CN102026645B - 溶瘤弹状病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒的组合物和方法以及它们作为抗癌治疗剂的用途。此类弹状病毒具有在体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。

Description

溶瘤弹状病毒
发明背景
本发明要求于2006年9月15日提交的美国临时申请系列60/844,726的优先权，所述临时申请系列的全部内容通过引用合并入本文。
I.发明领域
本发明总地说来涉及病毒学和药物。在某些方面，本发明涉及溶瘤病毒，特别是非VSV溶瘤弹状病毒和包含非VSV糖蛋白的溶瘤弹状病毒。
II.背景
许多病毒已显示在许多种肿瘤细胞中复制并且在体外杀伤它们(辛德比斯病毒(Unno等人，2005)、仙台病毒(Kinoh等人，2004)、柯萨奇病毒(Shafren等人，2004)、单纯疱疹病毒(Mineta等人，1995)、细小病毒(Abschuetz等人，2006)、腺病毒(Heise等人，2000)、脊髓灰质炎病毒(Gromeier等人，2000)、新城疫病毒(SinkovicsandHorvath，2000)、水泡性口膜炎病毒(Stojdl等人，2000)、麻疹病毒(Mealesvirus)(Grote等人，2001)、呼肠病毒(Coffey等人，1998)、逆转录病毒(Logg等人，2001)、痘苗病毒(Vaccinia)(Timiryasova等人，1999)、和流感病毒(Influenza)(Bergmann等人，2001))。此外，此类病毒已证明在治疗癌症的动物模型中是有功效的。
水泡性口膜炎病毒(VSV)为熟知的和详尽研究的弹状病毒，已显示其在细胞培养实验中杀伤肿瘤细胞系，并且已经证明其在多种基底细胞癌(rodentcancer)模型中的功效(Stojdl等人，2000；Stojdl等人，2003)。然而，VSV不杀伤所有癌细胞。
发明概述
几种新鉴定的弹状病毒在杀伤特定的癌症或癌细胞系方面比VSV更加有效得多。此外，VSV和减毒的VSV突变体具有神经毒性并且在啮齿类和灵长类动物中引发CNS病状。几种弹状病毒不影响CNS(即，MuirSprings和BahiaGrande：Kerschner等人，1986)，并且显示更可接受的安全特征。此外，基于新的弹状病毒的治疗可用于治疗CNS的原发性和继发性癌症。本发明的弹状病毒(和/或其他溶瘤剂(oncolyticagent))可接连用于规避抗特定治疗性病毒的宿主免疫反应。这将允许长期治疗和提高功效。
本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒的组合物和方法以及它们用作抗癌治疗剂的用途。此类弹状病毒具有在体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。
如本文所使用的，非VSV弹状病毒将包括一种或多种下列病毒或其变体：Arajasvirus、金迪普拉病毒(Chandipuravirus)、科卡病毒(Cocalvirus)、伊斯法罕病毒(Isfahanvirus)、Maraba病毒、皮理病毒(Piryvirus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒(Botekevirus)、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒(EelvirusAmerican)、格雷洛奇病毒(GrayLodgevirus)、朱罗纳病毒(Juronavirus)、克拉马斯病毒(Klamathvirus)、克瓦塔病毒(Kwattavirus)、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(MountElgonbatvirus)、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒(BahiaGrandevirus)、MuirSprings病毒、ReedRanch病毒、哈特公园病毒(HartParkvirus)、费兰杜病毒(Flandersvirus)、凯米斯病毒(Kamesevirus)、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒(Mossurilvirus)、巴鲁病毒(Barurvirus)、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒(KernCanyonvirus)、恩科比逊病毒(Nkolbissonvirus)、利丹特病毒(LeDantecvirus)、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒(NewMintovirus)、莎草病毒(Sawgrassvirus)、查可病毒(Chacovirus)、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒(Timbovirus)、阿尔姆皮瓦病毒(Almpiwarvirus)、阿鲁卡病毒(Aruacvirus)，班戈兰病毒(Bangoranvirus)、卞博病毒(Bimbovirus)、BivensArm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒(Charlevillevirus)、CoastalPlains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒(Garbavirus)、戈萨斯病毒(Gossasvirus)、HumptyDoo病毒、约英杰卡卡(Joinjakaka)病毒、肯纳曼格拉姆病毒(Kannamangalamvirus)、科隆各病毒(Kolongovirus)、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒(Landjiavirus)、Manitoba病毒、马可病毒(Marcovirus)、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒(Navarrovirus)、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒(Obodhiangvirus)、奥衣塔(Oita)病毒、奥安戈(Ouango)病毒、帕里河病毒(ParryCreekvirus)、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒(Sandjimbavirus)、西格马病毒(Sigmavirus)、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒(Yatavirus)、罗得岛(RhodeIsland)病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒(Kimberleyvirus)或牛短暂热病毒(Bovineephemeralfevervirus)。在某些方面，非VSV弹状病毒可以指Dimarhabdovirus的超级群(定义为能够感染昆虫和哺乳动物细胞的弹状病毒)。在特定的实施方案中，弹状病毒不是VSV。在特定的方面所述非VSV弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、Farmington、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒，包括其变体。
本发明的一个实施方案包括方法和组合物，其包含溶瘤非VSV弹状病毒或编码弹状病毒N、P、M、G和/或L蛋白，或其变体(包括其嵌合体和融合蛋白)的一种或多种的重组溶瘤非VSV弹状病毒，所述变体与下列病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具有至少或至多20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、100％(包括其间的所有范围和百分数)的氨基酸同一性，所述病毒是：Arajasvirus、金迪普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒、MuirSprings病毒、ReedRanch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、BivensArm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒、CoastalPlains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、HumptyDoo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。这些病毒的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85种或更多种(包括其间的所有整数或范围)可明确地不包括在所述范围内。VSV或任何非VSV弹状病毒可以是可向其中整合入变体G蛋白或其他病毒蛋白的背景序列。
在本发明的另一个方面，非VSV弹状病毒或其重组体可包含编码一种或多种非VSV弹状病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合体和融合蛋白)的至少或至多10、20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、125、175、250个或更多连续氨基酸(包括其间的所有值和范围)的核酸片段。在某些实施方案中，嵌合G蛋白可包括VSV或非VSVG蛋白的细胞质部分、跨膜部分或细胞质及跨膜部分。
本发明的方法和组合物可包括第二治疗性病毒例如溶瘤或复制缺陷型病毒。溶瘤剂通常是指能够杀伤、裂解癌细胞或停止癌细胞的生长的试剂。对于溶瘤病毒，该术语是指在某种程度上可在癌细胞中复制，引起癌细胞死亡、裂解或癌细胞生长停止并且通常对非癌细胞具有最小的毒性效应的病毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、甲病毒、细小病毒、疱疹病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒等。在其他方面，组合物是药学上可接受的组合物。组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
本发明的另外的实施方案包括杀伤过度增殖(hyperproliferative)的细胞的方法，该方法包括将细胞与分离的溶瘤弹状病毒组合物接触；或
另外的方法包括治疗癌症患者，包括施用有效量的溶瘤弹状病毒组合物。
在本发明的某些方面，细胞可包含在患者中，其可以是过度增殖的细胞、赘生性细胞、癌前细胞、癌细胞、转移性细胞(metastaticcell)或已转移的细胞(metastasizedcell)。可对具有易于被至少一种非VSV弹状病毒或包括非VSV弹状病毒的治疗方案或组合物杀伤的细胞的患者施用非VSV弹状病毒。可单独地或以各种组合施用具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种非VSV弹状病毒或重组非VSV弹状病毒的治疗性组合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的组合物可具有10、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或更多病毒颗粒或空斑形成单位(pfu)。可通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或鼻内施用来进行给药。在某些方面，可全身性，特别是通过血管内施用(其包括注射、输注等)施用组合物。本发明的方法还可包括施用第二抗癌治疗，例如第二治疗性病毒。在特别的方面，治疗性病毒可以是溶瘤病毒，更特别地非VSV弹状病毒。在其他方面，第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、手术等。
本发明的实施方案包括涉及VSV弹状病毒的组合物和方法，其包括异源G蛋白和它们作为抗癌治疗剂的用途。此类弹状病毒具有体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。
如本文中所使用的，异源G蛋白包括非VSV弹状病毒。非VSV弹状病毒将包括一种或多种下列病毒或其变体：Arajas病毒、金迪普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒、MuirSprings病毒、ReedRanch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、BivensArm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒、CoastalPlains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、HumptyDoo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒(RhodeIsland)、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。在某些方面，非VSV弹状病毒可以指Dimarhabdovirus的超级群(supergroup)(定义为能够感染昆虫和哺乳动物细胞的弹状病毒)。在特定的方面，非VSV弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒，包括其变体。
本发明的一个实施方案包括方法和组合物，其包含含有异源G蛋白的溶瘤VSV弹状病毒或重组溶瘤VSV弹状病毒，所述重组溶瘤VSV弹状病毒编码非VSV弹状病毒N、P、M、G和/或L蛋白，或其变体(包括其嵌合体和融合蛋白)的一种或多种，所述变体与非VSV弹状病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具有至少或至多20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、100％(包括其间的所有范围和百分数)的氨基酸同一性。
在本发明的另一个实施方案中，包含异源G蛋白的VSV弹状病毒或其重组体可包含核酸，所述核酸包含编码非VSV弹状病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合体和融合蛋白)的至少或至多10，20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、125、175、250个或更多连续氨基酸(包括其间所有值和范围)的核酸片段。在某些方面，嵌合G蛋白可包含VSV或第二非VSV病毒或非VSV弹状病毒的细胞质部分、跨膜部分或细胞质及跨膜部分。
本发明的方法和组合物可包括第二治疗性病毒，例如溶瘤病毒或复制缺陷型病毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、疱疹病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒等。在其他方面，组合物是药学上可接受的组合物。组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
本发明的另外方面包括杀伤过度增殖的细胞的方法，所述方法包括将细胞与分离的溶瘤弹状病毒、包含异源G蛋白分子的VSV、或非VSV弹状病毒组合物接触。另外的方法包括癌症患者的治疗，所述治疗包括施用有效量的此类病毒组合物。
在本发明的某些方面，细胞可包含在患者中，其可以是过度增殖的细胞、赘生性细胞、癌前细胞、癌细胞、转移性细胞或已转移的细胞。可对具有易于被至少一种病毒或包括病毒的治疗方案或组合物杀伤的细胞的患者施用本发明的病毒。可单独地或以各种组合施用具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种病毒的治疗性组合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的组合物可具有10、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014个或更多病毒颗粒或空斑形成单位(pfu)。可通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或鼻内施用来进行给药。在某些方面，可全身性，特别是通过血管内施用(其包括注射、输注等)施用组合物。本发明的方法还可包括施用第二抗癌治疗，例如第二治疗性病毒。在特定的方面，治疗性病毒可以是溶瘤病毒，例如包含异源G蛋白的VSV，更特别地非VSV弹状病毒。在其他方面，第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、手术等。
本发明的其他实施方案通过本申请来进行描述。关于本发明的一个方面所描述的任何实施方案同样可用于本发明的其他方面，反之亦然。发明详述和实施例部分的实施方案理解为可用于本发明的所有方面的本发明的非限定性实施方案。
术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变型，当用于权利要求和/或说明书时，包括任何可测量的减少或完全抑制以获得期望的结果。期望的结果包括但不限于癌性或过度增殖状况的减轻、减少、减缓或根除以及生命的提高的质量或延长。
词汇“一”或“一个”的用途，当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”、“包含”结合使用时，可以表示“一”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意义一致。
在整个本申请中，术语“大约”用于表示值包括用于测定值的装置或方法的误差的标准差。
除非明确指出表示只是选择性的或选择是相互排斥的，权利要求中的术语“或”用于表示“和/或”的意义，尽管公开内容支持只表示选择性的和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求中所使用的，词汇“包含”(和包含的任何形式，例如“包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任何形式，例如“拥有”和“有”)、“包括”(和包括的任何形式，例如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任何形式，例如“包含”和“包括”)是包括界限端点的或两端未封闭的(open-ended)并且不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本发明的其他目的、特征和有利方面将通过下列详细描述而变得显然。然而，应当理解，详细描述和具体实例，当表示本发明的特定实施方案时，仅通过举例说明的方式来给出，因为根据下面的详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员将变得很明显。
附图概述
下列附图构成了本说明书的部分并且用于进一步例证本发明的某些方面。参考一个或多个这些附图和本文中提供的特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1.基于N蛋白的相对保守区域(119个氨基酸)的GDE比对，和使用副粘病毒人副流感病毒1(HPIV-1)作为外类群产生的弹状病毒之间的系统发生关系。通过邻接法(NeighborJoiningMethod)产生进化树和使用1000个树replica评估自展支持率(bootstrapvalue)(对于各分支节点所指示的)。分支长度与遗传距离成正比。标尺条相应于每氨基酸位点的置换(CourtesyofH.BadraneandP.J.Walker)。
图2.体外肿瘤细胞杀伤测定的总结。用不同病毒的系列稀释物感染来自NCI60细胞组(cellpanel)的细胞，进行96小时。使用结晶紫染色法测定细胞生存力以检测残留的存活细胞。根据所得的细胞杀伤曲线计算EC50，并且将其总结于表格中。为了明了，将EC50值转化成图例说明中描述的1至7的值。此外，阴影用于标示EC50范围(即，最暗至最亮表示最高的EC50至最低的EC50值)。病毒缩写如下：MS＝MuirSprings、BG＝大巴伊亚病毒、NGG＝Ngaingan、TIB＝Tibrogargan、FMT＝Farmington、MRB＝Maraba、CRJ＝Carajas、VSVHR＝水泡性口膜炎病毒HR株系和VV＝痘苗病毒JX-963。该数据表明并非所有弹状病毒具有相同的溶瘤性，事实上密切相关的弹状病毒在相同肿瘤细胞系中行为非常不同。因此，目前不存在预测具有溶瘤潜力的弹状病毒的方法。需要经验检测来鉴定良好的溶瘤候选病毒。
图3A-3B.肿瘤细胞系中弹状病毒的生产力。用不同的弹状病毒(MOI＝3)感染SNB19人成胶质细胞瘤和NCIH226人肺癌细胞系，并在一段时间内通过空斑测定就病毒的产量对其进行监测。数据显示并非所有弹状病毒在这些肿瘤细胞系中具有相同的复制能力。NCIH226细胞在病毒生产力方面显示巨大的差异，大巴伊亚病毒根本不产生病毒，然而Maraba病毒却能够产生大量有感染性的病毒体。
图4.从质粒DNA形式回收重组弹状病毒的拯救系统的图示。在该实施例中，已将Maraba病毒克隆入DNA质粒(在T7启动子和来自丁型肝炎病毒的核酶(rybozyme)序列之间)。用T7表达痘苗病毒感染A549细胞，然后用经基因工程改造而表达GFP的Maraba基因组载体转染所述细胞。纯化被拯救的病毒体，然后将其用于感染Vero细胞，进行24小时，从而当通过荧光显微术显现时，在这些细胞中导致GFP表达。
图5.生物选择溶瘤弹状病毒的改良株系。弹状病毒是准种(quasi-species)。大巴伊亚病毒不是神经致病性的(neuropathogenic)但具有杀伤人成胶质细胞瘤细胞的能力。本发明者预期提高其毒性但同时保持其对于癌细胞的选择性。为了提高弹状病毒对于肿瘤细胞的毒性，本发明者选择在人成胶质细胞瘤细胞系中具有增加的复制能力的病毒突变体。简而言之，使用2.5×106个病毒颗粒感染5×105个SNB19细胞，即MOI为5。初次接种物具有200μl的体积，并且在用PBS清洗细胞10次之前进行1小时感染。通过空斑测定就病毒颗粒分析最后的清洗物以确保输入病毒的恰当清除。在不断增加的时间点上，收集整个上清液，然后更换新鲜培养基。将收集的培养基用于感染新细胞以进行扩增，并通过空斑测定就病毒颗粒的存在对其进行分析。对于第一代，测定在第4、8、12和24hpi(感染后的小时)直至病毒释放的初始时间上产生的收集物。将来自最早时间点的病毒扩增回106个的群体，然后再传代(re-passed)。
图6.生物选择溶瘤弹状病毒的改良株系。在本实施例中，大巴伊亚病毒经历多达6轮重复的生物选择。在感染后第4、6和8小时就SNB19细胞中的病毒产量监测亲本株系(WT)和第4至6代的传代株系。初始病毒复制速度的明确和渐进的提高在不断增加的生物选择轮次中是很明显的。MRB＝Maraba病毒，其用作在癌细胞系中快速的和期望的病毒复制的示例。
图7.经历13轮生物选择的大巴伊亚病毒P13。该病毒不仅在生物选择方案中使用的人成胶质细胞瘤(glioblastoma)中而且在不相关的人成胶质细胞瘤和人卵巢癌细胞系上显示提高的病毒复制。这证明可生物选择弹状病毒以提高它们的溶瘤性质并且这些提高对其他不同的癌症是有效的。
图8.用指定的病毒颅内感染Balb/C小鼠并且就发病率和/或死亡率对其进行监测。野生型VSV(HR株系)和VSV的ΔM51突变体株系都具有极强的神经毒性，显示后肢在感染的数天内麻痹，然而大巴伊亚病毒和MuirSprings病毒显示没有神经毒性。大巴伊亚病毒P6是在人成胶质细胞瘤细胞中具有提高的复制的大巴伊亚病毒的经生物选择的株系。该株系也显示没有神经毒性，表明可生物选择弹状病毒以提高对肿瘤细胞的毒性同时保持它们在正常健康组织中的安全特征。
