CN107557340A - 一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用。所述细胞系为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，所述的弹状病毒构建方法是将病毒聚合酶基因质粒pL及弹状病毒核心骨架质粒pCore双质粒按照特定的比例转染BHK(T7pol/P/N‑TetOn)细胞系快速获得重组弹状病毒。诱导表达T7pol/P/N的载体通过pGag/Pol，pRSV‑Rev和pMD2.G慢病毒质粒系统整合于BHK(TetOn)细胞基因组。本发明能高效的对弹状病毒组装进行快速拯救并完成筛选鉴定，与传统的多质粒拯救系统相比大大的提高重组弹状病毒的拯救效率。

Description

一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
弹状病毒科(Rhabdoviridae)的病毒粒子形态似棒状或子弹状。“Rhabdo”系来自希腊文的“Rhabdos”，意为杆状。病毒粒的大小为(130～380)×70nm，核心为螺旋对称的核壳，内含单股负链RNA。病毒感染宿主细胞时，由病毒粒内的RNA多聚酶转录成mRNA。核壳外层具脂蛋白包膜，膜上有糖蛋白突起。病毒在细胞质内增殖，以芽生方式释放。
一些病毒只在哺乳动物、鱼类、节肢动物或其他无脊椎动物体内增殖，有许多病毒具有节肢动物和脊椎动物体两种寄主，还有一些侵染植物及某些植食性节肢动物。某些侵染脊椎动物的病毒有广泛的实验寄主范围，植物弹状病毒在高等植物中寄主范围窄，有些在介体昆虫体内复制并可在昆虫培养细胞中生长。没有一种弹状病毒在脊椎动物或植物上可垂直传播，有些弹状病毒在植物之间可以机械传播。
以弹状病毒属的水泡性口炎病毒VSV来说，VSV可以在绝大多数体外培养细胞上生长，它增殖迅速在短时间内即可达到很高滴度；同时是一种高效的干扰素诱生剂，且本身对其高度敏感，容易被机体免疫系统识别并清除；只在胞浆内增殖，不会整合到宿主细胞基因组内造成细胞转化。rVSV-EGFP在BHK细胞(仓鼠肾细胞)连续传代10次仍保持绿色荧光蛋白的稳定表达及所有生物学特性不变。VSV的这些特点使其具有巨大的优势和潜力作为一种活病毒疫苗载体和肿瘤治疗载体。
目前国际上已有传统的弹状病毒拯救系统的应用比较局限，受限于四质粒系统在BHK细胞(仓鼠肾细胞)中的拯救效率的问题，一直没有得到广泛的应用，局限性在于质粒之间的竞争性表达以及弹状病毒RNP聚合物需要按照特定的比例组合在一起，才能高效完成病毒的反向遗传系统的运行，反之，三种辅助病毒基因的瞬时转染的量决定了RNP复合物的稳定性，以及对用于包装拯救病毒细胞系的毒性增加，严重影响了重组弹状病毒粒子的拯救效率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用，该细胞系操作简单，具有更高的拯救效率和更好的稳定性。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：
一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系，为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，即稳定表达TetOn3G蛋白的BHK21(IFNAR1KO)细胞，且I型干扰素识别受体基因缺失，保藏日期为2017年8月15日，存活检测日期为2017年8月28日，且结果为存活，保藏编号为CCTCC NO：C2017128，保藏地址为中国武汉武汉大学。
上述可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，包括以下步骤：步骤1，将弹状病毒聚合酶基因质粒pL与弹状病毒核心骨架质粒pCore双质粒按照1：9的比例转染BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞获得重组弹状病毒；步骤2，将诱导表达T7pol/P/N的载体基因通过pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G慢病毒质粒系统整合于BHK(TetOn)细胞基因组，所述的BHK(TetOn)细胞系由合成的TetOn3G的基因片段连接到慢病毒载体FG，整合到BHK21(IFNAR1KO)细胞。
作为改进的是，上述可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
S1，质粒的构建
构建pT7pol、pP、pN质粒，通过特异性引物将弹状病毒磷蛋白基因P、核蛋白基因N以及T7pol RNA聚合酶基因进行扩增，并对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N(对应的简写质粒名称分别为pT7pol、pP、pN)中间过渡质粒；
S2，慢病毒表达载体构建
分别用杀稻瘟菌素BSD、嘌呤霉素Puromycin、新霉素Neomycin三种抗生素标志基因克隆到慢病毒诱导表达载体上，作为慢病毒感染细胞后的筛选标志物；
S3，慢病毒载体构建
通过基因克隆技术，将构建好的pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N中间质粒的相对应的目的基因同源重组到可诱导型的慢病毒表达载体上，形成三种诱导表达慢病毒质粒pGFP-T7pol、pRFP-P和pYFP-N；
