ES2741138T3

ES2741138T3 - Rhabdovirus oncolítico de Farmington

Info

Publication number: ES2741138T3
Application number: ES14193656T
Authority: ES
Inventors: David F Stojdl
Original assignee: CHEO Research Institute
Current assignee: CHEO Research Institute
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-17
Publication date: 2020-02-10
Anticipated expiration: 2027-09-17
Also published as: EP2839837B1; US20140010787A1; CN102026645B; CA2663034A1; CA2921048A1; CN102026645A; US20170165305A1; JP2015038065A; JP5945789B2; US20180369303A1; CA2663034C; JP2010503660A; CA2921063A1; CA2921048C; US9572883B2; JP5606067B2; US20140037584A1; ES2551892T3; CN105769931B; CA2921063C

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un rhabdovirus oncolítico Farmington para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano mediante cirugía o terapia.

Description

DESCRIPCIÓN

Rhabdovirus oncolítico de Farmington

Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

Esta divulgación se refiere en general a la virología y la medicina. En ciertos aspectos, la divulgación se refiere a virus oncolíticos, particularmente rhabdovirus oncolíticos no VSV y rhabdovirus oncolíticos que comprenden una glicoproteína no de VSV.

II. Antecedentes

Se ha demostrado que varios virus se replican y matan una amplia variedad de células tumorales in vitro (virus Sindbis (Unno y col., 2005); virus Sendai (Kinoh y col., 2004); virus Coxackie (Shafren y col., 2004); virus del herpes simple (Mineta y col., 1995); Parvovirus (Abschuetz y col., 2006); Adenovirus (Heise y col., 2000); virus de polio (Gromeier y col., 2000); virus de la enfermedad de Newcastle (Sinkovics y Horvath, 2000); virus de la estomatitis vesicular (Stojdl y col., 2000); virus del sarampión (Grote y col., 2001); Reovirus (Coffey y col., 1998); Retrovirus (Logg y col., 2001); Vaccinia (Timiryasova y col., 1999); y gripe (Bergmann y col., 2001)). Además, se ha demostrado que dichos virus son eficaces en el tratamiento de modelos de cáncer en animales.

Se ha demostrado que el virus de la estomatitis vesicular (VSV), un rhabdovirus bien conocido y bien estudiado destruye las líneas celulares tumorales en experimentos de cultivo celular, y se ha demostrado su eficacia en una variedad de modelos de cáncer en roedores (Stojdl y col., 2000; Stojdl y col., 2003). Sin embargo, el VSV no destruye todas las células cancerosas.

Travassos da Rosa y col. (Emerg Infect Dis. 2002 jun; 8(6):614-618) informaron del aislamiento de dos rhabdovirus. Uno de estos se denominó virus Farmington y se propuso que era un nuevo miembro del género Vesiculovirus. El virus infectaba aves y ratones, así como células renales de mono en cultivo.

Césaire y col. (Oncogene. 2006 Jan 19;25(3):349-358) investigaron la capacidad del VSV para lisar linfocitos T humanos primarios infectados con un virus linfotrópico T tipo 1 (HTLV-1) de pacientes con leucemia de linfocitos T de adulto (ATL). Los autores informaron de que las células ATL primarias ex vivo eran permisivas para el VSV y sufrían oncólisis de una manera dependiente del tiempo. La infección por VSV no mostraba replicación vírica ni oncólisis en células no leucémicas infectadas con el HTLV-1 de pacientes con paraparesia espástica tropical/mielopatía asociada a HTLV-1 (HAM/TSP), ni en linfocitos T CD4(+) intactos de individuos normales ni en muestras celulares ex vivo de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CCL).

Sumario de la invención

Varios rhabdovirus identificados últimamente son mucho más eficaces en la destrucción de cánceres particulares o líneas celulares de cáncer que el VSV. También el VSV y los mutantes atenuados de VSV son neurovirulentos y producen patología del SNC en roedores y primates. Varios rhabdovirus no infectan el SNC (es decir, el Muir Springs y Bahía Grande: Kerschner y col., 1986), y se ha demostrado un perfil de seguridad más aceptable. Además, las terapias basadas en los nuevos rhabdovirus se pueden utilizar para tratar cánceres del SNC, tanto primarios como secundarios. El rhabdovirus de la divulgación (y/u otros agentes oncolíticos) se pueden utilizar sucesivamente para derivar la respuesta inmunitaria del huésped contra un virus terapéutico particular. Esto permitiría una terapia prolongada y mejora la eficacia.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un rhabdovirus oncolítico Farmington para su uso en medicina humana. Dicho rhabdovirus posee propiedades para destruir células tumorales in vitro e in vivo.

Como se utiliza en el presente documento, un rhabdovirus no VSV incluirá uno o más de los siguientes virus o variantes de los mismos: virus Arajas, virus Chandipura, virus Cocal, virus Isfahan, virus Maraba, virus Piry, virus Alagoas de la estomatitis vesicular, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus Eel Americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus Mount Elgon bat, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahia Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus Blue crab, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Valey, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus Rio Grande cichlid, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus Adelaide River, virus Berrimah, virus Kimberley, o virus de la fiebre efímera bovina. En ciertos aspectos, rhabdovirus no VSV puede referirse al supergrupo de Dimarhabdovirus (definidos como rhabdovirus capaces de infectar células tanto de insecto como de mamífero). En aspectos específicos, el rhabdovirus es no VSV. En aspectos particulares el rhabdovirus no VSV es un virus Carajas, virus Maraba, Farmington, virus Muir Springs, y/o virus Bahia grande, incluyendo variantes de los mismos.

Las composiciones para su uso en la invención pueden incluir un segundo virus terapéutico, al como un virus oncolítico. Oncolítico se refiere normalmente a un agente que es capaz de destruir, lisar o detener el crecimiento de una célula cancerosa. En términos de un virus oncolítico el término se refiere a un virus que puede replicarse hasta cierto grado en una célula cancerosa, causan la muerte, lisis o detención del crecimiento de células cancerosas y normalmente tienen efectos tóxicos mínimos sobre las células no cancerosas. Un segundo virus incluye, pero no se limita a un adenovirus, un virus vaccinia, un virus de la enfermedad de Newcastle, un alfavirus, un parvovirus, un herpesvirus, un rhabdovirus no VSV y similares. En otros aspectos, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. La composición también puede incluir un segundo agente anticáncer, tal como un quimioterápico, radioterápico o inmunoterápico.

El virus oncolítico Farmington para su uso de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en procedimientos que incluyen el tratamiento de un paciente de cáncer, en el que se va a administrar una cantidad eficaz de una composición de virus Farmington al sujeto.

En ciertos aspectos de la divulgación una célula puede estar comprendida en un paciente y puede ser una célula hiperproliferativa, neoplásica, precancerosa, cancerosa, metastática. De acuerdo con la divulgación, un rhabdovirus no VSV para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer se puede administrar a un paciente que tiene una célula susceptible de destruirse por al menos un rhabdovirus no VSV o un régimen o composición terapéuticos que incluyen un rhabdovirus no VSV. La administración de composiciones terapéuticas se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 6^{, 7,}8^{, 9, 10 o más veces con 1, 2, 3, 4, 5,}6^{, 7,}8^{, 9, 10 o más rhabdovirus no VSV o rhabdovirus no VSV}recombinante, solo o en distintas combinaciones. La composición que se administra puede tener 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o más partículas víricas o unidades formadoras de placas (ufp). La administración puede ser intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea, o administración intranasal. En ciertos aspectos, las composiciones se administran por vía sistémica particularmente por administración intravascular, que incluye la inyección, perfusión y similares. Los procedimientos pueden comprender adicionalmente la administración de una segunda terapia anticáncer, tal como un segundo virus terapéutico. En aspectos particulares un virus terapéutico puede ser un virus oncolítico, más particularmente un rhabdovirus no VSV. En otros aspectos, un segundo agente anticáncer es un quimioterápico, un radioterápico, un inmunoterápico, cirugía o similares.

Otros aspectos de la divulgación se exponen a lo largo de la presente solicitud. Cualquier especto expuesto con respecto a un aspecto de la divulgación también se aplica a otros aspectos de la divulgación, y viceversa.

Los términos “inhibición”, “reducción”, o “prevención” o cualquier variación de estos términos, cuando se utilizan en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva incluye cualquier disminución medible o inhibición completa para conseguir un resultado deseado. Los resultados deseados incluyen, pero no se limitan a paliar, reducir, enlentecer, o erradicación de una afección cancerosa o hiperproliferativa, así como una mejora de la calidad o extensión de la vida.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se utilizan en conjunción con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno”, y “uno o más de uno”.

A lo largo de la presente divulgación, el término “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación típica del error para el dispositivo o procedimiento que se va a emplear para determinar el valor.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se utiliza con el significado de “y/o” a menos de que se indique explícitamente para referirse solo a las alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación soporta una definición que se refiera solamente a alternativa e “y/o”.

Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras “que comprenden” (y cualquier forma de comprender tal como “comprende” y “comprender”), “que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” o “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluir”) o “que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contener”) son inclusivas y de extremos abiertos y no excluye elementos o etapas adicionales no mencionados del procedimiento.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente divulgación se volverán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debería entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican aspectos específicos de la divulgación se dan solo a modo de ilustración.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor en referencia a uno o más de esto dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas que se presenta en el presente documento.

FIG. 1. Relaciones filogenéticas entre los rhabdovirus basada en un alineamiento GDE de una región relativamente conservada de la proteína N (119 aminoácidos), y utilizando el virus paramyxovirus 1 de la para influenza humana (HPIV-1) como el ajeno. El árbol se generó por el procedimiento de unión de vecinos y los valores de arranque (indicados por cada nodo de una rama) se estimaron utilizando 1000 réplicas del árbol. Las longitudes de las ramas son proporcionales a las distancias genéticas. La barra de escala corresponde a sustituciones por sitio de aminoácido cortesía de H. Badrane y P.J. Walker).

FIG. 2. Sumario del ensayo de destrucción de células tumorales in vitro. Las células del panel celular NCI 60 se infectaron durante 96 horas con una serie de diluciones de distintos virus. Se ensayó la viabilidad celular utilizando tinción con cristal violeta para detectar células viables restantes. Se calculó la CE⁵⁰a partir de las curvas de destrucción celular resultante y se resumen en formato de tabla. Por claridad, los valores de la CE⁵⁰se habían convertido a un valor de 1-7 como se describe en la leyenda. Además, se ha utilizado el sombreado para indicar el intervalo de CE⁵⁰a (es decir, de más oscuro a más claro representa los valores de la mayor CE⁵⁰hasta la menor CE⁵⁰). Los virus se abreviaron de la siguiente manera: MS = Muir Springs, BG = Bahia Grande, NGG = Ngaingan, TIB = Tibrogargan, FMT = Farmington, MRB = Maraba, CRJ = Carajas, VSVHR = cepa HR del virus de estomatitis vesicular y VV = virus Vaccinia JX-963. Estos datos demuestran que no todos los rhabdovirus son igualmente oncolíticos, de hecho, rhabdovirus estrechamente relacionados se comportan de manera muy diferente sobre las mismas líneas celulares tumorales. Por lo tanto, actualmente no hay un procedimiento para predecir que rhabdovirus tienen un potencial oncolítico. Es necesario el ensayo empírico para identificar los virus que sean buenos candidatos oncolíticos.