图9.与金迪普拉病毒和WTVSV和Δ51VSV相比，Maraba和Carajas弹状病毒的体内功效。通过在左乳腺、后乳腺中注射106个肿瘤细胞在5-8周龄的Balb/C雌性小鼠中建立4T1肿瘤(表达萤火虫荧光素酶)。一周后，在第1和第2天静脉内注射小鼠(每剂量＝107pfuWTVSV、Δ51GFPVSV、Maraba或金迪普拉病毒；或108pfuCarajas)。使用IVIS200(Xenogen)通过生物发光成像测定肿瘤响应(测量为光子/s/cm2)。
图10.用伊斯法罕病毒G蛋白和VSVG蛋白假型化的G-lessVSV的感染性。
图11.VSVWT、伊斯法罕病毒和RVRIsfG1病毒的一步生长曲线。
图12.包含伊斯法罕病毒G蛋白的RVR保持溶瘤性质。评估伊斯法罕病毒、VSVd51和RVRIsfG1对各种癌细胞系的细胞毒性。
图13A-13C.包含IsfG1的RVR能够在体内逃脱对VSV的免疫反应。体内荧光素酶检测用于测定用RVRIsfG1或VSV接种的小鼠中的病毒的量。图13A，注射入初次接受实验的小鼠的重组病毒的体内检测。图13B，注射入用VSV免疫的小鼠的VSV的体内检测。图13C，注射入用VSV免疫的小鼠的重组RVRIsfG1病毒的体内检测。
图14.来自感染的肿瘤的病毒产量。在使用VSV的免疫存在或不存在的情况下(如所指示的)用重组病毒或VSV感染肿瘤。图解数据显示通过肿瘤的感染产生的病毒的量。
图15.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRChaG1的一步生长曲线。结果显示重组体产生与VSV相同量的病毒。
图16.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRChaG1的细胞毒性。结果显示重组体是与VSV细胞毒性一样。
图17.VSVWT、Maraba病毒和RVRMarG1的一步生长曲线。结果显示重组病毒滴度在第48和72小时比VSV大。
图18.VSVWT、Maraba病毒和RVRMarG1的细胞毒性。结果显示maraba和RVRMarG1在肿瘤细胞系中都是有细胞毒性的并且它们对于肿瘤细胞通常比VSVWT更具细胞毒性。
发明详述
本发明的方面基于非VSV弹状病毒或假型化的弹状病毒对几个类型或种类的癌细胞的杀伤作用，所述癌细胞抗VSV的杀伤作用。这些溶瘤弹状病毒和重组弹状病毒的一些有利方面包括下列方面：(1)抗发明的弹状病毒的抗体极少不存在于大多数世界人口中。(2)弹状病毒比其他溶瘤病毒例如腺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、细小病毒、逆转录病毒和HSV复制更快。(3)弹状病毒可培养至高滴度，并且可通过0.2微米的滤器过滤。(4)溶瘤弹状病毒和其重组体具有广谱宿主性，能够感染许多不同种类的癌细胞并且不受特定细胞上的受体的限制(例如，柯萨奇病毒、麻疹病毒、腺病毒)。(5)本发明的弹状病毒易于进行遗传操作。(6)弹状病毒也具有细胞质生活周期并且不整合入宿主细胞的遗传物质，这赋予了更有利的安全特征。
本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒或假型化的弹状病毒的组合物和方法和它们作为抗癌治疗剂的用途。
I、弹状病毒科(FamilyRhabdoviridae)(弹状病毒)
原型弹状病毒是狂犬病病毒和水泡性口膜炎病毒(VSV)，该病毒科研究最详尽的病毒。尽管这些病毒共有相似的形态学，但它们在它们的生活周期、宿主范围和病理学方面极其不同。弹状病毒是具有非节段(-)有义RNA基因组的子弹状病毒的科。存在超过250种已知的感染哺乳动物、鱼、昆虫和植物的弹状病毒。该科分为至少5个属：(1)狂犬病病毒属：包括狂犬病病毒、其他哺乳动物病毒、一些昆虫病毒；(2)水泡性病毒属：包括水泡性口膜炎病毒(VSV)；(3)短暂热病毒属：包括牛短暂热病毒(脊椎动物)；(4)质型弹状病毒属：包括莴苣坏死黄化病毒(植物)；和(5)核型弹状病毒属：包括马铃薯黄矮病毒(植物)。也已表明，存在包括多种感染哺乳动物和昆虫的弹状病毒的称为Dimarhabdovirus的弹状病毒的超级群。
弹状病毒科包括但不限于：Arajas病毒、金迪普拉病毒(AF128868/gi：4583436，AJ810083/gi：57833891，AY871800/gi：62861470，AY871799/gi：62861468，AY871798/gi：62861466，AY871797/gi：62861464，AY871796/gi：62861462，AY871795/gi：62861460，AY871794/gi：62861459，AY871793/gi：62861457，AY871792/gi：62861455，AY871791/gi：62861453)、科卡病毒(AF045556/gi：2865658)、伊斯法罕病毒(AJ810084/gi：57834038)、Maraba病毒(SEQIDNO：1-6)、Carajas病毒(SEQIDNO：7-12，AY335185/gi：33578037)、皮理病毒(D26175/gi：442480，Z15093/gi：61405)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(DQ457103/gi|91984805)、Perinet病毒(AY854652/gi：71842381)、Tupaia病毒(NC_007020/gi：66508427)、Farmington、大巴伊亚病毒(SEQIDNO：13-18)，MuirSprings病毒、ReedRanch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒(AF523199/gi：25140635，AF523197/gi：25140634，AF523196/gi：25140633，AF523195/gi：25140632，AF523194/gi：25140631，AH012179/gi：25140630)、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒(AY854651/gi：71842379)、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒(AY854650/gi：71842377)、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒(AY854645/gi：71842367)、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、BivensArm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒、CoastalPlains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、HumptyDoo病毒(AY854643/gi：71842363)、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒(DQ457100/gi|91984799核蛋白(N)mRNA、部分cds)、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒(DQ457099/gi|91984797，AY854638/gi：71842354)、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒(AY854649/gi：71842375)、Oak-Vale病毒(AY854670/gi：71842417)、奥博第安病毒(DQ457098/gi|91984795)、奥衣塔病毒(AB116386/gi：46020027)、奥安戈病毒、帕里河病毒(AY854647/gi：71842371)、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒(DQ457102/gi|91984803)、西格马病毒(AH004209/gi：1680545，AH004208/gi：1680544，AH004206/gi：1680542)、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒(AY854646/gi：71842369)、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、AdelaideRiver病毒(U10363/gi：600151，AF234998/gi：10443747，AF234534/gi：9971785，AY854635/gi：71842348)、Berrimah病毒(AY854636/gi：71842350])、金伯利病毒(AY854637/gi：71842352)或牛短暂热病毒(NC_002526/gi：10086561)。
某些未指定的血清型包括(1)BahiaGrande组(大巴伊亚病毒(BGV)、MuirSprings病毒(MSV)、ReedRanch病毒(RRV)；(2)HartPark组(费兰杜病毒(FLAV)、哈特公园病毒(HPV)、凯米斯病毒(KAMV)、Mosqueiro病毒(MQOV)、莫苏里病毒(MOSV)；(3)KernCanyon组(巴鲁病毒(BARV)、Fukuoka病毒(FUKAV)、克恩峡谷病毒(KCV)、恩科比逊病毒(NKOV)；(4)LeDantec组(利丹特病毒(LDV)、Keuraliba病毒(KEUV)、(5)Sawgrass组(Connecticut病毒(CNTV)、新明托病毒(NMV)、莎草病毒(SAWV)；(6)Timbo组(查可病毒(CHOV)、SenaMadureira病毒(SMV)、蒂姆博病毒(TIMV)；和(7)其他未指定病毒(阿尔姆皮瓦病毒(ALMV)、阿鲁卡病毒(ARUV)、班戈兰病毒(BGNV)、卞博病毒(BBOV)、BivensArm病毒(BAV)、Bluecrab病毒(BCV)、查里维勒河病毒(CHVV)、CoastalPlains病毒(CPV)、DakArK7292病毒(DAKV-7292)、Entamoeba病毒(ENTV)、加巴病毒(GARV)、戈萨斯病毒(GOSV)、HumptyDoo病毒(HDOOV)、约英杰卡卡病毒(JOIV)、肯纳曼格拉姆病毒(KANV)、科隆各病毒(KOLV)、Koolpinyah病毒(KOOLV)、Kotonkon病毒(KOTV)、兰德几亚病毒(LJAV)、Manitoba病毒(MNTBV)、马可病毒(MCOV)、Ngaingan、Nasoule病毒(NASV)、纳瓦鲁病毒(NAVV)、Ngaingan病毒(NGAV)、Oak-Vale病毒(OVRV)、奥博第安病毒(OBOV)、奥衣塔病毒(OITAV)、奥安戈病毒(OUAV)、帕里河病毒(PCRV)、RioGrandecichlid病毒(RGRCV)、圣德吉姆巴病毒(SJAV)、西格马病毒[X91062](SIGMAV)、Sripur病毒(SRIV)、SweetwaterBranch病毒(SWBV)、Tibrogargan病毒(TIBV)、Xiburema病毒(XIBV)、雅塔病毒(YATAV)。
本发明的方面可包括但不限于基于在哺乳动物细胞系中的生长、在成年小鼠(动物)中不存在毒性或毒性最低、在乳鼠(动物)中不存在毒性或毒性最低选择非VSV弹状病毒或假型化的弹状病毒。
A、弹状病毒基因组
通常，弹状病毒基因组大约11至15kb，具有大约50个核苷酸的3’前导序列和大约60个核苷酸的(-)有义病毒RNA(vRNA)的非翻译5’区。通常，弹状病毒vRNA具有编码5个蛋白的5个基因。弹状病毒在各基因的末端具有保守的多腺苷酸化信号并且在5个基因的各基因之间具有短基因间区域。所有弹状病毒包含编码核壳体蛋白(N)、磷蛋白(P，也称为NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)的5个基因。通常这些基因如下在负有义vRNA上按顺序排列：3′-N-P-M-G-(X)-L-5′。基因的顺序很重要，因为其控制合成的蛋白质的比例。弹状病毒基因组的任何操作物通常将包括至少5个转录结构域以保持以高水平感染和复制的能力。弹状病毒具有用于转录正有义信使RNA(mRNA)的内源RNA聚合酶。X基因并非存在于所有弹状病毒中。X基因编码发现于鱼感染性造血组织坏死病毒的非结构蛋白(GenBankDQ164103/gi|76262981；DQ164102/gi|76262979；DQ164101/gi|76262977；DQ164100/gi|76262975；DQ164099/gi|76262973；AB250935/gi|112821165；AB250934/gi|112821163；AB250933/gi|112821161；AB250932/gi|112821159；AB250931/gi|112821157；AB250930/gi|112821155；AB250929/gi|112821153；AB250928/gi|112821151；AB250927/gi|112821149，描述了G蛋白编码核苷酸序列)、牛短暂热病毒中的非结构糖蛋白和狂犬病毒中的假基因(pseudogene)。在弹状病毒基因组的不同位置发现了额外的(X)基因。感染细胞中M蛋白的合成使细胞产生细胞病变，并且将最终导致细胞死亡。
弹状病毒的传播视病毒/宿主的变化而变化，但大多数通过直接接触传播-例如，狂犬病病毒通过动物咬伤或昆虫载体传播。存在长体内潜伏期，但这不反映在培养中的病毒复制的动力学中。G蛋白结合宿主细胞表面上的受体，然后病毒通过G蛋白介导的内吞作用和与载体的膜的融合进入细胞。
无意受限于特定理论，弹状病毒的受体分子据认为是磷脂而非特定的蛋白。弹状病毒复制在细胞质中发生-L和NS蛋白都是进行转录所必需的-两者单独均不发挥功能。产生5个单顺反子mRNA，其在5′末端加帽和在3′末端多腺苷酸化，并且各自在信使的5′末端包含来自vRNA的3′末端的前导序列。这些mRNA通过病毒基因组中ORF的依次转录而产生，并且已显示基因间序列负责终止和通过各基因间的聚合酶重新起始转录，从而产生分开的转录物。
子代vRNA从(+)有义中间体产生。基因组通过L+P聚合酶复合物(如在转录中)进行复制，但还需要额外的宿主细胞因子。弹状病毒的特征在于这些事件全都在充当病毒“工厂”的细胞质的部分中发生并且表现为特征性细胞质内含体(inclusionbody)。
B、病毒蛋白质变体
在某些实施方案中，弹状病毒或非VSV弹状病毒可包括N、P、M、G，和/或L蛋白中的一种或多种的变体。在本发明的某些方面，此类病毒蛋白变体可包含在下面进一步定义的蛋白质性质的组合物中。蛋白质性质的组合物包括病毒颗粒和具有一种或多种病毒蛋白组分的其他组合物。此类多肽变体可进行基因工程改造或就一种或多种生理学或生物学特征例如宿主细胞范围、宿主细胞特异性、对非靶细胞或器官的毒性、复制、对靶细胞的细胞毒性、癌细胞的杀伤、癌细胞的阻抑(stasis)、感染性、生产参数、病毒颗粒的大小、病毒颗粒的稳定性、体内清除、免疫反应性等的改变进行选择。此类多肽变体可通过使用多种本领域内已知的方法进行基因工程改造，所述方法包括下面描述的各种诱变技术。在某些方面，N、P、M、G和/或L蛋白对于病毒可以是异源的(例如，VSV可包含伊斯法罕病毒G蛋白或其变体)。
C、重组弹状病毒
可这样产生重组弹状病毒，即通过(1)完全使用cDNA或(2)转染入辅助细胞的cDNA的组合或(3)转染入细胞(所述细胞进一步用minivirus感染，所述minivirus反向提供产生感染性或非感染性重组弹状病毒所需的其余组分和活性)的cDNA来产生。通过使用这些方法中的任一种(例如，minivirus、辅助细胞系或仅cDNA转染)，所需的最小组分是包含用于(1)通过弹状病毒N蛋白壳体化基因组(或反基因组(antigenomic))RNA和(2)基因组和反基因组(复制中间体)RNA等同物的复制的顺式作用信号的RNA分子。
通过复制元件或复制子，本发明者产生在5′和3′末端最低限度地包含弹状病毒的前导序列和尾随序列的RNA链。在基因组有义链中，前导序列位于3′末端，尾随序列位于5′末端。位于这两个复制信号之间的任何RNA将依次进行复制。为了通过N蛋白进行壳体化和为了起始转录和复制所必需的聚合酶结合，前导区和尾随区还必须包含最小顺式作用元件。
对于制备经基因工程改造的弹状病毒，包含G基因的minivirus也可包含前导区、尾随区和具有用于产生G蛋白mRNA的适当的起始和终止信号的G基因。如果minivirus还包含M基因，则也必须存在用于产生M蛋白mRNA的适当的起始和终止信号。
对于经基因工程改造的弹状病毒基因组内包含的任何基因，基因应侧翼于允许这些基因表达和蛋白质产物产生的适当的转录起始和终止信号。特别地，异源基因(其为通常不由从天然环境分离的弹状病毒编码的基因)在通常未发现其的位置、形式或背景中包含弹状病毒编码区，例如，嵌合G蛋白。
为了产生“非感染性”经基因工程改造的弹状病毒，所述经基因工程改造的弹状病毒必须具有最小的复制子元件和N、P和L蛋白，并且其必须包含M基因(一个实例是缺失G蛋白编码区的ΔG或G-less构建体)。这产生了从细胞出芽但为非感染性颗粒的病毒颗粒。为了产生“感染性”颗粒，病毒颗粒必须额外地包含可介导，例如通过使用附着蛋白或受体配体介导病毒颗粒结合和融合的蛋白质。弹状病毒的天然受体配体是G蛋白。
“合适的细胞”或“宿主细胞”是指允许重组弹状病毒的装配的任何细胞。
为制备感染性病毒颗粒，首先用痘苗病毒vTF7-3(Fuerst等人，1986)或编码T7RNA聚合酶或其他合适的噬菌体聚合酶例如T3或SP6聚合酶的等同物(参见Usdin等人，1993或Rodriguez等人，1990)感染合适的细胞系(例如，BHK细胞)。然后用包含编码G、N、P、L和M弹状病毒蛋白的基因的单独的cDNA转染细胞。此类cDNA将提供用于构建重组弹状病毒颗粒的蛋白。然后可通过本领域已知的任何方法转染细胞(例如，脂质体、电穿孔等)。
也将包含弹状病毒基因组RNA等同物的“多顺反子cDNA”转染入细胞系。如果期望感染性重组弹状病毒颗粒在感染的细胞中是裂解性的，那么编码N、P、M和L蛋白的基因以及任何异源核酸片段必须存在。如果不期望感染性重组弹状病毒颗粒是裂解性的，那么编码M蛋白的基因不包括在多顺反子DNA中。关于“多顺反子cDNA”，其是指至少包含含有编码N、P和L蛋白的基因的转录单位的cDNA。重组弹状病毒多顺反子DNA还可包含编码蛋白质变体或其多肽片段的基因或治疗性核酸。可选择地，首先产生的最初与病毒颗粒结合的任何蛋白或其片段可以反向提供。
另一个预期的实施方案是包含编码报告蛋白或荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白和其衍生物、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶等)的基因、N-P-L或N-P-L-M基因和/或融合蛋白或治疗性核酸的多顺反子cDNA。另一个预期的多顺反子DNA可包含编码蛋白质变体的基因、编码报告子的基因、治疗性核酸和/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。
产生重组弹状病毒的第一个步骤是从cDNA表达作为基因组或反基因组等同物的RNA。然后该RNA被N蛋白包装，然后通过P/L蛋白进行复制。可回收所产生的病毒。如果G蛋白不存于重组RNA基因组中，那么其通常以反向提供。如果G蛋白和M蛋白都不存在，那么两者均以反向提供。
关于制备“非感染性弹状病毒”颗粒，其方法可以与上述方法相同，除了转染入细胞的多顺反子cDNA将只包含弹状病毒的N、P和L基因外。非感染性弹状病毒颗粒的多顺反子cDNA可额外地包含编码报告蛋白的基因或治疗性核酸。关于有关产生缺乏编码G蛋白的基因的重组弹状病毒的方法的另外的描述，参见Takada等人(1997)。
1.产生病毒的细胞的培养
通常在期望的温度(通常大约37℃)下温育转染的细胞，进行至少24小时。对于非感染性病毒颗粒，收集上清液，分离病毒颗粒。对于感染性病毒颗粒，收获包含病毒的上清液，将其转移至新鲜细胞(freshcell)。温育该新鲜细胞，进行大约48小时，然后收集上清液。
2.重组弹状病毒的纯化
术语“分离”或“分离的”弹状病毒是指培养和纯化病毒颗粒(以使极少的细胞碎片留下)的方法。一个实例是获取含有病毒体的上清液，然后将它们通过0.1-0.2微米孔径大小的滤器(例如，Millex-GS、Millipore)以除去病毒和细胞碎片。可选择地，使用梯度例如蔗糖梯度纯化病毒体。然后沉淀重组弹状病毒颗粒，将其重悬于期望的任何赋形剂或载体中。可使用特异于特定蛋白的抗体，通过间接免疫荧光法测定滴度。
3.使用cDNA和Minivirus或辅助细胞系制备重组弹状病毒的方法
“miniviruses”和“辅助细胞”(也称为“辅助细胞系”)提供相同的事物：以提供用于弹状病毒病毒体装配的弹状病毒蛋白的来源。弹状病毒minivirus的一个实例是只表达G和M蛋白的VSVminivirus，如由Stillman等人，(1995)所报导的。辅助病毒和miniviruses用作提供弹状病毒蛋白的方法，所述弹状病毒蛋白不从编码弹状病毒蛋白的基因的转染的DNA产生。
当使用minivirus时，为了提供T7RNA聚合酶，如上所述使用痘苗病毒感染细胞。将包含N、P和L基因的期望的多顺反子RNA和质粒转染入细胞。在大约3小时后除去转染混合物，然后以大约1的感染复数(multiplicityofinfection)(m.o.i.)用minivirus感染细胞。Minivirus提供缺失的G和/或M蛋白。转染入细胞的多顺反子RNA将取决于想要的是感染性重组弹状病毒还是非感染性重组弹状病毒。
可选择地，minivirus可用于提供N、P和L基因。Minivirus还可用于产生除了N、P和L外的M蛋白。Minivirus还可产生G蛋白。
当使用辅助细胞系时，编码缺失的弹状病毒蛋白的基因通过辅助细胞系产生。辅助细胞系具有用于产生不编码野生型G蛋白的重组弹状病毒颗粒的N、P、L和G蛋白。从不为重组病毒基因组的部分的基因或DNA表达蛋白质。将这些质粒或其他载体系统稳定地整合入细胞系的基因组。然后从细胞的基因组而非从细胞质中的复制子产生蛋白质。然后可用包含不由辅助病毒表达的其他弹状病毒基因的多顺反子DNA和质粒cDNA转染辅助细胞系。所使用的多顺反子RNA将取决于期望的是感染性还是非感染性重组弹状病毒。另外，如上所述提供缺失的基因产物(例如，G和/或M)。
II.病毒组合物
本发明涉及在研究和治疗患者的过度增殖细胞或赘生性细胞(例如，癌细胞)和过度增殖性病况或瘤病况(neoplasticcondition)(例如，癌症)中是有利的弹状病毒。其可涉及但不限于具有减少的神经毒性的弹状病毒例如非VSV弹状病毒。在某些方面，弹状病毒编码或包含一个或多个蛋白质组分(N、P、M、G，和/或L蛋白)或与VSV的基因组不同的核酸基因组(即，在氨基酸或核苷酸水平上至少或至多10，20，40，50，60，70，80％同一)和/或用一个或多个突变或变异(与野生型病毒或病毒蛋白相比)来进行构建，以便所述病毒具有期望的性质以用于抗癌细胞，同时与最初分离的病毒或VSV相比对非癌细胞具有较低毒性或是无毒性。下面描述的教导提供了各种用于进行本发明的方法和组合物的方案的实例。它们提供了通过使用生物选择或重组DNA或核酸技术产生突变病毒或变异病毒的背景。
A、蛋白质性质的组合物
本发明的蛋白质性质的组合物包括病毒颗粒和包含病毒颗粒的组合物以及分离的多肽。在某些实施方案中，本发明涉及产生或分离假型化的或非VSV溶瘤弹状病毒(裂解、杀伤或迟滞癌细胞的生长的弹状病毒)。在某些实施方案，对弹状病毒进行基因工程改造以使之包括弹状病毒蛋白(N、P、M、G和/或L)的多肽变体和/或编码治疗性多肽的治疗性核酸。本发明的其他方面包括分离缺少一个或多个功能性多肽或蛋白的弹状病毒。在其他实施方案中，本发明涉及弹状病毒和它们作为药学上可接受的制剂的部分与蛋白质性质的组合物组合的用途或包含在其中的用途。