S4，BHK21(IFNAR1KO)的细胞构建
利用CRISPR-Cas9的技术，设计针对鼠源IFNAR1的向导RNA(sgRNA)，引导Cas9发生特定位点的基因编辑，产生双链断裂(DSB：Double-strand break)，迫使细胞进行紧急修复，最终将仓鼠胚肾细胞BHK的I型干扰素受体IFNAR1的基因敲除；
S5，稳定表达TetOn3G蛋白的BHK(TetOn)细胞的构建
将可诱导型基因片段，其序列为SEQ ID NO:1，通过酶切连接至慢病毒骨架载体FG上，转化至Stable2感受态细胞，标记为FG-TetOn3G，通过pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G的四质粒系统在293FT细胞中，包装出TetOn3G的慢病毒，慢病毒感染BHK细胞后，在细胞内稳定表达TetOn3G蛋白；
S6，可诱导表达T7pol/P/N的细胞系构建
将构建好的pT7pol-BSD、pP-puro和pN-Neo中间质粒通过慢病毒三质粒包装系统，使T7pol/P/N稳定整合在BHK(TetOn)细胞系基因组上，最终形成可诱导型表达T7pol、P、N的BHK(TetOn-T7pol/P/N)细胞系；
S7，弹状病毒的病毒拯救具体构建
通过将pL质粒和病毒核心骨架质粒pCore共转染BHK(TetOn-T7pol/P/N)细胞系，60h后收集上清，离心纯化得到重组的弹状病毒。
作为改进的是，S1中扩增的条件为98℃预变性2min；再进行32个循环，循环所遵循条件为95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，最后采用72℃延伸10min。
作为改进的是，S1中所述特异性引物的序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
作为改进的是，S7中所述的弹状病毒质粒核骨架载体pCore和聚合酶pL两质粒以9：1的比例共转染细胞，转染用的试剂为Lipofectin LTX。
上述一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系在拯救重组弹状病毒或包装重组弹状病毒上的应用。
有益效果：
本发明填补了国内此项研究领域的空白，成功建立了新型高效的弹状病毒(RV)包装系统，与传统的RV病毒的遗传操作系统相比，具有操作简单快捷，更高的拯救效率，更好的稳定性。为部分RV病毒作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。
与传统的六质粒弹状病毒拯救系统相比，本发明的制备系统能高效的对弹状病毒组装进行快速拯救并快速完成重组弹状病毒的筛选鉴定，大大的提高重组弹状病毒的拯救效率，节约了大量的时间成本。
综上所述，能用于拯救重组弹状病毒的细胞系及其包装病毒的技术方法具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是可诱导性表达弹状病毒基因的细胞系的构建的流程示意图。
图2为BHK(IFNAR1KO)细胞系的相关信息表，其中，(a)为BHK(IFNAR1KO)细胞系的功能鉴定图，(b)为BHK(IFNAR1KO)细胞系的基因水平的鉴定图。
图3为VSV-MuddSumer株病毒在不同细胞内不同时间点复制能力的情况。
图4为BHK(TetOn-T7pol/P/N)细胞系在Dox诱导24h后的表达情况，其中，(a)为诱导的目的蛋白GFP和mCherry的表达的荧光光谱图，(b)为表达的荧光蛋白的柱状图。
图5为实施例3中pCore和pL以不同比例共转染BHK(T7pol/P/N-TetOn)对弹状病毒拯救效率的影响，其中，(a)为荧光光谱图，(b)为共转染的24h，48h，72h时收集的转染上清液中病毒滴度的变化的柱状图。
图6为本发明BHK(T7pol/P/N-TetOn)在双质粒包装弹状病毒的效率与传统的六质粒转染系统的拯救效率的统计学比较。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。
转染用的试剂为LipofectinLTX，购于Thermo公司
实施例1BHK21(IFNAR1KO)细胞
建立IFNAR1基因缺失的BHK21细胞，简称BHK21(IFNAR1KO)细胞，同时在此细胞系的基础上利用慢病毒感染稳定表达TetOn-3G蛋白。
已有研究表明，体外细胞本底水平I型干扰素的产生表达对慢病毒的整合效率具有一定的抑制作用。同时干扰素的表达对弹状病毒的拯救也存在一定的影响(图3)，这个发现促使我们去建立一种I型干扰素通路受损的的细胞模型，该细胞的构建方法如下：
步骤一，将鼠源的IFNAR1(mIFNAR1)通过CRISPR-Cas9的方法敲除：依据CRISPR-Cas9技术，首先通过http://crispr.mit.edu网站设计短链sgRNA，设计mIFNAR1sgRNA序列如表1所示：5’-GAGACGGGAACATGTGGGCAC-3’。将合成的DNA双链通过BbsI酶插入sgRNA表达载体(FG-BB-sgRNA)上。将质粒FG-BB-sgRNA–mIFNAR1和Cas9表达质粒(FG-hEF/HTLV-Cas9)共转染BHK21细胞，48小时候加入puromycin抗生素，筛选48小时，换新鲜的DMEM培养基。
表1 sgRNA序列及PCR引物序列表