FIG. 3A-3B. Productividad de rhabdovirus sobre líneas celulares tumorales. Se infectaron líneas celulares de glioblastoma humano SNB19 y carcinoma de pulmón humano NCI H226 con distintos virus oncolíticos tales como el VSV que comprende una proteína G heteróloga, más particularmente un rhabdovirus no VSV. En otros aspectos, un segundo agente anticáncer es un quimioterápico, un radioterápico, un inmunoterápico, cirugía o similares.

Otros aspectos de la divulgación se exponen a lo largo de la presente solicitud. Cualquier aspecto que se expone con respecto a un aspecto de la divulgación se aplica a otros aspectos de la divulgación también, y viceversa. Los aspectos de las secciones Descripción detallada y Ejemplos se entiende que son aspectos no limitantes de la divulgación que son aplicables a todos los aspectos de la divulgación.

Los términos “inhibición”, “reducción” o “prevención” o cualquier variación de estos términos, cuando se utilizan en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva incluye cualquier disminución o inhibición completa para conseguir un resultado deseado. Los resultados deseados incluyen, pero no se limitan a paliar, reducir, enlentecer, o erradicar una afección cancerosa o hiperproliferativa, así como una mejor calidad o extensión de la vida.

Descripción de los dibujos

FIG. 1. Relaciones filogenéticas entre los rhabdovirus basada en un alineamiento GDE de una región relativamente conservada de la proteína N (119 aminoácidos), y utilizando el virus paramyxovirus 1 de la para influenza humana (HPIV-1) como el ajeno. El árbol se generó por el procedimiento de unión de vecinos y los valores de arranque (indicados por cada nodo de una rama) se estimaron utilizando 1000 réplicas del árbol. Las longitudes de las ramas son proporcionales a las distancias genéticas. La barra de escala corresponde a sustituciones por sitio de aminoácido cortesía de H. Badrane y P.J. Walker).

FIG. 2. Sumario del ensayo de destrucción de células tumorales in vitro. Las células del panel celular NCI 60 se infectaron durante 96 horas con una serie de diluciones de distintos virus. Se ensayó la viabilidad celular utilizando tinción con cristal violeta para detectar células viables restantes. Se calculó la CE⁵⁰a partir de las curvas de destrucción celular resultante y se resumen en formato de tabla. Por claridad, los valores de la CE⁵⁰se habían convertido a un valor de 1-7 como se describe en la leyenda. Además, se ha utilizado el sombreado para indicar el intervalo de CE⁵⁰a (es decir, de más oscuro a más claro representa los valores de la mayor CE⁵⁰hasta la menor CE⁵⁰). Los virus se abreviaron de la siguiente manera: MS = Muir Springs, BG = Bahia Grande, NGG = Ngaingan, TIB = Tibrogargan, FMT = Farmington, MRB = Maraba, CRJ = Carajas, VSVHR = cepa HR del virus de estomatitis vesicular y VV = virus Vaccinia JX-963. Estos datos demuestran que no todos los rhabdovirus son igualmente oncolíticos, de hecho, rhabdovirus estrechamente relacionados se comportan de manera muy diferente sobre las mismas líneas celulares tumorales. Por lo tanto, actualmente no hay un procedimiento para predecir que rhabdovirus tienen un potencial oncolítico. Es necesario el ensayo empírico para identificar los virus que sean buenos candidatos oncolíticos.

FIG. 3A-3B. Productividad de rhabdovirus sobre líneas celulares tumorales. Se infectaron líneas celulares de glioblastoma humano SNB19 y carcinoma de pulmón humano NCI H226 con distintos rhabdovirus (MOI = 3) y se monitorizaron a lo largo del tiempo en cuanto a la producción de virus mediante el ensayo de placas. Los datos muestran que no todos los rhabdovirus tienen la misma capacidad para replicarse en estas líneas celulares tumorales. Las células NCI H226 revela una gran disparidad de productividad vírica no produciendo nada el virus Bahia Grande mientras que el virus Maraba era capaz de producir copiosos viriones infecciosos.

FIG. 4. Esquema del sistema de rescate para recuperar rhabdovirus recombinantes a partir de una forma de ADN plasmídico. En este ejemplo, el virus Maraba se había clonado en un ADN plasmídico entre el promotor T7 y una secuencia de ribozima del virus de la Hepatitis D. Se infectaron células a 549 con virus vaccinia que expresaba T7 y luego posteriormente se transfectaron con un vector de genoma de Maraba modificado para que expresara GFP. Los viriones rescatados se purificaron y se utilizaron entonces para infectar células Vero durante 24 horas, dando como resultado la expresión de ^gF^pen estas células cuando se visualizaban por microscopía de fluorescencia.

FIG. 5. Bioselección de cepas mejoradas de rhabdovirus oncolíticos. Los rhabdovirus son casi una especie. Bahia Grande no es neuropatogénico, pero tiene la capacidad para destruir células de glioblastoma humano. Los inventores contemplaron mejorar su virulencia manteniendo su selectividad por las células cancerosas. Para mejorar la virulencia de un rhabdovirus contra una célula tumoral, los inventores seleccionaron virus mutantes que tuvieran aumentada la capacidad de replicación en una línea celular de glioblastoma humano. En resumen, se infectaron 5 x 10⁵células SNB19 con 2,5 x 10⁶partículas víricas, dando una MOI de 5. El inóculo inicial tenía un volumen de 200 pl y se dejó que infectaran durante 1 hora antes de lavarse las células 10 veces con PBS. El último lavado se analizó en cuanto a partículas víricas mediante el ensayo de placas para asegurar una retirada apropiada de los virus introducidos. En puntos de tiempo crecientes se recolectó el sobrenadante completo y se remplazó con medio reciente. El medio recolectado se utilizó para infectar nuevas células para la amplificación y se analizaron por el ensayo de placas en cuanto a la presencia de partículas víricas. Para el primer pasaje, las ^{recolecciones se hicieron a las 4,}8^{, 12 y 24 hpi (horas post infección) hasta el momento inicial en que se}determinó la liberación vírica. Los virus de los puntos de tiempo más tempranos se amplificaron hasta una ^{población de}10^{6 y entonces se volvieron a pasar.}

FIG. 6. Bioselección de cepas mejoradas de rhabdovirus oncolíticos. En este ejemplo, el virus de Bahia Grande ^{se sometió a hasta}6 ^{ciclos repetidos de bioselección. La cepa parental (WT) junto con los pasajes 4-6 se monitorizaron en cuanto a la producción de virus en las células SNB19 a las 4,}6 ^y8 ^{horas post infección. Una}mejora clara y progresiva de la velocidad de replicación inicial de virus era evidente durante las rondas crecientes de bioselección. MRB = Maraba se incluye como un ejemplo de la replicación vírica rápida y deseable en la línea celular cancerosa.

FIG. 7. El Bahia Grande P13 se sometió a 13 rondas de bioselección. Este virus demostró una replicación vírica mejorada no solo en el glioblastoma humano utilizado durante el protocolo de bioselección, sino en un glioblastoma humano no relacionado y en una línea celular de carcinoma ovárico humano. Esto demuestra que los rhabdovirus pueden bioseleccionarse para mejorar sus propiedades oncolíticas y estas mejoras son eficaces en otros cánceres diferentes.

FIG. 8. Se infectaron por vía intracraneal ratones Balb/c con los virus indicados y se monitorizaron en cuanto a la morbilidad y/o mortalidad. Tanto el VSV de tipo silvestre (cepa HR) como la cepa mutante delta M512 de VSV eran extremadamente neurotóxicos, demostrando parálisis de extremidades posteriores dentro de días de la ^{infección, mientras que los virus Bahía Grande y Muir Springs no presentaban neurotoxicidad. Bahía Grande P}6 es una cepa bioseleccionada de Bahía Grande con una replicación mejorada en células de glioblastoma humano. Esta cepa tampoco presentaba neurotoxicidad, demostrando que los rhabdovirus se pueden bioseleccionar para mejorar la virulencia en células tumorales mientras mantienen su perfil de seguridad en el tejido sano normal. FIG. 9. Eficacia in vivo de los rhabdovirus Maraba y Carajas en comparación con Chandipura y WT VSV y delata 51 VSV. Se establecieron tumores 4T1 (que expresan luciferasa de luciérnaga) en ratones hembra Balb/C de 5-8 semanas de edad inyectando 10⁶células tumorales en la glándula mamaria posterior izquierda. Después de una semana, se inyectó a los ratones los días 1 y 2 (cada dosis = 10⁷ufp de WT VSV, A51 GFP VSV, Maraba o Chandipura; o 10⁸ufp de Carajas). Las respuestas tumorales se midieron por creación de imágenes de ^{bioluminiscencia utilizando un IVlS}200 ^{(Xenogen) (medida en fotones/s/cm2).}

FIG. 10. Infectividad de VSV G-menos pseudotipado con proteína G de Isfahan y G de VSV.

FIG. 11. Una curva de crecimiento en una etapa de los virus VSV WT, Isfahan y RVR IsfGI.

FIG. 12. El RVR que comprende una proteína G de Isfahan se mantiene oncolítico. Se evaluaron las citotoxicidades del virus Isfahan, VSV d51 y RVR IsfGI sobre distintas líneas celulares.

FIG. 13A-13C. El RVR que comprende Isf G1 es un virus capaz de escapar a la respuesta inmunitaria contra VSV in vivo. Se utilizó la detección de luciferasa in vivo para determinar la cantidad de virus en los ratones inoculados con RVR IsfGI o VSV. La FIG. 13A, es la detección in vivo de virus recombinante inyectado en ratones intactos. La FIG. 13B, es la detección in vivo de VSV inyectado en ratones inmunizados con VSV. La FIG 13C, es la detección in vivo del virus RVR IsfGI recombinante inyectado en ratones inmunizados con VSV.

FIG. 14. Rendimientos de virus de tumores infectados. Se infectaron tumores con virus recombinante o VSV en presencia o ausencia de inmunización con VSV (como se indica) los datos en los gráficos muestran la cantidad de virus que resulta de la infección del tumor.

FIG. 15. Una curva de crecimiento en una etapa de VSV WT, virus Chandipura y RVR^chaG¹. Los resultados muestran que el recombinante produce la misma cantidad de virus que el VSV.

FIG. 16. Citotoxicidad de VSV WT, virus Chandipura y RVR^chaG¹. Los resultados muestran que recombinante es tan citotóxico como el VSV.

FIG. 17. Una curva de crecimiento en una etapa de VSV WT, virus Maraba y RVR^MarG¹. Los resultados muestran que el título de virus recombinante era mayor que el de VSV a las 48 y 72 h.

FIG. 18. Citotoxicidad de VSV WT, virus Maraba y RVR^MarG¹. Los resultados muestran que tanto el maraba como el RVR^MarG¹. Son citotóxicos en líneas celulares tumorales y son en general más citotóxicos para las células tumorales que el VSV WT.

Descripción detallada de la invención

Los aspectos de la divulgación se basan en la destrucción por un rhabdovirus no VSV o rhabdovirus pseudotipado de varias clases o tipos de células cancerosas, que son resistentes a la destrucción por VSV. Algunas de las ventajas de estos rhabdovirus oncolíticos y rhabdovirus recombinantes incluyen las siguientes: (1) Son raros los ^{anticuerpos contra los rhabdovirus inventivos o no existen en la mayoría de las poblaciones del mundo. (}2^{) los}rhabdovirus se replican más rápidamente que otros virus oncolíticos tales como adenovirus, reovirus, sarampión, parvovirus, retrovirus y VSH. (3) Los rhabdovirus crecen con altos títulos y se pueden filtrar a través de un filtro de 0. 2 micrómetros. (4) Los rhabdovirus oncolíticos y los recombinantes de los mismos tienen un intervalo de huéspedes amplio, capaz de infectar muchos tipos diferentes de células cancerosas y no están limitados por receptores sobre una célula particular (por ejemplo, como el coxsackie, sarampión, adenovirus). (5) El rhabdovirus ^{de la invención se presta a modificación genética. (}6^{) El rhabdovirus también tiene un ciclo de vida citoplásmica y no}se integra en el material genético de una célula huésped, lo que da lugar a un perfil de seguridad más favorable.