如本文所使用的，“蛋白”或“多肽”是指包含氨基酸残基的聚合物的分子。在一些实施方案中，使用蛋白质或多肽的野生型形式，然而，在本发明的许多实施方案中，病毒蛋白或多肽的全部或部分不存在或经改变以使病毒在治疗患者方面更加有用。上述术语在本文中可互换使用。“经修饰的蛋白”或“经修饰的多肽”或“变体蛋白”或“变体多肽”是指其化学结构或氨基酸序列相对于野生型或参照蛋白或多肽发生了改变的蛋白或多肽。在一些实施方案中，经修饰的蛋白或多肽具有至少一种改变的活性或功能(公认蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。相对于野生型蛋白或多肽的活性或功能或包含此类多肽的病毒的特征，可以以一些其他方法减小、减少、消除、增强、提高或改变该经修饰的活性或功能(例如感染特异性)。预期可就一种活性或功能改变经修饰的蛋白或多肽，然而在其他方面仍保持野生型或未改变的活性或功能。可选择地，经修饰的蛋白可以是完全无功能的或其相应核酸序列可进行改变以使多肽根本不再表达，被截短或作为移码或其他修饰的结果表达不同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，重组蛋白或多肽的大小可包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个或更多氨基分子残基，和可从其推导的任何范围。预期，多肽可通过截短、使它们比它们的相应未改变的形式更短或通过可使改变的蛋白质更长的融合或结构域改组(domainshuffling)来进行修饰。
如本文所使用的，“氨基分子”是指本领域技术人员已知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质性质的分子的残基是连续的，不具有间断氨基分子残基的序列的任何非氨基分子。在其他实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在特定实施方案中，蛋白质性质的分子的残基的序列可被一个或多个非氨基分子部分间断。因此，术语“蛋白质性质的组合物”包括包含天然合成的蛋白质中20种普通氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰的氨基酸或稀有氨基酸的氨基分子序列。
蛋白质性质的组合物可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物学技术进行的蛋白质、多肽或肽的表达、蛋白质性质的化合物从天然来源的分离或蛋白质性质的物质的化学合成。不同弹状病毒基因或基因组的核苷酸和多肽序列之前已经公开，并且可见于本领域技术人员已知的计算机化的数据库。一个这样的数据库是美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的GenBank和GenPept数据库，其可通过国际互联网在ncbi.nlm.nih.gov/访问。可使用本文中公开的或本领域技术人员已知的技术扩增和/或表达这些已知的基因和病毒的编码区。
B、功能方面
当本发明提及病毒蛋白或多肽的功能或活性时，除非另外指出，其是指该病毒蛋白或多肽在生理条件下的活性或功能。例如，G蛋白参与特定细胞类型的结合和感染的特异性和功效。可使用本领域技术人员熟知的测定法例如感染性测定法、蛋白质结合测定法、空斑测定法等确定具有该活性的分子。
C、病毒多肽的变体
本发明的多肽的氨基酸序列变体可以为置换、插入或缺失变体。编码病毒多肽的基因的突变可影响(与野生型或未改变的多肽或其他参照多肽相比)多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多非连续或连续氨基酸(即，片段)。可通过参考本文中公开的每一种病毒的GenBank登录号和相关公共数据库条目来鉴定由弹状病毒编码的各种多肽，涉及弹状病毒科的所有GenBank条目通过引用合并入本文。
缺失变体缺少天然的、未改变的或野生型蛋白的一个或多个残基。可缺失单个残基，或可缺失结构域(例如催化或结合结构域)的全部或一部分。可将终止密码子导入(通过置换或插入)编码核酸序列以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽的非终止点添加物质，特殊类型的插入物是嵌合多肽，所述嵌合多肽包括替代靶蛋白的相关部分的相关蛋白的同源或相似部分。这可包括免疫反应性表位或仅一个或多个残基的插入。还可产生末端添加物，其通常称为融合蛋白。
置换变体通常包括蛋白质内一个或多个位点上的一种氨基酸对另一种氨基酸的交换，并且可设计用于调节多肽的一个或多个性质(在丧失或不丧失其他功能或性质的情况下)。置换可以是保守的，即，一个氨基酸用相似形状和电荷的氨基酸替代。保守置换在本领域内是熟知的并且包括，例如，丙氨酸至丝氨酸、精氨酸至赖氨酸、天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸、天冬氨酸至谷氨酸、半胱氨酸至丝氨酸、谷氨酰胺至天冬酰胺、谷氨酸至天冬氨酸、甘氨酸至脯氨酸、组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺、异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸、亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸、赖氨酸至精氨酸、甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸、苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸、丝氨酸至苏氨酸、苏氨酸至丝氨酸、色氨酸至酪氨酸、酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸的改变。可选择地，置换可以是非保守的，以便多肽的功能或活性受到影响。非保守性改变通常包括用化学上不同的残基置换残基，例如用极性的或带电荷的氨基酸置换非极性的或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
术语“功能等同密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如编码精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也指编码生物学上等同的氨基酸的密码子(参见下面表1)。
表1.密码子表
应理解，氨基酸和核酸序列可包括额外的残基，例如额外的N或C末端氨基酸或5′或3′序列，并且仍然基本上与本文中所示的一样，包括具有某些生物学活性。末端序列的添加特别地用于核酸序列，所述核酸序列可以例如包括侧翼于编码区的5′或3′部分的任一部分的各种非编码序列或可包括已知存在于基因内的各种内部序列即内含子。
下列是基于改变N、P、L或G蛋白的氨基酸从而产生等同的或甚至改进的分子的描述。例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可用其他氨基酸置换而无与结构例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的相互结合能力的显著损失。因为蛋白质的相互作用能力和性质确定该蛋白质的生物学功能活性，因此可在蛋白质的序列中进行某些氨基酸置换(和在其DNA编码序列中进行某些碱基变化)，但仍产生具有相似性质的蛋白质。因此本发明者预期，可在弹状病毒的DNA序列中进行多种变化而无目的生物学功效或活性的显著损失，如下面所描述。
在进行这些变化时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质生物学功能中的重要性在本领域内是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982)。公认，氨基酸的相对亲水特征(relativehydropathiccharacter)促成所得的蛋白质的二级结构，该二级结构反过来又确定了蛋白质与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
本领域中也理解，可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的置换。美国专利4,554,101(通过引用合并入本文)指出蛋白质的最大局部平均亲水性，如由其相邻氨基酸的亲水性决定的，与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所描述的，将下列亲水性值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可用具有相似亲水性值的另一种氨基酸置换并且仍然产生生物学等同的和免疫学等同的蛋白质。在此类变化中，其亲水性值在±2内的氨基酸的置换是优选的，在±1内的氨基酸的置换是特别优选的，在±0.5内的氨基酸的置换是更优选的。
如上文所概述的，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种上述特征的示例性置换对于本领域内技术人员来说是熟知的，其包括：精氨酸和赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
III、核酸分子
本发明包括可从能够表达所有或部分病毒蛋白质或多肽的细胞分离的多核苷酸。在本发明的一些实施方案中，其涉及已进行特异性突变或改变以产生具有某些性质和/或特征的病毒或病毒多肽(例如假型化的或非VSV弹状病毒多肽或病毒)的病毒基因组的全部或部分。多核苷酸可编码包含病毒的全部或部分或异源氨基酸序列的肽或多肽，或进行基因工程改造以使它们不编码这样的病毒多肽或编码具有至少一个添加的、增加的、减少的、加入的、减小的或缺失的功能或活性的病毒多肽。重组蛋白可从产生活性蛋白的表达细胞纯化。弹状病毒成员的基因组可见于NCBI数据库或相似数据库的GenBank登录号(其各自通过引用合并入本文)。
A、编码天然或经修饰的蛋白质的多核苷酸
如本文中所使用的，术语“RNA、DNA或核酸片段”是指已分离的不含总基因组DNA或其他污染物的RNA、DNA或核酸分子。因此，编码多肽的核酸片段是指包含编码野生型多肽、多态性多肽或突变体多肽的序列但仍然与基因组核酸分离的或经纯化的不含有基因组核酸的核酸片段。术语“核酸片段”包括多核苷酸，比多核苷酸小的核酸片段，和重组载体包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
如本申请中所使用的，术语“弹状病毒多核苷酸”可以指编码至少一个非VSV弹状病毒多肽的假型化的或非VSV弹状病毒核酸分子。在某些实施方案中，多核苷酸被分离而不含有其他核酸。类似地，“Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒多核苷酸”是指已与其他核酸分离的编码Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒多肽的核酸分子。“弹状病毒基因组”或“Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒基因组”是指这样的VSV或非VSV核酸分子，所述核酸分子可在辅助病毒或以反向提供其他因子的互补编码区(complementingcodingregion)存在或不存在的情况下提供给宿主细胞来产生病毒颗粒。与野生型或未改变的病毒相比，基因组可以已进行了或可以不进行重组突变。
术语“cDNA”用于表示使用RNA作为模板制备的DNA。可能有时完全或部分基因组序列是优选的。
还预期，来自给定的物种的特定多肽可由天然变体代表，所述变体具有稍微不同的核酸序列但仍然编码相同的蛋白质(参见上面的表1)。
类似地，编码分离的或纯化的野生型或经修饰的多肽的多核苷酸是指包含野生型或突变体多肽编码序列和，在某些方面，基本上与其他天然存在的基因或蛋白质编码序列分离的调控序列的DNA片段。在该方面，术语“基因”只用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸单位(包括适当转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列和表达或可适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的更小的经基因工程改造的核酸片段。编码天然或经修饰的多肽的全部或部分的核酸可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多个核苷酸、核苷或碱基对的连续核酸。
在特定的实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，所述核酸片段和重组载体整合了编码在其氨基酸序列内包含与天然多肽一致或大体上相符的连续氨基酸序列的野生型或突变体弹状病毒多肽的核酸序列。术语“重组的”可以与多肽或特定多肽的名称结合使用，这通常是指从这样的核酸分子产生的多肽，所述核酸分子已进行体外操作或为此类分子的复制产物。
在其他实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，所述核酸片段和重组载体整合了编码在其氨基酸序列内包含与一个或多个弹状病毒多肽一致或大体上相符的连续氨基酸序列的多肽或肽的核酸序列。
用于本发明的核酸片段，无论编码序列本身的长度大小，可与其他核酸序列例如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性内切酶位点、多克隆位点、其他编码片段等组合，这样它们的总长度可大范围变化。因此预期，可使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选由制备的容易性和在期望的重组核酸方案中的用途限定。
预期，本发明的核酸构建体可编码来自任何来源的全长多肽或编码多肽的截短的或经修饰的形式，例如截短的弹状病毒多肽，以便编码区的转录物代表截短的形式。然后可将截短的转录物翻译成截短的蛋白质。可选择地，核酸序列可编码具有额外的异源编码序列的全长多肽序列，以例如允许进行多肽的纯化、转运、分泌、翻译后修饰或使之具有治疗益处例如靶向性或功效。如上所述，可向经修饰的多肽编码序列加入标签或其他异源多肽，其中“异源的”是指与经修饰的多肽不同的或发现不与天然存在的病毒结合在一起或不由其编码的多肽或其片段。
在非限定实例中，可制备一个或多个包括与特定病毒片段例如弹状病毒N、P、M、G或L基因同一或互补的核苷酸的连续区段(stretch)的核酸构建体。核酸构建体可以是至少20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1,000，2,000，3,000，4,000，5,000，6,000，7,000，8,000，9,000，10,000，15,000，20,000，30,000，50,000，100,000，250,000，500,000，750,000至至少1,000,000个核苷酸长度以及更大的，达到和包括染色体大小(包括所有中间长度和中间范围)的构建体。将容易地理解，“中间长度”和“中间范围”，如本文中所使用的，是指包括或在引用的值之间的任何长度或范围(即，包括和在这样的值之间的所有整数)。
用于本发明的核酸片段包括编码经修饰的多肽的经修饰的核酸。这样的序列可作为已知在核酸序列和所编码的蛋白质内天然存在的密码子冗余(codonredundancy)和功能等同性的结果产生。可选择地，可通过使用重组DNA技术产生功能等同的蛋白质或肽，在所述技术中可基于对将被交换的氨基酸的性质的考虑，通过基因工程改变蛋白质结构。可通过使用定点诱变技术导入由人设计的变化，例如以提高蛋白质的抗原性或使其不存在，以在体内减少蛋白质对接受该蛋白质的受试者的毒性效应，或以增加涉及该蛋白质或包含该蛋白质的病毒的任何治疗的功效。
在某些其他实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，所述核酸片段和重组载体在它们的序列内包含来自在本文中鉴定的(和/或通过引用合并入本文的)序列中显示的那些序列的连续核酸序列。然而，此类序列可进行突变以产生其活性相对于野生型发生了改变的蛋白质产物。
还应理解，本发明不限于特定的核酸和此类已鉴定的序列的氨基酸序列。因此重组载体和分离的核酸片段可不同地包含弹状病毒编码区本身、在基本编码区中具有选择的改变或修饰的编码区，或它们可编码更大的仍然包含弹状病毒编码区的多肽，或可编码具有变异氨基酸序列的生物学功能等同蛋白质或肽。
本发明的核酸片段可编码其为弹状病毒的生物学功能等同物或变体或突变体(其可增加病毒的治疗性益处)的弹状病毒蛋白质和肽。这样的序列可作为已知在核酸序列和所编码的蛋白质内天然存在的密码子冗余和功能等同性的结果产生。可选择地，可通过使用重组DNA技术产生功能等同的蛋白质或肽，在所述技术中可基于对将被交换的氨基酸的性质的考虑，通过基因工程改变蛋白质结构。可通过使用定点诱变技术将由人设计的变化导入，例如以提高病毒蛋白的癌细胞结合。
B、弹状病毒多核苷酸的诱变
在不同的实施方案中，可改变或诱变弹状病毒多核苷酸。改变或突变可包括插入、缺失、点突变、倒位(inversion)等并且可导致某些蛋白质或分子机制的调节、激活和/或灭活以及改变基因产物的功能、定位或表达，特别地使基因产物无功能。当使用时，可通过多种标准的诱变方法(Sambrook等人，2001)实现编码弹状病毒的全部或部分的多核苷酸的诱变。突变是其中在生物体的量或结构中发生变化的过程。突变可包括单个基因的核苷酸序列的修饰、基因或整个基因组的封闭(block)。单个基因的变化可以是点突变的结果，所述点突变包括DNA序列内单个核苷酸的去除、添加或置换，或它们可以是涉及许多核苷酸的插入或缺失的变化的结果。
1.随机诱变
a、插入诱变
插入诱变基于通过插入已知的核酸片段进行的基因灭活。因为其包括一些类型的核酸片段的插入，所以产生的突变通常是功能丧失突变而不是功能获得突变。然而，存在几个产生功能获得突变的插入的实例。可使用标准分子生物学技术完成插入诱变。
b、化学诱变
化学诱变提供某些有利方面，例如发现具有不同表型严重度的全部突变的能力，其进行是容易的和廉价的。大部分化学致癌物在DNA中产生突变。苯并芘(Benzo[a]pyrene)、N-乙酰氧基-2-乙酰基氨基芴和aflotoxinB1在细菌和哺乳动物细胞中引起GC至TA的颠换。苯并芘还可产生碱基置换例如AT至TA。N-亚硝基化合物产生GC至AT的转换(transition)。通过暴露于n-亚硝基脲诱导的胸腺嘧啶的O4位置的烷基化导致TA至CG的转换。
c、辐射诱变
生物分子被电离辐射降解。入射能量的吸收(Adsorption)导致离子和自由基的形成和一些共价键的断裂。对辐射破坏的易感性在分子之间和在相同分子的不同晶体形式之间表现相当大的可变性。其取决于总的积累的剂量，还取决于剂量率(因为一旦自由基存在，它们引起的分子破坏取决于它们的天然扩散速率，从而取决于实际时间(realtime))。通过制备尽可能冷的样品来减少和控制破坏。电离辐射引起DNA破坏，通常与剂量率成正比。
在本发明中，术语“电离辐射”是指包括具有足够能量或可产生足以产生离子化(电子的获得或丢失)的能量的颗粒或光子的辐射。示例性和优选的电离辐射是X射线辐射。给定的细胞中需要的或用于特定分子的电离辐射的量通常取决于细胞或分子的性质和突变靶的性质。用于测定辐射的有效量的方法在本领域内是熟知的。
d、体外扫描诱变
还可使用易错PCR导入随机诱变。可通过在具有不同模板稀释度的多个管中进行PCR来增加诱变率。一个特别有用的诱变技术是丙氨酸扫描诱变，其中许多残基用氨基酸丙氨酸单个地进行置换，以便可测定丧失侧链相互作用的效应，同时使蛋白质构象中的大规模扰动(perturbation)的风险减少至最小(Cunningham等人，1989)。
体内扫描饱和诱变提供了获得大量结构-功能信息的快速方法，所述信息包括：(i)调节配体结合特异性的残基的鉴定，(ii)基于保持活性的氨基酸和在给定的位置上消除活性的氨基酸的鉴定的配体结合的更好理解，(iii)活性位点或蛋白质亚结构域的总体可塑性的评估，(iv)导致增加的结合的氨基酸置换的鉴定。
2.定点诱变
结构指导的位点特异性诱变代表了用于蛋白质-配体相互作用的剖析和基因工程改造的强大工具(Wells，1996；Braisted等人，1996)。该技术通过将一个或多个核苷酸序列变化导入所选择的DNA来提供序列变体的制备和检测。
C、载体
为了在弹状病毒基因组中产生突变，可通过载体中包含的核酸分子编码天然的和经修饰的多肽。术语“载体”用于指这样的载体核酸分子，在所述载体核酸分子中可插入外源核酸序列以用于导入细胞中，在该细胞中其可进行复制。核酸序列可以是“外源的”，所述“外源的”表示所述序列对于向其中导入载体的细胞是外来的或所述序列与细胞中的序列同源但位于宿主细胞核酸的其中通常未发现所述序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员经良好训练可通过标准重组技术构建载体，所述标准重组技术描述于Sambrook等人(2001)和Ausubel等人(1994)，两者通过引用合并入本文。
除了编码经修饰的多肽例如经修饰的N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白或L蛋白外，载体可编码未修饰的多肽序列例如标签或靶向分子。编码此类融合蛋白的有用的载体包括pIN载体(Inouye等人，1985)、编码组氨酸区段的载体以及pGEX载体，其用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白以便以后的纯化和分离或切割。靶向分子是指导经修饰的多肽至受试者身体中的特定器官、组织、细胞或其他位置的分子。可选择地，靶向分子改变生物体的趋向性(tropism)，例如弹状病毒对某些细胞类型例如癌细胞的趋向性。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译，例如在反义分子或核酶的产生中不被翻译。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指特定宿主生物体中有效连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可包含也用于其他功能和下文中描述的核酸序列。
1.启动子和增强子
“启动子”是这样的控制序列，即其是在其上控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。其可包含结合调控蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子的基因元件(geneticelement)。短语“有效定位的(operativelypositioned)”、“有效偶联的(operativelycoupled)”、“有效连接的”、“在控制之下的”和“在转录控制之下的”表示启动子相对于核酸序列位于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，所述增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与基因或序列天然连接的启动子，如可通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列来获得。这样的启动子可称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然连接的增强子，其位于该序列的下游或上游。可选择地，可通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子(其指通常不与天然环境中的核酸序列连接的启动子)的控制之下来获得某些有利方面。重组或异源增强子也指通常不与其天然环境中的核酸序列连接的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子和从任何其他原核细胞、病毒、或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即，包含不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变。
除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)结合本文中公开的组合物来产生序列(参见美国专利4,683,202，美国专利5,928,906，各自通过引用合并入本文)。此外，预期也可使用指导非细胞核细胞器例如线粒体、叶绿体等中的序列转录和/或表达的控制序列。
