイルスに関する。
【０００３】
（発明の背景）
ヒトおよび動物における新生物に攻撃するための腫瘍崩壊性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）細菌の使用、腫瘍崩壊性細菌の組成物は、知られている。例えば、ＥＰ ５６４ １２１、ＧＢ １，５８７，２４４およびＵ．Ｓ．３，１９２，１１６は、脊椎動物における腫瘍の液状化および溶解を生じる非病原性細菌の使用を開示する。しかし、多くの症例において、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの使用の場合、腫瘍は、ほんの部分的に破壊され、そして腫瘍の再成長がなおも起こり得る。腫瘍成長の制御を確実にするために、細菌、続いて化学療法薬物（例えば、５フルオロデオキシウリジンまたはアルキル化剤）の投与が示唆されている（例えば、ＧＢ １，０６９，１４４）。
【０００４】
いくつかのウイルスはまた、腫瘍殺傷特性を示すことが示されている（例えば、パルボウイルスＨ−１（Ｄｕｐｒｅｓｓｏｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４９：３２０３−３２０８）、ニューキャッスル疾患ウイルス（Ｒｅｉｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ，５２：４４８−４５３）または薬物感受性遺伝子を含むレトロウイルス（Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，７９：１０４−１１０）。Ｗ０９７／２６９０４ およびＷ０９６／０３９９７は、腫瘍細胞増殖を阻害する変異型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１７６１）を開示する。長反復領域（ＲＬ）のγ３４．５の各コピーにおいて７５９塩基対欠失を含むＨＳＶ−１７１６の腫瘍細胞へ投与は、これらの細胞を殺傷する。しかし、このウイルスは、神経細胞に特異的である。なぜなら、ＨＳＶは、神経系を選択的に阻害することが知られているからである。さらに、腫瘍崩壊性ウイルスとしての一般的な病原体の使用は、限定されている。なぜなら、一般的な人口集団がそのようなウイルスに感染し、そしてそのようなウイルスに対して免疫と獲得しているようであるからである。癌の処置における治療剤として使用されるものに類似するウイルス株に対する既存の免疫応答は、治療剤としてのウイルスの有効性を減弱化し得る。
【０００５】
他のウイルス株が腫瘍崩壊性活性を有することが報告されている。ＯＮＹＸ−０１５ヒトアデノウイルス（ＯＮＹＸ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより生産される）は、ｐ５３陰性腫瘍細胞において優先的に複製すると考えられる。このウイルスは、頭部および頸部の癌患者での臨床試験において有望であることが示されている（Ｋｉｒｎ，Ｄ．，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９８．４：１３４１−１３４２）。レオウイルス３型は、癌治療剤としてＯｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈによって開発されている。これは、ＰＫＲ−／−細胞において優先的に増殖するｃｅｌｌｓ（Ｙｉｎ，Ｈ．Ｓ．，．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７．６７：９３１０１；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｌｅｅ，．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９６．７０：６１２−６１６；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３．１９７：４０５−４１１；Ｍｉｎｕｋ，Ｇ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，１９８７．５：８−１３；Ｒｏｚｅｅ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７８．３５：２９７−３００）。レオウイルスＩＩＩ型は、変異型ｒａｓオンコジーンを発現する細胞において増強された複製特性を示した（Ｃｏｆｆｅｙ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８．２８２：１３３２−１３３４；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ，１９９８．１７：３３５１−１３６２）。ＭｕｎｄｓｃｈａｕおよびＦａｌｌｅｒ（Ｍｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｄ．Ｖ．Ｆａｌｌｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９２．２６７：２３０９２−２３０９８）は、ｒａｓオンコジーン産物がＰＫＲのインヒビターを活性化したことが示され、これはＰＫＲ化学インヒビター２−アミノプリンが正常細胞におけるレオＩＩＩ型の増殖を増加させたという知見と組み合わせて、ＰＫＲがレオウイルスの増殖の重要なレギュレーターであることを示唆する。
【０００６】
ＷＯ ９９／０４０２６は、種々の疾患障害の処置のための、抗体、免疫原、毒素などを含む、広い範囲の産物の発現のための遺伝子治療におけるベクターとしてのＶＳＶの使用を教示する。
【０００７】
インターフェロンは、細胞表面レセプターに結合し、シグナル伝達カスケードを活性化して、最終的に多数の生物学的応答をもたらす循環する因子である。インターフェロンシグナル伝達の結果のうちの２つは、密接に関連している：（１）アンチウイルス応答、および（２）増殖阻害および／またはアポトーシスシグナルの誘発。
【０００８】
米国特許第４，８０６，３４７号は、γインターフェロンおよびＩＮＦ−γのフラグメント（Ａ４α２として知られる）の、ヒト腫瘍細胞に対する使用を開示する。
【０００９】
ＷＯ ９９／１８７９９は、いくつかのヒト癌細胞に対するニューキャッスル疾患ウイルス（ＮＤＶ）およびシンドビスウイルスの細胞傷害性活性を報告する。しかし、両方のウイルスは、腫瘍細胞に対する細胞傷害性活性における選択性を実証した。
【００１０】
ＷＯ ９９／１８７９９は、インターフェロンの正常細胞への添加がこれらの細胞をＮＤＶに対して抵抗性にさせ、なおかつ、この効果が、インターフェロン処置した腫瘍細胞には観察されず、ＮＤＶ誘発された感受性を示し続けたことを開示する。ＷＯ ９９／１８７９９はまた、ＫＢ細胞（頭部および頸部の癌腫）およびＨＴ１０８０（線維芽肉腫）に対するＶＳＶ細胞の細胞傷害性、ならびにインターフェロンの存在下でＶＳＶによる正常細胞および腫瘍細胞における細胞傷害性の緩和を開示する。他の細胞型は、ＶＳＶ細胞傷害性活性に対しては試験されなかった。
【００１１】
ＶＳＶの特定の変異体株が報告されている。Ｓｔａｎｎｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）１６０（１）：２５５−８．Ｆｒａｎｃｏｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）１６０（１）：２３６−４５．Ｓｔａｎｎｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９７５）２９（３）：２８１−９６．Ｓｔａｎｎｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７７）１１（２）：２７３−８１。
【００１２】
本発明は、疾患および癌（好ましくは白血病）の処置において有用であるウイルス処方物に関する。そのような処方物はまた、腫瘍崩壊性ＶＳＶ株および化学薬剤を含み得る（例えば、正常細胞にウイルス感染に対する耐性を付与するが、罹患した細胞または癌細胞はウイルス感染および溶解に対して感受性にしたままにさせるサイトカイン）。
【００１３】
本発明の目的は、先行技術の欠点を克服することである。
【００１４】
上記目的は、独立請求項の特徴部分の組合せによって達成され、そして従属請求項は、本発明のさらなる有利な実施形態を開示する。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、新規癌治療に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞増殖に選択的に感染しそして阻害するウイルスに関する。
【００１６】
本発明によれば、腫瘍細胞の生存性を減ずる方法が提供される。この方法は、その腫瘍細胞にウイルスを投与する工程であって、このウイルスは一般的なヒト病原体ではないことを特徴とする、工程を包含する。好ましくは、その腫瘍細胞は、ＰＫＲ活性を欠如し、そしてそのウイルスは、ラブドウイルスからなる群より選択される。より好ましくは、そのウイルスはＶＳＶである。
【００１７】
本発明はまた、腫瘍細胞の生存性を減ずる方法に関する。この方法は、その腫瘍細胞にウイルスを提供する工程であって、このウイルスは、宿主細胞内のＰＫＲ活性を不活化し得ないことを特徴とする、工程を包含する。好ましくは、このウイルスは、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス、ピコルナウイルス、インフルエンザウイルスおよびアデノウイルスからなる群より選択される。
【００１８】
本発明はまた、細胞の集団内の腫瘍細胞の生存性を減ずる方法に関する。この方法は、ウイルスをその細胞の集団に投与する工程であって、そのウイルスは、その腫瘍細胞に選択的に感染および殺傷し得ることを特徴とする、工程を包含する。好ましくは、このウイルスは、宿主細胞におけるＰＫＲ活性を不活化し得ないことをによってさらに特徴づけられる。
【００１９】
本発明はまた、上記の方法であって、その細胞の集団は、そのウイルスを投与する前にインターフェロンで処置する、方法に関する。
【００２０】
本発明は、ウイルスでの処置に受容性である腫瘍を同定するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）第一の部分および第二の部分にその腫瘍の細胞を含むサンプルを分割する工程；（ｂ）そのウイルスでその第一の部分を処置する工程；ならびに（ｃ）第二の部分におけるよりもその第一の部分における死んだ細胞の割合が高いかどうかを決定する工程であって、その腫瘍は、その第一の部分におけるその死んだ細胞の割合がその第二の部分よりも高い場合そのウイルスでの処置にその腫瘍が受容性である、工程。
【００２１】
本発明は、ウイルスでの処置に受容性である腫瘍を同定するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）第一の部分および第二の部分に、その腫瘍の細胞を含むサンプルを分割する工程；（ｂ）そのウイルスでその第一の部分を処置する工程；ならびに（ｃ）その第二の部分におけるよりも、その第一の部分における死んだ細胞の割合が高いかどうかを決定する工程であって、その第一の部分におけるその死んだ細胞の割合がその第二の部分よりも高い場合そのウイルスでの処置にその腫瘍が受容性である、工程。
【００２２】
本発明は、ウイルスでの処置に受容性である腫瘍を同定するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）第一の部分および第二の部分に、その腫瘍の細胞を含むサンプルを分割する工程；（ｂ）そのウイルスの存在下でインターフェロン応答性細胞の生存性を改善するに十分な量のインターフェロンおよびそのウイルスでその第一の部分を処置する工程、およびインターフェロンの非存在下で、そのウイルスでその第二の部分を処置する工程；ならびに（ｃ）その第二の部分におけるよりも、その第一の部分における死んだ細胞の割合が高いかどうかを決定する工程であって、その第一の部分におけるその死んだ細胞の割合がその第二の部分よりも高い場合そのウイルスでの処置にその腫瘍が受容性である、工程。
【００２３】
本発明は、変異型ＶＳＶがインターフェロン応答性細胞において貧弱に増殖することによって特徴づけられる、変異体ＶＳＶに関する。そのような株はまた、本明細書において、ＶＳＶの弱毒株、またはインターフェロン応答性細胞において貧弱に増殖するＶＳＶ株と称する。それらは、以下に記載されるように、インターフェロン非応答性細胞よりも、インターフェロン応答性細胞の単層においてより少ない斑をそれらが生成することによって同定され得る。弱毒化ＶＳＶ株はまた、以下に記載されるアッセイにおいて、野生型（ＷＴ）Ｉｎｄｉａｎａに比較して、ＰＫＲ＋／−マウスに鼻腔内投与する場合により高いＬＤ５０をそれらが有することによって同定され得る。
【００２４】
本発明はまた、アフィニティーマトリクスを用いてＶＳＶを単離するための方法に関する。この方法は以下の工程を包含する：アフィニティーマトリクスにそのＶＳＶを加えて結合したＶＳＶを生成する工程、その結合したＶＳＶを洗浄する工程、およびそのアフィニティーマトリクスからそのＶＳＶを溶離する工程。本発明において包含されるのはまた、そのウイルスの外側表面における非ネイティブ融合タンパク質を含む、改変されたＶＳＶである。その非ネイティブタンパク質は、アフィニティータグおよびウイルスエンベロープタンパク質を含む融合タンパク質であり得、あるいはそれは、プロデューサー細胞に由来し得る。
【００２５】
本発明はまた、変異体ＶＳＶタンパク質をコードする配列およびそれに相補的な配列を有する、単離された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。そのような核酸分子は、組換えＶＳＶの調製物中でまたはＤＮＡワクチンとして使用され得る。
【００２６】
本明細書において記載されるウイルスの治療ウイルスとしての使用について、他のウイルスに比較して優れたいくつかの利点が以下のように存在する：
＊ラブドウイルスは、一般的なヒトの病原体ではない。例えば、ＶＳＶは、昆虫、齧歯類および家庭用家畜動物においてほとんど見出される。そして従って、大部分の個体は、ＶＳＶに感染しておらず、ＶＳＶ感染に対して免疫もされていない。他方、アデノウイルスまたはレオウイルスは、ヒト病原体であり、そしてほとんどの一般的人口集団がこれらのウイルスの両方に感染し、そして免疫応答を獲得している。癌の処置における治療剤として使用されるものに類似するウイルス株に対する既存の免疫応答は、治療剤としてのウイルスの効力を弱め得；
＊ＶＳＶは、アデノウイルスよりもレオウイルスよりもはるかにより迅速に複製し、そして高い力価に容易に濃縮され得る。高い力価のウイルス調製物の生成は、他の可能なウイルス治療株の有意な限定であり；
＊ＶＳＶは、５つのみの遺伝子を含む単純なウイルスであり、遺伝子操作を行うことが容易に適合される。そのような系は、レオウイルスには現在利用可能ではない。
【００２７】
＊ＶＳＶによる細胞感染は、インターフェロンのようなさらなる化学剤に対して非常に応答性であり、これは、その治療的価値を高める１つの特徴である。
【００２８】
＊ＶＳＶは、広汎な宿主範囲を有し、そしてヒト細胞のほとんどの型に感染し得るが、他方、他のウイルスは、それらが感染し得る細胞型に関してより限定されている。
【００２９】
＊ＶＳＶは、ＲＮＡウイルスであり、そしてその生活環全体を細胞質中で過ごす。従って、ＶＳＶは、患者のゲノムに所望されない組み込みの危険が減る。
【００３０】
まとめると、これらのＶＳＶの属性は、癌溶解生活性を示すことが知られる他のウイルスの使用よりも、顕著な有利性を提供する。
【００３１】
本発明のこの要旨は、本発明の必要な特徴の全てをかならずしも記載したわけではないが、本発明はまた、記載された特徴の下位概念の組合せにおいて特徴が存在し得る。
【００３２】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、新規癌治療に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞に選択的に感染し、そして腫瘍細胞増殖を阻害するウイルスに関する。
【００３３】
以下の説明は、好ましい実施形態のものであり、例示の目的のみであり、そして本発明を実際に実施するために必要な特徴の組合せに対する限定ではない。
【００３４】
癌細胞は、増殖阻害またはアポトーシス経路における変異を獲得することによりそれらの正常な対応物よりも生存において利点を得、そしてインターフェロンの場合、重要な抗ウイルス防禦機構を犠牲にしてそのような利点を得る。腫瘍細胞が、インターフェロン応答遺伝子を変異させることにより顕著な増殖上の利点を得るとき、それらは、ウイルス感染に対してより受容性になる。
【００３５】
腫瘍細胞の「生存能力を減ずる（低減させる）」とは、腫瘍細胞を殺傷するか、またはその増殖を一定期間制限することをのいずれかを意味する。
【００３６】
「通常のヒト病原体ではない」とは、非ヒト宿主（例えば、昆虫、齧歯類および家畜動物であるがそれらに限定されない）においてたいてい見出されるウイルスを意味する。そのようなウイルスは、代表的に、一般的なヒト集団内には見出されない。
【００３７】
本明細書において使用される変異体Ｉ、変異体１、Ｍｕｔ１およびＭ１とは、弱毒化変異体株Ｔ１０２６をいう。変異体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ（および変異体Ｉに類似する改変体命名法）とは、それぞれ、弱毒化変異体Ｔ１０２６Ｒ，ＴＰ３，ＴＰ６およびＧ３１をいう。