1. Familia Rhabdoviridae (Rhabdovirus)

Los rhabdovirus arquetipo son los virus de la rabia y la estomatitis vesiculosa (VSV), el más estudiado de esta familia de virus. Aunque estos virus comparten morfologías similares, son muy diferentes en su ciclo vital, intervalo de huéspedes y patología. Rhabdoviridae es una familia de virus con forma de bala que tienen genomas de ARN en sentido (-) no segmentados. Hay más de 250 rhabdovirus conocidos por infectar mamíferos, peces, insectos y plantas. La familia se divide en al menos 5 géneros: (1) Lyssavirus: incluyendo el virus de la rabia, otros virus de mamífero, algunos virus de insecto; (2) Vesiculovirus: que incluyen el virus de la estomatitis vesicular (VSV); (3) Ephemerovirus: que incluyen el virus de la fiebre efímera bovina (vertebrados); (4) Citorhabdovirus: que incluye el virus amarillo necrótico de la lechuga (plantas); y (5) Nucleorhabdovirus: que incluyen el virus enano amarillo de la patata (plantas). También se ha sugerido que existe un supergrupo de rhabdovirus denominado Dimarthabdovirus que incluye una variedad de rhabdovirus que infecta tanto mamíferos como insectos.

La familia Rhabdoviridae incluye, pero no se limitan a: virus Arajas, virus Chandipura, (AF128868 / gi:4583436, AJ810083 / gi:57833891, AY871800 / gi:62861470, AY871799 / gi:62861468, AY871798 / gi:62861466, AY871797 / gi:62861464, AY871796 / gi:62861462, AY871795 / gi:62861460, AY871794 / gi:62861459, AY871793 / gi:62861457, AY871792 / gi:62861455, AY871791 / gi:62861453), virus Cocal (AF045556 / gi:2865658), Isfahan virus (AJ810084 / gi:57834038), virus Maraba (SEQ ID NO:1-6), virus Carajas (SEQ ID NO:7-12, AY335185 / gi:33578037), virus Piry (D26175 / gi:442480, Z15093 / gi:61405), virus de estomatitis vesicular Alagoas, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus Eel American, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus Mount Elgon bat (DQ457103 / gi:91984805), virus Perinet (AY854652 / gi:71842381), virus Tupaia (NC_007020/ gi:66508427), Farmington, virus Bahia Grande (SEQ ID NO:13-18), virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders (AF523199 / gi:25140635, AF523197 / gi:25140634, AF523196 / gi:25140633, AF523195 / gi:25140632, AF523194 / gi:25140631, AH012179 / gi:25140630), virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka (AY854651 / gi:71842379), virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec (AY854650 / gi:71842377), virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar (AY854645 / gi:71842367), virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus Blue crab, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo (AY854643 / gi:71842363), virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo (DQ457100 / gi:91984799 nucleoprotein (N) mRNA, partial cds); virus Koolpinyah, virus Kotonkon (DQ457099 / gi:91984797, AY854638 / gi:71842354); virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan (AY854649 / gi:71842375), virus Oak-Vale (AY854670 / gi:71842417), virus Obodhiang (DQ457098 / gi:91984795), virus Oita (AB116386 / gi:46020027), virus Ouango, virus Parry Creek (AY854647 / gi:71842371), virus Rio Grande cichlid, virus Sandjimba (DQ457102 / gi:91984803), Sigma virus (AH004209 / gi:1680545, AH004208 / gi:1680544, AH004206 / gi:1680542), virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan (AY854646 / gi:71842369), virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus Adelaide River (U10363 / gi:600151, AF234998 / gi:10443747, AF234534 / gi:9971785, AY854635 / gi:71842348), virus Berrimah (AY854636 / gi:71842350]), virus Kimberley (AY854637 / gi:71842352), o de la fiebre efímera bovina (NC_002526 / gi:10086561).

Ciertos serotipos sin asignar incluyen (1) el grupo Bahía Grande (virus Bahía Grande (BGV), virus Muir Springs (MSV), virus Reed Ranch (RRV); (2) virus del grupo Hart Park (Flanders virus (FLAV), virus Hart Park (HPV), virus Kamese (KAMV), virus Mosqueiro (MQOV), virus Mossuril (MOSV); (3) grupo del virus Kern Canyon (virus Barur (BARV), virus Fukuoka (FUKAV), virus Kern Canyon (KCV), virus Nkolbisson (NKOV); (4) Grupo Le Dantec (virus Le Dantec (LDV), virus Keuraliba (KEUV), (5) grupo Sawgrass (virus Connecticut (CNTV), virus New Minto (NMV), virus ^{Sawgrass (SAWV); (}6^{) Grupo Timbo (virus Chaco (CHOV), virus Sena Madureira (SMV), virus Timbo (TIMV); y (7)}otros virus sin asignar (virus Almpiwar (ALMV), virus Aruac (ARUV), virus Bangoran (BGNV), virus Bimbo (BBOV), virus Bivens Arm (BA^v), virus Blue crab (BCV), virus Charleville (CHVV), virus Coastal Plains (CPV), virus DakArK 7292 (DAKV-7292), virus Entamoeba (EnTV), virus Garba (g ArV), virus Gossas (GOSV), virus Humpty Doo (HDOOV), Joinjakaka virus (JOIV), Kannamangalam virus (KANV), Kolongo virus (KOLV), Koolpinyah virus (KOOLV), virus Kotonkon (KOTV), virus Landjia (LJAV), virus Manitoba (MNTBV), virus Marco (MCOV), Ngaingan, virus Nasoule (NASV), virus Navarro (NAVV), virus Ngaingan (NGAV), virus Oak-Vale (OVRV), virus Obodhiang (OBOV), virus Oita (OITAV), virus Ouango (OUAV), virus Parry Creek (PCRV), virus Rio Grande cichlid (RGRCV), virus Sandjimba (SJAV), virus Sigma [X91062] (SIGMAV), virus Sripur (SRIV), virus Sweetwater Branch (SWBV), virus Tibrogargan (TIBV), virus Xiburema (XIBV), virus Yata (YATAV).

Los aspectos de la divulgación pueden incluir, pero no se limita a rhabdovirus no VSV seleccionados o rhabdovirus pseudotipados basados en su crecimiento en líneas celulares, falta de o una mínima toxicidad en ratones adultos (animales), falta o mínima toxicidad en ratones lactantes (animales).

A. Genoma rhabdovírico

Normalmente el genoma del rhabdovirus tiene aproximadamente de 11-15 kb con un líder 3' de 50 nucleótidos y una región no traducida 5' de aproximadamente 60 nucleótidos de un ARN vírico en sentido (-) (vARN). Normalmente, el vARN del rhabdovirus tiene 5 genes que codifican 5 proteínas. Los rhabdovirus tienen una señal de poliadenilación conservada al final de cada gen y una corta región intergénica entre cada uno de los 5 genes. Todos los rhabdovirus contienen 5 genes que codifican la proteína de la nucleocápside (N), Fosfoproteína (P, también denominada NS), proteína de la matriz (M), glicoproteína (G), y proteína grande (L). Normalmente, estos genes se ordenan en el vARN en sentido negativo de la siguiente manera: 3'-N-P-M-G-(X)-L-5'. El orden de los genes es importante ya que dicta la proporción de proteínas sintetizadas. Cualquier modificación del genoma de un rhabdovirus incluye normalmente al menos cinco dominios de transcripción para mantener la capacidad de infectar y replicarse a altos niveles. Los rhabdovirus tiene una ARN polimerasa para la transcripción de más ARNm en sentido. El gen X no existe en todos los rhabdovirus. El gen X codifica una proteína no estructural que se encuentra en el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa de los peces (DQ164103 / gi:76262981; DQ164102 / gi:76262979; DQ164101 / gi:76262977; DQ164100 / gi:76262975; DQ164099 / gi:76262973; AB250935 / gi:112821165; AB250934 / gi:112821163; AB250933 / gi:112821161; AB250932 / gi: 112821159; AB250931 / gi: 112821157; AB250930 / gi:112821155; AB250929 / gi:112821153; AB250928 / gi: 112821151; AB250927 / gi:112821149, que describen la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína G), una glicoproteína no estructural del virus de la fiebre efímera bovina y un pseudogén en el virus de rabia. El gen extra (X) se ha encontrado en diferentes localizaciones del genoma de rhabdovirus. Las síntesis de proteína M en las células infectadas es citopático para la célula, y eventualmente da como resultado la muerte celular.

La transmisión del rhabdovirus varía dependiendo del virus/huésped, pero la mayoría se transmite por contacto directo - por ejemplo, la transmisión de rabia por mordedura de un animal o un insecto vector. Existe un periodo de incubación largo in vivo, pero esto no se refleja en la cinética de replicación vírica en cultivo. Las espículas de la proteína G se unen a los receptores en la superficie de las células huésped y los virus entran en la célula por endocitosis y se fusionan con la membrana de la vesícula con la mediación de la proteína G.

Sin intentar quedar limitados por una teoría en particular, se cree que las moléculas del receptor para los rhabdovirus son fosfolípidos más que proteínas específicas. La replicación rhabdovírica se produce en el citoplasma - tanto la proteína L y NS son necesarias para la transcripción - no funcionan solas. Se producen cinco ARNm monocistrónicos, protegidos en el extremo 50 y poliadenilados en el extremo 30 y cada uno contiene la secuencia líder desde el extremo 3' del vARN en el extremo 50 del mensaje. Estos ARNm se producen por transcripción secuencial de las ORF en el genoma vírico y no se ha demostrado que la secuencia intergénica sea responsable de la terminación y reinicio de la transcripción por la polimerasa entre cada gen, produciéndose así transcripciones diferentes.

El vARN de la progenie se produce a partir de un intermediario en sentido (+). El genoma se replica por el complejo polimerasa L P (como en la transcripción), pero también son necesarios factores de la célula del huésped adicionales. Es característico de los rhabdovirus que estos eventos se produzcan en una parte del citoplasma que actúa como una 'fábrica' de virus y aparece como un cuerpo de inclusión citoplásmico característico.

B. Variantes de proteínas víricas

En ciertos aspectos, un rhabdovirus o rhabdovirus no VSV comprenderá una variante de una o más de las proteínas N, P, M, G y/o L. En ciertos aspectos de la divulgación estas variantes de proteínas víricas pueden estar comprendidas en una composición proteinácea que se definen adicionalmente con posterioridad. Las composiciones proteináceas incluyen partículas víricas y otras composiciones que tienen uno o más componentes proteicos víricos. Estas variantes de polipéptido se pueden modificar o seleccionar para una modificación en una o más características fisiológicas o biológicas, tal como intervalo de células huésped, especificidad de células huésped, toxicidad para las células u órganos no diana, replicación, citotoxicidad para una célula diana, destrucción de células cancerosas, éstasis de células cancerosas, infectividad, parámetros de fabricación, tamaño de partícula vírica, estabilidad de las partículas víricas, aclaramiento in vivo, inmunorreactividad, y similares. Estas variantes polipeptídicas se pueden modificar utilizando una variedad de metodologías conocidas en la técnica, incluyendo distintas técnicas de mutagénesis descritas posteriormente.