序列编号 序列名称 碱基序列
SEQ ID NO:1 sgRNA-F CACCGAGACGGGAACATGTGGGCAC
SEQ ID NO:2 gRNA-R AAACGTGCCCACATGTTCCCGTCTC
SEQ ID NO:3 T-A-F GTGTGAAATGCACGTGGGAC
SEQ ID NO:4 T-A-R TGCTGTGTTTCTTAAGTGACGG
步骤二，随后将筛选到的基因(IFNAR1)敲除的细胞扩大培养，获得IFNAR1敲除的BHK21细胞系，抽提敲除细胞的DNA并通过如下引物进行PCR：forward primer is 5’-GTGTGAAATGCACGTGGGAC-3’，and reverse primer is 5’-TGCTGTGTTTCTTAAGTGACGG-3’，回收PCR产物并进行T-A克隆，随后送样测序。
通过测序的方法检测IFNAR1的敲除效率，如图2(b)所示。由于鼠源的干扰素-β(IFN-β)能够通过识别结合到BHK细胞表面的IFNAR1受体，激活I型干扰素的信号通路，显著的刺激ISRE的表达，因此可以通ISRE-luc和IFN-Rluc两个报告基因系统分别检测正常细胞和IFNAR1基因的敲除细胞，以IFNAR2KO的BHK细胞作为阴性对照。检测IFN-β刺激前后不同基因敲除的细胞的报告基因的表达情况(通过luc活性的检测来确定IFNAR1受体敲除后功能的缺失)。
选择野生型的VSV-MuddSummer株病毒作为BHK基因敲除的细胞感染实验的模型病毒，在感染BHK(IFNAR1KO)的细胞中，不同的时间点收集病毒上清，发现与BHK的空白对照细胞比较，BHK(IFNAR1KO)与VeroE6(IFNAR1KO)的细胞系，在病毒感染24h时对应的病毒载量与对照相比远超过一个数量级(10倍)，表明I型干扰素识别受体基因的缺失增强了病毒对细胞的耐受性，病毒载量的持续提升也间接证明病毒的复制扩增受限于IFN-β的抗病毒作用，将拯救病毒的细胞系统的IFNAR1受体阻断，对病毒的拯救效率的提升有积极作用。
如图2中(a)和(b)实验结果表明BHK21细胞中IFNAR1基因的敲除，有效阻断了IFN-β刺激产生的I型干扰素通路的激活作用。
实施例2
在BHK21(IFNAR1KO)的细胞基础上，构建稳定表达TetOn3G蛋白的BHK细胞系，构建新的细胞系命名为BHK(TetOn)。
将合成的TetOn3G基因片段(南京金斯瑞基因公司合成，所述序列为SEQ ID NO:13)通过酶切，用T4DNA连接酶(NEB公司)进行连接到慢病毒载体FG上，转化到Stable2感受态细胞(购自Invitrogen公司)中，并在本文中记为FG-TetOn-3G，该慢病毒载体系统将目的基因整合到宿主细胞中，稳定持续表达。通过第三代慢病毒包装系统即pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G四质粒系统，在293FT细胞中拯救出慢病毒，将慢病毒FG-TetOn-3G在BHK(IFNAR1KO)的细胞内稳定表达，将此细胞命名为BHK(TetOn)。具体操作分为病毒包装和侵染两个步骤：
A)慢病毒包装：慢病毒包装质粒转染的前一天铺293FT细胞(ATCC：CRL-11268)于24孔板(购自Thermo公司)，300uL DMEM(购自Invitrogen)全培养基(10％FBS,购自Gibco)；待细胞长至60％-80％密度时转染；每孔转染的质粒共约1ug，其中pGag/Pol，pRSV-Rev，pMD2.G，FG-TetOn-3G四种质粒的比例为4:2:1:2。转染8h后，去除培养基，补充1mL新鲜的培养基。48h后收取上清放入EP管中，2500rpm离心4min。取上清液转移到新的EP管中以用于病毒侵染。
B)病毒侵染：在收取病毒前18h，用100uL的DMEM铺10,000个实施例1中构建的BHK21(IFNAR1KO)细胞于96孔板(购自Thermo公司)中。在侵染前，移去约50uL的DMEM。在收取的上清病毒液中加入6ug/mL的polybrene(购自sigma)，混匀，每个96孔中加入约100uL的病毒液。待侵染8-10h后，移去50uL 96孔中的部分培养基，加入100uL新鲜的培养基。72h后即可从96孔板中将细胞传出扩大培养，即得到BHK(TetOn)细胞系，TetOn3G基因序列如SEQID NO:13所示。
SEQ ID NO:13ATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTAG
实施例3
构建可同时诱导表达的pT7pol/pP/pN的BHK(IFNAR1KO)细胞系。
a.三种不同抗性的慢病毒诱导型表达载体的构建方法：
表2引物序列表
首先PCR扩增弹状病毒(以VSV-MuddSummer株为例)的结构P、N、L的特异性引物，VSV-MuddSummer全基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司基因合成，具体序列如SEQ IDNO:14，特异性扩增P、N、L引物的序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12，pT7pol、pP、pN中目的基因进行扩增的条件为98℃预变性2min；再进行32个循环，循环所遵循条件为95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，最后采用72℃延伸10min。