【００３８】
本発明の新規癌治療剤は、腫瘍細胞を選択的に標的とし、そしてそれらの破壊をもたらす、少なくとも１つの腫瘍崩壊性ウイルスの使用を組み入れる。好ましくは、その腫瘍崩壊性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）であり、例えば、Ｉｎｄｉａｎａ株または他の株あるいはその誘導体である。ＶＳＶの誘導体により、異なる増殖条件下でそのウイルスを選択することにより得られたＶＳＶウイルスか、またはある範囲の淘汰圧に供されたウイルス、または当該分野において公知の組換え技術を用いて遺伝的に改変されたウイルスのいずれかを意味する。例えば、いかなる様式でも限定すると考慮されるべきではないが、ＶＳＶの誘導体は、本明細書において記載されるインターフェロンで処置されたヒト細胞に対する感染の後に選択された変異体ＶＳＶ、またはアフィニティー精製について有用なアフィニティータグを示すＶＳＶを包含し得る。
【００３９】
腫瘍細胞増殖の腫瘍崩壊性ウイルス抑制の効果は、部分的に、正常細胞と比較して異なる腫瘍細胞の、ウイルス感染に対する感受性にある。理論に拘束されることは望まないが、異なる感受性は、部分的に、細胞内に、そうでなければ腫瘍増殖およびウイルス感染からその細胞を防御するように機能する因子の下方制御または不活化に起因し得る。不活化されたときに腫瘍細胞増殖をもたらし、そしてウイルス感染を媒介することに関与もする因子の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ）およびＰＭＬ（前骨髄球性白血病）。しかし、他の因子もまた役割を果たし得ると理解されるべきである。
【００４０】
ＰＫＲ関連メディエーターを含むがそれらに限定されない、種々の機構を介した、ＰＫＲの下方制御または不活化は、腫瘍細胞増殖に関連することが知られる一方で、正常細胞は活性ＰＫＲを示す。さらに、ウイルス感染に暴露された野生型細胞は、上昇したＰＫＲ発現を示すが、これは、ウイルス複製の抑制を生じ、他方、ＰＫＲの減少した活性を示すかまたは示さない細胞は、ウイルス攻撃に対して受容性であり、そして癌増殖を示す。同様に、ＰＭＬ遺伝子産物は、腫瘍サプレッサーとして機能し、そしてウイルス複製を抑制することが知られている。
【００４１】
「異なる感受性」とは、腫瘍細胞増殖および細胞がウイルス複製を抑制できないことの両方を生じる細胞に関連する特性を意味する。異なる感受性を示す細胞は、本発明の癌治療を用いた腫瘍細胞増殖の処置について好ましい候補である。この異なる感受性は、腫瘍細胞の処置の前またはその間に１つ以上の化学薬剤を加えることを通じて加速され得る。好ましくは、この化学薬剤は、ウイルス感染に対して野生型細胞の耐性を増加するが、ウイルス感染に対する腫瘍細胞の応答に対する効果はほとんどないがその効果はない。そのような化学薬剤の、いかなる様式でも限定するとはみなされるべきではない例は、インターフェロンである。
【００４２】
「ＰＫＲ」とは、ｍＲＮＡ翻訳および遺伝子転写（１，２）の制御下での役割を含む、複数の機能を示すセリン／スレオニンキナーゼを意味する。このキナーゼは、そのアミノ末端調節の半分において２つの二本鎖ＲＮＡ ｄｓＲＮＡ結合モチーフ、およびそのカルボキシ末端において触媒性キナーゼドメインを有する。ｄｓＲＮＡのアミノ末端への結合は、触媒性キナーゼドメインを示しそして活性化する酵素におけるコンフォメーション変化を誘発する。ＰＫＲの発現は、インターフェロンを含むがそれに限定されないＰＫＲメディエーターにより誘発される。
【００４３】
「ＰＫＲメディエーター」とは、遺伝子またはタンパク質のいずれかのレベルでＰＫＲ活性に直接または間接的に影響を与えるタンパク質または化合物を意味し、そしてＰＫＲアクティベーターおよびＰＫＲインヒビターの両方を含む。ＰＫＲアクティベーターの例としては、ＳＴＡＴ１（図１を参照のこと）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）およびインターフェロンが挙げられるがそれらに限定されない。ＰＫＲインヒビターの例としては、ＶＡ ＲＮＡｓ，ｐ５８（ＩＰＫ）、Ｒａｓ経路に関連する因子、リボソームタンパク質Ｌ１８、またはＰＫＲタンパク質を分解するプロテアーゼが挙げられる芽それらに限定されない。ＰＫＲ活性はまた、ＰＫＲをコードする遺伝子へ、またはＰＫＲの発現を駆動する調節領域への変異を通じて媒介され得る。これらの変異は、ＰＫＲ活性を増加または減少のいずれかを行い得る。ＰＫＲ活性を減少するＰＫＲに対する変異は、ＰＫＲのｄｓＲＮＡ結合活性の欠失、または陰性の触媒変異体を生じる変異を包含するがそれらに限定されない。ＰＫＲ活性を増加する変異は、ＰＫＲの過剰発現、またはより活性なＰＫＲタンパク質を生じた変異体を包含するが、それらに限定されない。
【００４４】
ＰＫＲは、タンパク質翻訳の開始に関与する因子であるｅＩＦ−２αのリン酸化を通じて翻訳を調節する。一旦リン酸化されると、ｅＩＦ−２α−ＧＤＰは、ｅＩＦ−２Ｂと不活性複合体を形成し、タンパク質合成の迅速な阻害を生じる。ＰＫＲは、ＮＦκＢの活性化を介して間接的に遺伝子転写に対して影響を与える。この活性化は、ＩκＢキナーゼ（３）のＰＫＲリン酸化により行われるようである。これは、次いで、ＩκＢをリン酸化して、その標的化された破壊をもたらす。
【００４５】
（ＰＫＲ抗ウイルス活性）
多くの異なるウイルス型による細胞の感染は、ｄｓＲＮＡ（例えば、複製中間体）の形成をもたらし、これは、ＰＫＲの活性化を生じ、次いで下流のエフェクターを生じる（図１を参照のこと）。特に、タンパク質合成は、迅速に終結し、そしてアポトーシスカスケードが開始する（４，５）。ＰＫＲの活性化の結果として、新たなビリオンの生成が省略され、そしてその生物中へのウイルスの拡散が制限される。Ｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１２）は、種々のストレスインデューサーに応答して細胞アポトーシスの誘導においてＰＫＲが必要であることを報告する。
【００４６】
理論に束縛されないが、細胞増殖およびアポトーシスを制御する遺伝子において複数の変異の結果として、悪性疾患が生じる可能性がある。その抗増殖性および予備アポトーシス特性と組み合わせた、タンパク質合成を調節することにおけるＰＫＲの役割により、ＰＫＲは、オンコジーン変異についての標的となり、これは、その活性に直接または間接的に影響を与える。
【００４７】
実施例においてより詳細に記載されるように、ＰＫＲ−／−動物を用いるいくつかのウイルスの初期スクリーニングは、ＰＫＲヌル動物が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）による感染に感受性であることを指摘した。同様の結果は、インビトロで得られ、ここで、ＶＳＶ感染は、ＰＫＲ＋／＋線維芽細胞における感染に比較するとき、ＰＫＲ−／−線維芽細胞においてより迅速に進行した。これらの結果は、ＰＫＲがＶＳＶによる感染に対して抵抗するために、哺乳動物細胞により必要とされることを実証する。さらに、特定の細胞株（例えば、初代ヒト骨髄であるがそれに限定されない）は、ＶＳＶ感染に対して耐性であったが、他方、白血病細胞株は、ＶＳＶ感染に対して感受性であった。
【００４８】
減少したかＰＫＲ活性またはＰＫＲ活性のない細胞を選択的に感染する特性を示す、ＶＳＶに関連するウイルス、または類似のウイルス感染機構を示す他のウイルスが同定され得ることが企図される。当業者は、本明細書において記載される方法を用いて他のウイルスを、そのウイルスが細胞の生存性を減少する能力、またはＰＫＲ活性を欠如する細胞（またはＰＫＲ−／−細胞、ＰＫＲ−／−動物、またはＰＫＲ−／−細胞および動物の両方）を殺傷する能力について、容易にスクリーニングし得る。
【００４９】
以下の実施例において指摘するように、インターフェロンでの細胞の前処理は、数桁程度ウイルス感染性を減少させる。理論に束縛されることを所望しないが、インターフェロンを加えることにより、ＰＫＲ発現を上方制御し得、これは、ウイルス感染に対する耐性をこのように増加させる。
【００５０】
その強力な抗ウイルス活性のために、ウイルスは、ＰＫＲを回避する戦略を進化させてきた。例えば、ＨＩＶおよびＣ型肝炎は、ＰＫＲの結合および不活化に向けられたタンパク質をコードする（６，７）。アデノウイルスは、ＰＫＲに結合するが活性化しない小さなＲＮＡ分子（ＶＡ ＲＮＡ）をコードする（８）。インフルエンザウイルスは、細胞タンパク質ｐ５８（ＩＰＫ）に障害を与えて、ＰＫＲを阻害するが、他方ポリオウイルスは、ＰＫＲのタンパク質分解による分解を開始する（９，１０）。ＳＶ４０のラージＴ抗原は、活性化されたＰＫＲの存在下でさえ、ｅＩＦ−２αの下流を、タンパク質翻訳を促進するよう機能させるようである（１０）。
【００５１】
（ＰＫＲおよび腫瘍抑制）
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるドミナントネガティブＰＫＲ触媒性変異体の発現は、その悪性の形質転換をもたらし、そしてヌードマウスモデルにおける腫瘍としての増殖を容易にさせる（１３，１４）。類似の現象が、ｄｓＲＮＡ結合活性を欠如させたＰＫＲ変異体を用いて観察された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＰＫＲの誘導された発現は、酵母における増殖停止をもたらす。これは、ｅＩＦ−２αの非リン酸化可能なバージョンの同時発現によって反転され得る減少である。従って、ＰＫＲは、抗増殖活性を有し、そして腫瘍サプレッサーとして機能する。
【００５２】
広汎なスペクトルのヒト悪性腫瘍において、ＰＫＲが不活化されたか、発現がないかまたは減少したという証拠の筋がいくつか存在する。
【００５３】
＊オンコジーンＲａｓ変異体は、すべてのヒト腫瘍の約３０％において生じるが、他方、上流のＲａｓアクティベーター（すなわち、ＥＧＦレセプター、ｎｅｕレセプター、ＰＤＧＦレセプター）における変異は、さらにより一般的である。ＭｕｎｄｓｃｈａｕおよびＦａｌｌｅｒ（１５，１６）は、オンコジーンＲａｓが誘導したＰＫＲインヒビターを記載した。さらに、Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ（１７）は、Ｒａｓ経路の活性化がＰＫＲ活性の下方調節を生じることを実証した。
【００５４】
＊リボゾームタンパク質Ｌ１８は、原発性直腸結腸癌組織において過剰発現され、そして近年、ＰＫＲに結合しそして不活化することが示された（１８）。
【００５５】
＊５ｑトランスロケーションを伴う患者は、減少したＰＫＲ発現を示す（１９−２１）。
【００５６】
＊インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）は、腫瘍サプレッサー活性を伴う転写因子である。これは、ヒト染色体領域５ｑにマッピングされる。ＰＫＲ遺伝子転写は、ＩＲＦ−１により部分的に調節される。
【００５７】
＊ヒトＰＫＲは、２ｑ２１−２２にマッピングされ、そして近年急性骨髄性白血病の症例においてトランスロケーションの部位であると同定された。
【００５８】
＊貧弱に分化した、高度の悪性腫瘍由来の生検において、ＰＫＲタンパク質は、非常に低レベルで存在したか、または検出不能であった（２３−２５）。
【００５９】
（ＳＴＡＴ１）
ＳＴＡＴ１は、インターフェロン経路の基本的なメディエーターであり、そしてその活性化は、ＰＫＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質の上方制御を生じる（図１を参照のこと）。
【００６０】
インターフェロン耐性黒色腫細胞株および初代黒色腫生検材料（２６）、種々のヒト腫瘍細胞株（骨髄球性白血病、子宮頚癌、卵巣癌および肺癌を含む）（２７）、ならびに胃の腺癌（２８、２９）において、ＳＴＡＴ１のレベル／活性の顕著な欠乏がある。さらに、皮膚のＴ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、一般的にインターフェロンに対して応答性である（しかし、しばしば臨床的耐性がかなりの部分の場合において生じる）悪性疾患である。Ｓｕｎら（３０）は、ＳＴＡＴ１タンパク質がＣＴＣＬ細胞株には存在せず、インターフェロンに対して臨床的に耐性の発達が、ＳＴＡＴ１変異に起因して生じ得ることを示唆することを報告した。
【００６１】
（ＰＭＬ：前骨髄球性白血病遺伝子）
ＰＭＬは、腫瘍サプレッサならびにＦａｓ、ＴＮＦαおよびインターフェロン誘導アポトーシスの鍵レギュレーターとして通常機能するインターフェロン誘導遺伝子である。最近、Ｃｈｅｌｂｉ−Ａｌｉｘらは、ＰＭＬ遺伝子産物の別の正常な機能がウイルス複製を抑制することであることを示した。ＰＭＬ−ＲＡＲ融合タンパク質は、インターフェロン誘導アポトーシスのドミナントネガティブなインヒビターとして機能し、そして本発明者らは、これはまたＡＰＬ細胞をウイルス感染に優先的に感受性にすると予期する。
【００６２】
ＰＫＲタンパク質または活性の下方制御は、幅広いスペクトルのヒト悪性疾患において生じる。癌細胞がＰＫＲまたはＰＫＲメディエーターを除去することによって増殖の利点および抑制されないタンパク質翻訳能力を達成する一方で、これらの細胞は、細胞の一次および潜在的な抗ウイルス防御機構の一つを同時に除去する。従って、減少したＰＫＲ活性を有する腫瘍細胞は、それらの正常な対応物よりも感染により感受性である。上で示されるように、インターフェロン経路の他の構成要素（例えば、ＳＴＡＴ１およびＰＭＬ）は、ヒト悪性疾患においてしばしば変異され、そしてそれらの活性の損失は、腫瘍細胞をウイルス感染に感受性にする。この異なる感受性は、腫瘍細胞増殖の処置のために本発明のウイルスベースの癌治療の使用に対する基礎を形成する。
【００６３】
ＰＫＲヌルマウス系統のいくつかの異なるウイルスを用いたスクリーニングは、ＰＫＲヌル動物が、ワクシニア、インフルエンザおよびＥＭＣＶを含む多くのウイルス感染を抑制し得ることを示した。しかし、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が、ＰＫＲ−／−動物に感染する能力を示した。ＶＳＶ（ラブドウイルスファミリーのメンバー）は、５０の感染性ウイルス粒子（またはプラーク形成単位、ｐｆｆ）ほどの少なさで鼻腔内感染の後に１００％のＰＫＲヌル動物を殺傷することが観測された。対照的に、２０，０００倍を越える多くのＶＳＶ粒子が、感染された野生型同腹仔の半分を殺傷するのに必要であった。
【００６４】
ＶＳＶは、単純な５個の遺伝子ゲノムを有するエンベロープ型のネガティブセンスＲＮＡウイルスである。これは、いくつかの血清学的に異なる研究所の菌株および多数の特徴付けられた変異体を有する非常に良く特徴付けられたウイルスファミリーである。ＶＳＶの天然の宿主には、昆虫、ゲッ歯動物および家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）が挙げられる。一般的に、北アメリカ人は、このウイルスとほとんど接触しない−大部分のヒト感染は、研究所のヒトおよび農場主で発生する。ヒトにおいて感染は、軽い「ｆｌｕ」として無症候性か明かであるかのいずれかである。感染したヒトにおいて重症な疾病または死を報告するケースはない。
【００６５】
野生型の細胞に対して腫瘍細胞を選択的に感染するＶＳＶの能力がまた、観測された。腫瘍細胞株は、一晩の感染の後に、正常な初代細胞線維芽細胞において検出されるよりも１００〜１０００倍高い感染率を示した。さらに、細胞変性効果（ｃｐｅ）は、腫瘍細胞培養において加速された。
【００６６】
ＰＫＲがインターフェロン誘導性遺伝子産物であるので、ＶＳＶに対する曝露の前にインターフェロンを用いた細胞の前処理は、ウイルス感染の効果を決定するために試験された。インターフェロンで前処理された野生型細胞培養物は、ＶＳＶ感染に対して耐性であるが、一方、腫瘍細胞株（例えば、限定しないが、線維肉腫、黒色腫、前立腺癌、白血病および卵巣肉腫）は、ウイルス感染に対して感受性であった（表１、実施例２；図２を参照のこと）。肺癌細胞（ＬＣ８０）はまた、インターフェロンの存在下および非存在下でＶＳＶ感染に感受性であった（データは示さない）。しかし、いくつかの腫瘍細胞株は、インターフェロンの存在下でＶＳＶ感染に対して耐性であった。
【００６７】
卵巣癌細胞、線維肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、肺癌、および白血病細胞は、ＶＳＶ感受性であり、そしてこの感受性は、インターフェロンの存在下で維持され、従って、このような腫瘍細胞およびそれらから誘導される癌は、特にＶＳＶ処理を受け入れ可能であり得る。しかし、他の癌もまた、本明細書中に記載されるように、ウイルス処理が受け入れ可能であり得る。初代細胞腫瘍材料を使用するＶＳＶ感受性に関する研究は、腹水において容易に利用可能である。さらに、腫瘍が腹腔内に含まれるので、ウイルスに基づく治療の局在化された投与に特に適切であると証明され得る。これに関して、患者の腹水からの生きた組織は、インターフェロンの存在下および非存在下においてＶＳＶ感染を支持する腫瘍細胞能力を試験され得る。
【００６８】