C. Rhabdovirus recombinantes

Los rhabdovirus recombinantes se pueden producir (1) completamente utilizando ADNc o (2) con una combinación de ADNc transfectados en una célula auxiliar, o (3) con ADNc transfectados en una célula que se infectan adicionalmente con un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. Utilizando cualquiera de estos procedimientos (por ejemplo, minivirus, línea celular auxiliar, o transfección solo de ADNc), los componentes mínimos necesarios son una molécula de ARN que contenga las señales cis-actuantes para (1) la encapsidación del ARN genómico (o antigenómico) por la proteína N del rhabdovirus, y (2) la replicación de un equivalente de ARN genómico o antigenómico (intermediario replicante).

Por elemento replicante o replicón, los inventores quieren decir una cadena de ARN que contenga mínimamente en los extremos 5' y 3' la secuencia líder y la secuencia remolque de un rhabdovirus. En el sentido genómico el líder está en el extremo 3' y el remolque está en el extremo 5'. Cualquier ARN situado entre estas dos señales de replicación ser replicará a su vez. Las regiones líder y remolque deben contener adicionalmente los elementos cisactuantes mínimos con fines de encapsidación por la proteína N y para la unión de la polimerasa que son necesarios para iniciar la transcripción y replicación.

Para la preparación de rhabdovirus modificados uno minivirus que contenga el gen G también contendría una región líder y una región remolque y un gen G con las señales apropiadas de inicio y terminación para la producción de un ARNm de proteína G. Si el minivirus comprende adicionalmente un gen M, deben estar presentes también las señales apropiadas de inicio y terminación para la producción del ARNm de la proteína M.

Para cualquier gen contenido dentro del genoma modificado del rhabdovirus, el gen estaría flanqueado por las señales apropiadas de inicio y terminación de la transcripción, que es un gen que normalmente no se codifica por un rhabdovirus aislados de la naturaleza o que contiene la región codificante de rhabdovirus en una posición, forma o contexto que normalmente no se encuentra, por ejemplo, una proteína G quimérica.

Para producir rhabdovirus modificados “no-infecciosos”, el rhabdovirus modificado puede tener elementos mínimos de replicón y las proteínas N, P y L y debe contener el gen M (un ejemplo es la construcción AG o G-menos, que ha perdido la región codificante de la proteína G). Esto produce partículas víricas que brotan de la célula pero que son partículas no infecciosas. Para producir partículas “infecciosas”, las partículas víricas deben comprender adicionalmente proteínas que puedan mediar la unión de la partícula vírica y la fusión, tal como mediante el uso de una proteína de enganche o ligando de receptor. El ligando de receptor nativo de rhabdovirus es la proteína G. Una “célula adecuada” o “célula huésped” significa cualquier célula que permita la unión del rhabdovirus recombinante.

Par preparar partículas víricas infecciosas, se infecta primero una línea celular apropiada (por ejemplo, células BHK) con virus vaccinia VTF7-3 (Fuerst y col., 1986) o un equivalente que codifica la ARN polimerasa T7 u otras ^{polimerasas de bacteriófago adecuada tal como las polimerasas T3 o SP}6 ^{(véase Usdin y col., 1993 o Rodríguez y}col., 1990). Las células se transfectan entonces con ADNc individuales que contienen los genes que codifican las proteínas G, N, P y L de rhabdovirus. Estos ADNc proporcionarán las proteínas para construir una partícula de rhabdovirus recombinante. Las células se pueden transfectar por cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, liposomas, electroporación, etc.).

También se transfectan en una línea celular un “ADNc policistrónico” que contenga el equivalente de ARN genómico de rhabdovirus. Si se pretende que la partícula de rhabdovirus recombinante infecciosa sea lítica en la célula infectada, entonces los genes que codifican las proteínas N, P, M y L deben estar presentes, así como cualquier segmento de ácido nucleico heterólogo. Si no se pretende que la partícula de rhabdovirus recombinante infecciosa sea lítica, entonces el gen que codifica la proteína M n ose incluye en el ADN policistrónico- Por “ADNc policistrónico” se quiere decir un ADNc que comprende al menos unidades de transcripción que contengan los genes que codifican las proteínas N, P y L. El ADN policistrónico de rhabdovirus recombinante puede contener también un gen que codifique una variante de proteína o fragmento polipeptídico de la misma, o un ácido nucleico terapéutico. De manera alternativa, cualquier proteína asociada inicialmente con la particular vírica producida primero o fragmento de la misma se puede suministrar en trans.

Otro aspecto que se contempla es un ADN policistrónico que comprende un gen que codifica una proteína indicadora o proteína fluorescente (por ejemplo, una proteína fluorescente verde y sus derivados, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, etc.), los genes N-P-L o N-P-L-M, y/o una proteína de fusión o un ácido nucleico terapéutico. Otro ADN policistrónico contemplado puede contener un gen que codifica una variante proteica, un gen que codifica un indicador, un ácido nucleico terapéutico, y/o cualquiera de los genes N-P-L o los genes N-P-L-M.

La primera etapa en la generación de un rhabdovirus recombinante es la expresión de un ARN que es un equivalente genómico o antigenómico de un ADNc. Luego ese ARN se empaqueta en la proteína N y luego se replica mediante las proteínas p/l. El virus así producido se puede recuperar. Si la proteína G está ausente del ARN genómico recombinante, normalmente se suministra en trans. Si están ausentes las proteínas G y M, entonces ambas se suministran en trans.

Para la preparación de partículas de “rhabdovirus no infeccioso”, el procedimiento puede ser el mismos que anteriormente, excepto que el ADNc policistrónico transfectado en las células contendría solo los genes N, P y L de rhabdovirus. El ADNc policistrónico de partículas de rhabdovirus no infeccioso pueden contener adicionalmente un gen que codifique una proteína indicadora o un ácido nucleico terapéutico. Para una descripción adicional con respecto a los procedimientos de producción de un rhabdovirus recombinante que carezca del gen codificante de la proteína G, véase Takada y col. (1997).

1. Cultivo de células para producir virus

Las células transfectadas se incuban habitualmente durante al menos 24 h a la temperatura deseada, habitualmente aproximadamente de 37. Para las partículas víricas no infecciosas, se recolectó el sobrenadante y las partículas víricas aisladas. Para las partículas víricas infecciosas, el sobrenadante que contiene el virus se recolecta y se transfiere a nuevas células. Las nuevas células se incuban durante aproximadamente 48 horas, y se recolecta el sobrenadante.

2. Purificación del rhabdovirus recombinante

Los términos “aislamiento” o “aislar” un rhabdovirus significa el proceso de cultivo y purificación de las partículas víricas de manera que permanecen muy pocos desechos celulares. Un ejemplo sería tomar el sobrenadante que contiene el virión y pasarlo a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1-0,2 micrómetros (por ejemplo, Millex-GS, Millipore) para retirar el virus y los desechos celulares. De manera alternativa, se pueden purificar los viriones utilizando un gradiente, tal como un gradiente de sacarosa. Las partículas de rhabdovirus recombinante se pueden aglomerar y resuspender en cualquier excipiente o vehículo que se desee. Los títulos se pueden determinar por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos para las proteínas particulares.

3. Procedimientos de producción de rhabdovirus recombinantes utilizando ADNc y un minivirus o una línea celular auxiliar

Tanto los “minivirus” como las “células auxiliares” (también conocidas como “líneas celulares auxiliares”) proporcionan la misma cosa: proporcionar una fuente de proteína de rhabdovirus para el ensamblaje de viriones de rhabdovirus. Un ejemplo de un minivirus de rhabdovirus es el minivirus VSV, que expresa solo la proteína G y M, como informan Stillman y col., (1995). Los virus auxiliares y los minivirus se utilizan como procedimientos para proporcionar proteínas de rhabdovirus que no se producen a partir del ADN transfectado que codifica los genes de proteínas de rhabdovirus.

Cuando se utiliza un minivirus, las células se infectan con un virus vaccinia como se ha descrito anteriormente para los fines de proporcionar la ARN polimerasa T7. El ARN policistrónico deseado, y los plásmidos que contienen los genes N, P y L se transfectan en las células. La mezcla de transfección se retira después de aproximadamente 3 h y se infectan las células con el minivirus con una multiplicidad de infección (m.o.i.) de aproximadamente 1. El minivirus aporta las proteínas G y/o M omitidas. El ARN policistrónico transfectado en la célula dependerá de si se quiere un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso.

De manera alternativa, se podría utilizar un minivirus para proporcionar los genes N, P y L. El minivirus se podría utilizar también para producir la proteína M además de N, P y L. El minivirus también puede producir la proteína G. Cuando se utiliza una línea celular auxiliar, los genes que codifican las proteínas de rhabdovirus omitidas se producen por la línea celular auxiliar. La línea celular auxiliar tiene las proteínas N, P, L y G para la producción de partículas de rhabdovirus recombinantes que no codifican la proteína G de tipo silvestre. Las proteínas se expresan a partir de genes o ADN que no son parte del genoma vírico recombinante. Estos plásmidos u otro sistema de vectores se incorporan establemente en el genoma de la línea celular. Las proteínas se producen entonces a partir del genoma celular y no a partir de un replicón en el citoplasma. La célula auxiliar puede entonces transfectarse con un ADN policistrónico y ADNc plasmídicos que contienen los otros genes de rhabdovirus que no expresa el virus auxiliar. El ARN policistrónico que se utilice dependerá de si se desea un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. De otra manera, se consigue el suministro los productos genéticos omitidos (por ejemplo, G y/o M) como se ha descrito anteriormente.

II. COMPOSICIONES VÍRICAS

La presente divulgación se refiere a un rhabdovirus que tiene ventajas en el estudio y tratamiento de células hiperproliferativas o neoplásicas (por ejemplo, células cancerosas) y afecciones hiperproliferativas o neoplásicas (por ejemplo, el cáncer) en un paciente. Las enseñanzas descritas posteriormente proporcionan distintos ejemplos de protocolos para implementar un virus Farmington para su uso en la invención como se define en las reivindicaciones y las composiciones para su uso en la invención como se define en las reivindicaciones. Proporcionan el entorno para la generación de virus mutantes o variantes por medio del uso de bioselección o tecnología de ADN o ácido nucleico recombinante.