用NotI、AscI(购自NEB公司)双酶切PCR产物和pEntry载体(购自Invitrogen公司)，用T4连接酶(购自NEB公司)连接片段到pDonor骨架载体上，测序鉴定正确后提质粒保存。
本发明具体揭示了一种设计特异引物将弹状病毒的P、N、L基因从模板VSV-MuddSummer株病毒基因中扩增(VSV-MuddSummer全基因序列由金斯瑞合成)，具体序列如SEQ ID NO:14，所述扩增条件为95℃预变性5min；再进行32个循环，循环所遵循条件为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min，最后采用72℃延伸10min。T7pol基因直接从骨架载体pCAGGS-T7中扩增获得，以上所述T7特异性扩增引物序列见表2，引物的序列为SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8。
(1)构建并检测可诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系三种不同抗性的慢病毒诱导型表达载体的构建
通过Gateway cloning技术，将构建好的T7pol、P和N全长的穿梭质粒通同源重克隆到可诱导型(TetOn)的慢病毒表达载体FG-TRE骨架质粒上。其中T7pol同源重组进入慢病毒骨架是TRE启动子，且筛选抗性为BSD的pBSD载体即pBSD-T7pol，基因P同源重组进入慢病毒骨架启动子为TRE，同时共表达GFP，筛选抗性为puromycin的pGFP-puro载体即pGFP-P-puro,同时诱导表达GFP及目的基因P蛋白，基因N同源重组进入慢病毒骨架启动子为TRE，同时共表达mCherry，筛选抗性为Neomycin的pmCherry-Neo载体即pmCherry-N-Neo,同时诱导表达mcherry及目的基因N蛋白，最后通过基因测序完成质粒的构建验证。构建可同时诱导表达的pT7pol/pP/pN的BHK(IFNAR1KO)细胞系。
将构建好的pBSD-T7pol、pGFP-P-puro和pmCherry-N-Neo通过第三代慢病毒包装系统即pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G四质粒系统，将T7pol/P/N在稳定整合在BHK(TetOn)细胞内，记为BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞系。病毒的包装和侵染步骤如上所示。
(2)为了检测Doxcycline(Dox,多西霉素)(购自Sigma)对T7pol/P/N可控诱导表达
在48孔板中，每个孔铺100,000个BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞,200uL DMEM全培养基。24h后，加入Dox，浓度分别为0,10,30,100,300ng/mL。16h后，移去上清中的培养基，用50uL海肾荧光素酶裂解液(购自Promega，E2820)，冰上裂解10min，用移液器吹匀，转移50uL细胞裂解液到荧光素酶检测板(购自Thermo)，每孔加入20uL海肾荧光素酶底物(购自Promega)，用酶标仪来检测(购自Bio-Tek，SynergyH1)荧光素酶活性。
结果如图4显示，BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞系在不加入Dox的时候，其检测的T7pol/P/N相互作用的荧光素酶的活性为本底水平。随着Dox的添加，融合共表达荧光蛋白标签的T7pol/P/N的表达量逐渐增加，同时诱导表达T7pol/P/N的BHK细胞裂解物中荧光素酶的活性逐渐增强。当加入的Dox的浓度为200ng/mL时，其与本底水平的信号值差别达100倍。结果显示，可以通过Dox诱导BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞系来检测T7pol/P/N的表达。
(3)通过T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系检测pCore和质粒pL在特定的转染比例中对病毒拯救系统的效率的影响
i.已知的VSV-MuddSummer核心骨架质粒pCore的载体序列设计以及密码子序列优化均由公司自行设计，pL质粒的基因序列是由特异性引物序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12从VSV-MuddSummer骨架序列中扩增获得，通过XhoI和NheI双酶切克隆到pCAGGS骨架质粒上。如图5(a)的荧光图中所示，在弹状病毒拯救双质粒系统中，pCore：pL以四种不同的比例转染6孔板的细胞，72h后便可以获得有活性的重组病毒粒子，而传统的拯救方式：四质粒系统需要在10cm dish的BHK细胞中才有可能拯救出病毒粒子，相比较，两质粒系统的转染包装效率较六质粒的大大提升，直接反应在所需转染用细胞的数量降低5倍左右，且当pCore:pL在9:1的比例时病毒拯救效率最高。