ＶＳＶがインビボで治療的活性を有し、そして遠い（転移性）腫瘍増殖を殺傷する能力を有することが期待される。現在まで、処置されたマウスにおいて有意な器官病理学は観測されていないが、ＶＳＶウイルス血症の速度論がさらに研究されることが必要である。ヌードマウスは、ＶＳＶを受容したヒト黒色腫細胞、またはＶＳＶを用いてインビトロで感染されたさらなる黒色腫細胞（実施例５を参照のこと）を移植されて、注射による、数時間にわたる腫瘍に対する感染性粒子の連続的産生を確実にする（図５）。偽感染動物（ＶＳＶ（−）；ビヒクルのみの注射）において、腫瘍は、実験の過程にわたって連続的に増殖した。純粋なウイルスのみを受容した動物は、最初に、最初の４日間にわたって連続的な腫瘍の増殖を示し、この後に、腫瘍がサイズを減少し始め、そしてこの実験の過程にわたってこのようにし続けた。感染した細胞を注射された腫瘍は、増殖を停止し、そして瘢痕組織に似た小さな硬い塊に後退した。より大きな注射された腫瘍のいくつかにおいて、潰瘍が、１〜２日以内で腫瘍上に形成された（図６を参照のこと）。精製ウイルスの注射と感染された黒色腫細胞の両方が有意な後退を引き起こしたが、感染したプロデューサー細胞がより効果的である。
【００６９】
免疫コンピテントマウス腫瘍モデルを用いた研究（すなわち、Ｓｔｒｏｎｇらによって記載される；１７）は、治療的なＶＳＶ感染に応答性の抗体の影響を試験し、腫瘍細胞のＶＳＶ感染が、それらの免疫原性を増加し、そして宿主生物による腫瘍抗原の認識を促進するか否かを決定する。
【００７０】
初代ヒト骨髄はまた、インターフェロン前処理の非存在下でＶＳＶ感染に耐性であることがわかり（表１、実施例２を参照のこと）、これらの細胞がＶＳＶ感染に対して生来の（ｉｎｎａｔｅ）耐性を有することを示す。対照的に、２つの白血病細胞株（Ｍ０７ＥおよびＬ１２１０）はまた、試験され、ＶＳＶ感染に感受性であることが見出され、これは、細胞変性効果、ウイルス増殖および細胞生存能力の減少によって示された。
【００７１】
本明細書中に開示される結果はＶＳＶに関連するが、この文書において概説される方法に従って、当業者は、腫瘍細胞を選択的に殺傷する能力について、他のＶＳＶ菌株、ＶＳＶの誘導体（ＶＳＶの変異体を含む）または関連するウイルスを容易にスクリーニングし得る。いくつかの他の血清学的および生物学的に異なるＶＳＶの菌株が存在し、これらは、この性質について試験され得る。このようなＶＳＶ菌株には、限定しないが、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、Ｐｉｒｙ、Ｃｏｃｃａｌ、およびＣｈａｎｄｉｐｕｒａが挙げられる。他の適切な血清学的に関連しない菌株の同定は、連続的なＶＳＶ注射が、腫瘍を完全に根絶するために必要とされる場合、有用であり得る。さらに、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス）は、正常なヒト組織に対して比較的無害であるが、組織培養物中の形質転換された細胞において非常に増殖することが公知であり、そしてこれらのウイルスがまた使用され得る。さらに、ウイルスの組み合わせが、ＶＳＶを用いて観測される細胞変性効果を増加させるために使用され得る。
【００７２】
正常な細胞または腫瘍細胞のいずれかの存在が、他の細胞型（正常細胞および腫瘍細胞のいずれか）に影響し得、ＶＳＶ感染に対するこれらの細胞のいずれかの耐性または感受性を変えるか否かを決定するために、正常な細胞および線維芽細胞は、ＶＳＶの存在下で同時培養された。培養物は、０．１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで感染され、そして感染がインターフェロンの存在下または非存在下で進行し得た。０、１２、および２４時間（図４）において、培養物は、固定され、ラージＴ抗原（赤い核）に対する抗体を用いて染色されて２９３Ｔ細胞を検出し、ＤＡＰＩ（青い核）（全ての細胞型を染色する）を用いて染色した（図４）。２９３Ｔ細胞（赤い核）の数は、時間の経過の間次第に減少し、そしてウイルス的に誘導されたアポトーシスにより死にかけの細胞に特徴的な非常に濃縮したかまたはフラグメント化した核を示した。形質転換された細胞のこの選択的な破壊は、インターフェロンの存在下および非存在下の両方において観測された。正常な線維芽細胞は、２９３Ｔ細胞が同時培養物内で大量のウイルスを産生したが、核変化を示さず、ＶＳＶ感染に対して応答して減少した数も無かった。これは、細胞集団の混合物が、ＶＳＶを用いて処置され得るが、ＶＳＶに対する腫瘍細胞感受性および正常細胞の耐性をなお維持することを示す。
【００７３】
さらに、多くの変異体のＶＳＶ（例えば、限定しないが、宿主タンパク質合成の停止において与えられるか、インターフェロンに対して多少感受性である変異体）（正常な細胞と腫瘍細胞との間に異なる感染を示し得る）が存在する。例えば、いかなるようにも限定することを意図しないが、ＳＴＡＴ１またはＰＫＲネガティブ細胞に対する親和性を示す他のウイルス変異体は、公知であり、ＰＫＲを不活化し得ないインフルエンザウイルス株が挙げられ、（３６）に記載されている。ＰＫＲ不活化ＶＡ遺伝子を欠くアデノウイルス変異体は、ＰＫＲの非存在下でより良く増殖することが公知である。
【００７４】
本明細書中に記載されるように、インターフェロン応答性細胞に対して乏しく増殖するＶＳＶ変異体が単離された。これらの変異体は、インターフェロン応答性細胞の単層において小さなプラークを形成する能力に基づいて選択された。インターフェロン非応答性細胞（すなわち、腫瘍細胞）について、これらの変異体は、大きなプラークを形成する。インターフェロン応答性細胞におけるプラークのサイズによる変異体の選択は、正常な細胞において乏しく増殖するウイルスの単離を可能にする。しかし、他のＶＳＶ変異体は、異なる選択基準で得られ得る。インターフェロン応答性細胞を使用して単離される変異体は、増幅されて、腫瘍細胞および正常細胞を殺傷する能力について試験された。ここで、理論的説明は、ＶＳＶ変異体（標的細胞にインターフェロンを導入し得る）が、インターフェロン応答性細胞集団におけるそれら自身の複製を制限することである。しかし、これらの同じウイルスは、インターフェロン応答性を欠く腫瘍細胞において制限されない増殖を有する。これらの変異体は、価値がある。なぜなら、正常細胞に対してほとんど細胞変性効果を有さない一方、野生型ＶＳＶよりも腫瘍崩壊性の活性を維持するからである。
【００７５】
４つの変異体（Ｍｕｔ１〜４）は、インターフェロン応答性細胞の単層においてプラークを形成する能力に基づいて得られた。これらの変異体、および野生型ウイルス（１．０ｐｆｕ／細胞のｍｏｉ）を使用して、黒色腫細胞および正常なヒトの包皮線維芽細胞に感染させた。全ての変異体が、効率的に腫瘍細胞を殺傷し得るが、長期の感染が完全に非感染性であるようである後でさえ正常細胞は変異体を用いて感染され得た。この同じｍｏｉにおいて、野生型ＶＳＶが正常細胞に対して細胞変性効果を示した。これらの結果は、変異体ウイルスが、腫瘍細胞を効率的に殺傷する一方、正常な細胞を危害を与えない点、およびそれらがまたより多くのウイルス粒子を作製しそして腫瘍全体にわたって拡散したウイルスを増殖する（実施例４を参照のこと）点で、より大きな治療効果を有することを示す。驚くべきことに、これらの変異体は、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞において野生型ＶＳＶ（Ｉｎｄｉａｎａ）よりも迅速に増殖したが、ＯＳＦ７細胞においてはそうではなかった（実施例２１および図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと）。関心の腫瘍細胞において迅速な増殖を示すが、正常細胞ではそうではないＶＳＶ変異体が好ましい。
【００７６】
より初期の実験は、ＰＫＲ−／−マウスがＶＳＶを用いていくつかの感染経路で殺傷されたが、しかし、これらのマウスは、ウイルスの静脈内注射によっては影響しなかった。血漿成分が接触時にウイルスを不活化したか否かを決定するために、マウスＬ細胞内に含まれるいくつかの供給源から産生されたＶＳＶを、ヒト血清（正常な感染していないドナー由来）とともにインキュベートし、インキュベーションの後にウイルスの力価を決定した（実施例６）。Ｌ細胞産生ＶＳＶのウイルス力価は、４００倍低下したが、一方、ヒト黒色腫において産生されるＶＳＶは、血漿中におけるインキュベーションによって影響されなかった。これらの結果は、ＶＳＶの産生のための細胞株の選択が、重要であることを示す。この観測に基づいて、ヒト血清に対して感受性でない最適量のウイルスを産生するヒト細胞株について、ヒト細胞株をスクリーニングすることが可能である。
【００７７】
理論に束縛されることを望まないが、これらの２つのウイルス調製物における差が、ウイルス増殖細胞の表面において見出されるタンパク質のコホートの性質を反映することがあり得る。その複製サイクルの一部として、ＶＳＶが形質膜を介して出芽し、そしてそのエンベロープに細胞性タンパク質を得る。ウイルス粒子の文脈で発現される場合、Ｌ細胞において見出される特定のタンパク質は、補体を活性化し得る。実際、特定のマウス細胞において産生されるレトロウイルス粒子が血清によって不活化されるが、ヒト細胞株のサブセットにおいて産生された同じウイルスが血漿によって影響しなかったことが先に示された（Ｐｅｎｓｉｅｒｏ、Ｍ．Ｎ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１９９６、７：１０９５〜１１０１）。
【００７８】
ＶＳＶ産生のための従来の技術は、工業的産生にスケールアップすることが困難である。従って、ＶＳＶの精製（アフィニティーマトリクス（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を使用する）が探索される。（実施例７を参照のこと）。しかし、アフィニティー精製のために他のプロトコルがまた使用され得、例えば、限定しないが、ウイルスおよびアフィニティーマトリクスの溶液をバッチ処理し、遠心分離によってＶＳＶ結合したマトリクスをペレット化し、そしてウイルスを単離することが当該分野において公知である。ウイルスの精製のために使用されるアフィニティータグをウイルスに提供するために、当該分野で周知の技術を使用して、その表面に１つ以上のアフィニティータグ（好ましくは、融合ウイルスエンベロープタンパク質）を発現するために、ウイルスが遺伝的に改変され得るか、プロデューサー細胞株が操作されて、膜を通してウイルスが発芽するときに、ウイルスによって必要とされる形質膜上に一つ以上のアフィニティータグを発現し得るが、内因性ウイルスエンベロープタンパク質がまた、使用され得る。一つの十分に特徴付けられたアフィニティータグは、固定化されたニッケルカラムに結合するヒスチジン残基の使用を含むが、他のアフィニティータグが使用され得ることが理解される。
【００７９】
ＶＳＶまたは他のウイルス（ニッケル結合または他のアフィニティータグ性質を有するキメラＶＳＶタンパク質を発現する）のユニバーサルプロデューサーとして作用する細胞株が作製され得る。このユニバーサルプロデューサー細胞は、任意のエンベロープウイルス（エンベロープＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含む）についてのキメラタンパク質（アフィニティータグ）の産生のために使用され得る。核膜を通って発芽するウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）の精製について、核膜において発現されるウイルスエンベロープタンパク質上において発現されるタグが操作される。
【００８０】
他のアフィニティータグには、抗体（好ましくは低塩分、低温度の条件下でまたは決定的なカチオン／アニオンの存在下で特定のペプチドを認識する抗体）が挙げられる。生理学的塩濃度、熱溶出またはキレーションは、溶出を行い得る。ジペプチドまたはトリペプチドに対して産生される抗体もまた、精製のために使用され得る。この様式において、単一のウイルス粒子の表面上の二つ以上これらのタグが、ウイルスの連続的なアフィニティー精製を可能にする。
【００８１】
ＶＳＶは、インビボでの使用のためにその性質を変化させるために遺伝的に改変され得る。ＶＳＶの遺伝的改変のための方法は、当該分野において十分に確立されている。例えば、逆遺伝的システムが、ＶＳＶについて確立されており（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ．およびＪ．Ｋ．Ｒｏｓｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、２４７：１−６）。ウイルスの遺伝的な性質を変えることが可能である。さらに、当業者に周知の標準的な技術を使用して、ＶＳＶを遺伝的に改変し得、そして組換えＶＳＶを産生するためにＶＳＶゲノム内で所望の遺伝子を導入し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００８２】
ＶＳＶは、インビボで所望の部位を標的化して、ウイルス効力を増加し得る。例えば、特定の部位を標的化する融合物を作製するためのＶＳＶ プロテインＧの改変を使用して、インビボのＶＳＶ効力を増加し得る。しかし、ＶＳＶ プロテインＧに加えて、他のタンパク質標的がまた、このような融合タンパク質を作製するために改変され得ることが理解される。このような融合タンパク質は、例えば、限定しないが、腫瘍抗原に対する特異性を有する単鎖Ｆｖフラグメント（Ｌｏｒｉｍｅｒ、Ｉ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６．９３：１４８１５−２０）を含み得る。ＶＳＶ Ｇ融合タンパク質を調製するために使用され得るこのような単鎖Ｆｖフラグメントの例としては、ヒト乳房腫瘍細胞の約８０％に見出される変異ＥＧＦレセプターを標的とするＦｖフラグメントである。
【００８３】
ＶＳＶはまた、プロドラックを毒性代謝物に代謝し得、それによってＶＳＶ感染細胞がプロドラックの投与によって殺傷され得る１つ以上の自殺遺伝子を発現するように改変され得る。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子またはシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むＶＳＶは、ガンシクロビルまたは５−Ｆｃをそれぞれ毒性化合物に変換し得る酵素をコードする。しかし、他の自殺遺伝子がまた利用され得ることが理解される。ガンシクロビル代謝物が、ＨＳＶ ＴＫを発現する細胞だけでなく、すぐ近くの細胞も殺傷することが十分確立されているので、これらの自殺遺伝子を含むｒＶＳＶは、いくつかの利点を示す。例えば、ウイルスによる効果的な殺傷は増加する。なぜなら、一つの感染した細胞が、１０以上の周りの腫瘍細胞を殺傷し、さらに自殺遺伝子を含むｒＶＳＶは、望ましい場合、ウイルスに感染した個体からのウイルスの除去を可能にし得る。これは、ＶＳＶがどのように個体に影響し得るかが明かでない場合に重要であり得る。例えば、免疫無防備状態の個体は、ＶＳＶに対して予期されない感受性であり得る。従って、自殺遺伝子の追加は、ウイルス治療の安全性に対する改善である。
【００８４】
ＶＳＶはまた、哺乳動物遺伝子産物の導入によって改変され得る。このような哺乳動物遺伝子産物は、正常な細胞においてＶＳＶ増殖を制限するが、腫瘍または疾患した細胞においてＶＳＶの増殖を制限しない。例えば、ｐ５３の１つ以上のトランス活性化因子を発現し得るｒＶＳＶは、正常細胞においてアポトーシス経路を活性化するが、腫瘍細胞ではそうではない。このようなｒＶＳＶは、従って、正常細胞においてウイルス拡散を選択的に制限する。しかし、他の哺乳動物遺伝子産物がまたこの目的でＶＳＶ内で発現され得ることが理解される。別の例（いかなるようにも制限するようには考慮されない）は、ＰＫＲ遺伝子である。ＰＫＲ遺伝子を発現するｒＶＳＶは、全ての正常な細胞においてウイルス複製を制限するが、ＰＫＲインヒビターを発現する細胞において、ウイルス的にコードされるＰＫＲが不活化される。１つ以上のＰＫＲインヒビターを発現する細胞の例は、慢性Ｃ型肝炎感染細胞である。Ｃ型肝炎は、２つの公知のＰＫＲのインヒビター（すなわち、ＮＳ５ＡおよびＥ２）をコードするので、ＰＫＲ遺伝子産物をコードするＶＳＶは中和され、そしてＶＳＶが自由に複製され得る。
【００８５】
上の記載は、いかなるようにも本発明を制限することは意図せず、さらに、開示された特徴の組み合わせは、本発明の解決のために絶対的に必要でなくなてもよい。
【００８６】
本発明は、さらに、以下の実施例にさらに説明される。しかし、これらの実施例が、例示の目的のみであり、いかなるようにも本発明の範囲を制限するために使用されるべきではないことが理解される。
【００８７】
（実施例１：ＰＫＲネガティブ細胞は、ＶＳＶ感染に感受性である）
（インビボ実験）
最初の研究は、ＰＫＲ−／−動物および細胞に感染し得るウイルスを同定することに関する。相同組換えストラテジーを使用して、ＰＫＲヌルマウス系統が作製され（３５、参考として援用される）、ウイルス感染と戦う能力について試験された。これらのマウスがＰＫＲ−／−であるので、これらは、ウイルス感染に感受性であるべきである。ウイルスのいくつかの種は、ある範囲の濃度でＰＫＲヌル動物に投与された。
【００８８】
（ＰＫＲヌルマウスの感染）
ＰＫＲヌルマウス系統は、従来のノックアウト技術を使用して作製された（Ａｂｒａｈａｍ、Ｎ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４：５９５３−５９６２）。５匹の雌性マウスのグループ（３ヶ月齢以上）を、種々の量の水疱性口内炎ウイルス（Ｉｎｄｉａｎａ ｓｔｒａｉｎ）を用いて鼻腔内的に感染させた。年齢を一致させた野生型の動物を平行して感染させ、両方のセットの動物を、感染の徴候に基づいて毎日モニターした。これらには、水分、起毛、活性レベル、欲求（食欲）、後肢麻痺、呼吸速度、体重および動物が窮迫していることを示す任意の他の症状が挙げられる。
【００８９】