自然，使用有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子可能是重要的。分子生物学领域技术人员通常已知启动子、增强子以及细胞类型组合用于蛋白质表达的用途，例如，参见Sambrook等人(2001)(其通过引用合并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异型的、细胞选择型(cellselective)的(即，与另一种细胞类型相比在一种细胞类型中更具活性)、诱导型的和/或在适当的条件下用于指导导入的核酸片段的高水平表达的，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
在本发明的说明书中，几种元件/启动子可用于调控基因的表达。该列表并非意欲于穷举参与表达的促进的所有可能的元件，而仅是作为其示例。还提供了诱导型元件的实例，所述诱导型元件是可响应特定刺激而被激活的核酸序列的区域。启动子/增强子(参考文献)包括：免疫球蛋白重链(Banerji等人，1983、Gilles等人，1983、Grosschedl等人，1985、Atchinson等人，1986，1987、Imler等人，1987、Weinberger等人，1984、Kiledjian等人，1988、Porton等人、1990)、免疫球蛋白轻链(Queen等人，1983、Picard等人，1984)、T细胞受体(Luria等人，1987、Winoto等人，1989、Redondo等人、1990)、HLADQα和/或DQβ(Sullivan等人，1987)、β干扰素(Goodbourn等人，1986、Fujita等人，1987、Goodbourn等人，1988)、白细胞介素-2(Greene等人，1989)、白介素-2受体(Greene等人，1989、Lin等人，1990)、MHCII类5(Koch等人，1989)、MHCII类HLA-DRα(Sherman等人，1989)、β-肌动蛋白(Kawamoto等人，1988、Ng等人、1989)、肌肌酸激酶(MCK)(Jaynes等人，1988、Horlick等人，1989、Johnson等人，1989)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白)(Costa等人，1988)、弹性蛋白酶I(Omitz等人，1987)、金属硫蛋白(MTII)(Karin等人，1987、Culotta等人，1989)、胶原酶(Pinkert等人，1987、Angel等人，1987)、白蛋白(Pinkert等人，1987、Tronche等人，1989，1990)；甲胎蛋白(Godbout等人，1988、Campere等人，1989)、γ-珠蛋白(Bodine等人，1987、Perez-Stable等人，1990)、β-珠蛋白(Trudel等人，1987)、c-fos(Cohen等人，1987)、c-HA-ras(Triesman，1986、Deschamps等人，1985)、胰岛素(Edlund等人，1985)、神经细胞粘附分子(NCAM)(Hirsh等人，1990)、α1-Antitrypain(Latimer等人，1990)、H2B(TH2B)组蛋白(Hwang等人，1990)、小鼠和/或I型胶原(Ripe等人，1989)、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)(Chang等人，1989)、大鼠生长激素(Larsen等人，1986)、人血清淀粉样蛋白A(SAA)(Edbrooke等人，1989)、肌钙蛋白I(TNI)(Yutzey等人，1989)、血小板源生长因子(PDGF)(Pech等人，1989)、假肥大型肌营养不良(Klamut等人，1990)、SV40(Banerji等人，1981、Moreau等人，1981、Sleigh等人，1985、Firak等人，1986、Herr等人，1986、Imbra等人，1986、Kadesch等人，1986、Wang等人，1986、Ondek等人，1987、Kuhl等人，1987、Schaffner等人，1988)、多瘤(Swartzendruber等人，1975、Vasseur等人，1980、Katinka等人，1980，1981、Tyndell等人，1981、Dandolo等人，1983、deVilliers等人，1984、Hen等人，1986、Satake等人，1988、Campbell等人，1988)、逆转录病毒(Kriegler等人，1982，1983、Levinson等人，1982、Kriegler等人，1983，1984a，b，1988、Bosze等人，1986、Miksicek等人，1986、Celander等人，1987、Thiesen等人，1988、Celander等人，1988、Chol等人，1988、Reisman等人，1989)、乳头状瘤病毒(Campo等人，1983、Lusky等人，1983、Spandidos和Wilkie，1983、Spalholz等人，1985、Lusky等人，1986、Cripe等人，1987、Gloss等人，1987、Hirochika等人，1987、Stephens等人，1987)、乙型肝炎病毒(Bulla等人，1986、Jameel等人，1986、Shaul等人，1987、Spandau等人，1988、Vannice等人，1988)、人免疫缺陷病毒(Muesing等人，1987、Hauber等人，1988、Jakobovits等人，1988、Feng等人，1988、Takebe等人，1988、Rosen等人，1988、Berkhout等人，1989、Laspia等人，1989、Sharp等人，1989、Braddock等人，1989)、巨细胞病毒(CMV)(Weber等人，1984、Boshart等人，1985、Foecking等人，1986)和长臂猿白血病病毒(Holbrook等人，1987；Quinn等人，1989)。
诱导型元件(元件/诱导剂(参考文献))包括：MTII/佛波酯(TFA)，重金属(Palmiter等人，1982；Haslinger等人，1985；Searle等人，1985、Stuart等人，1985；Imagawa等人，1987；Karin等人，1987；Angel等人，1987b、McNeall等人，1989)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)/糖皮质激素(Huang等人，1981；Lee等人，1981；Majors等人，1983；Chandler等人，1983；Lee等人，1984、Ponta等人，1985；Sakai等人，1988)、β-干扰素/poly(rI)x，poly(rc)(Tavernier等人，1983)、腺病毒5E2/E1A(Imperiale等人，1984)、胶原酶/佛波酯(TPA)(Angel等人，1987a)、溶基质蛋白酶/佛波酯(TPA)(Angel等人，1987b)、SV40/佛波酯(TPA)(Angel等人，1987b)、鼠MX基因/干扰素，新城疫病毒(Hug等人，1988)、GRP78基因/A23187(Resendez等人，1988)、α-2-巨球蛋白/IL-6(Kunz等人，1989)、波形蛋白/血清(Rittling等人，1989)、MHCI类基因H-2κb/干扰素(Blanar等人，1989)、HSP70/E1A，SV40大T抗原(Taylor等人，1989，1990a，1990b)、增殖蛋白/佛波酯-TPA(Mordacq等人，1989)、肿瘤坏死因子/PMA(Hensel等人，1989)和促甲状腺激素α基因/甲状腺激素(Chatterjee等人，1989)。
组织特异型或组织选择型(即，与另一种细胞相比在一种细胞中具有更大活性的启动子)启动子或元件的鉴定以及表征它们的活性的测定法对于本领域技术人员来说是熟知的。此类区域的实例包括人LIMK2基因(Nomoto等人1999)、生长抑素受体2基因(Kraus等人，1998)、鼠附睾视黄酸-结合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki，等人，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee，等人，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等人，1997)、人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等人，1996)和SM22α启动子。
可以与本发明组合使用的另外的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子列于本文中。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(EukaryoticPromoterDataBase)EPDB)也可用于驱动编码寡糖加工酶、蛋白折叠辅助蛋白、选择标记蛋白或目的异源蛋白的结构基因表达。可选择地，用于癌症基因治疗(表2)或肿瘤靶向(表3)的组织特异型启动子可以与本发明的核酸分子一起使用。
表2.用于癌症基因治疗的候选组织特异型启动子
组织特异型启动子 其中启动子具有活性的癌症 其中启动子具有活性的正常细胞
癌胚抗原(CEA)* 大多数结肠直肠癌；50％的肺癌；40-50％的胃癌；大多数胰腺癌；许多乳腺癌 结肠粘膜；胃粘膜；肺上皮；外泌汗腺；睾九中的细胞
前列腺特异性抗原(PSA) 大多数前列腺癌 前列腺上皮
血管活性肠肽(VIP) 大多数非小细胞肺癌 神经元；淋巴细胞；肥大细胞；嗜酸性粒细胞
表面活性蛋白A(SP-A) 许多肺腺癌细胞 II型肺细胞；Clara
人无刚毛鳞甲(achaete-scute)同源物(hASH) 大多数小细胞肺癌 肺中的神经内分泌细胞
组织特异型启动子 其中启动子具有活性的癌症 其中启动子具有活性的正常细胞
粘蛋白-1(MUC1)** 大多数腺癌(来源于任何组织) 乳房中和呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道中的腺上皮细胞
甲胎蛋白 大多数肝细胞癌；可能地许多睾九癌 肝细胞(在某些病况下)；)睾丸
白蛋白 大多数肝细胞癌 肝细胞
酪氨酸酶 大多数黑色素瘤 黑素细胞；星形胶质细胞，施旺细胞；一些神经元
酪氨酸-结合蛋白(TRP) 大多数黑色素瘤 黑素细胞；星形胶质细胞，施旺细胞；一些神经元
角蛋白14 推定的许多鳞状细胞癌(例如：头颈癌) 角质形成细胞
EBV LD-2 头和颈的许多鳞状细胞癌 上消化道的角质形成细胞、上消化道的角质形成细胞
胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) 许多星形细胞瘤 星形胶质细胞
髓磷脂碱蛋白(MBP) 许多神经胶质瘤 少突胶质细胞
睾丸特异性血管紧张素转化酶(睾九-特异性ACE) 可能地许多睾丸癌 精子(Spermatazoa)
骨钙素 可能地许多骨肉瘤 成骨细胞
表3.与肿瘤的组织特异性靶向一起使用的候选启动子
启动子 其中启动子具有活性的癌症 其中启动子具有活性的正常细胞
E2F-调控的启动子 几乎所有癌症 增殖细胞
启动子 其中启动子具有活性的癌症 其中启动子具有活性的正常细胞
HLA-G 许多结肠直肠癌；许多黑色素瘤；可能地许多其他癌症 淋巴细胞；单核细胞；精母细胞；滋养层
FasL 大多数黑色素瘤；许多胰腺癌；大多数星形细胞瘤；可能地许多其他癌症 活化的白细胞；神经元；内皮细胞；角质形成细胞；免疫豁免组织中的细胞；肺、卵巢、肝和前列腺中的一些细胞
Myc-调控的启动子 大多数肺癌(小细胞和非小细胞)；大多数结肠直肠癌 增殖细胞(只有一些细胞类型)：乳腺上皮细胞(包括非增殖的)
MAGE-1 许多黑色素瘤；一些非小细胞肺癌；一些乳腺癌 睾丸
VEGF 70％的所有癌症(在许多癌细胞中组成型过表达) 新生血管形成的位置上的细胞(但与肿瘤中的不同，表达是瞬时的，不太强，并且决非组成型的)
bFGF 推定的许多不同的癌症，因为bFGF表达由局部缺血病况诱导 局部缺血位置上的细胞(但与肿瘤中的不同，表达是瞬时的，不太强，并且决非组成型的)
COX-2 大多数结肠直肠癌；许多肺癌；可能地许多其他癌症 炎症部位上的细胞
IL-10 大多数结肠直肠癌；许多肺癌；许多头和颈的鳞状 白细胞
启动子 其中启动子具有活性的癌症 其中启动子具有活性的正常细胞
细胞癌；可能地许多其他癌症
GRP78/BiP 推定地许多不同的癌症，因为GRP7S表达由肿瘤特异性病况诱导 局部缺血部位上的细胞
来自Egr-1的CarG元件 由电离辐射诱导，因此可以想像地辐射后的大多数肿瘤 暴露于电离辐射的细胞；白细胞
2.起始信号和内部核糖体结合位点
特定的起始信号也可能是编码序列的有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员将容易地能够确定其并且提供必需的信号。众所周知，起始密码子对于期望的编码序列的阅读框必须是“符合读框的”，从而确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的功效可通过包含适当的转录增强子元件来增强。
在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用用于产生多基因(multigene)、或多顺反子信使。IRES元件能够避开5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式，并且在内部位点上开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了来自细小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可一起转录，各自通过IRES分隔，从而产生多顺反子信使。依靠IRES元件，各开放阅读框架易于接近核糖体以进行有效翻译。通过使用单个启动子/增强子转录单个信使可有效地表达多个基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819，其通过引用合并入本文)。
3.多克隆位点
载体可包含多克隆位点(MCS)，所述多克隆位点是包含多个限制性内切酶位点的核酸区域，所述限制性内切酶位点的任何一个可以与标准重组技术结合使用来消化载体(参见Carbonelli等人，1999，Levenson等人，1998，和Cocea，1997，其通过引用合并入本文)。“限制性内切酶消化”是指使用只在核酸分子的特定位置上起作用的酶对核酸分子的催化切割。许多限制性内切酶是商业可获得的。此类酶的用途为本领域技术人员普遍理解。通常，使用在MCS内切割的限制性内切酶线性化或片段化载体以使得能够将外源序列连接入载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是或可以不是相互相邻的。包括限制性内切酶和连接反应的技术对于重组技术领域内的技术人员来说是熟知的。
4.终止信号
本发明的载体或构建体将通常包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与RNA聚合酶对RNA转录物的特异性终止的RNA序列组成。因此，在某些实施方案中，涉及终止RNA转录物的产生的终止信号。终止子可以是在体内获得期望的信使水平所必需的。
在负有义RNA病毒，包括弹状病毒中，终止由RNA基序来确定。
预期用于本发明的终止子包括本文中描述的或本领域技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，例如由于序列的截短，终止信号可以缺少可转录的或可翻译的序列。
5.多腺苷酸化信号
在表达，特别是真核生物表达中，其通常包括多腺苷酸化信号以进行转录物的适当多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质据认为对于本发明的成功实施不是至关重要的，和/或可使用任何此类序列。优选实施方案包括方便的和/或已知在多种靶细胞中良好发挥功能的SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号。多腺苷酸化可增加转录物的稳定性或可促进细胞质转运。
6.复制起点
为了在宿主细胞中扩增载体，其可包含一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，所述复制起始位点是在其上起始复制的特定核酸序列。可选择地，如果宿主细胞是酵母，那么可使用自主复制序列(ARS)。
7.选择和筛选标记
在本发明的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标记来在体外或体内鉴定包含本发明的核酸构建体的细胞。此类标记将赋予细胞可识别的变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予允许选择的性质的标记。阳性选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而阴性选择标记是其中其存在阻止其选择的标记。阳性选择标记的实例是药物抗性标记。
通常药物选择标记的包含帮助转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于进行条件(implementationofcondition)区分转化体的表型的标记外，也可使用其他类型的标记，包括筛选标记例如GFP，其基础是比色分析。可选择地，可使用筛选酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标记(可能与FACS分析法结合)。所使用的标记据认为不是特别重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择和筛选标记的另外的实例对于本领域技术人员来说是熟知的。
D、宿主细胞
如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语也包括它们的后代，所述后代是任何和所有后代。应理解，由于有意的或非有意的突变，所有后代可以是不同一的。在表达异源核酸序列的背景中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且其包括能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。宿主细胞可以用作，和已用作载体或病毒(如果其不表达外源多肽其不具有作为载体的资格)的受体。可“转染”或“转化”(所述转染或转化是指通过其将外源核酸例如编码经修饰的蛋白质的序列转移入或导入宿主细胞的方法)宿主细胞。转化的细胞包括原代受试细胞和其后代。
宿主细胞可来源于原核或真核生物，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，这取决于期望的结果是载体的复制还是部分或所有载体编码核酸序列的表达。可获得许多细胞系和培养物以用作宿主细胞，它们可通过美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)获得，所述保藏中心是用作活培养物和遗传物质的档案馆(archive)的组织机构(www.atcc.org)。适当的宿主可由本领域技术人员基于载体主链和期望的结果决定。质粒或粘粒，例如，可被导入原核宿主细胞以复制许多载体。用作用于载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多可商购获得的细菌宿主例如CompetentCells和SOLOPACKTMGoldCells(，LaJolla，CA)。可选择地，细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)LE392可用作噬菌体病毒的宿主细胞。适当的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomycespombe)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。
用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自各种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可获得的并且对于本领域技术人员来说已知的。类似地，病毒载体可以与真核或原核宿主细胞，特别是允许载体的复制或表达的宿主细胞结合使用。
一些载体可使用允许其在原核和真核细胞中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将进一步理解这样的条件，在该条件下温育所有上述宿主细胞以维持它们和允许载体复制。也理解和已知允许载体的大规模产生以及由载体编码的核酸和它们的相应多肽、蛋白质或肽的产生的技术和条件。
E、表达系统
存在包括至少所有或部分上述组合物的许多表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以与本发明一起使用以产生核酸序列、或它们的相应多肽、蛋白质和肽。许多此类系统可商购和广泛获得。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸片段的蛋白质表达，例如美国专利5,871,986和4,879,236中描述的(两者通过引用合并入本文的)，并且所述系统可以例如在2.0的名称下从和BACPACKTMBACULOVIRUSEXPRESSIONSYSTEMFROM购得。
除了本发明的公开的表达系统外，表达系统的其他实例包括的COMPLETECONTROLTMInducibleMammalianExpressionSystem，其包括合成的蜕皮激素诱导型受体，或其pETExpressionSystem(大肠杆菌表达系统)。诱导型表达系统的另一个实例可从获得，该系统携带T-REXTM(四环素-调控的表达)System(使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统)。还提供称为PichiamethanolicaExpressionSystem的酵母表达系统，其设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员知道如何表达载体(例如表达构建体)以产生核酸序列或其相应多肽、蛋白质或肽。
F、核酸的检测
除了它们在指导痘病毒蛋白质、多肽和/或肽的表达中的用途外，本文中公开的核酸序列还具有多种其他用途。例如，它们具有作为用于包括核酸杂交的实施方案的探针或引物的功用。它们可用于本发明的诊断或筛选方法。本发明包括编码弹状病毒或弹状病毒多肽调节子(modulator)的核酸的检测。
1.杂交
长度为13至100个核苷酸的，优选17至100个核苷酸的，或在本发明的一些方面长度达到1至2千碱基或更长的探针或引物的使用允许形成稳定且选择性的双链分子。通常优选在长度大于20个碱基的连续区段上具有互补序列的分子，以增加获得的杂交分子的稳定性和/或选择性。研究人员通常偏爱设计具有一个或多个20至30个核苷酸或甚至更长(当想要时)的互补序列的核酸分子用于杂交。此类片段可以例如通过用化学方法直接合成片段或通过将选择的序列导入用于产生重组体的重组载体来容易地制备。
因此，本发明的核苷酸序列可用于它们与DNA和/或RNA互补区段选择性形成双链分子或提供用于从样品扩增DNA或RNA的引物的能力。取决于期望的应用，研究人员希望使用不同的杂交条件来获得不同程度的探针或引物对靶序列的选择性。
对于需要高选择性的应用，研究人员通常希望使用相对高的严格条件来形成杂交物(hybrid)。例如，相对低的盐和/或高温度条件，例如在大约50℃至大约70℃的温度下由大约0.02M至大约0.10M的NaCl提供的条件。这样的高严格条件容忍极少的(如果有的话)探针或引物与模板或靶链之间的错配并且特别适合用于分离特异性基因或用于检测特异性mRNA转录物。通常理解，可通过加入不断增加的量的甲酰胺来使条件更严格。
对于某些应用，例如定点诱变，应理解，较低的严格条件是优选的。在这些条件下，可发生杂交，即使杂交链的序列并非完全互补，而是在一个或多个位置上错配。可通过增加盐浓度和/或降低温度来使条件较不严格。例如，可通过在大约37℃至大约55℃的温度下由大约0.1至0.25M的NaCl提供中等严格条件，而可通过在大约20℃至大约55℃的温度下由大约0.15M至大约0.9M的盐提供低严格条件。取决于期望的结果可容易地操控杂交条件。