ii.利用TCID50检测两质粒系统转染BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞系后拯救出的病毒载量，pCore和质粒pL以四种不同比例，在3个不同的转染时间后，收集细胞转染后的上清中，检测上清中病毒载量的变化，如图5(b)的实验结果所示，在两质粒包装系统中转染48h后，细胞上清中的病毒载量已经达到一个峰值，与传统的四质粒系统共转染BHK细胞相比，病毒粒子获得提前了接近24h，同时整个系统在转染72h后，病毒载量还是维持在一个较高水平，病毒粒子的活性比较高，间接证明两质粒系统的稳定性及可靠性。
iii.同时将BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞和BHK-T7的细胞铺在60mm dish中，细胞密度达到80％时，加入100ng/ml Dox诱导BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞和BHK-T7的细胞，诱导6小时后换新鲜的培养基，在BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞转染表达质粒pCore和质粒pL(9:1)共5ug，BHK-T7细胞转染表达质粒pCore/pL/pN/pP，六质粒共9ug的质粒总量，以三种不同的比例分别转染对应的拯救病毒的细胞系，分别在转染48小时和72小时后检测上清中病毒的滴度。结果如图6所示，转染两质粒系统时与传统的四质粒系统相比较，两质粒转染体系的拯救效率超过传统的接近三个数量级。我们的结果显示，在BHK(T7pol/P/N-TetOn)的细胞体系中，利用两质粒拯救系统可以大大提高弹状病毒的拯救效率，尤其是我们案例中提到的水泡性口炎病毒属的各类病毒。
另外，本发明不限于上述实施方式，只要在不超出本发明的范围内，可以采取各种方式实施本发明。
序列表
<110> 南京普菲科医药科技有限公司
<120> 一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
caccgagacg ggaacatgtg ggcac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
aaacgtgccc acatgttccc gtctc 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gtgtgaaatg cacgtgggac 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
tgctgtgttt cttaagtgac gg 22
<210> 5
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
atagcggccg caatgaacac gattaacatc gc 32
<210> 6
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
ttggcgcgcc ctttttacgc gaacgcgaag tcc 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
atagcggccg caatggataa tctcacaaaa gtt 33
<210> 8
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ttggcgcgcc ctttctacag agaatatttg actc 34
<210> 9
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
atagcggccg caatgtctgt tacagtcaag aga 33
<210> 10
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ttggcgcgcc cttttcattt gtcaaattct gactt 35
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
atggaagtcc acgattttga g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
ctaatctctc caagagtttt c 21
<210> 13
<211> 394
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
atgtctagac tggacaagag caaagtcata aactctgctc tggaattact caatggagtc 60
ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120
ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180
gacaggcatc atacccactc ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240
aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300
ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360
tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctag 394