野生型動物は、ＶＳＶを用いて１０^５ｐｆｕまでの感染の増幅で一過性の症状のみを示すか、ほとんど示さなかった。対照的に、ＰＫＲヌル動物は、非常に迅速に、脱水、起毛、欲求（食欲）の喪失、速い呼吸速度、減少した活性および堅い眼を細くすることを発した。高用量のＶＳＶ感染（１０^５ｐｆｕ）において、動物は、２４時間未満に症状を示し、そして通常、４８時間以内に感染に屈した。２５ｐｆｕの低い感染用量において、１００％のＰＫＲヌル動物が、５日以内にＶＳＶ感染で死亡した。別の実験において、５匹の野生型およびＰＫＲヌル動物のグループを、ＶＳＶでの感染の４８時間後に屠殺し、そして器官を除いてウイルス力価を評価した。ＰＫＲ動物において、肺ホモジネートの１ｍｌ当たり１００万以上のＰＦＵの力価がこのとき見出されたが、野生型動物において、ウイルス力価は肺ホモジネートの１ｍｌ当たり０〜１００ｐｆｕの範囲であった。野生型およびＰＫＲヌル動物において、同様な量のウイルスが脳内に見出された。両マウス系統の組織の残りは、感染後のこの時点では検出不可能なウイルスを有した。
【００９０】
水疱性口内炎ウイルス（ラブドウイルスファミリーのメンバー）は、５０の感染ウイルス粒子（またはプラーク形成単位、ｐｆｕ）ほどの少ない鼻腔内感染の後に１００％のＰＫＲヌル動物を殺傷し得た。対照的に、２０，０００倍を越える多くのＶＳＶ粒子が、感染した正常な同腹仔の半分を殺傷するのに必要とされた。これらの結果は、ＰＫＲヌル動物が、多くのウイルス感染（ワクシニア、インフルエンザおよびＥＭＣＶを含む）を抑制し得る。しかし、ＶＳＶは、ＰＫＲ−／−動物を感染する能力を示した。これらの結果はまた、ＰＫＲがＶＳＶ（Ｉｎｄｉａｎａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｒａｉｎ）によって感染に抵抗するために哺乳動物によって必要である。
【００９１】
（実施例２：ＶＳＶによる腫瘍細胞の選択的殺傷）
（インビトロ実験）
いくつかの腫瘍細胞株を、Ｏｔｔａｗａ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒからランダムに選択し、そしてＶＳＶ感染に対するそれらの感受性を試験した。健康な大人のボランティアからの初代繊維芽細胞培養物または健康なドナーからの初代骨髄サンプルを、コントロール細胞として使用した。
【００９２】
（ＶＳＶによる腫瘍細胞の感染）
ＶＳＶの腫瘍崩壊の性質の第１の試験として、ＶＳＶとの一晩のインキュベーション後のウイルス産物および細胞変性効果を評価した。単層の細胞を、０．１プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）（ｐｆｕ）の多数の感染（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ｍｏｉ）で、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株と共にインキュベートした。ウイルスを３７℃で３０分間吸着させた後、培養物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で全体的にリンスし、次いで、３７℃でさらに１８時間培養した。この時、培養物を細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）（ｃｐｅ）について顕微鏡的に観察し、そして写真を撮った。１８時間目の上清を除去し、そして培地１ｍｌ当たりのウイルスタイターを決定した。いくつかの実験において、感染前に、培養物をヒトαインターフェロン（１００単位／ｍｌ）と一緒に１２時間プレインキュベートした。
【００９３】
類別された細胞型の感染の速度論を調べるために、改変ｃｐｅアッセイ（Ｈｅｉｓｅ、Ｇ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１９９７．３：６３９−６４５）を使用した。本質的には、単層の細胞を、１２ウェルプレートにおいて、０．１ｐｆｕのｍｏｉで感染させた。時間０および１２時間毎に、後の４８時間まで、１つのウェルの感染細胞を、Ｌｅｕｋｏｓｔａｔ固定液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）０．５ｍｌで、２分間固定した。実験の終わりに、製造者の指示に従って、単層をＬｅｕｋｏｓｔａｔ染料１および２で染色した。ＰＫＲは、遺伝子産物を誘導し得るインターフェロンであるので、インターフェロンでの前処理（感染前１２時間のヒトαインターフェロン１００単位／ｍｌ）は、インターフェロンが類別された細胞の培養物内で防御を増強し得るか否かを決定するために試験された。データを表１および図２〜３に示す。
【００９４】
【表１】

表１のデータから、正常ヒト繊維芽細胞は、ウイルスの複製をサポートするが、産生されるウイルスの量および細胞溶解に対する細胞増殖は、腫瘍細胞と比較した場合、実質的に遅れた。感染による前処理後に、ウイルス産生におけるなおより実質的な違いが観察された。正常ヒト繊維芽細胞単層は、感染によるＶＳＶの細胞溶解の影響から完全に防御されたが、腫瘍細胞は感受性のままで、大量のウイルス粒子を産生し、そして急激に細胞溶解した。
【００９５】
肺癌細胞株（ＬＣ８０）および白血病性細胞株（ＡＭＬ５（急性骨髄性白血病５）細胞）を含む他の細胞株もまた、ＶＳＶによって効果的に殺傷されることがわかった。ＡＭＬ５の場合、１．０ｐｆｕ／ｍｌのｍｏｉで、細胞は２４時間以内に完全に殺傷され、一方、０．０００１ｐｆｕ／ｍｌでは、細胞は７２時間以内に殺傷され、さらに、ＶＳＶに対する白血病性細胞の感受性を示した。
【００９６】
図２に示され得るように、単層の腫瘍細胞は、正常ヒト繊維芽細胞と比較した場合、ＶＳＶ感染によってずっとより急速に破壊された。ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ３、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株および卵巣癌細胞Ａ２７８０は全て、感染後１２時間という速さで実質的なｃｐｅを示した。正常ヒト繊維芽細胞の培養物は、感染され、そしてウイルス産生し得る（表１を参照）が、感染の速度論は、この実験において試験された３つの腫瘍細胞株におけるより、実質的により遅かった。さらに、一晩のウイルス増殖アッセイによる場合（表１、図２）、インターフェロンα処置は、正常ヒト繊維芽細胞を完全に防御したが、この３つの腫瘍細胞株をＶＳＶの細胞変性効果から防御するには、効果がなかった。
【００９７】
表１に対して得られた結果は、ＶＳＶによる殺傷に感受性の腫瘍の型を決定するためのスクリーニングストラテジーは、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な腫瘍細胞株のＮＩＨ／ＮＣＩ標準パネル（しかし、これに限定されない）を用いて利用され得ることを示す。これらの細胞株を、感染の種々の初期多重性を用いて、ｃｐｅおよび／またはウイルス増殖を完了するための時間を決定するために、スクリーンする。これらの実験を、インターフェロンの存在下、および非存在下で行い、その結果、ＶＳＶ感受性で、そしてインターフェロンの抗ウイルス活性に耐性のある腫瘍の数および型を決定する。
【００９８】
（白血病のＶＳＶ処置）
ＶＳＶは、１０ｐｆｕ／細胞という高ｍｏｉでさえ、骨髄幹細胞に生産的に感染しなかった（Ｈ−１０７８；表１）。処置された培養物は、それらの幹細胞の特徴を全て保持した。２つの白血病性細胞株（ＭＯ７ＥおよびＬ１２１０；表１）は、一晩の感染に続いて殺傷され、そして大量のウイルスを産生した。
【００９９】
ＶＳＶが癌患者からの初代白血病性細胞を殺傷し得るか否かを決定するために、抹消血サンプルをＡＭＬ患者から得て、そして白血球を収集し、そして１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地に（６ウェルプレートに１０^７／ウェル、各感染２連で）プレートした。細胞を偽の感染、または１０．０／細胞のｍｏｉで感染させた。ＶＳＶは、芽細胞（白血病性芽細胞）の百分率における減少によって示されるように、骨髄白血病性細胞を選択的に殺傷したが、全体の細胞数には、最小限の影響しかなかった（すなわち、好中球が活躍した）。白血病性サンプルは、感染後１６時間で、１０^７ｐｆｕ／ｍｌを超えるＶＳＶのタイターを実現した。サンプル内の芽細胞の数は、感染後２１時間には、劇的に減少したが、正常好中球の割合は増加した。偽の感染をした細胞（−ＶＳＶ）は、単層内にほぼ７０％の芽細胞を含み、一方、ＶＳＶで感染された細胞（＋ＶＳＶ）内では、正常細胞が優勢であった。これらの結果は、ＶＳＶが、正常血液細胞を保持する一方、初代白血病性芽細胞を優先的に殺傷し得ることを示す。
【０１００】
（実施例３：混合培養物における腫瘍細胞の殺傷）
正常ヒト繊維芽細胞および２９３Ｔ腫瘍細胞を、５０：５０の配合でコカルチャーした。２９３Ｔ細胞は、正常細胞ではみられないラージＴ抗原を発現し、この２つの細胞型は、免疫蛍光によって区別され得る。
【０１０１】
この実験において、培養物を０．１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで感染させ、そしてインターフェロンの存在下、または非存在下で感染を進行させた。０、１８、および２４時間に（図４）、培養物を固定し、そして２９３Ｔ細胞を検出するためにラージＴ抗原に対する抗体（赤い核）、および全ての細胞型を染色するＤＡＰＩ（青い核）によって染色した。最初、両方の細胞型は、大きな楕円形の核を有する紡錘体様の形態を示した。１８時間後に、２９３Ｔ細胞（赤い核）の数は、減少し、そして多くの残留した２９３Ｔ細胞は、変化した核の形態を示した。最初の感染から２４時間までに、ほんのわずかな２９３Ｔ細胞が検出され、そして残留したこれらのわずかな細胞は、ウイルス的に誘導されたアポトーシスによって死亡し、激しく凝結された、または断片化された細胞核の特徴を示した。
【０１０２】
形質転換された細胞のこの選択的な破壊は、インターフェロンの存在下および非存在下の両方で観察された。２９３Ｔ細胞は、個カルチャー内で大量のウイルスを産生していたが、正常繊維芽細胞は、核の変化を発現せず、ＶＳＶ感染に対してそれらの数も減少させなかった。
【０１０３】
（実施例４：腫瘍崩壊性薬剤としてのＶＳＶ変異体）
ＶＳＶ変異体を、単層のインターフェロン無効細胞におけるプラークのサイズと比較して、単層のインターフェロン反応性細胞に小さなプラークを形成する、それらの能力に基づいて単離した。インターフェロン反応性細胞において小さなプラークを形成するウイルス分離菌をピックアップし、増殖させ、そして再びクローニングした。このように単離された変異体を、増殖させ、そして腫瘍細胞および正常細胞を殺傷する、それらの能力について試験した。ここでの原理は、標的細胞においてインターフェロンを誘導し得るＶＳＶ変異体を、インターフェロン応答細胞集団における変異体自体の複製を制限することである。しかし、これらの同じウイルスは、インターフェロン応答性を欠く腫瘍細胞において無制限に増殖する。これらの変異体は、細胞崩壊性活性を維持する一方、正常組織に、なおより少ない細胞変性効果を及ぼすはずなので、有用である。
【０１０４】
４つの変異体（Ｍｕｔ １〜４）を、単層のインターフェロン応答性細胞上に小さなプラークを形成するそれらの能力に基づいて得た。これらの変異体は、最初に、Ｌａｕｒｅｎ Ｐｏｌｉｑｕｉｎ博士（モントリオールのケベック大学）によって同定され、そして彼によって提供された。５回目のプラーク精製後に、これらの変異体および野生型ウイルス（１．０ｐｆｕ／細胞のｍｏｉ）を使用して、黒色腫細胞および正常細胞包皮繊維芽細胞を感染させ、感染後１２時間、および２４時間目に、放出されたウイルスのタイターを決定した。
【０１０５】
全ての変異体は、腫瘍細胞を効果的に殺傷し得たが、変異体で感染させた正常細胞は、長時間後でさえ、完全に未感染と思われた。この同じｍｏｉにおいて、野生型ＶＳＶは、正常細胞に対して細胞変性効果を示した。全てのＶＳＶ変異体は、一晩の黒色腫細胞による感染後に、野生型ＶＳＶ細胞より約１０倍多いウイルスを産生することも観察された。正常細胞に対して、変異体１〜４は、野生型ＶＳＶより有意に少ない細胞変性効果を有するが、同様の量のウイルスが感染培養物から産生された。これらの結果は、変異体ウイルスは、正常細胞を保持する一方、腫瘍細胞を効率的に殺傷するという点で、および、変異体ウイルスはまた、より多くのウイルス粒子を産生する能力を有し、そして腫瘍全体に広がるウイルスを増加させるという点で、変異体ウイルスがより大きな治療的効果を有することを示す。
【０１０６】
（実施例５：ヒト腫瘍細胞の異種移植片を保有するヌードマウスの感染）
ヌードマウスに、ヒト黒色腫細胞を移植し、そして群に分けた。１つの群には、偽の注射（ＶＳＶ（−））をし、そしてその他には、数時間の間にわたって腫瘍に感染粒子を連続的に産生する細胞を送達するために、野生型ＢＳＢを注射するか、または腫瘍部位への注射前に１時間、インビトロでＶＳＶを感染させた、さらなる黒色腫細胞を注射した（ＶＳＶ（＋））。これらの実験の結果を図５に示し、図５は、処置された動物および偽の注射を受けた動物における、経時的な平均の腫瘍領域を示す。
【０１０７】
偽の注射を受けた動物の場合（ＶＳＶ（−）；ビヒクルのみを注射）、腫瘍は、実験の間中、連続的に増殖した。純粋なウイルスのみを接種した動物は、最初は腫瘍の連続的な増殖を示したが、注射後４日目には、腫瘍は縮小し始め、そしてこの実験の期間にわたって縮小し続けた。感染細胞を注射された腫瘍は、最も劇的な退化を示した。本質的に、ほとんどの腫瘍は増殖を停止し、そして瘢痕組織に似た、小さな硬い塊に退化した。
【０１０８】
より大きな注射された腫瘍のいくつかにおいて、１〜２日以内に、潰瘍が腫瘍上にでき（図６を参照）、引き続いて、一度に急速に増殖した悪性腫瘍の連続的な縮小が起こった。精製されたウイルスの注射と感染黒色腫細胞の注射の両方は、優位な抗体を引き起こしたが、感染させた産生細胞は、より効果的であった。
【０１０９】
（実施例６：ＶＳＶを産生するための細胞株の選択は、血漿に対するウイルスの感受性に影響を及ぼす）
初期の実験は、ＰＫＲ−／−マウスが、いくつかの感染経路によって、ＶＳＶで殺傷されるが、これらのマウスは、ウイルスの静脈注射によって影響を受けないことを示した。理論で固めたいと考えず、これは、ＰＫＲ−／−血管内皮細胞が組織感染に対して障壁を提供するため、または血漿成分が接触の際、ウイルスを不活性化するためであり得る。この後者の考えを試験するために、マウスＬ細胞内に含むいくつかのソースから産生されたＶＳＶを、（正常の未感染のドナーからの）ヒト血漿と一緒にインキュベートし、そしてインキュベーション後のウイルスタイターを決定した。
【０１１０】
ヒト血清でのＶＳＶのインキュベーション後に、Ｌ細胞産生ＶＳＶのウイルスタイターは、１／４００に低下した。一方、ヒト黒色腫細胞において産生されたＶＳＶは、血漿でのインキュベーションによって影響を受けなかった。
【０１１１】
これらの結果は、ＶＳＶの産生のための細胞株の選択は、決定的でないことを示す。この観察に基づいて、ヒト血漿に感受性でない最適な量のウイルスを産生するヒト細胞株について、ヒト細胞株をスクリーニングすることが可能である。
【０１１２】
（実施例７：ＶＳＶの濃縮および精製のためのストラテジー）
ＶＳＶ産生のための従来の方法としては、遠心分離工程および勾配精製が挙げれレセプター、これらのアプローチの両方は、工業的産生のためにスケールアップすることが難しい。従って、ＶＳＶの精製のための別のプロトコル（例えば、ウイルス粒子の同時濃縮および精製のためのアフィニティカラム）が探索されてきた。
【０１１３】
ウイルスの精製のために使用されるべきアフィニティタグをウイスルに提供するために、内因性タンパク質が使用され得、またはウイルスがその表面に１以上のアフィニティタグを発現するように操作され得、あるいは産生細胞株が、それらの血清膜を介して現れる時に、ウイルスが必要とする、その膜上の１以上のアフィニティタグを発現するように操作され得る。独特のウイルスエンベロープタンパク質は、アフィニティクロマトフラフィーを用いて精製され得る。
【０１１４】
このようなアフィニティタグの１つは、固定化ニッケルカラムに結合するヒスチジン残基の使用を含み得るが、他のアフィニティタグも使用され得ることが理解されるべきである。このアプローチは、細菌性ウイルスＭ１３を用いて試験された。ファージペプチド表示系（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ、１９９９．４０：８８３−８８８）である、ニッケルカラムに結合するペプチドを含む、ヒスチジンを発現するウイルス粒子（しかし、これはイミダゾールで抽出し得る）を用いて、以下を選択した：ＣＴＴＥＲＨＨＴＳＮＣ（配列番号：１）；ＣＬＮＡＨＲＴＴＨＨＨＣ（配列番号：２）；ＣＨＧＬＨＳＮＭＲＨＣ（配列番号：３）；ＣＨＨＨＨＲＬＮＣ（配列番号：４）；ＣＨＳＨＨＨＲＧＣ（配列番号：５）；ＣＷＤＨＨＮＨＨＣ（配列番号：６）；ＣＤＮＮＨＨＨＨＣ（配列番号：７）；ＣＨＨＨＲＩＳＳＨＣ（配列番号：８）。Ｍ１３ファージの表面上におけるこれらのペプチドの発現は、ニッケル樹脂上のウイルスの精製濃縮、および低濃度のイミダゾールを用いる、それらの溶出を引き起こした。
【０１１５】
１以上のこれらの配列は、ＶＳＶ Ｇタンパク質中へ統合され得、ニッケル残基上における、これらのペプチドを保有するウイルス粒子の増加した濃縮を引き起こし得る。この溶出されたウイルスは、その感染性を保持すると予期される。
【０１１６】