在其他实施方案中，可例如在大约20℃至大约37℃的温度下在50mMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3mMMgC12，1.0mM二硫苏糖醇的条件下完成杂交。所使用的其他杂交条件可包括在大约40℃至大约72℃的温度下，大约10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mMMgCl2。
在某些实施方案中，有利地与用于确定杂交的适当的方法例如标记组合使用本发明的确定序列的核酸。许多合适的指示剂方法在本领域内是已知的，包括能够被检测的荧光的、放射性的、酶促的或其他配体，例如抗生物素蛋白/生物素。在优选实施方案中，研究人员可能期望使用荧光标记或酶标签例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶而非放射性或其他不合环境要求的试剂。在酶标签的情况下，比色指示剂(colorimetricindicator)底物已知可用于提供可见的或分光光度法可检测的检测方法，以鉴定与包含互补核酸的样品的特异性杂交。
一般来说，预期本文中描述的探针或引物将在溶液杂交(如在PCRTM中)中以及在使用固相的实施方案中用作试剂，用于检测相应基因的表达。在包括固相的实施方案中，将受试DNA(或RNA)吸附或附着至选择的基质或表面。然后使该固定的、单链核酸在期望的条件下经历与选择的探针的杂交。所选择的条件将取决于特定的环境(例如取决于G+C含量、靶核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的大小等)。用于特定的目的应用的杂交条件的最优化对于本领域技术人员来说是熟知的。在清洗杂交的分子以除去非特异性结合的探针分子后，通过测定结合的标记的量来检测和/或定量杂交。代表性固相杂交法公开于美国专利5,843,663、5,900,481和5,919,626中。可用于实施本发明的其他杂交方法公开于美国专利5,849,481、5,849,486和5,851,772中。本说明书的该部分中鉴定的这些和其他参考文献的相关部分通过引用合并入本文。
2.核酸的扩增
用作扩增的模板的核酸可按照标准方法(Sambrook等人，2001)从细胞、组织或其他样品中分离。在某些实施方案中，对完整细胞或组织匀浆或生物体液样品进行分析而无需充分纯化模板核酸。核酸可以是基因组DNA或分开的(fractionated)或全细胞RNA。当使用RNA时，可能期望首先将RNA转变成互补DNA。
术语“引物”，如本文所使用的，是指包括能够在依赖于模板的方法中引发新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是长度为10至20和/或30个碱基对的寡核苷酸，但也可使用更长的序列。引物可以以双链和/或单链的形式提供，尽管单链形式是优选的。
将经设计选择性与相应于本文中鉴定的基因序列的核酸杂交的引物对与模板核酸在允许选择性杂交的条件下接触。取决于期望的应用，可选择只允许对与引物完全互补的序列杂交的高严格杂交条件。在其他实施方案中，杂交可在减少的严格性下发生，从而允许包含一个或多个与引物序列的错配的核酸扩增。杂交后，将模板-引物复合物与一个或多个促进依赖于模板的核酸合成的酶接触。进行多轮扩增(也称为“循环”)直至产生足够量的扩增产物。
许多依赖于模板的方法可用于扩增存在于给定的模板样品中的寡核苷酸序列。最有名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(称为PCRTM)，其详细地描述于美国专利4,683,195，4,683,202和4,800,159，以及Innis等人，1988中，其各自以其全文通过引用合并入本文。
可进行逆转录酶PCRTM扩增方法以定量扩增的mRNA的量，所述的增方法是熟知的(参见Sambrook等人，2001；WO90/07641；和美国专利5,882,864)。
用于扩增的另一个方法是连接酶链式反应(“LCR”)，其公开于欧洲申请320308(其全文通过引用合并入本文)。美国专利4,883,750描述了与LCR相似的用于将探针对与靶序列结合的方法。还可使用美国专利5,912,148中公开的基于PCRTM和寡核苷酸连接酶测定(OLA)的方法。可用于实施本发明的用于扩增靶核酸序列的可选择的方法公开于美国专利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291和5,942,391、GB申请2202328，以及PCT申请PCT/US89/01025中，其各自以其全文通过引用合并入本文。PCT申请PCT/US87/00880中描述的Qβ复制酶也可用于本发明的扩增方法。还可使用Walker等人(1992)描述的等温扩增。此外还可使用美国专利5,916,779中公开的链置换扩增(SDA)。
其他核酸扩增法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等人，1989；PCT申请WO88/10315，以其全文通过引用合并入本文)。欧洲申请329822公开了包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增法，其可按照本发明使用。
PCT申请WO89/06700(以其全文通过引用合并入本文)公开了基于启动子区域/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)杂交，然后转录所述序列的许多RNA拷贝的核酸序列扩增方案。其他扩增法包括“RACE”和“单向(one-sided)PCR”(Frohman，1990；Ohara等人，1989)。
3.核酸的检测
在任何扩增后，可期望将扩增产物与模板和过量引物分开和/或分离。在一个实施方案中，使用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺、或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物(Sambrook等人，2001)。
核酸的分离还可通过本领域内已知的色谱技术来实现。存在许多种可用于实施本发明的色谱法，包括吸附、分配、离子交换、羟基磷灰石、分子筛、反相、柱、纸、薄层和气相色谱以及HPLC。
常用的显现方法包括使用溴化乙锭的凝胶染色和在紫外光下条带的显现。可选择地，如果用放射性或荧光标记的核苷酸整体标记扩增产物，则可将分离的扩增产物暴露于X线胶片或在合适的激发光谱下显现。
在特定的实施方案中，通过Southern印迹法和与标记的探针的杂交来进行检测。涉及Southern印迹法的技术对于本领域技术人员来说是熟知的(参见Sambrook等人，2001)。一个上述的实例描述于美国专利5,279,721(通过引用全并入本文)中，该专利公开了用于核酸的自动化电泳和转移的装置和方法。
可用于实施本发明的其他核酸检测方法公开于美国专利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791，其各自通过引用合并入本文。
4.其他测定法
用于遗传筛选的其他方法可用于本发明的范围内，例如，用于检测基因组核酸、cDNA和/或RNA样品中的突变。用于检测突变的方法包括变性梯度凝胶电泳法(“DGGE”)、限制片段长度多态性分析(“RFLP”)、化学或酶促切割法、由PCRTM(参见上面)扩增的靶序列的直接测序、单链构象多态性分析(“SSCP”)和本领域内熟知的其他方法。一个筛选点突变的方法基于RNA/DNA或RNA/RNA异源双链分子中的碱基对错配的RNA酶切割。如本文中所使用的，术语“错配”定义为双链RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中一个或多个未配对的或错配的核苷酸的区域。因此该定义包括由于插入/缺失突变以及单个或多个碱基点突变引起的错配(例如参见美国专利4,946,773)。可用于实施本发明的用于检测缺失、插入或置换突变的可选择的方法公开于美国专利5,849,483、5,851,770、5,866,337、5,925,525和5,928,870中，其各自以其全文通过引用合并入本文。
G、基因转移的方法
用于核酸递送以实现本发明的组合物的表达的合适方法据认为实际上包括任何这样的方法，通过所述方法可将核酸(例如，DNA或RNA，包括病毒和非病毒载体)导入细胞器、细胞、组织或生物体，如本文中所描述的或本领域技术人员所已知的。此类方法包括但不限于核酸的直接递送，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用合并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，通过引用合并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，通过引用合并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE葡聚糖，然后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接sonicloading(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)；通过微粒轰击(PCT申请WO94/09699和95/06128；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，各自通过引用合并入本文)；通过使用碳化硅纤维的搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，各自通过引用合并入本文)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055，各自通过引用合并入本文)；或通过PEG介导的原生质体的转化(Omirulleh等人，1993；美国专利4,684,611和4,952,500，各自通过引用合并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄入(Potrykus等人，1985)进行的直接递送。通过技术例如这些技术的应用，可稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
H、脂质组分和部分
在某些实施方案中，本发明涉及包含一种或多种与核酸、氨基酸分子例如肽或另一种小分子化合物结合的脂质的组合物。在本文描述的任何实施方案中，所述分子可以是弹状病毒多肽或弹状病毒多肽调节子，例如编码弹状病毒多肽的全部或部分的核酸，或可选择地，编码弹状病毒多肽调节子的全部或部分的氨基酸分子。脂质是特有地不溶水和可用有机溶剂提取的物质。除了本文中明确公开的那些化合物外的化合物由本领域技术人员理解为脂质，其包括在本发明的组合物和方法中。可将脂质组分和非脂质共价或非共价地相互连接。
脂质可以是天然存在或合成的(即，由人设计或产生)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域内是熟知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶脂质(lysolipids)、鞘糖脂、糖脂、sulphatide、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质以及其组合。
与脂质结合的核酸分子或氨基酸分子，例如肽，可在包含脂质的溶液中分散，可用脂质溶解，可用脂质乳化，可与脂质混合，可与脂质组合，可与脂质共价键合，可作为悬浮液包含在脂质中或可另外与脂质结合。本发明的脂质或脂质/病毒相关组合物不限于任何特定的结构。例如，它们也可以简单地在溶液中分散，从而可能形成大小或形状不均一的聚集体。在另一个实例中，它们可以以双层结构存在，如微团，或具有“折叠”的结构。在另一个非限定性实例中，也涉及lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-病毒复合物。
在某些实施方案中，脂质组合物包含大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％、大约10％、大约11％、大约12％、大约13％、大约14％、大约15％、大约16％、大约17％、大约18％、大约19％、大约20％、大约21％、大约22％、大约23％、大约24％、大约25％、大约26％、大约27％、大约28％、大约29％、大约30％、大约31％、大约32％、大约33％、大约34％、大约35％、大约36％、大约37％、大约38％、大约39％、大约40％、大约41％、大约42％、大约43％、大约44％、大约45％、大约46％、大约47％、大约48％、大约49％、大约50％、大约51％、大约52％、大约53％、大约54％、大约55％、大约56％、大约57％、大约58％、大约59％、大约60％、大约61％、大约62％、大约63％、大约64％、大约65％、大约66％、大约67％、大约68％、大约69％、大约70％、大约71％、大约72％、大约73％、大约74％、大约75％、大约76％、大约77％、大约78％、大约79％、大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、大约100％或可从其推导的任何范围的特定脂质、脂质类型或非脂质组分例如药物、蛋白质、糖、核酸或本文中公开的或本领域技术人员已知的其他物质。在非限定性实例中，脂质组合物可包含大约10％至大约20％的中性脂质和大约33％至大约34％的脑苷脂以及大约1％的胆固醇。因此，预期本发明的脂质组合物可以以任何组合或百分数范围包含任何脂质、脂质类型或其他组分。
IV、药物配制和治疗方案(TREATMENTREGIMEN)
在本发明的实施方案中，预期通过递送非VSV弹状病毒例如Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒治疗过度增殖性疾病或肿瘤性疾病(neoplasticdisease)例如癌症的方法。预期治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、癌前病变、肺中的癌前病变、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌和可治疗的任何其他癌症或肿瘤，包括转移性或全身性分布的癌症。
药物组合物的有效量通常定义为足以可检测地和重现地减缓、改善、减轻、最小化或限制疾病或其症状的程度的量。更严格的定义可使用，包括疾病的消除、根除或治愈。
优选，患者具有适当的骨髓功能(定义为大于2,000/mm3的外周粒细胞绝对计数和100,000/mm3的血小板计数)、适当的肝功能(小于1.5mg/dl的胆红素)和适当的肾功能(小于1.5mg/dl肌酸酐)。
A、施用
通过使用本发明的方法和组合物，技术人员通常可将过度增殖细胞或赘生性细胞与治疗性组合物例如病毒或编码多肽的表达构建体接触以杀伤细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减小肿瘤或组织大小以及逆转、停止或减少肿瘤细胞的恶性表型。施用途径可自然地随损伤的位置和性质的不同而变化，其包括例如皮内、透皮、胃肠外、血管内、静脉内、肌内、鼻内、皮下、局部、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、输注、灌洗、直接注射、饮食(alimentary)以及口服施用和配制。
为实现有关血管病况或疾病的治疗益处，技术人员可将血管细胞与治疗性化合物接触。对于血管疾病和病况，也可使用用于癌症的治疗或诊断的任何制剂和施用途径。
瘤内注射或至肿瘤脉管系统的注射预期用于分离的(discrete)、实体的、可到达的(accessible)肿瘤。局部、区域或全身性施用也特别预期用于散布的或可能全身性散布的肿瘤。可通过至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次注射施用病毒颗粒。
在外科手术(surgicalintervention)的情况下，可在手术前使用本发明以使不宜做手术的肿瘤能够进行切除术。可选择地，本发明可在手术时和/或之后使用，以治疗残留的或转移的疾病。例如，可用包含弹状病毒多肽或弹状病毒(其可以具有或可以不具有突变)的制剂注射或输注切除后的瘤床，这对于癌症或癌细胞的治疗是有利的。切除后，可例如通过将导管植入手术的位置来继续输注。也可使用周期性术后治疗。
当适当时，例如当切除肿瘤和治疗瘤床以消除残留的微观疾病时，可使用连续给药。通过注射器或导管进行的递送是优选的。在开始治疗后，这样的连续输注可进行大约1-2小时至大约2-6小时、至大约6-12小时、至大约12-24小时、至大约1-2天、至大约1-2周或更长的时间。通常，通过连续输注的治疗性组合物的剂量将等同于由单次或多次注射提供的剂量(在输注发生期间调整)。还预期，肢体输注法可用于施用本发明的治疗性组合物，特别是在黑色素瘤和肉瘤的治疗中。
治疗方案也可改变，且通常取决于患者的肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进程以及健康情况和年龄。显然，某些类型的肿瘤需要更激进的治疗，然而同时，某些患者不能耐受更繁重的(taxing)的方案。临床医生将能够基于治疗制剂的已知功效和毒性(如果有的话)来做这样的判断。
在某些实施方案中，待治疗的肿瘤可能不可以(至少最初)被切除。使用治疗性病毒构建体的治疗可增加肿瘤的可切除性(由于边缘的皱缩或通过消除某些特定侵袭部分)。在治疗后，可能可以进行切除。切除后的额外治疗将用于消除肿瘤部位的微观残留疾病。
原发性肿瘤或切除后的瘤床的典型疗程将包括多个剂量。典型的原发性肿瘤治疗包括在1，2，3，4，5，6周内或更长的时间内进行1，2，3，4，5，6或更多次剂量施用。两周的方案可重复1、2、3、4、5、6或更多次。在治疗过程中，可重新评估完成计划给药的需要。
治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为包含预先确定量的治疗性组合物。待施用的量以及特定的施用途径和制剂在临床领域技术人员的能力之内。单位剂量不必以单次注射施用，而是可包括在设定的时间内的连续输注。本发明的单位剂量可方便地以病毒构建体的空斑形成单位(pfu)或病毒颗粒的方式来描述。剂量单位在103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013pfu或vp和更高的范围内变化。可选择地，取决于病毒的种类和可达到的滴度，技术人员可将1至100，10至50，100-1000，或高达大约1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011，1×1012，1×1013，1×1014或1×1015或更高的感染性病毒颗粒(vp)递送至患者或患者的细胞。
B、可注射的组合物和制剂
在本发明中用于将编码弹状病毒基因组的全部或部分的表达构建体或病毒递送至癌细胞或肿瘤细胞的优选方法是通过血管内注射。然而，本文中公开的药物组合物可选择地可瘤内、胃肠外、静脉内、动脉内、皮内、肌内、透皮或甚至腹膜内施用，如美国专利5,543,158、5,641,515和5,399,363(各自明确地以其全文通过引用合并入本文)中所描述的。
核酸构建体的注射可通过注射器或用于溶液注射的任何其他方法进行，只要表达构建体可通过注射所需的特定规格的针头(例如参见美国专利5,846,233和5,846,225)。
以游离碱或药学上可接受的盐存在的活性化合物的溶液可在与表面活性剂例如羟丙纤维素适当混合的水中进行配制。也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中和油中制备分散体。在普通贮藏和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂(美国专利5,466,468，明确地以其全文通过引用合并入本文)。在所有情况下，剂型(form)必需是无菌的并且必须具有达到易于注射的程度的流动性。其在生产和贮藏的条件下必须是稳定的且必须进行防腐以防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。
关于水溶液中的胃肠外施用，例如，溶液应当进行适当的缓冲(如果需要的话)并且首先用足够的盐或糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合用于静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。关于这一点，在本公开内容的指导下，可使用的无菌水性介质对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，然后将其加至1000ml的皮下输液液体(hypodermoclysisfluid)或在推荐的灌输部位进行注射，(参见例如，“Remington′sPharmaceuticalSciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。剂量的一些变化将取决于接受治疗的受试者的状况而必然发生。负责施用的人无论如何将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足正在使用该组合物的国家的政府所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
可以以中性或盐形式配制本文中公开的组合物。药学上可接受的盐，包括与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐(与蛋白质游离氨基形成的)。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和来源于有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。在配制后，以与剂量制剂(dosageformulation)相容的方式和以这样的量如治疗有效量施用溶液。以多种剂型例如注射液、药物释放胶囊(drugreleasecapsule)等容易地施用制剂。
如本文所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类用于药物活性物质的介质和试剂的使用在本领域内是熟知的。除了在任何常规介质或试剂与活性组分不相容的情况下外，预期将其用于治疗性组合物。还可将补充性活性组分并入组合物。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当对人施用时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。包含蛋白作为活性组分的水性组合物的制备在本领域内已广为理解。一般地，将此类组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可制备适合于在注射之前在液体中配制成溶液或悬浮液的固体剂型。
C、组合治疗
本发明的化合物和方法可用于过度增殖或肿瘤性疾病/病况(包括癌症和动脉粥样硬化)的背景。为了增加使用本发明的组合物例如弹状病毒的治疗的功效，可能期望将这些组合物与在治疗此类疾病或病况中有效的其他试剂组合。例如，可用本发明的治疗化合物和其他抗癌治疗例如抗癌剂或手术进行癌症的治疗。
可以使用各种组合；例如，非VSV弹状病毒，例如Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSprings病毒和/或大巴伊亚病毒，是“A”，并且可包括第二弹状病毒的第二抗癌治疗是“B”：A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
考虑到病毒治疗的毒性(如果有的话)，按照用于施用该特定的第二治疗的一般方案对患者施用本发明的治疗性病毒或病毒载体。预期当必需时，重复治疗周期。也预期，各种标准治疗，以及外科手术，可以与描述的癌症或肿瘤细胞治疗组合使用。
1.抗癌治疗