A. Composiciones proteináceas

Las composiciones proteináceas de la invención incluyen las partículas víricas y composiciones que incluyen las partículas víricas, así como polipéptidos aislados. En ciertos aspectos se generan o aíslan rhabdovirus oncolíticos pseudotipados o VSV (rhabdovirus que lisan, destruyen o retrasan el crecimiento de células cancerosas). En ciertos aspectos, los rhabdovirus se modificarán para que incluyan variantes polipeptídicas de proteínas de rhabdovirus (N, P, M, G y/o L) y/o ácidos nucleicos terapéuticos que codifiquen polipéptidos terapéuticos. Otros aspectos incluyen el aislamiento de rhabdovirus que carecen de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales. En otras realizaciones, la presente invención se refiere al virus de Farmington para su uso como se define en las reivindicaciones. Además, se contempla su uso en combinación con o incluido en composiciones proteináceas como parte de una formulación farmacéuticamente aceptable

Como se utiliza en el presente documento, una “proteína” o un “polipéptido” se refiere a una molécula que comprende un polímero de restos de aminoácido. En algunos aspectos, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la divulgación, todo o parte de una proteína o polipéptido vírico está ausente o alterado de manera que haga que el virus sea más útil para el tratamiento de un paciente. Los términos descritos anteriormente se pueden utilizar de manera intercambiable en el presente documento. Una “proteína modificada” o “polipéptido modificado” o “una variante de proteína” o “una variante de polipéptido” se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química o secuencia de aminoácidos está alterada con respecto a la de tipo silvestre o a una proteína o polipéptido de referencia. En algunos aspectos, una proteína o polipéptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (reconociendo que las proteínas o polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). La actividad o función modificada puede reducirse, disminuir, eliminarse, aumentarse, mejorarse, o alterase de alguna otra manera (tal como la especificidad de infección) con respecto a la actividad o función de una proteína o polipéptido de tipo silvestre, o las características del virus que contiene dicho polipéptido. Se contempla que una proteína o polipéptido modificado puede alterarse con respecto a una actividad o función mientras se mantiene la actividad o función de tipo silvestre o inalterada en otros aspectos. De manera alternativa, una proteína puede ser completamente no funcional o su secuencia de ácidos nucleicos equivalente puede haberse alterado de manera que el polipéptido no se vuelva a expresar más, esté truncado, o exprese una secuencia de ácido nucleico diferentes como resultado de un cambio de fase u otra modificación.

En ciertos aspectos, el tamaño de una proteína o polipéptido recombinante puede comprender, pero no se limita , 5, ³

6 ^{69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 9}100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425,

450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 o más restos de moléculas de aminoácido, y cualquier intervalo derivado de esto. Se contempla que los polipéptidos se pueden modificar por truncado, haciéndolos más cortos que sus formas correspondientes sin alterar o por fusión o intercambio de dominios pueden dar lugar a una proteína alterada más larga.

Como se utiliza en el presente documento, una “molécula de aminoácido” se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido, mimético de aminoácido como conocerá un experto habituado en la técnica. En ciertos aspectos, los restos de la molécula proteinácea es secuencial, sin ninguna molécula no amino que interrumpa la secuencia de restos de moléculas de aminoácido. En otros aspectos la secuencia puede comprender uno o más restos de moléculas no amino. En aspectos particulares, la secuencia de restos de molécula proteinácea se puede interrumpir por uno o más restos de molécula no amino. En consecuencia, la expresión “composición proteinácea” ^{engloba secuencias de moléculas de amino que comprende al menos uno de los}20 ^{aminoácidos comunes de las}proteínas sintetizadas naturalmente, o al menos un aminoácido modificado o inusual.

Las composiciones proteináceas se pueden producir por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos, o péptidos mediante técnicas de biología molecular, el aislamiento de los compuestos proteináceos de fuentes naturales, o síntesis química de materiales proteináceos.

Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos de distintos genes o genomas de rhabdovirus se habían desvelado previamente, y se pueden encontrar en bases de datos computarizadas conocidas por los expertos habituados en la técnica. Una de dichas bases de datos es el GenBank del Centro Nacional de información Biotecnológica y las bases de datos GenPept, a las que se puede acceder mediante internet en nc-bi.nlm.nih.gov/. Las regiones codificantes de estos genes y virus conocidos se pueden amplificar y/o expresar utilizando las técnicas desveladas en el presente documento o como es sabido por los expertos habituados en la técnica.

B. Aspectos funcionales

Cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de proteínas o polipéptidos víricos, quiere decir que se refiere a la actividad o función de esa proteína o polipéptido vírico en condiciones fisiológicas, a menos de que se especifique otra cosa. Por ejemplo, la proteína G está implicada en la especificidad y la eficacia de unión y la infección de tipos celulares particulares. La determinación de qué moléculas poseen esta actividad se puede conseguir utilizando ensayos familiares a los expertos en la técnica, tales como ensayos de infectividad, ensayos de unión proteica, ensayos de placas y similares.

C. Variantes de polipéptidos víricos

Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente divulgación pueden ser variantes de sustitución, inserción o eliminación. Una mutación en un gen que codifica una polipéptido vírico puede afectar a 1, 2,

^{3, 4, 5,}6^{, 7,}8^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,}66^,

^67,68^{, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,}

98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375,

400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos (es decir, segmentos) de un polipéptido en comparación con un polipéptido de tipo silvestre o sin altera u otro polipéptido de referencia. Se pueden identificar distintos polipéptidos codificados por rhabdovirus en referencia a los números de acceso del GenBank y las entradas en la base de datos pública relacionada para cada uno de los virus desvelados en el presente documento.

Las variantes de eliminación carecen de uno o más restos de la proteína nativa, sin alterar o de tipo silvestre. Se pueden eliminar restos individuales, o se pueden eliminar toto o parte de un dominio (tal como un dominio catalítico o de unión). Un codón de parada se puede introducir (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción normalmente implican la adición de material en un punto no terminal del polipéptido, un tipo específico de inserción es un polipéptido quimérico que incluye porciones homólogas o similares de una proteína relacionada en lugar de los restos. También se pueden generar adiciones terminales, normalmente llamadas proteínas de fusión.

Las variantes de sustitución normalmente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y se pueden diseñar para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se sustituye por otro con una forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina por serina; arginina por lisina; asparagina por glutamina o histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparagina o glutamina; isoleucina por leucina o valina; leucina por valina o isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina o isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina o metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptófano por tirosina; tirosina por triptófano o fenilalanina; y valina por isoleucina o leucina. De manera alternativa, las sustituciones pueden ser no conservadoras de manera que afectan a la función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservadores implican normalmente la sustitución de un resto con otro que sea distinto químicamente, tal como un aminoácido polar o con carga por un aminoácido no polar o sin carga, y viceversa.

La expresión “codón funcionalmente equivalente” se utiliza en el presente documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para la arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la Tabla 1, a continuación).

Tabla 1. Tabla de codones

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir restos adicionales, tal como aminoácidos adicionales en el extremo N o C o secuencias 5' o 3', y seguir siendo esencialmente como los que se exponen en el presente documento, incluyendo los que tienen una cierta actividad biológica. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a las secuencias de ácido nucleico que puede, por ejemplo, incluir distintas secuencias no codificantes flanqueando las partes 5' o 3' de la región codificante o que pueden incluir distintas secuencias internas, es decir, intrones, que se conoce que existen dentro de los genes.

Lo siguiente es una exposición basándose en el cambio de aminoácidos de una proteína N, P, Lo G para crear una molécula equivalente, o incluso mejorada. Por ejemplo, se pueden sustituir ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin apreciar pérdida de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Como es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica y en su secuencia de ADN codificante subyacente, y, no obstante, producir una proteína con propiedades parecidas. Por lo tanto, los inventores contemplan que se pueden hacer distintos cambios en las secuencias de ADN de los rhabdovirus sin apreciar una pérdida de actividad o utilidad biológica de interés, como se expone posteriormente.

Al hacer dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para dar una función a una proteína se conoce en general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer eficazmente basándose en la hidrofilia. La patente de EE. UU. 4.554.101, establece que el mayor promedio local de hidrofilia de una proteína, que dependerá de la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de una proteína. Como se detalla en la Patente de EE. u U. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1^{); serina (+0,3); asparagina (+}0^,2^{); glutamina (+}0^,2^{); glicina (}0^{); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±}1^{); alanina ( 0,5);}histidina *-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y seguir produciendo una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En dichos cambios la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de 62 se prefieren, los que están dentro de 61 son particularmente preferidos, y los que están dentro de 60,5 son incluso más particularmente preferidos.

Como se ha señalado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan en general en la relativa similitud de los sustituyentes de cadenas laterales del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en consideración las distintas características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina.

III. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO

La presente divulgación incluye polinucleótidos que se pueden aislar de células que son capaces de expresar todo o parte de un proteína o polipéptido vírico. En algunos aspectos de la divulgación, se refiere a todo o partes del genoma vírico que se ha mutado o alterado específicamente para generar un polipéptido vírico o virus, por ejemplo, un polipéptido rhabdovírico o virus pseudotipado o no v Sv , con ciertas propiedades y/o características. Los polinucleótidos pueden codificar un péptido o polipéptido que contenga todo o parte de una secuencia de aminoácidos heteróloga o vírica o se modifican de manera que no codifiquen dicho polipéptido vírico o que codifiquen un polipéptido que tenga al menos una función o actividad añadida, aumentada, reducida, añadida, disminuida o ausente. Las proteínas recombinantes se pueden purificar a partir de células de expresión para obtener proteínas activas. Los miembros del genoma de rhabdovirus se pueden encontrar con los números de acceso al GenBank en la base de datos del NCBI o bases de datos similares.

A. Polinucleótidos que codifican proteínas nativas o modificadas

Como se utiliza en el presente documento “ARN, ADN, o segmento de ácido nucleico” se refiere a un ARN, ADN o molécula de ácido nucleico que se ha aislado libre del ADN genómico total u otros contaminantes. Por lo tanto, un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ácido nucleico que contiene secuencias de tipo silvestre, polimórficas, o que codifican polipéptidos mutantes que se han aislado de, o se han purificado libres de, ácidos nucleicos genómicos. Se incluye dentro de la expresión “segmento de ácido nucleico” los polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico menores de un polinucleótido, y vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares.

Como se utiliza en la presente solicitud, la expresión polinucleótidos rhabdovírico” se puede referir a una molécula de ácido nucleico rhabdovírica pseudotipada o no VSV que codifica al menos un polipéptido rhabdovírico no VSV. En ciertos aspectos el polinucleótido se ha aislado libre de otros ácidos nucleicos. De manera similar, un “polinucleótido de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande” se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande que se ha aislado de otros ácidos nucleicos. Un “genoma rhabdovírico” o un “genoma vírico de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande” se refiere a una molécula de ácido nucleico VSV o no VSV que se puede proporcionar a una célula huésped para obtener una partícula vírica, en presencia o ausencia de un virus auxiliar o regiones codificantes complementarias que suministren otros factores en trans. El genoma puede abre sido mutado o no en comparación con un virus de tipo silvestre o no alterado.

El término “ADNc” pretende referirse a un ADN que se prepara utilizando un ARN como matriz. Puede haber veces en las que se prefiera la secuencia genómica completa o parcial.

También se contempla que un polipéptido particular de una especie determinada puede estar representada por variantes naturales que tienen secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes, que, no obstante, codifiquen la misma proteína (véase, la Tabla 1 anteriormente).

De manera similar, un polinucleótido que codifica un polipéptido aislado o purificado de tipo silvestre o modificado se refiere a un segmento de ADN que incluye un polipéptido de tipo silvestre o mutante que codifica secuencias y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, sustancialmente aisladas de otros genes de origen natural o secuencias codificantes de proteínas. A este respecto, el término “gen” se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, o péptido (incluyendo cualquier secuencia necesaria para la transcripción apropiada, la modificación postraduccional, o localización). Como entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc, y segmentos de ácido nucleico modificado más pequeños que expresen o se puedan adaptar para que expresen proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión, y mutantes. Una ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido nativo o modificado puede contener un ácido nucleico contiguo de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más pares de bases.

En aspectos particulares, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido rhabdovírico de tipo silvestre o mutante que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contigua de acuerdo con, o esencialmente que se corresponde con un polipéptido nativo. El término “recombinante” se puede utilizar en conjunción con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y se refiere en general a un polipéptido producido por una molécula de ácido nucleico que se ha modificado in vitro o que es el producto replicado de dicha molécula.