このような手法で、ＶＳＶの一般的産生株であり得る細胞株、または他のウイルス（これは、ニッケルに結合する性質を有するキメラＶＳＶタンパク質を発現する）が、産生される。この一般的な産生細胞は、任意のエンベロープされたウイルス（全てのエンベロープされたＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含む）に対するこのようなキメラタンパク質（アフィニティタグ）の産生のために使用され得る。核膜を介して現れるウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）の精製のために、核膜内で発現されたウイルスエンベロープタンパク質上に発現されるべきタグが操作される。
【０１１７】
他のアフィニティタグとしては、抗体、好ましくは、低塩、低温度の条件下で、または決定的なカチオン／アニオンの存在下で、特定のペプチドを認識する抗体が挙げられる。生理学的な塩濃度、温度溶出、またはキレート化が、溶出に影響し得る。ジペプチドまたはトリペプチドに対して生成される抗体もまた
生成のために使用され得る。このように、単一のウイルス粒子の表面上のこれらのタグの２以上のこれらのタグは、引き続いてのウイルスのアフィニティ精製を可能とする。
【０１１８】
（実施例８：慢性的感染を処置するためのＶＳＶの使用）
いくつかのヒトの疾患は、潜伏性ヘルプス感染、肝炎、ＡＩＤＳおよび頸部癌を含む慢性的なウイルス感染、の結果として起こる。これらの場合の各々では、原因となるウイルス因子は、ＰＫＲを含むインターフェロン応答経路の不活性成分に対する機構を発展させた（例えば、Ｃｈｅｌｂｉ−Ａｌｉｘ、Ｍ．Ｋ．およびＨ．ｄｅ Ｔｈｅ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９９．１８：９３５−９４１；．Ｇａｌｅ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９７．２３０：２１７−２２７；Ｇａｌｅ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ、１９９８．１０：１５７−１６２；Ｇａｌｅ、Ｍ．Ｊｒ．およびＭ．Ｇ．Ｋａｔｚｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７．１１：３８３−４０１；Ｂａｒｎａｒｄ、Ｐ．およびＮ．Ａ．ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９．２５９：３０５−３１３）。従って、これらの疾患を患う固体への、ＶＳＶ、あるいはＶＳＶ変異体を含むインターフェロン、またはそれらの組み合わせの投与は、慢性的感染細胞を選択的に除去する。さらなる治療的効果は、細胞またはウイルスレセプターを介して、慢性的感染細胞のみを標的化することによって見つけられ得る。
【０１１９】
（実施例９：ＶＳＶの遺伝子改変）
逆方向遺伝子系が、ＶＳＶに対して確立され（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ．およびＪ．Ｋ．Ｒｏｓｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８．２４７：１−６）、ウイルスの遺伝的性質を変えることが可能となった。
【０１２０】
（インビボでの所望の部位へのＶＳＶの標的化）
現在、ＶＳＶは、ほとんどの哺乳動物細胞型に結合し得るが、細胞内でのその複製が、一度制限され得る（すなわち、ＰＫＲを含むインターフェロン応答性遺伝子産物による）。従って、増殖性感染のために標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を実際に見つけ得る、効果的な量のウイルスは、他の正常組織が提供する「シンク」によって容易に大きく制限され得る。従って、ＶＳＶは、腫瘍細胞のみに結合しそして感染するために、遺伝子的に改変され得る。
【０１２１】
当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、研究室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）が、ＶＳＶ Ｇタンパク質を改変するために使用される。腫瘍抗原に対して特異性を有する一本鎖Ｆｖフラグメント（Ｌｏｒｉｍｅｒ、Ｉ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６．９３：１４８１５−２０）が、ＶＳＶ Ｇタンパク質に融合する。このような一本鎖Ｆｖフラグメントの例は、約８０％のヒト乳房腫瘍細胞上で発見される変異ＥＧＦレセプターを標的とする一本鎖Ｆｖフラグメントである。
【０１２２】
（ＶＳＶ中での自殺遺伝子の発現）
ＶＳＶゲノムは、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子またはシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むように改変される。これらの遺伝子の両方は、プロドラックを毒性化合物（例えば、ガンシクロビルまたは５−ＦＣ）に変換し得る酵素をコードする。この方法で改変されたウイルスは、これらの自殺遺伝子を発現し、これによって、ＶＳＶに感染した細胞がプロドラックの投与によって殺されるのを可能にする。これは、２つの利点を提供する。なぜならば（１）ガンシクロビル代謝産物は、ＨＳＶ ＴＫを発現する細胞だけではなく、すぐ隣の細胞も殺し得ることが十分確立されているからである。この「バイスタンダー効果」は、ウイルスによる効果的な屠殺を増加させ得（すなわち、１つの感染した細胞により１０以上の周りの腫瘍細胞の屠殺を生じ得る）；そして（２）自殺遺伝子を含むＶＳＶはウイルスで感染された固体から所望の場合ウイルスの排除を可能にし得る。
【０１２３】
（インビボでのＶＳＶ増殖の制御）
哺乳動物の遺伝子産物は、ＶＳＶ内で正常細胞中のＶＳＶ増殖を制限するように導入されが、この遺伝子産物は、腫瘍細胞または疾患細胞中でＶＳＶ増殖に影響を与えない。
【０１２４】
ｐ５３の１以上のトランス活性化因子を含む組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ）は、正常細胞（腫瘍細胞ではない）内でアポトーシス経路を活性化する。このようなｒＶＳＶは、正常の組織内で伝播したウイルスに制限されるが、腫瘍細胞内でのウイルスの増殖を可能にする。
【０１２５】
ＰＫＲ遺伝子を含むｒＶＳＶは、全正常細胞中のウイルス複製に制限されず、しかし、ＰＫＲインヒビターを発現する細胞において、ウイルスでコードされたＰＫＲは活性化されない。１以上のＰＫＲインヒビターを発現する細胞の例は、慢性Ｃ型肝炎感染細胞である。Ｃ型肝炎は、２つの公知のＰＫＲのインヒビター（すなわち、ＮＳ５ＡおよびＥ２）をコードし、そして発現するので、ＶＳＶでコードされたＰＫＲ遺伝子産物は、中和され、そしてＶＳＶが自由に複製されるのを可能にする。
【０１２６】
（実施例１０．腫瘍形成転換を伴うインターフェロン応答の進行性喪失）
１００単位のインターフェロンαで前処置されたか、または未処置のままのいずれかである、形質転換の種々の段階のマウス線維芽細胞は、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶを用いて感染させた。ウイルスの産生を標準プラークアッセイによって１８時間測定した。ＭＥＦ：Ｂａｌｂ／Ｃマウス胚から単離されたマウス線維芽細胞初代培養物。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞：不死化マウス胚線維芽細胞。ＰＶＳｒｃ：ウイルスｓｒｃ遺伝子で形質転換されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞。ＭＯＰ８：ポリオーマウイルス大Ｔ抗原で形質転換されたＮＩＳ ３Ｔ３細胞。結果を表２に示す。
【０１２７】
この例において、インターフェロン応答の喪失は、悪性表現型のＶＳＶ感染および進行に対する感受性と相関する。このＭＥＦ細胞は、致命的（すなわち、培地中で限られた寿命を有する）であり、そして完全にインターフェロン応答性である。腫瘍遺伝子ではないがＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、不死化され、そしてＭＥＦよりもインターフェロンに対して約１０，０００倍低い応答性である。ＰＶＳｒｃおよびＭＯ８細胞は、完全な腫瘍遺伝子であり、強力なＶＳＶ複製を支持し、そしてインターフェロン処置によって最小で保護される。
【０１２８】
（表２）

【０１２９】
（実施例１１．未処理またはＩＦＮ処理したいずれかの種々の細胞を一晩感染させた後のウイルス収量）
処理しないかまたは１００単位のＩＦＮ−αで予め処置した種々の正常および形質転換した細胞を、０．１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩでＷＴ Ｉｎｄｉａ ＶＳＶを用いて感染し、３７℃で１８時間かけてインキュベートした。各試料の培養培地を、ＶＳＶの産生のために滴下した。結果を表３に示す。
【０１３０】
この例は、ウイルス産物は、正常な１次組織と比較して一連の腫瘍細胞型中で１０〜１０，０００倍より効果的である。インターフェロンαの存在下で、正常な１次細胞中でのウイルス産物は、ほぼ完全に阻害されるが、腫瘍細胞中で、インターフェロンは、ＶＳＶの複製において、ほとんどまたは全く効果を有さない。
【０１３１】
（表３）

【０１３２】
（実施例１２．ＰＫＲ^＋／−（１２９×Ｂａｌｂ／ｃ）マウスに鼻腔内送達したＷＴおよび変異ＶＳＶについてのＬＤ_５０）
８〜１０週齢の雌のマウスを麻酔させ、各動物の外鼻腔に５０μｌのリン酸緩衝化水溶液（ＰＢＳ）（ＰＫＲ^＋／−；１２９×Ｂａｌｂ／ｃ染料）中で希釈したウイルスで鼻腔内感染させた。致死量５０値を、Ｋｏｒｌｅｒ−Ｓｐｅａｒｍａｎ法を使用して計算した。結果を、表４に示す。
【０１３３】
この例は、特に変異Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩが１２９Ｘ Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける毒性について試験された場合に、広範の型のＩｎｄｉａｎａウイルス株と比較して弱毒化される。
【０１３４】
（表４）

【０１３５】
（実施例１３．ＰＫＲ^−／−マウスは、種々のＰＫＲ^＋／＋マウス株と比較してＶＳＶに精巧に感受性である）
ＰＫＲ^−／−マウスおよびＰＫＲ^＋／＋マウスを、種々の用量で鼻腔内感染させ、そしてそれらの生存について経時的にモニターした。全てのＰＫＲ^−／−マウスは、投与量に依存して２日から５日の間で感染により死んだが、コントロールマウスは、この時点を越えて生存したままであった。結果を表５に示す。
【０１３６】
この実施例は、ＶＳＶ感染に対するマウスの耐性におけるＰＫＲ遺伝子産物の重要性を実証する。
【０１３７】
（表５）

【０１３８】
（実施例１４．ＶＳＶでの感染後にアポトーシスによって屠殺されるＡＭＬ３細胞）
ＯＣＩ／ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病）細胞を、３．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＶＳＶを用いて感染した。感染の１４時間後および２０時間後に、未定試料を分析した。ホスファチジルセリン膜トランスロケーションを伴うアポトーシス細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ／ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＰＥ赤色蛍光タンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって決定した。初期アポトーシス細胞でのミトコンドリア膜の脱分極を、ＪＣ−１電位感応性色素（Ｍｏｌｅｘｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。ＪＣ−１を、蛍光発光の緑色スペクトルから赤スペクトルへシフトする分極化したミトコンドリアによって蓄積する。生存不可のＡＭＬ３細胞を、エチジウム（ＥｔｈＤ−１）ホモジェナイザー−１赤色蛍光活性色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を使用して同定した。アッセイを、製造者の仕様書に従って実施した。結果を表６に示す。
【０１３９】
この例は、ＶＳＶが、ウイルスによって誘導されたアポトーシス経路を介して少なくとも部分的にＡＭＬ細胞を殺すことを実証する。
【０１４０】
【表２】

（実施例１５．変異ＶＳＶ株は、ＡＭＬ細胞に感染しそして屠殺する）
ＯＣＩ／ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病）細胞を、１．０のＭＯＩで感染させ、そして２３時間インキュベートした。未定の細胞をＥｔｈ−Ｄ１（エチジウムダイマー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、製造業者の仕様書に従って生存不可細胞を検出した。計数した１０，０００個の細胞当たりの染色した細胞の数を使用して、死亡率を計算した。結果を図７に示す。
【０１４１】
この実施例により、使用したマウスＶＳＶ染料が、ＡＭＬ細胞を死滅させるのに広範の型のＩｎｄｉａｎａ染料と同じ程度効果的であることが示された。
【０１４２】
【表３】

（実施例１６．ＶＳＶおよびＶＳＶによって感染された細胞は、ヌードマウスにおいて、ヒト黒色腫異種移植片に対する抗腫瘍活性を示す）
ＳＫ−ＭＥＬ−３（黒色腫）誘導化腫瘍を、８〜１０週齢の雌のＢａｌｂ／ｃ無胸腺マウスにおいて展開させた。０日目に、腫瘍は、未処理のままであるか、または培養培地中の１０^８ｐｆｕ ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶもしくは２．５×１０^６のＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶで感染させたＳＫ−ＭＥＬ３細胞（ＶＳＶ産生細胞）で感染させた。以下の信頼値（ｂ：ｐ＜０．０１；ｃ：ｐ＜０．００１；ｄ：ｐ＝０．００７）を用いて各データポイントにおいて処置したグループと未処理のグループとの間の統計学的な差異を計算した。結果を、図７に示す。３日目に、ＶＳＶ産生細胞で処置した腫瘍のみは、未処置の腫瘍よりも有意に少なかった（ａ：ｐ＜０．００１）。グループ間での腫瘍容積の統計学的な有意な差異は、０日目から２日目までは現れなかった。データポイントは、複数の腫瘍からの平均＋／−ＳＥＭを表す（未処理ｎ＝８；ＶＳＶ産生細胞ｎ＝８；ＶＳＶのみｎ＝４）。
【０１４３】
この実施例は、固体の腫瘍に直接的にＶＳＶを単回注射することは、部分的に得られる腫瘍の増殖の完全な後退に大きく影響を与えることを実証する。ウイルスを送達するためのビヒクルとして感染した腫瘍細胞を使用することはまた、有効である。
【０１４４】
（実施例１７．ＰＫＲ^−／−マウスは、鼻腔内ＶＳＶ感染に対して急性的に感受性であり、そしてＩＦＮ媒介耐性における欠乏性を実証する）
（Ａ＆Ｂ）ＰＫＲ^−／−マウスおよびコントロールマウス（Ｂａｌｂ／ｃ×１２９）を５×１０^４ｐｆｕのＶＳＶで鼻腔内に感染させ、そして１４日の過程にわたって移動度および生存度についてモニターした。その後、残った動物は、感染を切り抜けたようであった。結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。ＰＫＲ^−／−マウスは、コントロールマウス（ＷＴ）と比較して生存度がかなり減少（３日または４日で死んだ）することが示され、一方、全てのコントロールマウスは、この感染を切り抜けた。２×１０^４ＩＵ（図８Ａ）または２×１０^５ＩＵ（図８Ｂ）のいずれかでのＩＦＮ−α／β前処理（感染前１８時間）では、ＰＫＲ^−／−動物において保護的効果を有さなかった。
【０１４５】
この例は、インターフェロン経路の単一欠損（ＰＲＫ遺伝子産物の欠如）は、ＶＳＶ感染に耐え得ないマウスを与えるのに十分であることを実証する。この欠損は、感染によって救われ得ない。
【０１４６】
（実施例１８．インターフェロンは、ＶＳＶ処置の間に異種移植片耐性ヌードマウスを保護し得る）
ＳＫ−ＭＥＬ黒色腫細胞を、ＣＤ−１無胸腺ヌードマウス中の皮下に注射した。０日目に、腫瘍に生存ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ（１×１０^９ｐｆｕ）または当量のＵＶで不活化されたＶＳＶのいずれかを注射し、そして毎日測定した。結果を図９に示す。インターフェロンを、示した時間（黒矢印）に動物のサブセットに投与した（ＵＶ−ＶＳＶ ｎ＝４；ＶＳＶ ＩＦＮ ｎ＝６；ＶＳＶ ｎ＝６）。これらの実験において、腫瘍内でＶＳＶの単回注射により、全細胞中で腫瘍を阻害する。全腫瘍は、少なくとも一部の回復、および処置した１２匹にうち３匹において完全な腫瘍の退行を有した。これらの動物が１１日目に屠殺されるまで、ＵＶで不活化されたウイルスを受容する腫瘍は、増殖し続けた。インターフェロンを受容しないヌードマウスおよび生存ウイルスで注射したヌードマウスは、１０日目に死に始め、そして６匹中２匹のみが１５日まで生存したままであった。対照的に、全てのインターフェロンで処置した、感染ヌードマウスをＶＳＶ毒性から保護し、そして４５日以上の間、症状がないままであった。
【０１４７】
この実施例は、生存ＶＳＶの単一の腫瘍内注射は、腫瘍に対して有効であることを実証する。さらに感染された、腫瘍耐性ヌードマウスは、インターフェロン感染によりＶＳＶ毒素から救われ得る。
【０１４８】
（実施例１９．ＶＳＶは白血病および骨髄腫の細胞に感染し、そしてこれらを死滅させる。）