“抗癌”剂能够例如通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞的凋亡、减少癌细胞的生长速度、减少转移灶的发生或数目、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血液供应、促进抗癌细胞或肿瘤的免疫反应、阻止或抑制癌症的进程或增加患癌受试者的寿命来负作用于受试者的癌症。抗癌剂包括生物试剂(生物治疗)、化学治疗剂和放射治疗剂。更常见地，此类其他组合物可以以有效地杀伤或抑制细胞的增殖的组合的量提供。该方法可包括同时将细胞与病毒或病毒构建体和试剂或多种因子接触。这可通过将细胞与包含两种试剂的单个组合物或药物制剂接触，或通过同时将细胞与两种不同的组合物或制剂(其中一种组合物包含病毒，而另一种包含第二试剂)接触来实现。
肿瘤细胞对化学治疗剂和放射治疗剂的抗性代表了临床肿瘤学中的主要问题。当前癌症研究的一个目标是发现通过将化学治疗和放射治疗与基因治疗组合来提高其功效的方法。例如，单纯疱疹-胸腺激酶(HS-tK)基因，当通过逆转录病毒载体系统递送至脑瘤时，成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的易感性(Culver等人，1992)。在本发明的背景中预期，除了其他促凋亡剂或细胞周期调节剂外，类似地还可将痘病毒治疗与化学治疗、放射治疗、免疫治疗或其他生物干涉结合使用。
可选择地，病毒治疗可通过数分钟至数周的间隔在其他治疗前或治疗后进行。在其中其他试剂和病毒分别用于细胞的实施方案中，技术人员通常可确保有效时间在每次递送的时间之间不过期，以便试剂和病毒将仍然能够对细胞产生有利的组合效应。在这样的情况下，预期技术人员可在相互的大约12至24小时内和，更优选在相互的大约6至12小时内将细胞与两种药征接触。然而，在一些情况下，可能期望显著延长治疗时间，其中在各自的施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
a、化学治疗
癌症的治疗还包括多种具有基于化学和放射的治疗的组合治疗。组合化学治疗包括，例如，顺铂(CDDP)、卡铂、甲苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法尼基蛋白质转移酶抑制剂、反式铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨喋呤、Temazolomide(DTIC的水性形式)或上述物质的任何类似物或衍生变体。化学治疗与生物治疗的组合称为生物化学治疗(biochemotherapy)。
b、放射治疗
引起DNA损伤和已广泛使用的其他因子包括通常称为γ-射线、X-射线、质子束的因子和/或放射性同位素至肿瘤细胞的直接递送。DNA损伤因子的其他形式还涉及例如微波和紫外线照射。所有这些因子都很可能对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成大范围损伤。X射线的剂量范围在从50至200伦琴的日剂量(对于长期(3至4周))到2000至6000伦琴的单剂量的范围内。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的吸收。
术语“接触”或“暴露”，当用于细胞时，在本文中用于描述通过其将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置放置的方法。为了获得细胞杀伤或阻滞，将两种试剂以有效杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。
c、免疫治疗
免疫治疗剂通常依赖于免疫效应细胞和分子靶向和破坏癌细胞的用途。免疫效应物可以是例如特异于肿瘤细胞表面上的一些标记的抗体。抗体单独地可用作治疗的效应物或其可募集其他细胞来实际进行细胞杀伤。还可将抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且其只用作靶向性试剂。可选择地，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗药征(modalities)(即直接的细胞毒性活性和某些弹状病毒或弹状病毒多肽的抑制或减少作用)的组合，可在癌症的治疗中提供治疗益处。
免疫治疗也可用作组合治疗的部分。下面论述用于组合治疗的一般方法。在免疫治疗的一个方面，肿瘤细胞必须具有一些易于靶向(即不存在于大多数其他细胞)的标记。存在许多肿瘤标记并且这些标记中的任一个可适合用于本发明背景中的靶向。常见肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原(urinarytumorassociatedantigen)、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。肿瘤细胞裂解物也可用于抗原组合物。
免疫治疗的可选择的方面是将抗癌效应与免疫刺激效应组合。免疫刺激分子包括：细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、IFNγ，趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子例如FLT3配体。已显示将免疫刺激分子(如蛋白质或使用基因递送)与肿瘤抑制剂组合增强抗肿瘤效应(Ju等人，2000)。
如之前所描述的，目前在研究的或使用的免疫治疗的实例是免疫佐剂(例如，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)、细胞因子治疗(例如，干扰素α，β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)、基因治疗(例如，TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)以及单克隆抗体(例如，抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185)(Pietras等人，1998；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。赫赛汀(曲妥珠单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(小鼠-人)单克隆抗体(Dillman，1999)。已显示使用赫赛汀和化学治疗的癌症的组合治疗比单独的治疗更有效。因此，预期可将一种或多种抗癌治疗与本文中描述的弹状病毒相关治疗一起使用。
(1)被动免疫治疗
存在许多用于癌症的被动免疫治疗的不同方法。它们可广泛分类为：单独的抗体注射、与毒素或化学治疗剂偶联的抗体的注射、与放射性同位素偶联的抗体的注射、抗-独特型抗体的注射和最后，骨髓中肿瘤细胞的清除(purging)。
优选，人单克隆抗体用于被动免疫治疗，因为它们在患者中产生少量或不产生副作用。然而，它们的应用多少受到它们的缺乏的限制并且到目前为止仅通过损伤内(intralesionally)施用。已将抗神经节苷脂抗原的人单克隆抗体通过损伤内施用给患有皮肤复发性黑色素瘤(cutaneousrecurrentmelanoma)的患者(Irie和Morton，1986)。在每日或每周损伤内注射后，在10个患者的6个中观察到消退(Regression)。在另一个研究中，通过两种人单克隆抗体的损伤内注射获得了适度的成功(Irie等人，1989)。
可以有利地施用一种以上的抗两种不同抗原的单克隆抗体或甚至具有多个抗原特异性的抗体。治疗方案还可包括施用如Bajorin等人(1988)描述的淋巴因子或其他免疫增强剂。人单克隆抗体的开发在本说明书的其他地方进一步详细地描述。
(2)主动免疫治疗
在主动免疫治疗中，通常将抗原性肽、多肽或蛋白质或自体(autologous)或异体(allogenic)肿瘤细胞组合物或“疫苗”与不同的细菌佐剂一起施用(Ravindranath和Morton，1991；Morton等人，1992；Mitchell等人，1990；Mitchell等人，1993)。在黑色素瘤免疫治疗中，引发高IgM反应的患者通常比不引发或引发低IgM抗体的患者存活更好(Morton等人，1992)。IgM抗体通常是瞬时抗体(transientantibody)并且例外地显示为抗神经节苷脂或抗碳水化合物抗体。
(3)过继性免疫治疗
在过继性免疫治疗中，在体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴细胞，通过淋巴因子例如IL2活化其或用肿瘤坏死的基因转导其，然后将其施用回体内(Rosenberg等人，1988；1989)。为实现该治疗，可对动物或人患者施用免疫有效量的活化的淋巴细胞和本文中描述的合并佐剂的抗原性肽组合物。活化的淋巴细胞最优选是早先从血液或肿瘤样品分离并且进行体外活化(或“扩增”)的患者自己的细胞。该形式的免疫治疗已产生几例黑色素瘤和肾癌的消退，但与不反应的人相比，反应者的百分数很少。
d、基因
在另一个实施方案中，第二治疗是其中在施用弹状病毒之前、之后或同时施用治疗性多核苷酸的基因治疗。弹状病毒与编码下列基因产物之一的载体一起的递送将对靶组织具有组合的抗癌效应。可选择地，弹状病毒可通过基因工程改造为病毒载体以包含治疗性多核苷酸。多种蛋白质包括在本发明内，其中一些在下面进行描述。表4列出了可被靶向用于与本发明组合的一些形式的基因治疗的各种基因。
(1)细胞增殖的诱导物
诱导细胞增殖的蛋白质依赖于功能进一步分为不同种类。所有此类蛋白质的共同特征是它们调控细胞增殖的能力。例如，PDGF的一种形式，sis癌基因，是分泌的生长因子。癌基因极少从编码生长因子的基因产生，并且目前，sis是唯一已知的天然存在的致癌生长因子。在本发明的一个实施方案中，预期针对细胞增殖的特定诱导物的反义mRNA用于阻止细胞增殖的诱导物的表达。
(2)细胞增殖的抑制剂
抑癌基因用于抑制过度的细胞增殖。此类基因的灭活破坏了它们的抑制活性，从而导致不受调控的增殖。抑癌基因包括p53、p16和C-CAM。可按照本发明使用的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合蛋白、p21/p27融合蛋白、抗血栓基因(例如，COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、参与血管发生的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反应蛋白(thrombospondin)、BAI-1、GDAIF或它们的受体)和MCC。
(3)程序性细胞死亡的调控剂
凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育、成年组织中保持动态平衡和抑制致癌作用的必需过程(Kerr等人，1972)。蛋白质的Bc1-2家族和ICE样蛋白酶已证明是其他系统中凋亡的重要的调控剂和效应物。Bcl2蛋白(发现其与滤泡性淋巴瘤相关)在控制凋亡和增强细胞存活中(响应于不同凋亡刺激)起着显著作用(Bakhshi等人，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等人，1986；Tsujimoto等人，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。进化保守的Bcl-2蛋白现被公认为是可被分类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的相关蛋白的家族的成员。
在其发现后，已显示Bcl2用于抑制由多种刺激触发的细胞死亡。此外，现已很清楚，存在共有相同结构和序列同源性(homology)的Bcl-2细胞死亡调控蛋白的家族。这些不同的家族成员已显示具有与Bcl2相似的功能(例如，BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)或抵消Bcl2功能和促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
e、手术
大约60％患有癌症的人将经历相同类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可与其他治疗例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或可选择的治疗结合使用的癌症治疗。
治愈性手术包括其中物理除去、切除和/或破坏全部或部分癌组织的切除术。肿瘤切除术是指物理除去肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除术以外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(Mohs手术)。进一步预期，本发明可与浅表癌(superficialcancer)、初期癌(pre-cancer)或附带量的正常组织的切除结合使用。
在切除部分或全部癌细胞、组织、或肿瘤后，可在体内形成空腔。可通过将另外的抗癌治疗剂输注、直接注射或局部施用至该区域来进行治疗。可以例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这样的治疗。这些治疗同样可具有不同的剂量。
f、其他试剂
预期，可将其他试剂与本发明组合使用以提高治疗的治疗功效。此类额外的试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和缝隙连接(GAPjunction)的上调的试剂、细胞生长抑制和分化试剂、细胞粘着的抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导物的敏感性的试剂或其他生物试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。进一步预期，细胞表面受体或它们的配体例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体)的上调可通过在过度增殖的细胞上建立自分泌或旁分泌效应来增强本发明的凋亡诱导能力。通过提高缝隙连接的数目来增加细胞间信号传导可增加对相邻过度增殖的细胞群体的抗过度增殖效应。在其他实施方案中，细胞生长抑制或分化试剂可以与本发明组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘着的抑制剂提高本发明的功效。细胞粘着抑制剂的实例是黏着斑激酶(focaladhesionkinase)(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期，增加过度增殖的细胞对凋亡的敏感性的其他试剂例如抗体c225可以与本发明组合使用以提高治疗功效。
在导入细胞毒性化学治疗药物后的癌症的治疗中已取得许多进展。然而，化学治疗的一个后果是抗药表型的发生/获得以及多重抗药性的发生。抗药性的发生仍然是此类肿瘤治疗中的主要障碍，因而，很明显存在对可选择的方法例如病毒治疗的需要。
与化学治疗、放射治疗或生物治疗结合使用的另一种形式的治疗包括过热治疗(hyperthermia)，其为其中将患者的组织暴露于高温(高达106°F)的方法。外部或内部加热装置可参与局部、区域或全身过热治疗的应用。局部过热治疗包括对小区域例如肿瘤进行加热。热可以用来自体外装置的靶向肿瘤的高频波从外部产生。内部热(internalheat)可涉及无菌探针，包括细的、加热的金属丝或充满温水的中空管、植入的微波天线或，射频电极(radiofrequencyelectrode)。
加热患者的器官或肢体以进行区域治疗，这使用产生高能的装置例如磁体来完成。可选择地，可取出患者的一些血液并且在输注入将进行内部加热的区域之前进行加热。全身加热还可在其中癌症已扩散至全身的情况下进行。温水毯、热蜡、感应线圈和热室(thermalchamber)可用于该目的。
激素治疗也可与本发明或与之前描述的任何其他癌症治疗组合使用。激素的用途可用于某些癌症例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌的治疗以降低某些激素例如睾酮或雌激素的水平或阻断其效应。该治疗通常与至少一种其他癌症治疗组合使用。
实施例
下列实施例以举例说明本发明的各种实施方案的目的给出，并且不意欲于以任何方式限定本发明。本领域技术人员将容易地理解，本发明非常适合于实现所述目的和获得提及的目标和有利方面，以及其中固有的目的、目标和有利方面。本实施例与本文中描述的方法一起仅代表优选的实施方案，其是示例性的，并且不意欲于作为对本发明的范围的限定。本领域技术人员可想到包括在由权利要求的范围所界定的本发明的精神之内的其中的变化和其他用途。
实施例1
筛选新型溶瘤候选弹状病毒
体外筛选。作为鉴定新型溶瘤病毒的初步筛选，就它们杀伤来自NCI60细胞组的人肿瘤细胞的能力对弹状病毒野外分离株进行评估。这在过去对于本发明者来说是测定一系列作为溶瘤(裂解癌细胞的)候选物的VSV突变体的相对效率的富有成效的策略。最初，本发明者检查了之前已确定在哺乳动物细胞中复制的13种新型弹状病毒。预期，扩展该方法以研究对于其缺少细胞培养经验的弹状病毒。在快速和有效筛选用13种不同病毒感染的60种细胞的矩阵的努力中，本发明者使用在96孔板中进行的快速和便宜的测定法(利用MTS还原成甲臜(formazan)，或残留细胞的结晶紫染色)来测量细胞数目和生存力。本发明者将细胞系在96孔板中培养至80％的汇合，然后在不断增加的MOI(MOI＝0.0001-10PFU/细胞)下将它们平行地暴露于我们的弹状病毒野外分离株。在感染后48和96小时，用水性MTS试剂(PromegaUSA)对细胞进行染色并且温育细胞3小时以使足够的甲臜形成。可选择地，用缓冲液清洗感染的细胞的板以除去死亡细胞，用结晶紫染料染色，清洗以除去残留的染料，之后使用去污剂溶解染料。然后使用集成多孔板读出器(BiotekSynergyHT；USA)读取这些板，拟合数据曲线，并从该曲线测定EC50。通常，以一式六份重复进行测定，除去最高和最低EC50值，平均剩余的4个EC50来最终确定值和置信区间。(例如参见图2)。
作为评估特定病毒是否在体外感染/杀伤正常人细胞的相反筛选，筛选来自本发明者的收集和可商购获得的那些(Cambrex，USA)的正常人成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞以及神经元培养物的培养物。用候选病毒(0.1至20pfu/细胞)感染培养物，进行48和96小时。细胞的生存力通过MTS测定法或结晶紫测定法来检测，并且通过用活化的caspase3抗体D175(CellSignalingTechnologies，USA)标记和使用FITC-缀合的二抗进行检测来进一步表征。用已知的易感的/抗性的人和小鼠肿瘤细胞系平行进行研究。未处理的细胞和用TRAIL和环己酰胺处理的细胞的组合已用于建立测定的动态范围，初步的z-因子测定显著高于0.5。
另一个偶然性是病毒可在培养物内复制和有效传播而不快速杀伤这些细胞。这些病毒也是潜在吸引人的病毒，只要它们的复制本质上是肿瘤选择性的，因为它们的裂解能力随后可通过重组基因工程改造而得到增加。为了检测这些病毒，本发明者用野外分离株以低MOI(0.1pfu/细胞)在24孔板的成对孔中感染NCI60细胞组的细胞。1小时后，充分清洗孔以除去游离的输入病毒，加入培养基，将培养物再温育72小时。然后在允许的细胞系(Vero细胞)上滴定这些培养物上清液以检测和定量生产性感染。滴定来自这些病毒的每一种的终清洗物以作为残留输入病毒的对照。使用病毒特异性抗血清和标准免疫荧光显微术在组织培养细胞中验证本测定法中候选病毒的击中(hit)。
基于所有参数的分级。几个性质导致肿瘤细胞的溶瘤杀伤，所述性质包括：诱导凋亡的能力、病毒产生的速度、产生的病毒的数量以及特殊功能例如合胞体形成。进一步就凋亡诱导(如通过TUNEL测定法和对活化的caspase-3的免疫荧光染色所测定的)以及比较动力学和定量病毒产量的一步生长曲线表征来自初步筛选的具有希望的候选物。这些研究将用作改良这些株系的指导。例如：(1)如果病毒杀伤肿瘤细胞但对正常细胞显示不可接受的毒性，那么本发明者将使用一种或多种下面概述的策略使该病毒减毒；(2)可选择地，如果病毒显示较慢的杀伤动力学但保持高复制速度，那么本发明者可加入毒性或治疗性转基因；(3)如果候选病毒缓慢复制，但其仍然是有效的杀伤者，那么本发明者将选择具有增加的生长动力学的变体以增强其效力。
根据本发明者对VSV和其他溶瘤病毒的经验，他们已鉴定了3个极重要的体外门控标准以缩小候选物名单：(1)选择性肿瘤细胞杀伤，(2)在肿瘤细胞内的生产性复制(不依赖于杀伤)，和(3)对抗VSV肿瘤系(UACC-62黑色素瘤、A431和NCI-H226肺、DU-145前列腺、HL60白血病)的功效。基于这些标准，整合来自上述筛选测定的结果以减少用于进一步在初步的体内测试中进行评估的名单。
体内毒性和生物分布(Biodistribution)。与临床环境相关的两个施用途径是静脉内(IV)和颅内(IC)注射。通过这些途径在感染后的小鼠中就毒性和生物分布评估在体外筛选过程中鉴定的前导候选物。以1×105至1×109pfu的剂量通过IV或以1×102至1×106pfu通过IC感染小鼠组(每组3只小鼠)。除了死亡率外，每天就昏睡、脱水、体重减轻和肢体麻痹的征状监测发病率。对来自最小致死剂量组(如果没有获得致死剂量，则最高剂量)(针对各候选病毒感染)的2只小鼠进行组织病理学检测。WTVSV和模拟物感染将分别用作适当的阳性对照和阴性对照。从该组中的其余小鼠收获器官，将其匀浆并且作为病毒生物分布的初步评估进行滴定。
对于展示可按受的致死剂量范围的病毒，本发明者随后将评估荷瘤小鼠中的生物分布以鉴定与全身性施用相容的病毒。本发明者将使用我们现有的癌症模型中的3个模型(代表极其不同的至关重要的临床关联性的器官靶)：(1)静脉内注射CT-26小鼠结肠癌(1×105个细胞)以在同基因型Balb/C小鼠中形成散布肺肿瘤，(2)将4T1小鼠乳腺癌(4×105个细胞)注射入同基因型Balb/C小鼠的脂肪垫以形成具有自发转移的单个原发性肿瘤，和(3)将U87人成胶质细胞瘤细胞(1×105个细胞)立体定向植入裸鼠的皮层。根据初步的体内毒性实验测定各病毒和途径(IV或IC)的最大耐受剂量。该值将用作荷瘤小鼠中的生物分布研究的初始治疗剂量。在每组3只的小鼠组中，建立肿瘤，进行1周，然后在它们各自的MTD用单剂量的各候选病毒通过IV或IC进行治疗。治疗后48小时，用盐水输注动物以从循环冲洗任何游离的病毒，收获肿瘤和器官，匀浆，然后滴定以定量感染性病毒。以这种方式，本发明者将确定可通过全身性注射递送至肿瘤位置的病毒以及体内病毒复制的相对肿瘤选择性。
再分级。基于体内研究的毒性、生物分布、全身性递送和肿瘤选择性特征，本研究者将选择最佳候选物以继续进行详细表征和进一步开发。
实施例2
建立重组体
测序和重组系统。为了促进快速研究和开发、临床材料的随后产生以及确保治疗性病毒的安全性和稳定性，本发明者将克隆和拯救所选择的病毒的重组体形式。
使用标准重组技术已克隆和拯救了许多负链ssRNA病毒。本发明者将使用已成功用于报导的重组-ssRNA病毒的相似策略。简而言之，通过RNA提取(QiagenCorp)从1×109个纯化的病毒颗粒分离候选病毒的基因组。然后用随机六聚物引发纯化的基因组RNA并且将其逆转录成cDNA，然后产生双链，通过连接EcoRI接头进行克隆，按大小分级分离，最后将其连接入EcoRI消化的细菌质粒(pT7Blue；Novagen)。结果是可通过标准技术容易地测序的基因组片段的文库。由于该文库的随机引发的性质，该策略将不“捕获”极端的3’和5’末端。为达到该目的，本发明者将使用T4RNA连接酶将寡核苷酸(oligo)连接至纯化的基因组RNA的3’或5’末端。通过使用与新连接的侧翼于基因组的寡核苷酸互补的引物，本发明者PCR扩增和克隆基因组的末端以用于随后的测序。该序列信息然后用于设计末端特异性引物以用于扩增完整基因组，然后将完整基因组克隆入指定的质粒。该质粒在一个末端用T7启动子以及在相对侧用肝炎Δ自切割核酶和T7终止子序列侧翼连接基因组。当转染入表达T7RNA聚合酶(之前用表达T7的痘苗病毒感染)的A549细胞时，该质粒在细胞质中产生病毒基因组。与此同时，将病毒的N、P和L基因的编码序列克隆入CMV启动子驱动的表达质粒。将基因组构建体与N、P和L质粒共转染入这些A549细胞在病毒基因组上重建了病毒复制复合体，并导致感染性病毒的拯救。作为原理的证明，本发明者已使用该方法克隆、基因操作和拯救了Maraba病毒。关于Maraba相关病毒的实例，参见图17和图18。
实施例3
最优化/增强