Claims (7)

1.一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系，其特征在于：为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，即稳定表达TetOn3G蛋白的BHK21（IFNAR1 KO）细胞，且I型干扰素识别受体基因缺失，保藏日期为2017年8月15日，存活检测日期为2017年8月28日，且结果为存活，保藏编号为CCTCC NO：C2017128，分类命名为T7pol/P/N BHK(TetOn)仓鼠胚肾细胞，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.基于权利要求1所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1，将弹状病毒聚合酶基因质粒pL与弹状病毒核心骨架质粒pCore双质粒按照1：9的比例转染BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞获得重组弹状病毒；步骤2，将诱导表达T7pol/P/N的载体基因通过pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G慢病毒质粒系统整合于BHK(TetOn)细胞基因组，所述的BHK(TetOn)细胞系由合成的TetOn3G的基因片段连接到慢病毒载体FG，整合到BHK21（IFNAR1 KO）细胞。
3.根据权利要求2所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，质粒的构建：构建pT7pol、pP、pN质粒；通过特异性引物将弹状病毒磷蛋白基因P、核蛋白基因N以及T7pol RNA聚合酶基因进行扩增，并对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N中间过渡质粒；S2，慢病毒表达载体构建：分别采用杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、新霉素三种抗生素标志基因作为慢病毒感染细胞后的筛选标志物，克隆到慢病毒诱导表达载体上；S3，慢病毒载体构建：通过基因克隆技术，将构建好的pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N中间质粒的相对应的目的基因同源重组到可诱导型的慢病毒表达载体上，形成三种诱导表达慢病毒质粒pGFP-T7pol、pRFP-P和pYFP-N；S4，BHK21（IFNAR1 KO）的细胞构建：利用CRISPR-Cas9的技术，设计针对鼠源IFNAR1的sgRNA，引导Cas9发生特定位点的基因编辑，产生双链断裂（DSB：Double-strandbreak），迫使细胞进行紧急修复，最终将仓鼠胚肾细胞BHK的I型干扰素受体IFNAR1的基因敲除；S5，稳定表达TetOn3G蛋白的BHK（TetOn）细胞的构建：将可诱导型基因片段，其序列为SEQ ID NO:1，通过酶切连接至慢病毒骨架载体FG上，转化至Stable2感受态细胞，标记为FG-TetOn3G，通过pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G的四质粒系统在293FT细胞中，包装出TetOn3G的慢病毒，慢病毒感染BHK细胞后，在细胞内稳定表达TetOn3G蛋白；S6，可诱导表达T7pol/P/N的细胞系构建：将构建好的pT7pol-BSD、pP-puro和pN-Neo通过慢病毒三质粒包装系统，使T7pol/P/N稳定整合在BHK(TetOn)细胞系基因组上，最终形成可诱导型表达T7pol、P、N的BHK(TetOn-T7pol/P/N)细胞系；S7，弹状病毒（以VSV MuddSummer亚型株为例）的病毒拯救具体构建：通过将pL质粒和病毒核心骨架质粒pCore共转染BHK(TetOn-T7pol/P/N)细胞系，60h后收集上清，离心纯化得到重组的弹状病毒。
4.根据权利要求3所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，S1中pT7pol、pP、pN中目的基因进行扩增的条件为98℃预变性2min；再进行32个循环，循环所遵循条件为95℃ 变性30s，58℃退火30s，72℃ 延伸2min，最后采用72℃ 延伸10min。
5.根据权利要求3所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，S1中扩增的条件为98℃预变性2min；再进行32个循环，循环所遵循条件为95℃ 变性30s，58℃退火30s，72℃ 延伸2min，最后采用72℃ 延伸10min。
6.根据权利要求3所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，S7中所述的弹状病毒质粒核骨架载体pCore和聚合酶pL两质粒以9：1的比例共转染细胞，转染用的试剂为Lipofectin LTX。
7.基于权利要求1所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系在拯救重组弹状病毒或包装重组弹状病毒上的应用。
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