示された細胞株を、細胞１個当たり１つのプラーク形成単位の感染多重度で、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ ＨＲ菌株に感染させた。感染（ｐ．ｉ．）の２４、４８および７２時間後に、サンプルを感染培養物から取り出し、そして製造者の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に従ってプロピジウムヨージドを用いて直接染色した。次いでサンプルを、ＦＡＣＳｓｏｒｔ ＷｉｎＭＤＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．７プログラムを使用するフローサイトメトリーによって分析した。表８において、各白血病細胞型についての死滅した細胞のパーセンテージは、感染の示された時間後に示した。
【０１４９】
この実施例は、ＶＳＶが、白血病型の多様なセットに感染し得、そして殺傷し得ることを示す。Ｋ−５６２細胞は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者から単離されるが、一方、ＭＯＬＴ−４は、Ｔ細胞白血病であり、そしてＳＲおよびＨ９２９は骨髄腫である。
【０１５０】
表８
【０１５１】
【表４】

（実施例２０：野生型Ｉｎｄｉａｎａおよび５種類の弱毒化ＶＳＶ変異体を含む水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）菌株は、正常なヒト線維芽細胞と比較して、ヒト前立腺癌細胞に関して選択的な細胞傷害性を示す。）
野生型Ｉｎｄｉａｎａおよび弱毒化された変異体菌株Ｉ（ＴＲ１０２６）、ＩＩ（ＴＲ１０２６Ｒ）、ＩＩＩ（ＴＰ３）、ＩＶ（ＴＰ６）およびＶ（Ｇ３１）を含む水疱性口内炎ウイルス菌株を、モントリオールのＤｒ．Ｌａｕｒｅｎ Ｐｏｌｉｑｕｉｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｂｅｃから得た。これらのウイルス菌株の各々を、この実験における使用の前に５回プラーク精製した。
【０１５２】
ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣＡＰ）および正常なヒト細胞（ＯＳＦ７前腕線維芽細胞）を、ウェル当たり約５×１０^４細胞の密度まで９６ウェル組織培養プレート中で増殖させた。ウイルスを、５×１０^５ｐｆｕ〜５ｐｆｕの範囲の１０倍希釈物に加えた。ウイルスを含まないコントロールウェルを、各プレートに含めた。このプレートを、５％ＣＯ２下で３７℃で４８時間インキュベートした。細胞傷害性を、比色ＭＴＳ（（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ））アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ，カタログ＃Ｇ１１１２，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１１−５３９９）を用いて数量化し、４９０ｎｍでモニターし、ミトコンドリアの酵素活性を検出した。ウイルス処理したウェルにおける細胞殺傷の量を、未処理ウェルに対するウイルス処理ウェルにおける生存度の損失によって決定した。このデータを、ｐｆｕ／細胞対コントロールに対する細胞殺傷のパーセンテージとしてグラフにプロットした。これらの細胞についてのＴＣ５０を、生存可能な細胞の量における５０％の減少を生じる、ｐｆｕ／細胞でのウイルスの量として算出した。低いＴＣ５０値は、このウイルスの溶解効果に対する細胞の増加した感受性を反映する。各ＶＳＶ菌株についてのインビトロの治療係数を、ＬＮＣＡＰ細胞についてのＴＣ５０と比較したＯＳＦ７細胞についてのＴＣ５０の比として算出した。
【０１５３】
この結果を表９に示す。野生型ＶＳＶ−Ｉｎｄｉａｎａおよび５つの変異体の各々は、低いＴＣ５０値（全て０．０１ｐｆｕ／細胞未満）に反映されるように、ヒト前立腺癌細胞に対する高度な細胞傷害性を示した。正常なヒト線維芽細胞は、６つ全てのＶＳＶ菌株の細胞傷害効果に対して１〜３桁より大きな規模で、より耐性であった。５つ全ての変異体は、正常なＯＳＦ７線維芽細胞に対して少ない毒性を有し、そして野生型ＩｎｄｉａｎａＶＳＶより高いインビトロ治療係数を有した。
【０１５４】
表９．前立腺癌細胞および正常な線維芽細胞に対する、ＶＳＶ菌株（野生型Ｉｎｄｉａｎａおよび変異体Ｉ〜Ｖ）の細胞傷害性アッセイの結果。
【０１５５】
【表５】

（実施例２１：野生型Ｉｎｄｉａｎａおよび種々の変異体ＶＳＶ菌株に感染した腫瘍細胞および正常細胞からのウイルスの産生）
ＨＣＴ １１６結腸癌細胞およびＯＳＦ７前腕線維芽細胞を、３５ｍｍ組織培養皿でコンフルーエンスまで増殖させた。培地を除去し、そしてウイルスを、３０μｌの容量で、ＨＣＴ １１６細胞について０．１ｐｆｕ／細胞およびＯＳＦ７細胞について１．５ｐｆｕ／細胞の感染多重度で加えた。３７℃、５％ＣＯ２での１時間のインキュベーションの後、１ｍｌの組織培養培地をこの皿に加えた。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。示される時点で、培地の１０μｌサンプルをこの皿から取り出した。これらのサンプルのウイルス力価を、プラークアッセイによって決定した。
【０１５６】
この実施例は、ＨＣＴ １１６結腸癌細胞における野生型および変異体のＶＳＶ菌株の急速な複製動力学を示す。４つの変異体ＶＳＶ菌株の全ては、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞において野生型ＶＳＶよりも速い増殖を有する。正常なＯＳＦ−７細胞培養物において、同様の複製動力学を達成するためにはウイルスの１０倍高いインプットが必要であることに注意のこと。
【０１５７】
（実施例２２．悪性細胞は、ＶＳＶ（ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ）感染の後に急速に殺傷され、そしてこれはＩＮＦ−αによって保護されない。）
正常な一次ヒト線維芽細胞（ＡＧ １５２２）およびいくつかの腫瘍細胞株の単層は、未処理であるかＩＮＦ−α（１００単位）で前処理されるかのいずれかであり、次いで０．１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩでＶＳＶに感染させる。１２時間の増殖期で、細胞の固定化および染色によってこの感染を終結し、細胞殺傷の動力学を決定した。コントロール（ＣＮＴＬ）単層を、この実験の過程にわたって増殖、未感染のままにし、そして従ってより激しく染色した。図１１に結果を示す。ＬＮＣＡＰはヒト前立腺癌であり；Ａ２７８０はヒト卵巣上皮癌であり、そしてＳｋ ＭＥＬ３はヒト黒色腫である。
【０１５８】
この実施例は、インターフェロンαの存在下においてもなお、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａによる腫瘍細胞の殺傷の速い動力学を示す。正常細胞もまたＶＳＶによって殺傷されるが、この動力学はより遅く、そして正常細胞はインターフェロンαによって完全に保護され得る。
【０１５９】
（実施例２３：ヒト黒色腫細胞において明らかであるが、ＩＮＦ−αを有するかまたは有さない一次ヒト細胞においては明らかでないＶＳＶ誘導細胞変性効果。）
正常なヒト細胞および未処理またはＩＮＦ−α（１００単位）で前処理されたＳＫ−ＭＥＬ３細胞を有するゼラチンコーティングされたカバーガラスを、０．１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩでＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶに感染させた。結果を図１２に示す。ヒト黒色腫細胞（ＳＫ−ＭＥＬ３）は、インターフェロンの存在下においてでさえも、感染の１２時間後にｃｐｅを示した。感染の２４時間後にこれらの悪性細胞は死滅し、そしてカバーガラスから取り上げた。包皮線維芽細胞（ＡＧ１５２２）、卵巣表面上皮細胞（ＨＯＳＥ）および前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を含むヒト一次細胞は、インターフェロンの非存在下では３６時間までＣＰＥ（細胞変性効果）を示さず、そしてインターフェロンの存在下では感染後７２時間を越えて完全に保護された。
【０１６０】
この実施例は、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａは、インターフェロンαの存在下においてでさえも黒色腫細胞を急速に破壊し得るが、一方で、正常な線維芽細胞および上皮細胞はゆっくりと殺傷され、そしてインターフェロンαによって完全に保護され得ることを示す。
【０１６１】
（実施例２４．ＶＳＶは、正常な線維芽細胞と共に共存培養された形質転換細胞を選択的に殺傷する。）
同数の２９３Ｔ細胞（アデノウイルスＥ１ＡおよびラージＴ抗原を用いて形質転換されたヒト胚腎臓細胞）および正常なヒト包皮線維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたカバーガラス上にプレーティングし、そしてインターフェロンの存在下および非存在下の両方で、０．１のＭＯＩで感染させた（ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ）。細胞を、感染の１２（示さず）、２４および３６時間後に固定した。固定した細胞を、抗ＴＡｇ抗体およびＤＡＰＩで染色した。赤に染色した２９３Ｔ細胞を、インターフェロン処置に関係なく感染の１２時間後の早さで急速に殺傷し、凝縮または断片化した核を示すわずかの細胞が残った。正常な線維芽細胞は、インターフェロンの非存在下で感染の３６時間後で変化した核を示したが、これはインターフェロンの存在下でこの時点を超えてウイルスから保護された。
【０１６２】
この実施例は、正常細胞および腫瘍細胞の混合培養物において、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａが腫瘍細胞を優先的に複製し、そして殺傷することを示す。感染された共存培養物中の正常な細胞はゆっくりと死滅し、そしてインターフェロン処理によって完全にレスキューされ得る。
【０１６３】
（実施例２５．裸のマウスにおけるヒト黒色腫異種移植片の処置における、変異体ＶＳＶの１回の静脈内用量の効力。）
ＳＫ−Ｍｅｌ３ヒト黒色腫異種移植片を、５〜６週齢のＣＤ−１無胸腺症マウスで樹立した。０日目に、腫瘍を未処理のままにしておくか、または示されるような変異体ＶＳＶの５×１０^９ｐｆｕでの静脈内処置のいずれかを行った。結果を図１３に示す。
【０１６４】
この実施例は、変異体ＩＩおよびＩＩＩが、１回の静脈内注射の後に腫瘍の増殖を阻害し得ることを示す。従って、ウイルスは、腫瘍の増殖を阻害するのに有用な腫瘍部位に投与される必要はない。さらに、変異体は、正常なマウス組織における増殖が減弱されるが、依然としてインビボで腫瘍細胞を標的化し得る。
【０１６５】
（実施例２６．正常な骨髄と共存培養されたＡＭＬ細胞の選択的殺傷。）
成長因子に非依存性の細胞株ＯＣＩ／ＡＭＬ３を、正常な骨髄と１：９で混合し、そしてＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶで２４時間感染させた。次いで、細胞の種々の希釈物を、成長因子を加えたメチルセルロースおよび成長因子を除いたメチルセルロースにプレーティングし、そして１４日後にコロニーカウントを行った。表１０は、１０^４個の細胞を受けた皿についてのデータを示す。アスタリスク（＊）は、たとえ皿当たり１０^５個の細胞をプレーティングした場合でも、成長因子を除いた皿で白血病コロニーが検出されなかったことを意味する。
【０１６６】
この実施例は、正常な骨の幹細胞の存在下における白血病細胞の急速かつ選択的な殺傷を示す。さらに、この実施例は、大部分の他の通常の癌治療を伴う場合、骨髄がＶＳＶ腫瘍崩壊治療の用量限定標的ではないことを示す。
【０１６７】
表１０
【０１６８】
【表６】

（実施例２７．ＶＳＶ配列）
ＶＳＶのゲノムは、ウイルスプロテインＮ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬをコードする遺伝子を含む。野生型の耐熱性ＶＳＶ（ＨＲ）および３つの変異体ＶＳＶ由来のこれらのタンパク質についてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のｃＤＮＡ配列を決定し（各５回の配列決定に基づいて）、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ ００１５６０（ＶＳＶのＣｏｌｏｒａｄｏおよびＳａｎ Ｊｕａｎ菌株由来）の配列と比較した。この変異体は、Ｍ２（ＴＲ１０２６Ｒ）、Ｍ３（ＴＰ３）およびＭ４（ＴＰ６）である。この核酸配列を、図１４、１６、１８、２０および２２に示す。対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ図１５、１７、１９、２１および２３に示す。差異を、強調した文字で示す。点線は、不完全な配列決定を示す。
【０１６９】
アミノ酸配列間のいくつかの差異を、カラムの見出しに基づく表記を用いて表１１に示す（すなわち、カラムの見出し「ＧｅｎＢａｎｋとＨＲとの間の差異」について、表記Ｋ１５５Ｒは、１５５位のアミノ酸がＧｅｎＢａｎｋにおいてはＫであり、そしてＨＲにおいてはＲであることを意味する）。ＨＲ配列がまだ入手可能でない場合において、比較は、ＧｅｎＢａｎｋと特定の変異体との間のみでなされ得る。Ｍ３^＊は、変異体３とＨＲとの間の差異を示すが、この場合、アミノ酸はその位置でＧｅｎＢａｎｋ寄託物と一致する（すなわち、変異体３およびＧｅｎｂａｎｋの配列はその位置で一致するが、ＨＲは異なる）。
【０１７０】
このデータは、ＨＲ菌株とＧｅｎＢａｎｋ寄託物（これは、主にＳａｎ Ｊｕａｎ菌株由来である）との間の配列における多くの差異を示す。これはまた、この変異体と、これらが誘導されるＨＲ菌株との間のいくつかの差異を示す。これらの遺伝的差異は、表現型の差異と関連する。
【０１７１】
表１１
【０１７２】
【表７】

全ての引用物は、本明細書中で参考として援用される。
【０１７３】
本発明は、好ましい実施形態に関して記載されてきた。しかし、本明細書中に記載されるような本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化および改変がなされ得ることが当業者に明らかである。
【０１７４】
（参考文献）
１． Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．ら，Ｈｏｗ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８．６７：ｐ．２２７−６４。
２． Ｊａｒａｍｉｌｌｏ，Ｍ．Ｌ．，Ｎ．Ａｂｒａｈａｍ，およびＪ．Ｃ．Ｂｅｌｌ，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＰＫＲ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９５．１３（３）：ｐ．３２７−３８。
３． Ｃｕｄｄｉｈｙ，Ａ．Ｒ．ら，Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ−ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐ５３．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９９．１９（４）：ｐ．２４７５−８４。
４． Ｌｅｅ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ，ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｂｃｌ−２，ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ＩＣＥ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７．２３１（１）：ｐ．８１−８。
５． Ｌｅｅ，Ｓ．Ｂ．およびＭ．Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４．１９９（２）：ｐ．４９１−６。
６． Ｇａｌｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｒ．ら，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＫＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ５Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７．２３０（２）：ｐ．２１７−２７。
７． ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｎ．Ａ．ら，ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ，ＰＫＲ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５．２１３（２）：ｐ．４１３−２４。