非VSV弹状病毒是野生病毒；并且与迄今报导的所有溶瘤病毒包括VSV一样，本发明者预测这些野外分离株将受益于通过体外选择和/或重组基因工程策略的进一步最优化。一些候选物可能需要减毒(例如，Maraba病毒)，然而一些可能需要增强它们的复制和/或肿瘤杀伤动力学(例如，MuirSprings病毒)。下列是本发明者将用来使新鉴定的治疗性病毒的功效最大化的几种策略的概述。
基因工程产生的突变(EngineeredMutation)。VSV阻断细胞核/细胞质mRNA转运(作为击败宿主细胞的先天免疫的方法)。本发明者之前已描述了通过基因工程将突变导入VSV的M蛋白以使该活性丧失，从而选择性减少该病毒在正常细胞中的毒性。鉴于水泡性病毒属的其他成员已显示该能力(金迪普拉病毒和鲤鱼春季病毒血症病毒)和鉴于大多数迄今已测序的水泡性病毒(VSV、金迪普拉病毒、皮理病毒、科卡病毒、鲤鱼春季病毒血症病毒、Maraba)具有VSV进行该功能所需的至关该重要的序列基序，本发明者预期以与用于VSV的方法相似的方式对非VSV弹状病毒减毒。然而，其他弹状病毒例如狂犬病病毒和牛短暂热病毒不具有该基序并且不阻断细胞核细胞质mRNA转运，从而可能不适用该减毒策略。随着可从联盟(consortium)实验室和其他实验室获得更多的关于弹状病毒/宿主相互作用的信息，使这些病毒减毒的额外的结构/功能指导的操作将成为可能。
转基因。现有几个关于用自杀基因或免疫介体“武装”溶瘤病毒以增加它们的功效的报导。本发明者关注于加入转基因以增加显示有效复制但不足以杀伤肿瘤的候选病毒的细胞毒性。本发明者具有目前正通过基因工程导入Maraba病毒的转基因的优先权重(priority-weighted)表。目前，等级由下列组成：(1)凋亡诱导因子(AIF)-负责染色质折叠和以不依赖于caspase的方式降解的氧化还原酶同源物。(2)HaraKiri-最有效的负责常规依赖于caspase的凋亡(I型PCD)的诱导的Bc1-2家族的BH3-only促凋亡成员。(3)XAF1-有效的肿瘤抑制基因和IAP家族的直接抑制剂。(4)Atg4B-负责起始自吞噬(II型PCD)的关键蛋白酶。
最后，细胞死亡的内部或外部途径的成员可使用Tat或其他蛋白转导结构域进行基因工程改造来从病毒感染的细胞分泌，以在肿瘤块内诱导旁观者杀伤效应(bystanderkilling)。本发明者仍然认识到，其他旁观者杀伤效应可能通过宿主对病毒和/或肿瘤的免疫的组分来介导。因此可选择的策略是设计转基因以将免疫细胞吸引至感染部位。证据表明CT26肺肿瘤的病毒感染诱导嗜中性粒细胞浸润肿瘤并且引起大量的凋亡旁观者杀伤效应。
改良溶瘤弹状病毒的定向进化。已描述了许多定向进化的实例，其中亲本病毒株系的复制适应性(replicationfitness)通过在哺乳动物细胞培养物中的连续传代获得增加或减少。弹状病毒特别适合该类型的方法，因为它们不以单个实体而以称为准种的株系群体的形式存在。准种的成员代表优势基因组(dominantgenome)的点突变。当使用适当的选择压力时，群体的最适成员被选择出来，并且成为优势基因组。这在建立更好的溶瘤病毒的努力中具有巨大的功用，因为其为技术人员提供了容易制备的突变体的集合，从其中选择具有更好的溶瘤能力的变体。因此，为了对给定的候选物进行减毒，本发明者将在原代成纤维细胞上选择小空斑突变体，然后在肿瘤细胞上扩增该克隆的病毒以进行回选(back-select)而避免无生产性突变(即，一致变弱的突变，例如聚合酶突变，这与在正常细胞/组织中的特定功能丧失相反)。通过以高MOI(10pfu/细胞)在重复的循环中进行该方法，本发明者预期分离在肿瘤细胞中保持强烈复制的，但已丧失有效感染健康正常细胞的能力的突变体。可选择地，本发明者可通过选择更快速的复制者或更致命的杀伤者来增强非VSV弹状病毒的功效。为了提高候选病毒的复制速度，本发明者将在肿瘤细胞系中进行反复的感染/复制，但在每一个随后的轮次中，将减少感染后收获时间。该选择压力将迫使病毒朝向快速复制方向进化。如果期望增加细胞毒性，本发明者将用候选病毒(MOI＝1)感染具有抗性或顽抗的肿瘤细胞系(1×106个细胞)。然后用JC1活体染料对活细胞进行染色，以通过双色流式细胞术检测早期凋亡事件。正在经历凋亡的细胞将被分选至单层Vero细胞上以回收在其中复制的病毒。重复进行该测定，不断减少收获时间，将选择出更快速致死的表型。对用这种方式改良的病毒进行测序以绘制遗传改变的图谱和促进我们朝向更好地理解弹状病毒和肿瘤细胞溶解的生物学的结构/功能分析努力。反向遗传筛选允许无偏方法改良弹状病毒并且代表了对通过转基因的重组基因工程或基于结构/功能研究的合理突变进行改良的努力的良好补充。
实施例4
新型重组溶瘤弹状病毒的体内测试
本发明者已选择使用癌症的原位模型(orthotopicmodel)，因为它们更精确地再现了人临床疾病。然而，与皮下肿瘤模型不同，原位肿瘤不容易接近，因而在不杀死实验动物的情况下难以进行评估。为了解决该问题，采用允许非侵入性成像的多模式光学成像(multimodalopticalimaging)技术，并且反复测量植入的肿瘤的生长或消退以及远侧转移病灶的发展或消退。本发明者具有可检测甚至从深层组织中发射的光子的高度灵敏的完全集成的整体动物成像平台(IVIS200；XenogenCorp)。其可测量由重组荧光蛋白例如GFP发射的荧光以及检测荧光素酶产生的生物发光。通过使用底物特异性荧光素酶报告基因，一个从病毒表达，另一个从肿瘤细胞表达，本发明者可测量由病毒复制产生的生物发光，同时进行肿瘤测量。为了进行该方法，本发明者已克隆了阅读框内具有萤火虫荧光素酶或来自海洋桡脚类动物Gaussiaprincep的新型海肾样(renilla-like)荧光素酶的YFP或新型单体RFP。在这两个编码序列之间，本发明者已通过基因工程产生了30个氨基酸的翻译“终止-再起始(stop-restart)”序列。该小基序来自口蹄疫病毒并且允许两个蛋白质从单个mRNA按化学计量比表达，该基序非常小，从而不会如IRES基序那样在不同的细胞间具有变异性。将该双重报告构建体克隆入慢病毒载体，包装入病毒，然后用于建立稳定的带报告基因标签的4T1、CT26和U87人成胶质细胞瘤细胞。这些细胞系用于三个原位小鼠肿瘤模型：颅内植入CD-1裸小鼠的U87人神经胶质瘤；植入Balb/C雌性小鼠的脂肪垫的4T1小鼠乳腺癌细胞(自发的、侵袭性的转移性疾病模型)；注射入Balb/C小鼠的尾静脉的CT-26结肠癌(肺中的散布肿瘤)。根据下列标准判定原位模型的选择：侵袭性、快速发展的肿瘤，从而挑战治疗；代表非常不同的器官靶；横跨有免疫能力的(immunecompetent)和免疫妥协的(immunocompromised)宿主系统。
最初的研究是评估我们的模型中的剂量响应特征以鉴定最佳剂量。根据初步毒性实验，本发明者已确定了非荷瘤Balb/C动物中用于我们的各候选株系的MTD。因此本发明者将测试根据MTD的剂量，以半对数间隔(halfloginterval)减少至1×103pfu。使用IVIS在建立的肿瘤中对复制成像，初始病毒递送的动力学和随后复制的持续时间将作为剂量的函数进行研究。在平行研究中，在该过程中杀死小鼠，并使用荧光显微术检查以确定影响达到肿瘤和远侧转移病灶的所有部分的能力的剂量。将检查健康组织以评估肿瘤特异性复制。最后，将通过就病态的任何征状例如体重减轻、脱水和行为改变监测小鼠来测定各剂量上的安全性。在单次剂量IV治疗后以面对面(headtohead)的比较方式评估肿瘤对病毒的反应。光学成像技术的灵敏性和定量性质使其理想地适合用于该目的。因此将如上所述建立肿瘤，并且在病毒剂量给药后监测肿瘤的生长或消退，将这些结果与紫外线灭活的病毒对照相比较。基于之前使用VSV的工作，预期单个剂量可能不足以完全和持久地消退肿瘤。这使得必需进行一系列实验以确定剂量的最有效次数和时间安排。在与上述策略相似的策略中，本发明者将使用肿瘤模型开发最有效剂量策略。当监测与肿瘤生长/消退相关的病毒至肿瘤的递送、复制、瘤床上的复制持续时间和至远距离肿瘤位置的扩散时，进行该策略。此外，本发明者使用流式细胞术和免疫组织化学检查了作为溶瘤活性的另一个参数的免疫细胞在瘤床和周围淋巴结中的浸润和活化。最后，通过监测这些小鼠的总体存活和/或进展的时间，将病毒治疗的组与作为对照的用紫外灭活的病毒治疗的组比较来确认功效。动物模型的实例可见于图13。
循环回最优化/增强。可能地需要几个循环的最优化和之后的再测试来最终开发最大功效的治疗性病毒。因此，本发明者将使用来自体内测试的结果来在肿瘤模型中指导另外轮次的生物学和/或重组最优化和之后的再测试。
表4.弹状病毒在NCI60细胞组上介导细胞杀伤。将来自NCI60细胞组的细胞涂布在6孔板上至90％的汇合。使用所指定的不同的弹状病毒以对数稀释感染这些细胞。48小时后，清洗单层，固定，用结晶紫染色以对有活力的细胞进行评分。值表示48小时内杀伤50％的细胞所需的pfu。
表5.4种弹状病毒之间的焦点比较。将来自NCI60细胞组的细胞涂布在6孔板中至90％的汇合。用所指定的不同的弹状病毒以对数稀释感染这些细胞。48小时后，清洗单层，固定其，用结晶紫染色以对有活力的细胞进行评分。值表示48小时内杀伤50％的细胞所需的pfu。
VSV和其他弹状病毒之间对NCI60细胞组的差异包括：(1)与VSV相比，Maraba病毒优先杀伤A549肺、M14黑色素瘤、UACC-62黑色素瘤、SF268CNS、SF539CNS、786-O肾、DU-145前列腺；(2)与VSV相比，Carajas病毒优先杀伤M14黑色素瘤、UACC-62黑色素瘤、SF539CNS；VSV优先杀伤H226肺、K562白血病、OVCAR-8卵巢、HCT-15、HS578T乳腺和PC-3前列腺。60种细胞的组的所有其他细胞系显示相似的对VSV、Maraba和Carajas以及金迪普拉病毒的易感性。
表6.新型弹状病毒对所选择的转化的和永生化的细胞的体外杀伤。将细胞涂布在6孔板中，使其达到75％的汇合。然后以固定的滴度用每一种病毒感染这些细胞。在96小时后就细胞死亡对培养物进行目测评分。4+＝100％消除，3+＝75-90％死亡，2+＝50％死亡，1+＝＜30％死亡，--＝无死亡。
Farmington MuirSprings RioGrande Ngaingan Tibrogargan 利丹特病毒 克瓦塔病毒
人 293T ++++ ++++ +++ ++ +
小鼠 4T1 + + ++ +
人 SW620 +++ +++ +++ +
仓鼠 BHKT7 + +++ +++ +++ +++
人 U2OS ++++ ++ ++++ ++++
猴 Vero +++ ++++ +++ ++++
实施例5
嵌合弹状病毒
对于溶瘤病毒组合物一个潜在的问题是患者中免疫反应的潜能。这样的免疫反应可减弱溶瘤病毒的进一步应用的功效，因为大部使用的病毒可被患者的免疫系统中和。为了避免该问题，优选具有免疫上不同的多种溶瘤病毒组合物。在该情况下，对于每一个随后的治疗，对患者使用不同的溶瘤病毒，从而提供了受宿主免疫响应影响最小的持续的溶瘤活性。为此目的，构建许多假型化病毒组合物并且就它们感染细胞的能力对其进行检测。
为了研究使用包含来自许多弹状病毒的不同G蛋白的溶瘤弹状病毒的可能性，构建不同的重组病毒。除非另外指出，各重组体包括VSVIndiana野生型主链(N、P、M和L基因)。此外，重组体还在G基因和L基因之间包含荧光素酶报告基因，萤火虫(FL)或海肾(RL)。用于表示重组体的一般命名法为RVRaGx，其中RVR表示弹状病毒重组体，(a)表示G-蛋白或G-蛋白样基因的来源，以及(x)表示版本编号(versionnumber)。
具有伊斯法罕病毒G蛋白的RVR。将RVR基因组克隆入pXN2VSV载体以使XhoI和NheI限制性内切酶位点侧翼于G或G样基因。向所有G或G样基因的3’末端加入病毒终止起始序列，其编码下列序列：CTCGAGGGTATGAAAAAAACTAACAGATATCACGGCTAG(SEQIDNO：25)。用与VSVGInd相比具有37％的蛋白质序列同一性的伊斯法罕病毒G蛋白假型化重组病毒。包含FL受体基因的RVR命名为RVRIsf(Isfahan)G1(其中版本1表示FL报告基因的存在)。
此外，抗体中和研究显示来自用VSVWT免疫的小鼠的包含抗体的血清在体外不显著地中和RVRIsfG1的活性。
此外，当用RVRIsfG1注射用VSV-WT免疫的小鼠时，具有IsfG多肽的病毒能够逃避免疫系统。如图6C中所示，在病毒接种后，在免疫过的小鼠的不同位置可检测到RVRIsfG1。免疫过的小鼠中检测到的RVRIsfG1的水平与初次接受实验的对照动物中检测到的水平相似(图6A)。在另一方面，在用VSV接种的免疫过的小鼠中没有检测到病毒(图6B)。因此，包含IsfG多肽的溶瘤病毒在体内逃脱了对之前施用的VSV的宿主免疫反应。
这些结果进一步通过用VSV或重组病毒注射免疫过的初次接受实验的小鼠中的肿瘤，然后测定因感染产生的病毒产量来验证。如图7中所示，注射入免疫过的或初次接受实验的小鼠的肿瘤中的重组病毒产生大量后代病毒。在另一个方面，注射入免疫过的小鼠中的VSV的增殖几乎不可检测。
还构建了包含Isf的两个另外的RVR。RVRIsfG2包含RL报告基因，替代了来自RVRIsfG1的FL报告基因。此外，RVRIsfG3包含嵌合VSV-IsfG蛋白。所述嵌合蛋白(SEQIDNO：19)包含伊斯法罕病毒G胞外结构域(ectodomain)以及VSVG跨膜结构域和胞质尾。
具有金迪普拉病毒G蛋白的RVR。金迪普拉病毒G与VSVG(Indiana)具有42％的蛋白质序列同源性。使用上述相同的克隆策略构建RVRChaG1。RVRChaG1的一步生长曲线显示其产生与VSV相比相似的病毒量(图8)。此外，RVR具有与VSV相比相似的细胞毒性(图9)。
具有MarabaG蛋白的RVR。MarabaG与VSVG(Indiana)具有83％的蛋白质序列同源性。这是MarabaG蛋白的序列的首次报导(作为SEQIDNO：20中的DNA序列提供)。使用上述相同的克隆策略构建RVRMarG1。RVRMarG1的一步生长曲线显示在48和72小时，重组病毒滴度大于VSV。因此，转换G蛋白可稳定病毒，从而提高产量(图10)。此外，显示RVRMarG1是有细胞毒性的(图11)。此外，抗体中和测定显示来自用VSVWT免疫的小鼠的血清不中和RVRMarG1的活性，表明RVR能够免疫逃避。
具有MuirSpringsG蛋白的RVR。MuirSpringsG与VSVG(Indiana)具有25.4％的蛋白质序列同源性。MuirSpringsG序列在SEQIDNO：21(氨基酸)和SEQIDNO：22(DNA)中提供。上述相同的克隆策略用于构建RVRMurG1。
具有克拉马斯病毒G蛋白的RVR。假型化实验证实与VSVG不同，克拉马斯病毒G蛋白在低pH(6.8)环境中起作用。这是非常重要的，因为已知肿瘤核心是含氧量低的和酸性的。因此，可有利地具有可以在这样的环境中复制的病毒。产生假型化的VSVHRGFP-Klamath，以使病毒体包含一个病毒的基因组，但两种病毒的包膜蛋白(通过共感染入CT26细胞)。在共感染后24小时，收集上清液，滴定假型化的颗粒。然后使用假型化病毒(与对照病毒一起)感染两种不同酸度的培养基中的靶细胞。结果显示克拉马斯病毒G蛋白负责病毒在低pH下感染的能力。
使用上述大体上相同的克隆策略构建RVRKlaG2。然而，与之前的策略不同，除了原始VSVG(Indiana)外，该重组体包括克拉马斯病毒G。
具有Farmington(Far)病毒G蛋白的RVR。Farmington病毒是非向神经的非水泡性病毒并且显示巨大合胞体的形成。
具有大巴伊亚(Bah)病毒G蛋白的RVR。大巴伊亚病毒是非向神经的非水泡性病毒。
具有JSR逆转录Env蛋白的RVR。因为VSV具有已知的神经毒性，因此其中VSV重组体不感染神经元的策略将是有利的。JSREnv是来源于JSRV逆转录病毒(非向神经病毒)的包膜(Env)基因(非向神经的)。产生包含JSRVEnv胞外结构域以及VSVG跨膜结构域和胞质尾的嵌合体(DNA序列提供为SEQIDNO：23)。
具有埃博拉病毒G蛋白的RVR。埃博拉病毒(Ebola)是具有用于结合受体和介导膜融合的糖蛋白的非向神经病毒。G蛋白在氨基酸位点497-501包含弗林蛋白酶切割位点。切割的产物(GP1和GP2)通过二硫键连接并且据认为用作中和抗体的可能诱饵或免疫调节剂。然而，弗林蛋白酶切割位点不是感染或趋向性所需要的。埃博拉病毒G蛋白DNA序列提供为SEQIDNO：24。
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<130>KIRN：004WO
<140>未知
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<160>28
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>11068
<212>DNA
<213>Maraba病毒
<400>1
ctgttacagtcaagagagtcattgatgattcactcatcacccccaaattgcctgcgaatg60
aggaccctgtggagtaccctgctgattatttcaaaaagtcccgtgatattccggtgtaca120
taaacacgaccaaaagtttgtctgatttgcggggctatgtttatcaaggcctaaagtcag180
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ctgatgctactcgaactagctcagacgatgcatggcttccactgtatctattggggttat420
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<213>大巴伊亚病毒N
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Arg
<210>15
<211>353
<212>PRT
<213>大巴伊亚病毒P
<400>15
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202530
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Leu
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<212>PRT
<213>大巴伊亚病毒M
<220>
<221>misc_feature
<222>(160)..(160)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>16
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<212>PRT
<213>大巴伊亚病毒G
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MetIleSerAsnMetPhePheLeuPheGlnLeuSerLeuPheLeuGln
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(389)..(390)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>21
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515
<210>22
<211>2248
<212>DNA
<213>MuirSpring病毒G-蛋白
<400>22
gcggcgggggctggccatcactttggcaagcacgtgagatctgattcgcggccgcgtcga60
cgcccctgaaactcctgatcctatcctcctccaaggagataaaacttatctctttttagt120
cccttcagagagcaaaaattggaaacccgcagatcttaatgaagtatcctgtcctcctct180
tatatcaaaaccagatactgctgaaatggaatacatgtctactgatgtcatggaactcgc240
aaaaacatcatgaactcgcgcctgtgcaagggtatttatgttctggcttaagatataaag300
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aacctgatcagaacaaatgtgttcaagatttagaaaagtttattaatgacgattatttgc420
taccctatttcccatcagaagattgtaattggatgaaagaaacaccagttcatcaagatt480
tcatagtttaccaaaaacatcaggttaaatatgatccataccacaatggcttttacgatg540
ctctgttcaagaaagatttttgtcaagagaaaatatgtgagacagagcatgatcagacaa600
tatggataactaaccaagaattaaaacaagaatgcacttttaattatccggttaaaaaac660
atgtattctataagagagattatagcaaaatgatcatcgattatgaaatcaaccaatgga720
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atgggatgttctttgtaggaaaattttacaaattaatatcgaatctgccaatttgtccag840
aaggaaccaagatcagctacaagcccattaaagcacaattagatgaaatagaaaatgaaa900
taattttaaatcaagaaagacttttatgtttagattctatacgacaaatgactgcttcta960
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cttttaattttaatggaaagaatcaaatcggagtaaataaagaagggaaggaagtttatt1140
ggaatgaatgggtgcccagtggaaaagatggattgctctcaggattcaatggagtttata1200
agaaagttaattcttccaaaatttcaatatcaagattagaaaccattaaagaagattatg1260
aaagagaaatgatgatagatcatgaattggttacagttgagcatcctamaattgkccatc1320
ttaawasagaaaacatmacaggttctagagtggagatagttaatactgaacattcagacg1380
tcagtggttggttctcatctgttttaaagagtttttggggaaagttgatgatgactgttg1440
tcagtataataataattatcatcataggcctattgattatcaattgtggtccaattatct1500
gtaaaacttgcattagcagctataaaaagaaaaagagtagaagagatagatttagagcag1560
atagagaaactgaaactggactgcgtcgacaacatagagtggtatttcataataatgaaa1620
cagatgatgaaagagcaatagagatgactggccatcactttggcaagcacgtgagatctg1680
aattgcggccgcgtcgacatcctggctcaggatgaacgctggctgtgtgcctaatacatg1740
catgtcgagcgaggttcttttgaacctagcggcgaatgggtgagtaacacgtgcttaatc1800
taccctttagattggaatacccaatggaaacattggctaatgccggatacgcatggaatc1860
gcatgattccgttgtgaaaggagcctttaaagctccgctagaggatgagggtgcggaaca1920
ttagttagttggtagggtaatggcctaccaagactatgatgtttagccgggtcgagagac1980
tgaacggccacattgggactgagatacggcccaaactcctacgggaggcagcagtaggga2040
atattccacaatgagcgaaagcttgatggagcgacacagcgtgcacgatgaaggtcttcg2100
gattgtaaagtgctgttatagggaaagaacacctggttgaggaaatgcttccaggctgac2160