En otros aspectos, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido o péptido que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contigua de acuerdo con, o que se corresponde esencialmente con uno o más polipéptidos rhabdovíricos.

Los segmentos de ácido nucleico que se utilizan en la presente divulgación, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, se pueden combinar con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se puede utilizar un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferentemente por la facilidad de preparación y el uso del protocolo de ácido nucleico recombinante que se pretenda.

Se contempla que las construcciones de ácido nucleico de la presente divulgación pueden codificar polipéptidos de longitud completa a partir de cualquier fuente o codificar una versión truncada o modificada de los polipéptidos, por ejemplo, un polipéptido rhabdovírico truncado, de manera que la transcripción de la región codificante represente la versión truncada. La transcripción truncada puede entonces traducirse en una proteína truncada. De manera alternativa, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de polipéptido de longitud completa con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo, para permitir la purificación de los polipéptidos, el transporte, secreción modificación postraduccional, o por sus beneficios terapéuticos tales como el direccionamiento o la eficacia. Como se ha tratado anteriormente, se puede añadir a la secuencia que codifica un polipéptido modificado un marcador u otro polipéptido heterólogo, en el que “heterólogo” se refiere a un polipéptido o segmento del mismo que no es el mismo que el polipéptido modificado ni se encuentra asociado o codificado por el virus de origen natural.

En un ejemplo no limitante, se pueden preparar una o más construcciones de ácido nucleico que incluyan un tramo contiguo de nucleótidos idéntico o complementario de un segmento vírico particular, tal como un gen rhabdovírico N, P, M, G o L. Una construcción de ácido nucleico puede tener al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000.

6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 250.000, 500.000, 750.000, hasta al ^menos1^.000.000 ^{nucleótidos de longitud, así como construcciones de tamaño mayor, hasta e incluyendo tamaños}cromosómicos (incluyendo todas las longitudes intermedias e intervalos intermedios). Se entenderá fácilmente que “longitudes intermedias” e “intervalos intermedios” como se utilizan en el presente documento, significan cualquier longitud o intervalo incluido o entre los valores acotados (es decir, todos los números enteros incluidos y entre dichos valores).

Los segmentos de ácido nucleico que se utilizan en la presente divulgación engloban ácidos nucleicos modificados que codifican polipéptidos modificados. Dichas secuencias pueden aparecer como consecuencia de redundancia de codón y equivalencia funcional que se sabe que se produce naturalmente dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. De manera alternativa, se pueden crear proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que se pueden modificar cambios en la estructura proteica, basándose en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se van a intercambiar. Los cambios diseñados por el ser humano se pueden introducir mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras de la antigenicidad o la falta de la misma de la proteína, para reducir los efectos de toxicidad de la proteína in vivo a un sujeto al que se da la proteína, o para aumentar la eficacia de cualquier tratamiento que implique la proteína o un virus que comprenda dicha proteína.

En otros ciertos aspectos, la divulgación se refiere a segmentos aislados de ácido nucleico y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucleico contigua de entre las que se muestran en las secuencias identificadas en el presente documento. Dichas secuencias, sin embargo, se pueden mutar para obtener un producto proteico cuya actividad se altera con respecto al de tipo silvestre.

También se entenderá que la presente divulgación no se limita a las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos en particular de estas secuencias identificadas. Los vectores recombinantes y segmentos de ácido nucleico aislados pueden por lo tanto incluir de manera distinta regiones codificantes propias de rhabdovirus, regiones codificantes que tienen alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos mayores que no obstante incluyan regiones codificantes de rhabdovirus, o pueden codificar proteínas o péptido que tienen secuencias de aminoácidos variantes.

Los segmentos de ácido nucleico de la presente divulgación pueden codificar proteínas y péptidos de rhabdovirus que son funcionales biológicos equivalentes, o variantes o mutantes de rhabdovirus que aumentan el beneficio terapéutico del virus. Dichas secuencias pueden aparecer como consecuencia de la redundancia del codón y la equivalencia funcional que se sabe que existe de manera natural dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas codificadas. De manera alternativa, las proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes se pueden crear mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que se pueden modificar cambios en la estructura de la proteína, basándose en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se van a intercambiar. Los cambios diseñados por un ser humano se pueden introducir mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras en la unión a las células cancerosas de una proteína vírica. B. Mutagénesis de polinucleótidos rhabdovíricos

En distintos aspectos el polinucleótido de rhabdovirus se puede alterar o mutar. Las alteraciones o mutaciones pueden incluir inserciones, eliminaciones, mutaciones puntuales, inversiones y similares y pueden dar como resultado la modulación, activación y/o inactivación de ciertas proteínas o mecanismos moleculares, así como la alteración de la función, localización, o expresión de un producto genético, en particular dando lugar a un producto genético no funcional. Cuando se emplea, la mutagénesis de un polinucleótido que codifica todo o parte de un rhabdovirus se puede conseguir mediante una variedad de procedimientos mutagénicos convencionales (Sambrook ^{y col.,}2001^{). La mutación es el proceso por el que se producen cambios en la cantidad o estructura de un}organismo. La mutación puede implicar la modificación de la secuencia de nucleótidos de un único gen, bloques de genes o genomas completos. Los cambios en genes únicos pueden ser la consecuencia de mutaciones puntuales que implican la retirada, adición o sustitución de una única base de nucleótido dentro de una secuencia de ADN, o pueden ser la consecuencia de cambios que implican la inserción o eliminación de un gran número de nucleótidos.

1. Mutagénesis aleatoria

a. Mutagénesis de inserción

La mutagénesis de inserción se basa en la inactivación de un gen mediante la inserción de un fragmento de ácido nucleico conocido. Debido a que implica la inserción de algún tipo de fragmento de ácido nucleico, las mutaciones generadas son en general de pérdida de función, más que mutaciones de ganancia de función. Sin embargo, hay varios ejemplos de inserciones que generan mutaciones de ganancia de función. Las mutagénesis de inserción se pueden conseguir utilizando técnicas de biología molecular convencionales.

b. Mutagénesis química

La mutagénesis química ofrece ciertas ventajas, tales como la capacidad de encontrar un intervalo completo de mutaciones con grados de gravedad fenotípica y e s fácil y barata de llevar a cabo. La mayoría de los carcinógenos químicos producen mutaciones en el ADN . El benzo[a]pireno, N-acetoxi-2-acetil aminofluoreno y aflatoxina B1 producen transversiones GC a TA en células bacterianas y de mamífero. El benzo[a]pireno también puede producir sustituciones de bases tales como AT a TA. Los compuestos N-nitrosourea producen transiciones GC a AT. La alquilación de la posición O4 de la timina inducida por exposición a n-nitrosourea da como resultado transiciones de TA a CG.

c. Mutagénesis por radiación

Las moléculas biológicas se degradan por radiación ionizante. La adsorción de la energía incidente da lugar a la formación de iones y radicales libre, y la rotura de algunos enlaces covalentes. La susceptibilidad al daño por radiación aparece bastante variable entre las moléculas, y entre diferentes formas cristalinas de la misma molécula. Depende de la dosis acumulada total, y también sobre la tasa de dosis (ya que una vez que están presentes los radicales libres, el daño molecular que causan depende de su tasa de difusión natural y por lo tanto del tiempo real). El daño se reduce y controla enfriando la muestra cuanto sea posible. La radiación ionizante produce daño del ADN, generalmente proporcional a la tasa de dosis.

En la presente divulgación, la expresión “radiación ionizante” significa una radiación que comprende partículas o fotones que tienen suficiente energía o pueden producir suficiente energía para producir la ionización (ganancia o pérdida de electrones). Una radiación ionizante preferida y ejemplar es una radiación-x. La cantidad de radiación ionizante necesaria en una célula determinada o para una molécula particular depende en general de la naturaleza de esa célula o molécula y la naturaleza de la diana de la mutación. Los medios para determinar una cantidad eficaz de radiación se conocen bien en la técnica.

d. Mutagénesis de exploración in vitro

La mutagénesis aleatoria también se puede introducir utilizando una PCR con tendencia al error. La tasa de mutagénesis se puede aumentar llevando a cabo la PCR en múltiples tubos con dilución de las matrices. Una técnica de mutagénesis particularmente útil es la mutagénesis por exploración de alanina en la que se sustituyen varios restos individualmente con el aminoácido alanina de manera que el efecto de pérdida de interacciones de cadenas laterales se puede determinar, mientras que se minimiza el riesgo de perturbaciones a gran escala en la conformación proteica (Cunningham y col., 1989).

La mutagénesis por saturación de exploración in vitro proporciona un procedimiento rápido para la obtención de una gran cantidad de información estructura-función, que incluye: (i) la identificación de restos que modula la especificidad de unión al ligando, (ii) un mejor entendimiento de la unión al aligando basándose en la identificación de los aminoácidos que mantienen la actividad y los que anulan la actividad en una localización determinada (iii) una evaluación de la plasticidad completa de un sitio activo o subdominio proteico, (iv) identificación de sustituciones de aminoácidos que dan como resultado un aumento de la unión.

2. Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis específica del sitio guiada por la estructura representa una herramienta potente para la disección y modificación de las interacciones proteína-ligando (Wells, 1996; Braisted y col., 1996). La técnica proporciona la preparación y ensayo de variantes de secuencia introduciendo uno más cambios de secuencia de nucleótidos en un ADN seleccionado.

C. Vectores

Para generar mutaciones en un genoma de rhabdovirus, se pueden codificar polipéptidos nativos y modificados mediante una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término “vector” se utiliza para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico exógena para su introducción en una célula donde se pueda replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “exógena”, que significa que es ajena a la célula en la que el vector se va a introducir o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula, pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que el ácido nucleico no se encuentra comúnmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus de animales y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la técnica estaría equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes convencionales, que se describen en Sambrook y col. (2001) y Ausubel y col. (1994).

Además de codificar el polipéptido modificado tal como la proteína N, proteína P, proteína M, proteína G o proteína L modificadas, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas no modificadas tal como un marcador o molécula de direccionamiento. Los vectores útiles que codifican dichas proteínas de fusión incluyen vectores pIN (Inouye y col., 1985), vectores que codifican un tramo de histidina, y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles con glutatión S-transferasa (GST) para la purificación y separación o escisión posteriores. Una molécula de direccionamiento es la que dirige el polipéptido modificado a un órgano, tejido, célula u otra localización particular en el cuerpo de un sujeto. De manera alternativa, la molécula de direccionamiento altera el tropismo de un organismo, tal como un rhabdovirus por ciertos tipos celulares, por ejemplo, células cancerosas. La expresión “vector de expresión” se refiere a un vector que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto genético capaz de ser transcrito. En algunos casos las moléculas de ARN se traducen en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias de Control”, que se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Además, para controlar las secuencias que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven para otras funciones, así como se describe infra.