８． Ｋｉｔａｊｅｗｓｋｉ，Ｊ．ら，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ＶＡＩ ＲＮＡ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅＩＦ−２ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ．Ｃｅｌｌ，１９８６．４５（２）：ｐ．１９５−２００。．
９． Ｂｌａｃｋ，Ｔ．Ｌ．，Ｇ．Ｎ．Ｂａｒｂｅｒ，およびＭ．Ｇ．Ｋａｔｚｅ，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ６８，０００−Ｍ（ｒ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＲＮＡ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９３．６７（２）：ｐ．７９１−８００。
１０． Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｍ．Ｗ．ら，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｈｓｐ４０ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐ５８ＩＰＫ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＰＫＲ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９７．９４（１）：ｐ．９７−１０２。
１１． Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．ら，Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０ Ｌａｒｇｅ−Ｔ Ｂｙｐａｓｓｅｓ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｃｋ Ｉｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＩＦ−２ａｌｐｈａ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６．２１９（１）：ｐ．３２１−３。
１２． Ｄｅｒ，Ｓ．Ｄ．ら，Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９７．９４（７）：ｐ．３２７９−８３。
１３． Ｍｅｕｒｓ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９３．９０（１）：ｐ．２３２−６。
１４． Ｋｏｒｏｍｉｌａｓ，Ａ．Ｅ．ら，Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２．２５７（５０７７）：ｐ．１６８５−９。
１５． Ｍｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｌ．Ｊ．およびＤ．Ｖ．Ｆａｌｌｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｒａｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ ａｌｐｈａ−ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９２．２６７（３２）：ｐ．２３０９２−８。
１６． Ｍｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｌ．Ｊ．およびＤ．Ｖ．Ｆａｌｌｅｒ，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅＩＦ−２ ａｌｐｈａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９４．７６（８）：ｐ．７９２−８００。
１７． Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ： ｕｓｕｒｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｒｅｏｖｉｒｕｓ．Ｅｍｂｏ Ｊ，１９９８．１７（１２）：ｐ．３３５１−６２。
１８． Ｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｕ．，Ｓ．Ｐ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，およびＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＰＫＲ） ｉｓ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ６０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９９．１９（２）：ｐ．１１１６−２５。
１９． Ｐｅｒａｌｔａ，Ｒ．Ｃ．ら，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ｐ ａｎｄ ５ｑ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９８．７８（５）：ｐ．６００−５。
２０． Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ，Ｓ．ら，ＩＲＦ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５．１１（３）：ｐ．４３９−４５。
２１． Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｌ．ら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＩＲＦ−１ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ５ｑ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６．１２（７）：ｐ．１５９３−６。
２２． Ｌｏｓｓｏｓ，Ｉ．Ｓ．ら，Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（１；２）（ｐ３４；ｐ２１−２２） ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，１９９８．１０６（１）：ｐ．７８−９。
２３． Ｈａｉｎｅｓ，Ｇ．Ｋ．ｄ．ら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ｐ６８） ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｒｅｇｉｏｎ．Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ，１９９３．１１９（１０）：ｐ．１１４２−７。
２４． Ｈａｉｎｅｓ，Ｇ．Ｋ．ら，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ｐ６８） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｃｌ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，１９９３．６３（５）：ｐ．２８９−９５。
２５． Ｓｈｉｍａｄａ，Ａ．ら，Ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９８．５８（１９）：ｐ．４４３４−８。
２６． Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｈ．ら，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＩＳＧＦ３ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ， ＳＴＡＴ１， ＳＴＡＴ２， ａｎｄ ｐ４８−ＩＳＧＦ３ｇａｍｍａ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７．２７２（４５）：ｐ．２８７７９−８５。
２７． Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．，３ｒｄら，Ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９４．１４（２）：ｐ．１４７７−８６。
２８． Ａｂｒｉｌ，Ｅ．ら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇａｓｔｒｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｂｏｔｈ ａｌｐｈａ−ａｎｄ ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１９９６．４７（５）：ｐ．３９１−８。
２９． Ａｂｒｉｌ，Ｅ．ら，Ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＳＴＡＴＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，１９９８．４７（２）：ｐ．１１３−２０。
３０． Ｓｕｎ，Ｗ．Ｈ．ら，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌａｃｋ ｏｆ ＳＴＡＴＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，１９９８．９１（２）：ｐ．５７０−６。
３１． Ｃｈｅｌｂｉ−Ａｌｉｘ，Ｍ．Ｋ．ら，Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１０４３−５１。
３２． Ｃｈｅｌｂｉ−Ａｌｉｘ，Ｍ．Ｋ．ら，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＭＬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ＡＰＬ ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９５．９（１２）：ｐ．２０２７−３３。
３３． Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＭＬ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｂｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ＩＳＲＥ ａｎｄ ａ ＧＡＳ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５．１１（１２）：ｐ．２５６５−７３。
３４． Ｋｏｋｅｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒｓ， ＰＭＬ ａｎｄ ＰＬＺＦ， ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ ｔｏ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９７．９４（１９）：ｐ．１０２５５−６０。
３５． Ａｂｒａｈａｍ，Ｎ．ら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＰＫＲ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９．２７４（９）：ｐ．５９５３−６２。
３６． Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ａ．ら，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＮＳ１ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．２５２（２）：ｐ．３２４−３０。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面に関する以下の説明からより明らかになる。
【図１】
図１は、インターフェロンカスケードの一般的な模式図を示す。
【図２】
図２は、改変されたｃｐｅアッセイにより決定される、インターフェロンの存在および非存在下で、正常ヒト線維芽細胞、ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ３、前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ、および卵巣癌細胞Ａ２７８０に対するＶＳＶの効果を示す。細胞の単層は、１２ウェルプレート中に０．ｌｐｆｕのｍｏｉで感染させた。時間０およびその後１２時間ごとに４８時間まで、感染させた細胞の１ウェルを、０．５ｍｌのＬｅｕｋｏｓｔａｔ固定液で２分間にわたり固定した。実験の終わりに、単層をＬｅｕｋｏｓｔａｔ色素で染色した。
【図３】
図３は、正常な線維芽細胞（図３（ａ））、および腫瘍細胞株（卵巣腫瘍細胞（図３（ｂ））およびＫＢ腫瘍細胞（図３（ｃ））を含む）におけるＶＳＶの細胞殺傷効果を示す。
【図４】
図４は、２４時間の期間にわたり、２９３Ｔ腫瘍細胞とともに共同培養した正常ヒト線維芽細胞に対するＶＳＶの効果を示す。共同培養物には、０．１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで感染させ、そしてその感染を、インターフェロンの存在（ＩＦＮ＋）または非存在（ＩＦＮ−）の下で進行させた。培養物を、ラージＴ抗原に対する抗体（赤い核）で染色して２９３Ｔ細胞を検出し、そしてすべての細胞型を染色するＤＡＰＩ（青い核）で染色した。
【図５】
図５は、ヌードマウス内に移植した腫瘍に対するＶＳＶのインビトロ効果を示す。ヒト黒色腫細胞をヌードマウスに移植し、そして腫瘍部位ＶＳＶ（＋）への注射の前に１時間にわたり、偽注射したか（ＶＳＶ（−））、野生型ＶＳＶを注射した（データは示さず）か、またはインビトロでＶＳＶとともにさらなる黒色腫細胞を注射した。その腫瘍のサイズは、７日間にわたり決定した。
【図６】
図６は、図５に記載されるヌードマウス内で生成した腫瘍上に形成された潰瘍を示す。
【図７】
図７では、ＶＳＶおよびＶＳＶに感染した細胞は、ヌードマウスにおいてヒト黒色腫移植片の増殖を阻害する。
【図８】
図８Ａおよび図８Ｂは、ＰＫＲ−／−マウスは、鼻孔内ＶＳＶ感染に対して急性で感受性であり、そしてＩＦＮ媒介される耐性における欠損を実証する。
【図９】
図９は、インターフェロンは、ＶＳＶ処置の間、移植片を有するヌードマウスを保護し得る。
【図１０】
図１０Ａおよび図１０Ｂでは、野生型Ｉｎｄｉａｎａおよび種々の変異体ＶＳＶ株に感染した、腫瘍細胞および正常細胞からのウイルス生成である。
【図１１】
図１１は、悪性細胞は、ＶＳＶ（ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ）感染の後に迅速に殺傷され、そしてＩＦＮ−αによっては保護されない。
【図１２】
図１２では、ＶＳＶは、ヒト黒色腫細胞において可視の細胞殺傷効果を誘発したが、ＩＦＮ−αを伴うかまたは伴わない初代ヒト細胞では誘発しなかった。
【図１３】
図１３は、ヌードマウスにおけるヒト黒色腫移植片を処置するにおいて、変異体ＶＳＶの単回静脈内用量の効力である。
【図１４】
図１４は、野生型および変異体ＶＳＶのプロテインＮのｃＤＮＡ配列である。
【図１５】
図１５は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＮのアミノ酸配列である。
【図１６】
図１６は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＰのｃＤＮＡ配列である。
【図１７】
図１７は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＰのアミノ酸配列である。
【図１８】
図１８は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＭのｃＤＮＡ配列である。
【図１９】
図１９は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＭのアミノ酸配列である。
【図２０】
図２０は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＧのｃＤＮＡ配列である。
【図２１】
図２１は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＧのアミノ酸配列である。
【図２２】
図２２は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＬのｃＤＮＡ配列である。
【図２３】
図２３は、野生型および変異体のＶＳＶのプロテインＬのアミノ酸配列である。

Claims (73)