ggtaccctgtcagaaagcgatggctaactatgtgccagcagccgcggtaatacataggtc2220
gcaagcgttatccggaattattgggcgt2248
<210>23
<211>1948
<212>DNA
<213>VSVg蛋白
<400>23
acgcgttttcgccaccatgccgaagcgccgcgctggattccggaaaggctggtacgcgcg60
gcagaggaactccctgacgcatcaaatgcaacgcatgacgctgagcgagcccacgagtga120
gctgcccacccagaggcaaattgaagcgctaatgcgctacgcctggaatgaggcacatgt180
acaacctccggtgacacctactaacatcttgatcatgttattattattgttacagcgggt240
acaaaatggggcagctgcggctttttgggcgtacattcctgatccgccaatgattcaatc300
cttaggatgggatagagaaatagtacccgtatatgttaatgatacgagccttttaggagg360
aaaatcagatattcacatttcccctcagcaagcaaatatctctttttatggccttaccac420
tcaatatcccatgtgcttttcttatcaatcgcagcatcctcattgtatacaggtatcagc480
tgacatatcatatcctcgagtgactatctcaggcattgatgaaaaaactgggaaaaaatc540
atacgggaacggatctggacccctcgacattccgttttgtgacaagcatttaagcattgg600
cataggcatagacactccttggactttatgtcgagcccgggtcgcgtcagtatataacat660
caataatgccaatgccacctttttatgggattgggcacctggaggaacacctgattttcc720
tgaatatcgaggacagcatccgcctattttctctgtgaataccgctccaatataccaaac780
ggaactatggaaacttttggctgcttttggtcatggcaatagtttatatttacagcccaa840
tatcagtggaagcaaatatggtgatgtaggagttacaggatttttatatcctcgagcttg900
cgtgccgtatccattcatgttgatacaaggccatatggaaataacactgtcattaaatat960
ttatcatttgaattgttctaattgcatactgactaattgtatcaggggagtagccaaagg1020
agaacaggttataatagtaaaacagcctgcctttgtaatgctgcccgttgaaatagctga1080
agcctggtatgatgaaactgctttagaattattacaacgcattaatacggctcttagccg1140
ccctaagagaggcctgagcctgattattctgggtatagtatctttaatcaccctcatagc1200
tacagctgttacggcttccgtatctttagcacagtctattcaagctgcgcacacggtaga1260
ctccttatcatataatgttactaaagtgatggggacccaagaagatattgataaaaaaat1320
agaagataggctatcagctctatatgatgtagtcagagtcttaggagagcaagttcagag1380
cattaattttcgcatgaaaatccaatgtcatgctaactataaatggatttgtgttacaaa1440
aaaaccatacaacacttctgattttccatgggacaaagtgaagaaacatttgcaaggaat1500
ttggttcaatactaatctatcgttagaccttttacaactgcataatgagattcttgatat1560
tgaaaattcgccgaaggctacactaaatatagccgatactgttgataatttcttgcaaaa1620
tttattctctaatttccctagtctccattcgctgtggaaaaccctgattggtgtaggaat1680
acttgtgtttattataattgtcgtaatccttatatttccttgcctcgtacgtagtagttg1740
gaagagctctattgcctcttttttctttaccatagggttaatcattggactattcttggt1800
tctccgagttggtatttatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagattta1860
tacagacatagagatgaaccgacttggaacgtaactcaaatcctcgaggctaggtatgaa1920
aaaaactaacagatatcacggctagcgg1948
<210>24
<211>2031
<212>DNA
<213>埃博拉病毒G蛋白
<400>24
atgggcgttacaggaatattgcagttacctcgtgatcgattcaagaggacatcattcttt60
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aatcaattgagatcagttggactgaatctcgaagggaatggagtggcaactgacgtgcca240
tctgcaactaaaagatggggcttcaggtccggtgtcccaccaaaggtggtcaattatgaa300
gctggtgaatgggctgaaaactgctacaatcttgaaatcaaaaaacctgacgggagtgag360
tgtctaccagcagcgccagacgggattcggggcttcccccggtgccggtatgtgcacaaa420
gtatcaggaacgggaccgtgtgccggagactttgccttccataaagagggtgctttcttc480
ctgtatgatcgacttgcttccacagttatctaccgaggaacgactttcgctgaaggtgtc540
gttgcatttctgatactgccccaagctaagaaggacttcttcagctcacaccccttgaga600
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attgatacaacaatcggggagtgggccttctgggaaactaaaaaaaacctcactagaaaa900
attcgcagtgaagagttgtctttcacagttgtatcaaacggagccaaaaacatcagtggt960
cagagtccggcgcgaacttcttccgacccagggaccaacacaacaactgaagaccacaaa1020
atcatggcttcagaaaattcctctgcaatggttcaagtgcacagtcaaggaagggaagct1080
gcagtgtcgcatctaacaacccttgccacaatctccacgagtccccaatccctcacaacc1140
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成引物
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ctcgagggtatgaaaaaaactaacagatatcacggctag39
<210>26
<211>523
<212>PRT
<213>伊斯法罕病毒G蛋白
<400>26
MetThrSerValLeuPheMetValGlyValLeuLeuGlyAlaPheGly
151015
SerThrHisCysSerIleGlnIleValPheProSerGluThrLysLeu
202530
ValTrpLysProValLeuLysGlyThrArgTyrCysProGlnSerAla
354045
GluLeuAsnLeuGluProAspLeuLysThrMetAlaPheAspSerLys
505560
ValProIleGlyIleThrProSerAsnSerAspGlyTyrLeuCysHis
65707580
AlaAlaLysTrpValThrThrCysAspPheArgTrpTyrGlyProLys
859095
TyrIleThrHisSerValHisSerLeuArgProThrValSerAspCys
100105110
LysAlaAlaValGluAlaTyrAsnAlaGlyThrLeuMetTyrProGly
115120125
PheProProGluSerCysGlyTyrAlaSerIleThrAspSerGluPhe
130135140
TyrValMetLeuValThrProHisProValGlyValAspAspTyrArg
145150155160
GlyHisTrpValAspProLeuPheProThrSerGluCysAsnSerAsn
165170175
PheCysGluThrValHisAsnAlaThrMetTrpIleProLysAspLeu
180185190
LysThrHisAspValCysSerGlnAspPheGlnThrIleArgValSer
195200205
ValMetTyrProGlnThrLysProThrLysGlyAlaAspLeuThrLeu
210215220
LysSerLysPheHisAlaHisMetLysGlyAspArgValCysLysMet
225230235240
LysPheCysAsnLysAsnGlyLeuArgLeuGlyAsnGlyGluTrpIle
245250255
GluValGlyAspGluValMetLeuAspAsnSerLysLeuLeuSerLeu
260265270
PheProAspCysLeuValGlySerValValLysSerThrLeuLeuSer
275280285
GluGlyValGlnThrAlaLeuTrpGluThrAspArgLeuLeuAspTyr
290295300
SerLeuCysGlnAsnThrTrpGluLysIleAspArgLysGluProLeu
305310315320
SerAlaValAspLeuSerTyrLeuAlaProArgSerProGlyLysGly
325330335
MetAlaTyrIleValAlaAsnGlySerLeuMetSerAlaProAlaArg
340345350
TyrIleArgValTrpIleAspSerProIleLeuLysGluIleLysGly
355360365
LysLysGluSerAlaSerGlyIleAspThrValLeuTrpGluGlnTrp
370375380
LeuProPheAsnGlyMetGluLeuGlyProAsnGlyLeuIleLysThr
385390395400
LysSerGlyTyrLysPheProLeuTyrLeuLeuGlyMetGlyIleVal
405410415
AspGlnAspLeuGlnGluLeuSerSerValAsnProValAspHisPro
420425430
HisValProIleAlaGlnAlaPheValSerGluGlyGluGluValPhe
435440445
PheGlyAspThrGlyValSerLysAsnProIleGluLeuIleSerGly
450455460
TrpPheSerAspTrpLysGluThrAlaAlaAlaLeuGlyPheAlaAla
465470475480
IleSerValIleLeuIleIleGlyLeuMetArgLeuLeuProLeuLeu
485490495
CysArgArgArgLysGlnLysLysValIleTyrLysAspValGluLeu
500505510
AsnSerPheAspProArgGlnAlaPheHisArg
515520
<210>27
<211>530
<212>PRT
<213>金迪普拉病毒G蛋白
<400>27
MetThrSerSerValThrIleSerValValLeuLeuIleSerPheIle
151015
ThrProSerTyrSerSerLeuSerIleAlaPheProGluAsnThrLys
202530
LeuAspTrpLysProValThrLysAsnThrArgTyrCysProMetGly
354045
GlyGluTrpPheLeuGluProGlyLeuGlnGluGluSerPheLeuSer
505560
SerThrProIleGlyAlaThrProSerLysSerAspGlyPheLeuCys
65707580
HisAlaAlaLysTrpValThrThrCysAspPheArgTrpTyrGlyPro
859095
LysTyrIleThrHisSerIleHisAsnIleLysProThrArgSerAsp
100105110
CysAspThrAlaLeuAlaSerTyrLysSerGlyThrLeuValSerPro
115120125
GlyPheProProGluSerCysGlyTyrAlaSerValThrAspSerGlu
130135140
PheLeuValIleMetIleThrProHisHisValGlyValAspAspTyr
145150155160
ArgGlyHisTrpValAspProLeuPheValGlyGlyGluCysAspGln
165170175
SerTyrCysAspThrIleHisAsnSerSerValTrpIleProAlaAsp
180185190
GlnThrLysLysAsnIleCysGlyGlnSerPheThrProLeuThrVal
195200205
ThrValAlaTyrValLysThrLysGluIleAlaAlaGlyAlaIleVal
210215220
PheLysSerLysTyrHisSerHisMetGluGlyAlaArgThrCysArg
225230235240
LeuSerTyrCysGlyArgAsnGlyIleLysPheProAsnGlyGluTrp
245250255
ValSerLeuAspValLysThrLysIleGlnGluLysProLeuLeuPro
260265270
LeuPheLysGluCysProAlaGlyThrGluValArgSerThrLeuGln
275280285
SerAspGlyAlaGlnValLeuThrSerGluIleGlnArgIleLeuAsp
290295300
TyrSerLeuCysGlnAsnThrTrpAspLysValGluArgLysGluPro
305310315320
LeuSerProLeuAspLeuSerTyrLeuAlaSerLysSerProGlyLys
325330335
GlyLeuAlaTyrThrValIleAsnGlyThrLeuSerPheAlaHisThr
340345350
ArgTyrValArgMetTrpIleAspGlyProValLeuLysGluMetLys
355360365
GlyLysArgGluSerProSerGlyIleSerSerAspIleTrpThrGln
370375380
TrpPheLysTyrGlyAspMetGluIleGlyProAsnGlyLeuLeuLys
385390395400
ThrAlaGlyGlyTyrLysPheProTrpHisLeuIleGlyMetGlyIle
405410415
ValAspAsnGluLeuHisGluLeuSerGluAlaAsnProLeuAspHis
420425430
ProGlnLeuProHisAlaGlnSerIleAlaAspAspSerGluGluIle
435440445
PhePheGlyAspThrGlyValSerLysAsnProValGluLeuValThr
450455460
GlyTrpPheThrSerTrpLysGluSerLeuAlaAlaGlyValValLeu
465470475480
IleLeuValValValLeuIleTyrGlyValLeuArgCysPheProVal
485490495
LeuCysThrThrCysArgLysProLysTrpLysLysGlyValGluArg
500505510
SerAspSerPheGluMetArgIlePheLysProAsnAsnMetArgAla
515520525
ArgVal
530
<210>28
<211>611
<212>PRT
<213>Jaagsietke绵羊逆转录病毒G蛋白
<400>28
MetProLysArgArgAlaGlyPheArgLysGlyTrpTyrAlaArgGln
151015
ArgAsnSerLeuThrHisGlnMetGlnArgMetThrLeuSerGluPro
202530
ThrSerGluLeuProThrGlnArgGlnIleGluAlaLeuMetArgTyr
354045
AlaTrpAsnGluAlaHisValGlnProProValThrProThrAsnIle
505560
LeuIleMetLeuLeuLeuLeuLeuGlnArgIleGlnAsnGlyAlaAla
65707580
AlaThrPheTrpAlaTyrIleProAspProProMetLeuGlnSerLeu
859095
GlyTrpAspLysGluThrValProValTyrValAsnAspThrSerLeu
100105110
LeuGlyGlyLysSerAspIleHisIleSerProGlnGlnAlaAsnIle
115120125
SerPheTyrGlyLeuThrThrGlnTyrProMetCysPheSerTyrGln
130135140
SerGlnHisProHisCysIleGlnValSerAlaAspIleSerTyrPro
145150155160
ArgValThrIleSerGlyIleAspGluLysThrGlyMetArgSerTyr
165170175
ArgAspGlyThrGlyProLeuAspIleProPheCysAspLysHisLeu
180185190
SerIleGlyIleGlyIleAspThrProTrpThrLeuCysArgAlaArg
195200205
IleAlaSerValTyrAsnIleAsnAsnAlaAsnThrThrLeuLeuTrp
210215220
AspTrpAlaProGlyGlyThrProAspPheProGluTyrArgGlyGln
225230235240
HisProProIleSerSerValAsnThrAlaProIleTyrGlnThrGlu
245250255
LeuTrpLysLeuLeuAlaAlaPheGlyHisGlyAsnSerLeuTyrLeu
260265270
GlnProAsnIleSerGlySerLysTyrGlyAspValGlyValThrGly
275280285
PheLeuTyrProArgAlaCysValProTyrProPheMetValIleGln
290295300
GlyHisMetGluIleThrProSerLeuAsnIleTyrTyrLeuAsnCys
305310315320
SerAsnCysIleLeuThrAsnCysIleArgGlyValAlaLysGlyGlu
325330335
GlnValIleIleValLysGlnProAlaPheValMetLeuProValGlu
340345350
IleThrGluGluTrpTyrAspGluThrAlaLeuGluLeuLeuGlnArg
355360365
IleAsnThrAlaLeuSerArgProLysArgGlyLeuSerLeuIleIle
370375380
LeuGlyIleValSerLeuIleThrLeuIleAlaThrAlaValThrAla
385390395400
SerValSerLeuAlaGlnSerIleGlnValAlaHisThrValAspSer
405410415
LeuSerSerAsnValThrLysValMetGlyThrGlnGluAsnIleAsp
420425430
LysLysIleGluAspArgLeuProAlaLeuTyrAspValValArgVal
435440445
LeuGlyGluGlnValGlnSerIleAsnPheArgMetLysIleGlnCys
450455460
HisAlaAsnTyrLysTrpIleCysValThrLysLysProTyrAsnThr
465470475480
SerAspPheProTrpAspLysValLysLysHisLeuGlnGlyIleTrp
485490495
PheAsnThrThrValSerLeuAspLeuLeuGlnLeuHisAsnGluIle
500505510
LeuAspIleGluAsnSerProLysAlaThrLeuAsnIleAlaAspThr
515520525
ValAspAsnPheLeuGlnAsnLeuPheSerAsnPheProSerLeuHis
530535540
SerLeuTrpArgSerIleIleAlaMetGlyAlaValLeuThrPheVal
545550555560
LeuIleIleIleCysLeuAlaProCysLeuIleArgSerIleValLys
565570575
GluPheLeuHisMetArgValLeuIleHisLysAsnMetLeuGlnHis
580585590
GlnHisLeuMetGluLeuLeuAsnAsnLysGluArgGlyAlaAlaGly
595600605
AspAspPro
610

Claims (8)

1.分离的溶瘤弹状病毒在制备药物中的用途，所述药物用于杀伤过度增殖细胞，其中所述弹状病毒具有包含下列的基因组：
(a)编码如SEQIDNO：5所示氨基酸序列的G蛋白的基因；
(b)编码如SEQIDNO：4所示氨基酸序列的M蛋白的基因；
(c)编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的N蛋白的基因；
(d)编码如SEQIDNO：3所示氨基酸序列的P蛋白的基因；和
(e)编码如SEQIDNO：6所示氨基酸序列的L蛋白的基因。
2.权利要求1的用途，其中所述过度增殖细胞是癌细胞。
3.权利要求2的用途，其中所述癌细胞是转移性癌细胞。
4.权利要求1的用途，其中所述分离的溶瘤弹状病毒经配制用于腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮下或鼻内施用。
5.包含溶瘤弹状病毒的组合物，所述重组溶瘤弹状病毒具有包含下列的基因组：
(a)编码如SEQIDNO：4所示氨基酸序列的M蛋白的基因；
(b)编码如SEQIDNO：5所示氨基酸序列的G蛋白的基因；
(c)编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的N蛋白的基因；
(d)编码如SEQIDNO：3所示氨基酸序列的P蛋白的基因；和
(e)编码如SEQIDNO：6所示氨基酸序列的L蛋白的基因。
6.权利要求2的用途，其中所述癌选自肺癌、黑色素瘤、白血病、卵巢癌、中枢神经系统癌症、结肠癌、乳腺癌、肾癌和前列腺癌。
7.包含分离的重组弹状病毒的组合物，所述重组弹状病毒编码伊斯法罕病毒G蛋白、Maraba病毒G蛋白或MuirSprings病毒G蛋白，以及来自VSV的M、P、N和L蛋白。
8.权利要求7的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于杀伤过度增殖细胞。
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