1. Promotores y Amplificadores

Un “promotor” es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico cuyo inicio y tasa de transcripción se controlan. Puede contener elementos genéticos que se unen a proteínas reguladoras y moléculas, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las frases “posicionadas operativamente”, “emparejadas operativamente”, “unidas operativamente”, “bajo control”, y “bajo el control transcripcional” significa que un promotor está en una localización funcional correcta y/u orientación en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio y/o expresión de esa secuencia. Un promotor se puede utilizar o no en conjunción con un “amplificación”, que se refiere a una secuencia reguladora cis-actuante implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser el que se asocia naturalmente con un gen o secuencia, como se puede obtener aislando las secuencias 5' no codificantes localizadas corriente arriba del segmento codificante y/o exón. Se puede hacer referencia a dicho promotor como “endógeno”. De manera similar un amplificador puede asociarse naturalmente a una secuencia de ácido nucleico, que se localiza corriente abajo o corriente arriba de esa secuencia. De manera alternativa, se pueden conseguir ciertas ventajas posicionando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no se asocia normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un amplificador recombinante o heterólogo se refiere también a un amplificador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores y amplificadores pueden incluir promotores o amplificadores de otros genes, y promotores o amplificadores aislados de cualquier otra célula procariota, víricos o eucariota, y promotores o amplificadores que no son de “origen natural”, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras, y/o mutaciones que alteran la expresión.

Además de producir las secuencias de ácido nucleico de promotores y amplificadores sintéticamente, las secuencias pueden producirse utilizando la clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo la PCR™, en conexión con las composiciones desveladas en el presente documento (véase la Patente de EE. UU. 4.683.202, Patente de EE. UU. 5.928.906). Además, se contemplan las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos, y similares, que también se pueden emplear.

De manera natural, puede ser importante emplear un promotor y/o amplificador que dirija eficazmente la expresión del segmento de a Dn en el tipo celular, orgánulo, y organismo escogido para la expresión. Los expertos en la técnica de biología molecular conocen en general el uso de promotores, amplificadores, y combinaciones de tipo celular para la expresión proteica, por ejemplo, véase Sambrook y col. (2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido, selectivo de la célula (es decir, más activo en un tipo celular en comparación con otro), inducible, y/o útil en las condiciones adecuadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ácido nucleico introducido, tal como sea ventajoso en la producción a gran escala de proteína y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo y endógeno.

Se pueden emplear varios elementos/promotores, en el contexto de la presente invención, para regular la expresión de un gen. Esta lista no pretende ser exhaustiva de todos los elementos posibles implicados en la promoción de la expresión, sino simplemente, ser ejemplares de los mismos. también se proporcionan ejemplos de elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que se puede activar en respuesta a un estímulo específico. El promotor/amplificador (Referencias) incluyen: Cadena pesada de inmunoglobulina (Banerji y col., 1983; Gilles y col., 1983; Grosschedl y col., 1985; Atchinson y col., 1986, 1987; Imler y col., 1987; Weinberger y col., 1984; Kiledjian y col., 1988; Porton y col.; 1990); cadena ligera de inmunoglobulina (Queen y col., 1983; Picard y col., 1984); Receptor de linfocitos T (Luria y col., 1987; Winoto y col., 1989; Redondo y col.; 1990); HLA DQa y/o DQp (Sullivan y col., 1987); Interferón p (Goodbourn y col., 1986; Fujita y col., 1987; Goodbourn y col., 1988); Interleucina-2 (Greene y col., 1989); receptor de Interleucina-2 (Greene y col., 1989; Lin y col., 1990); MHC Clase II 5 (Koch y col., 1989); MhC Clase II HLA-DRa (Sherman y col., 1989); p-Actina (Kawamoto y col., 1988; Ng y col.; 1989) ; creatina cinasa muscular (MCK) (Jaynes y col., 1988; Horlick y col., 1989; Johnson y col., 1989); Prealbúmina (Transtiretina) (Costa y col., 1988); Elastasa I (Omitz y col., 1987); Metalotioneína (MTII) (Karin y col., 1987; Culotta y col., 1989); Colagenasa (Pinkert y col., 1987; Angel y col., 1987); Albúmina (Pinkert y col., 1987; Tronche y col., 1989, 1990); a-Fetoproteína (Godbout y col., 1988; Campere y col., 1989); Y-Globina (Bodine y col., 1987; Perez-Stable y col., 1990); p-Globina (Trudel y col., 1987); c-fos (Cohen y col., 1987); c-HA-ras (Triesman, 1986; Deschamps y col., 1985); Insulina (Edlund y col., 1985); molécula de adhesión celular neural (NCAM) (Hirsh y col., 1990) ; a1-Antitripaína (Latimer y col., 1990); H2B (TH2B) Histona (Hwang y col., 1990); Mouse y/o colágeno Tipo I (Ripe y col., 1989); proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang y col., 1989); Hormona de crecimiento de la rata (Larsen y col., 1986); Amiloide A sérico humano (SAA) (Edbrooke y col., 1989); Troponina I (TN I) (Yutzey y col., 1989); Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Pech y col., 1989); Distrofia muscular de Duchenne (Klamut y col., 1990); SV40 (Banerji y col., 1981; Moreau y col., 1981; Sleigh y col., 1985; Firak y col., 1986; Herr y col., 1986; Imbra y col., 1986; Kadesch y col., 1986; Wang y col., 1986; Ondek y col., 1987; Kuhl y col., 1987; Schaffner y col., 1988); Polioma (Swartzendruber y col., 1975; Vasseur y col., 1980; Katinka y col., 1980, 1981; Tyndell y col., 1981; Dandolo y col., 1983; de Villiers y col., 1984; Hen y col., 1986; Satake y col., 1988; Campbell y col., 1988); Retroviruses (Kriegler y col., 1982, 1983; Levinson y col., 1982; Kriegler y col., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze y col., 1986; Miksicek y col., 1986; Celander y col., 1987; Thiesen y col., 1988; Celander y col., 1988; Chol y col., 1988; Reisman y col., 1989); virus del papiloma (Campo y col., 1983; Lusky y col., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz y col., 1985; Lusky y col., 1986; Cripe y col., 1987; Gloss y col., 1987; Hirochika y col., 1987; Stephens y col., 1987); virus de Hepatitis B (Bulla y col., 1986; Jameel y col., 1986; Shaul y col., 1987; Spandau y col., 1988; Vannice y col., 1988); virus de inmunodeficiencia humana (Muesing y col., 1987; Hauber y col., 1988; Jakobovits y col., 1988; Feng y col., 1988; Takebe y col., 1988; Rosen y col., 1988; Berkhout y col., 1989; Laspia y col., 1989; Sharp y col., 1989; Braddock y col., 1989); Citomegalovirus (CMV) (Weber y col., 1984; Boshart y col., 1985; Foecking y col., 1986); y virus de leucemia del mono Gibón (Holbrook y col., 1987; Quinn y col., 1989).

Los elementos inducibles (Elemento/inductor (Referencias)) incluyen: MT II/Éster de Forbol (TFA), metales pesados (Palmiter y col., 1982; Haslinger y col., 1985; Searle y col., 1985; Stuart y col., 1985; Imagawa y col., 1987, Karin y col., 1987; Angel y col., 1987b; McNeall y col., 1989); MMTV (virus del tumor mamaior de ratón)/Glucocorticoides (Huang y col., 1981; Lee y col., 1981; Majors y col., 1983; Chandler y col., 1983; Lee y col., 1984; Ponta y col., 1985; Sakai y col., 1988); p-Interferon/poli(rI)x, poli(rc) (Tavernier y col., 1983); Adenovirus 5 E2/ElA (Imperiale y col., 1984); Colagenasa/ Éster de Forbol (T^pA) (Angel y col., 1987a); Estromelisina/Forbol Ester (TPA) (Angel y col., 1987b); SV40/Forbol Ester (TPA) (Angel y col., 1987b); Gen MX Murino /Interferón, virus de enfermedad de Newcastle (Hug y col., 1988); GRP78 Gene/A23187 (Resendez y col., 1988); a-2-Macroglobulina/IL-6 (Kunz y col., 1989); Vimentina/Suero (Rittling y col., 1989); Gen de MHC Clase I H-2Kb/Interferón (Blanar y col., 1989); HSP7o/ElA, Antígeno T grande de SV40 (Taylor y col., 1989, 1990a, 1990b); Proliferina/ Éster de Forbol -T^pA (Mordacq y col., 1989); Factor de necrosis tumoral/PMA (Hensel y col., 1989); y Gen a de la hormona estimulante de tiroides /Hormona tiroidea (Chatterjee y col., 1989).

La identidad de promotores o elementos específicos de tejido o selectivos de tejido (es decir, promotores que tienen una mayor actividad en una célula en comparación con otra), así como los ensayos para caracterizar su actividad, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de dichas regiones incluyen el gen LIMK2 humano (Nomoto y col. 1999), gen del receptor 2 de somatostatina (Kraus y col., 1998), gen de unión al ácido retinoico del epidídimo murino (Lareyre y col., 1999), CD4 humano (Zhao-Emonet y col., 1998), alfa 2 (XI) colágeno de ratón (Tsumaki, y col., 1998), D1A gen receptor de dopamina (Lee, y col., 1997), Factor II de crecimiento tipo insulina (Wu y col., 1997), molécula-1 de adhesión celular de plaquetas humana (Almendro y col., 1996), y el promotor SM22a. Los promotores víricos adicionales, promotores/amplificadores celulares y promotores/amplificadores inducibles que se pueden utilizar en combinación con la presente divulgación se enumeran en el presente documento. Adicionalmente, también se podría utilizar cualquier combinación de promotor/amplificador (como por la Base de datos de promotores de eucariotas EPDB) para dirigir la expresión de genes estructurales que codifican enzimas que procesan oligosacáridos, proteínas accesorias de plegamiento proteico, proteínas de marcador genético o una proteína heteróloga de interés. De manera alternativa, se puede emplear un promotor específico de tejido para la terapia genética del cáncer (Tabla 2) o el direccionamiento a tumores (Tabla 3) con las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación.

Tabla 2. Promotores específicos de tejido candidatos para la terapia genética

(continuación)

Tabla 3. Promotores candidatos para su uso con un direccionamiento específico de tejido de tumores

(continuación)

2. Señales de inicio de sitios internos de unión al ribosoma

También puede ser necesaria una señal de inicio para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede que sea necesario proporcionar las señales de control traduccional exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto habituado en la técnica sería capaz fácilmente de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Se sabe bien que el codón de inicio debe estar “en fase” con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Las señales de control traduccional exógenas y codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede aumentar mediante la inclusión de elementos amplificadores de la transcripción apropiados.

En ciertos aspectos de la divulgación, el uso de elementos de sitios internos de entrada en el ribosoma (IRES) se utilizan para crear mensajes multigenéticos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de sobrepasar el modelo de exploración del ribosoma de traducción dependiente de la protección metilada 5' y comienza la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES se pueden unir a fases de lectura abierta heterólogas. Se pueden transcribir múltiples fases de lectura abierta a la vez, cada una separada por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Gracias al elemento IRES cada fase de lectura abierta es accesible a los ribosomas para una traducción eficaz. Se pueden expresar eficazmente múltiples genes utilizando un único promotor/amplificador para transcribir un único mensaje (véase las Patentes de EE. UU. 5.925.565 y 5.935.819).

3. Múltiples sitios de clonación

Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción cualquiera de los cuales se puede utilizar junto con una tecnología recombinante convencional para digerir el vector (Véase Carbonelli y col., 1999, Levenson y col., 1998, y Cocea, 1997). “Digestión por enzimas de restricción” se refiere a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solo en localizaciones específicas de la molécula de ácido nucleico. Muchas d estas enzimas de restricción están disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas se entiende ampliamente por los expertos en la técnica. Frecuentemente, se linealiza un vector o fragmento utilizando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para permitir que se liguen secuencias externas al vector. “Ligadura” se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden ser contiguos entre ellos o no. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligadura son bien conocidas por los expertos en la técnica de la tecnología recombinante.