1. 腫瘍細胞の生存能力を減少する方法であって、該腫瘍細胞にウイルスを投与する工程を包含し、ここで該ウイルスが、通常のヒト病原体ではなく、そして該腫瘍細胞が、造血性癌細胞、黒色腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、肺癌または結腸癌である、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、肺癌である、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、造血性癌細胞である、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、ここで前記造血性癌細胞が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、ここで前記造血性癌細胞が、白血病である、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、ここで前記白血病が、急性骨髄性白血病である、方法。
7. 請求項５に記載の方法であって、ここで前記白血病が、慢性骨髄性白血病である、方法。
8. 請求項５に記載の方法であって、ここで前記白血病が、前骨髄球性白血病である、方法。
9. 請求項５に記載の方法であって、ここで前記白血病が、Ｔ細胞白血病である、方法。
10. 請求項４に記載の方法であって、ここで前記造血性癌細胞が、リンパ腫である、方法。
11. 請求項４に記載の方法であって、ここで前記造血性癌細胞が、骨髄腫である、方法。
12. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、肉腫である、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、ここで前記肉腫が、骨肉腫である、方法。
14. 請求項１２に記載の方法であって、ここで前記肉腫が、線維肉腫である、方法。
15. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、神経内分泌腫瘍である、方法。
16. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、実質的にＰＫＲ活性を有さない、方法。
17. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、ＰＫＲ−／−；ＳＴＡＴ１−／−；またはＰＫＲ−／−とＳＴＡＴ１−／−の両方である、方法。
18. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、ラブドウイルスまたはピコルナウイルスである、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、ラブドウイルスである、方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスであり、そして前記腫瘍細胞が、白血病である、方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、ＶＳＶを投与する工程の前に、前記腫瘍細胞にインターフェロンを投与する工程をさらに包含する、方法。
22. 請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスが、前記腫瘍細胞内でＰＫＲ活性を不活化することができない、方法。
23. 請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスが、水疱性口内炎ウイルスの弱毒株である、方法。
24. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＭ１株である、方法。
25. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＭ２株である、方法。
26. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＭ３株である、方法。
27. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＭ４株である、方法。
28. 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＭ５株である、方法。
29. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞が、哺乳動物被験体中にあり、そして前記ウイルスが、該被験体への静脈内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与によって該腫瘍細胞に投与される、方法。
30. 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記哺乳動物被験体が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、方法。
31. 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、該ウイルスに感染した細胞株内に含まれ、そして前記投与が、該ウイルス感染細胞株を前記被験体に、腫瘍内経路、静脈内経路、または腹腔内経路から選択される経路によって投与する工程を包含する、方法。
32. ウイルスを用いる処理に感受性の腫瘍を同定するための方法であって、以下：
    （ａ）該腫瘍の細胞を含むサンプルを第１部分および第２部分に分割する工程；
    （ｂ）該第１部分を該ウイルスを用いて処理する工程；および
    （ｃ）該第１部分における死細胞の割合が、該第２部分においてよりも高いか否かを決定する工程、
    を包含し、
    ここで、該第１部分における死細胞の割合が、該第２部分においてよりも高い場合、該腫瘍が、該ウイルスを用いた処理に感受性であり；そして
    ここで、死細胞の割合が、フローサイトメトリーを利用して決定されるか：または該腫瘍が、固形腫瘍であり、そして該サンプルが生検によって被験体から得られるか；または該腫瘍が、白血病であり、そして該サンプルが、該腫瘍細胞を含むサンプルを得るために血液サンプルから白血球を単離することによって得られる、方法。
33. 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、ラブドウイルスである、方法。
34. 請求項３３に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、水疱性口内炎ウイルスである、方法。
35. 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記死細胞の割合が、フローサイトメトリーを利用して決定される、方法。
36. 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記腫瘍が固形腫瘍であり、そして前記サンプルが、生検によって被験体から得られる、方法。
37. 請求項３６に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記細胞を分離させるために前記腫瘍サンプルを処理する工程をさらに包含する、方法。
38. 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記腫瘍が白血病であり、そして前記サンプルが、前記腫瘍細胞を含むサンプルを得るために血液サンプルから白血球を単離することによって得られる、方法。
39. ウイルスを用いる処理に感受性の腫瘍を同定するための方法であって、以下：
    （ａ）該腫瘍の細胞を含むサンプルを第１部分および第２部分に分割する工程；
    （ｂ）該第１の部分を、該ウイルスと該ウイルスの存在下でインターフェロン応答性細胞の生存を改善するのに十分な量のインターフェロンとで処理し、そしてインターフェロンの非存在下で該ウイルスを用いて該第２部分を処理する工程；および
    （ｃ）該第１部分における死細胞の割合が、該第２部分においてよりも高いか否かを決定する工程、
    を包含し、
    ここで、該第１の部分における死細胞の割合が第２部分においてよりも高い場合、該腫瘍が該ウイルスの処理に感受性であり；そして
    ここで、死細胞の割合が、フローサイトメトリーを利用して決定されるか：または該腫瘍が、固形腫瘍であり、そして該サンプルが生検によって被験体から得られるか；または該腫瘍が、白血病であり、そして該サンプルが、腫瘍細胞を含むサンプルを得るために血液サンプルから白血球を単離することによって得られる、方法。
40. 請求項３９に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、ラブドウイルスである、方法。
41. 請求項４０に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、水疱性口内炎ウイルスである、方法。
42. 請求項３９に記載の方法であって、ここで前記死細胞の割合が、フローサイトメトリーを利用して決定される、方法。
43. 請求項３９に記載の方法であって、ここで前記腫瘍が固形腫瘍であり、そして前記サンプルが、生検によって被験体から得られる、方法。
44. 請求項４３に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記細胞を分離させるために前記腫瘍サンプルを処理する工程をさらに包含する、方法。
45. 請求項３９に記載の方法であって、ここで前記腫瘍が白血病であり、そして前記サンプルが、前記腫瘍細胞を含むサンプルを得るために血液サンプルから白血球を単離することによって得られる、方法。
46. 水疱性口内炎ウイルスを精製するための方法であって、該ウイルスを含有するサンプルをアフィニティーマトリクスに添加して該アフィニティマトリクスに結合した該ウイルスを生成する工程；該結合したウイルスを洗浄する工程；および該アフィニティーマトリクスから該結合したウイルスを溶出する工程を包含する方法。
47. 請求項４６に記載の方法であって、ここで前記アフィニティーマトリクスが、ＶＳＶのエンベロープ上に発現されるタンパク質に方向付けられる、方法。
48. 請求項４７に記載の方法であって、ここで前記ＶＳＶのエンベロープ上で発現されるタンパク質がキメラタンパク質である、方法。
49. 請求項４７に記載の方法であって、ここで前記キメラタンパク質が、ヒスチジンタグを含み、そして前記アフィニティーマトリクスがニッケル樹脂である、方法。
50. 表面上に非ネイティブタンパク質を発現する、改変水疱性口内炎ウイルス。
51. 請求項５０に記載の改変ウイルスであって、ここで前記非ネイティブタンパク質が、アフィニティータグおよびウイルスエンベロープタンパク質を含む融合タンパク質である、改変ウイルス。
52. 請求項５０に記載の改変ウイルスであって、ここで前記非ネイティブタンパク質が、プロデューサー細胞に由来する、改変ウイルス。
53. 単離された核酸分子であって、以下：
    （ａ）図１５に示されるＶＳＶのＨＲ株のプロテインＮのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列；または
    （ｂ）図１４に示されるＨＲ、Ｍ２およびＭ３からなる群より選択されるＶＳＶ株のＮ遺伝子ｃＤＮＡ配列；または
    （ｃ）（ｂ）に対応するＲＮＡ配列；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列、
    を含む配列を有する、核酸分子。
54. 単離された核酸分子であって、以下：
    （ａ）図１７に示されるＶＳＶのＨＲ株のプロテインＰのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列；または
    （ｂ）図１６に示されるＨＲおよびＭ３からなる群より選択されるＶＳＶ株のＰ遺伝子ｃＤＮＡ配列；または
    （ｃ）（ｂ）に対応するＲＮＡ配列；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列、
    を含む配列を有する、核酸分子。
55. 単離された核酸分子であって、以下：
    （ａ）図１９に示されるＨＲ、Ｍ３およびＭ４からなる群より選択されるＶＳＶ株のプロテインＭのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列；または
    （ｂ）図１８に示されるＨＲ、Ｍ３およびＭ４からなる群より選択されるＶＳＶ株のＭ遺伝子ｃＤＮＡ配列；または
    （ｃ）（ｂ）に対応するＲＮＡ配列；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列、
    を含む配列を有する、核酸分子。
56. 単離された核酸分子であって、以下：
    （ａ）図２１に示されるＶＳＶのＭ３株のプロテインＧのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列；または
    （ｂ）図２０に示されるＶＳＶのＭ３株のＧ遺伝子ｃＤＮＡ配列；または
    （ｃ）（ｂ）に対応するＲＮＡ配列；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列、
    を含む配列を有する、核酸分子。
57. 単離された核酸分子であって、以下：
    （ａ）図２３に示されるＶＳＶのＭ４株のプロテインＬのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列；または
    （ｂ）図１６に示されるＶＳＶのＭ４株のＬ遺伝子ｃＤＮＡ配列；または
    （ｃ）（ｂ）に対応するＲＮＡ配列；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列、
    を含む配列を有する、核酸分子。
58. 造血性癌細胞、黒色腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、肺癌および結腸癌からなる群より選択される腫瘍細胞の生存能力を減少するための医薬の製造におけるウイルスの使用であって、該ウイルスが、通常のヒト病原体ではない、使用。
59. 請求項５８に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、肺癌である、使用。
60. 請求項５８に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、造血性癌細胞であり、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病またはＴ細胞白血病のような白血病；リンパ腫；または骨髄腫である、使用。
61. 請求項５８に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、肉腫であり、例えば骨肉腫または線維肉腫である、使用。
62. 請求項５８に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、神経内分泌腫瘍である、使用。
63. 請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、実質的にＰＫＲ活性を有さない、使用。
64. 請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が、ＰＫＲ−／−；ＳＴＡＴ１−／−；またはＰＫＲ−／−とＳＴＡＴ１−／−の両方である、使用。
65. 請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の使用であって、ここで前記ウイルスが、ラブドウイルスおよびピコルナウイルスからなる群より選択される、使用。
66. 請求項６５に記載の使用であって、ここで、前記ウイルスが、ラブドウイルスである、使用。
67. 請求項６６に記載の使用であって、ここで、前記ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルスである、使用。
68. 請求項６７に記載の使用であって、ここで、前記腫瘍細胞が白血病であり、ＶＳＶの投与の前に、該腫瘍細胞にインターフェロンが投与される、使用。
69. 請求項６７または６８に記載の使用であって、ここで、前記ウイルスが、水疱性口内炎ウイルスの弱毒株、例えばＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４またはＭ５である、使用。
70. 請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の使用であって、ここで前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞と非腫瘍細胞との集団内にあり、そして前記ウイルスが、該細胞集団に投与される、使用。
71. 請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の使用であって、ここで前記腫瘍細胞が、哺乳動物被験体内にあり、前記ウイルスが、該被験体への静脈内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与によって該腫瘍細胞に投与される、使用。
72. 請求項５８〜７１のいずれか１項に記載の使用であって、ここで前記哺乳動物被験体が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、使用。
73. 請求項５８〜７２のいずれか１項に記載の使用であって、ここで前記ウイルスが、該ウイルスに感染した細胞株内に含まれ、そして前記投与が、該ウイルスに感染した細胞株を該被験体に、腫瘍内経路、静脈内経路、または腹腔内経路から選択される経路によって投与する工程を包含する、使用。

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