4. Señales de terminación

Los vectores o construcciones de la presente invención comprenderán en general al menos una señal de terminación. Una “señal de terminación” o “terminador” está comprendido por secuencias de ARN implicadas en la terminación específica de una transcripción de ARN por una ARN polimerasas. Por tanto, en ciertos aspectos se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de una transcripción de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para conseguir niveles deseados de mensaje.

En los virus ARN de sentido negativo, incluyendo los rhabdovirus, la terminación se define por un motivo del ARN. Los terminadores contemplados para su uso en la invención incluyen cualquier terminador de la transcripción conocido descrito en el presente documento o conocidos por los expertos habituados en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, tales como, por ejemplo, el terminador de la hormona de crecimiento bovina o las secuencias de terminación víricas, tales como, por ejemplo, el terminador de SV40. En ciertos aspectos, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia que se pueda transcribir o traducir, tal como debido a un truncado de secuencia.

5. Señales de poliadenilación

En la expresión, particularmente en la expresión en eucariotas, se incluirá normalmente una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada de la transcripción. Se cree que naturaleza de la señal de poliadenilación no es crucial para la práctica satisfactoria de la divulgación y/o se puede utilizar cualquier secuencia. Los aspectos preferidos incluyen la señal de poliadenilación del SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, que son convenientes y/o se sabe que funcionan bien en distintas células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad de la transcripción o puede facilitar el transporte citoplásmico.

6. Orígenes de replicación

Con el fin de propagar un vector en una célula huésped, puede contener uno o más orígenes de replicación (a menudo denominados “ori”), que es una secuencia de ácido nucleico que la que se inicia la replicación. De manera alternativa se puede emplear una secuencia que se replica autónomamente (ARS) si la célula huésped es una levadura.

7. Marcadores que se pueden seleccionar y explorar

En ciertos aspectos de la divulgación, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la divulgación se pueden identificar in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores darían lugar a un cambio identificable en la célula que permita la identificación fácil de las células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador de selección es el que otorga una propiedad que permite la selección. Un marcador genético positivo es el que en presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador genético negativo es el que su presencia evita su selección. Un ejemplo de marcador genético positivo es un marcador de resistencia a fármacos.

Habitualmente la inclusión de un marcado genético de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, son útiles los genes que dan lugar a una resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol como marcadores genéticos. Además de los marcadores que dan lugar a un fenotipo que permite la discriminación de los transformantes basándose en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyen los marcadores que puede explorarse tales como la GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. De manera alternativa, se pueden utilizar marcadores que se pueden explorar tales como la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la técnica también conocería cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente en conjunción con el análisis FACS. No se cree que el marcador que se utilice sea importante, a condición de que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifique un producto genético. Los ejemplos adicionales de marcadores que se pueden seleccionar y explorar son bien conocidos por el experto en la técnica. D. Células huésped

Como se utiliza en el presente documento, los términos “célula”, “línea celular”, y “cultivo celular” se pueden utilizar de manera intercambiable. Todos estos términos incluyen también su progenie, que son todas y cada una de las generaciones siguientes. Se entiende que toda progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, una “célula huésped” se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluyen cualquier organismo que se pueda transformar que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped, puede utilizarse y se ha utilizado como receptor de vectores o virus (que no se califica como vector si no expresa polipéptidos exógenos). Una célula huésped puede estar “transfectada” o “transformada”, que se refiere a un proceso por el que el ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia que codifica una proteína modificada, se transfiere o introduce en la célula huésped. Una célula transformada incluye el sujeto celular primario y su progenie.

Las células huésped se puede derivar de procariotas o eucariotas, incluyendo células de levadura, células de insecto y células de mamífero, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector. Están disponibles numerosas líneas celulares y cultivos para su uso como células huésped, y se pueden obtener en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que es una organización que sirve como archivo de cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). Un huésped apropiado puede determinarlo un experto en la técnica basándose en la estructura del vector y el resultado deseado. Por ejemplo, se puede introducir un plásmido o cósmido en una célula huésped procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas utilizadas como células huésped para la replicación y/o ^{expresión de un vector incluyen DH5a, JM109, y KC}8^{, así como varios huéspedes bacterianos disponibles en el}mercado tales como células competentes SURE® y SOLOPACK™ Gold Cells (STRATAGENE®, La Jolla, CA). De manera alternativa se podrían utilizar células bacterianas tales como E. coli LE392 como células huésped para virus fagos. Las células de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, y Pichia pastoris.

Ejemplos de células huésped eucariotas para la replicación y/o expresión de un vector incluyen HeLa, NÍH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Muchas células huésped de distintos tipos celulares y organismos están disponibles y son conocidas por un experto en la técnica. De manera similar, se puede utilizar un vector vírico en conjunción con cualquier célula huésped eucariota o procariota, particularmente una que sea permisiva a la replicación o expresión del vector.

Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que permitan que se replique o se exprese en células tanto procariotas como eucariotas. Un experto en la técnica entendería adicionalmente las condiciones en las que incubar todas las células huésped descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se entienden y conocen técnicas y condiciones que permitirían la producción de vectores a gran escala, así como la producción de ácidos nucleicos codificados por los vectores y sus polipéptidos, proteínas, o péptidos equivalentes.

E. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos todas o parte de las composiciones expuestas anteriormente. Los sistemas basados en procariotas y eucariotas pueden emplearse para su uso con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipéptidos, proteínas o péptidos equivalentes. Muchos de dichos sistemas están disponibles en el mercado y ampliamente.

El sistema insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión proteica de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las Patentes de EE. UU. 5.871.986 y 4.879.236, y se puede comprar, por ejemplo, con los nombres MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM de CLONTECH®.

Además de los sistemas de expresión desvelados de la invención, otros sistemas de expresión incluyen el STRATAGENE®'s COMPLETE CONTROL™ Inducible Mammalian Expression System, que implica un ecepotr inducible ecdysone sintético o su Sistema de Expresión pET, una sistema de expresión en E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible en INVITROGEN®, que tiene el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión en mamíferos indicuible que utiliza un promotor CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión en levaduras llamado Sistema de Expresión metanólica en Pichia, que se ha diseñado para la producción a alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. Un experto en la técnica sabría como expresar un vector, tal como una construccioon de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido equivalente.

F. Detección de ácidos nucleicos

Además de su uso en el direccionamiento de la expresión de proteínas, polipéptidos y/o péptidos de poxvirus, las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento tienen una variedad de otros usos. Por ejemplo, son útiles como sondas o cebadores para las realizaciones que implican la hibridación de ácidos nucleicos. Se pueden utilizar en procedimientos de diagnóstico y exploración de la presente divulgación. La detección de ácidos nucleicos que codifican rhabdovirus o moduladores polipeptídicos de rhabdovirus están englobados en la divulgación.

1. Hibridación

El uso de una sonda o cebador de entre 13 y 100 nucleótidos, preferentemente entre 17 y 100 nucleótidos de ^{longitud, o en algunos aspectos de la invención de hasta}1-2 ^{kilobases o más de longitud, permite la formación de}una molécula doble que es tanto estable como selectiva. Se prefieren generalmente las moléculas que tienen ^{secuencias complementarias sobre tramos contiguos mayores de}20 ^{bases de longitud, para aumentar la estabilidad}y/o selectividad de las moléculas híbridas obtenidas. Se preferirá en general diseñar moléculas de ácido nucleico para la hibridación que tengan una o más secuencias complementarias de 20 a 30 nucleótidos, o incluso más largas si se desea. Dichos fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante.

En consecuencias, las secuencias de nucleótido de la divulgación pueden utilizarse por su capacidad para formar selectivamente moléculas dobles con tramos complementarios de ADN y/o ARN o proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o ARN a partir de muestras. Dependiendo de la aplicación planeada, sería deseable emplear condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda o cebadores para la secuencia diana.

Para las aplicaciones que necesitan una alta selectividad, se deseará normalmente emplear condiciones de alta rigurosidad para formar los híbridos. Por ejemplo, condiciones de relativamente baja salinidad y/o alta temperatura, tal como las provistas por aproximadamente un 0,02 M a aproximadamente 0,10 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran pocas, si alguna, faltas de coincidencia entre la sonda o los cebadores y la matriz o cadena diana y serían particularmente adecuadas para el aislamiento de genes específicos o para la detección de transcripciones de ARNm específicas. Se aprecia en general que las condiciones pueden dar más rigurosidad por la adición de cantidades crecientes de formamida. Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, se aprecia que se prefieren condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones la hibridación puede producirse incluso entre las secuencias de cadenas de hibridación que no son perfectamente complementarias, sino que ha y faltas de coincidencia en una o más posiciones. Las condiciones pueden dar menos rigurosidad aumentando la concentración de sal y/o disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, las condiciones de rigurosidad media se podrían proporcionar con aproximadamente 0,1 a 0,25 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 55 °C, mientras que unas condiciones de baja rigurosidad se pueden proporcionar con aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían desde aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. Las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente dependiendo de los resultados deseados.

En otros aspectos, la hibridación se puede conseguir en condiciones de, por ejemplo, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 1,0 mM de ditiotreitol, a temperaturas entre aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C. Otras condiciones de hibridación que se utilizan incluyen aproximadamente 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, a temperaturas que varían desde aproximadamente 40 °C a aproximadamente 72 °C.

En ciertos aspectos, sería ventajoso emplear ácidos nucleicos de secuencias definidas de la presente invención en combinación con un medio apropiado tal como un marcador, para la determinación de la hibridación. Se conocen en la técnica una amplia variedad de medios indicadores apropiados, que incluyen fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, que son capaces de detectarse. En aspectos preferidos, se puede desear emplear un marcador fluorescente o un marcador enzimático tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de un reactivo radioactivo u otro ambientalmente indeseable. En el caso de marcadores enzimáticos, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que se pueden emplear para proporcionar un medio de detección que sea visible o detectable espectrofotométricamente, para identificar una hibridación específica con muestras que contengan ácidos nucleicos complementarios.

En general, se planea que las sondas o cebadores descritos en el presente documento serán útiles como reactivos en una solución de hibridación, como en una PCR™, para la detección de la expresión de genes correspondientes, así como en aspectos que emplean una fase sólida. Aquí, el ensayo de ADN (o ARN) se adsorbe o se fija de otra manera a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico de cadena sencilla fijado se somete entonces a hibridación con sondas seleccionadas en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares (dependiendo, por ejemplo, del contenido en G+C, tipo de ácido nucleico diana, fuente del ácido nucleico, tamaño de la sonda de hibridación, etc.). La optimización de las condiciones de hibridación para una aplicación particular de interés es bien conocida por los expertos en la técnica. Después del lavado de las moléculas hibridadas para retirar las moléculas de sonda unidas no específicamente, se detecta la hibridación /o se cuantifica, determinando la cantidad de marcador unido. Los procedimientos de hibridación en fase sólida representativos se desvelan en las Patentes de EE. UU. 5.843.663. 5.900.481 y 5.919.626. Otros procedimientos de hibridación que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención se desvelan en las Patentes de EE. UU.

5.849.481. 5.849.486 y 5.851.772.

2. Amplificación de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos utilizados como matriz para la amplificación se pueden aislar de células, tejidos u otras muestras de acuerdo con metodologías convencionales (Sambrook y col., 2001). En ciertas realizaciones, se llevan a cabo análisis sobre homogenados de células completas o tejidos o muestras de fluidos biológicos sin una purificación sustancial del ácido nucleico matriz. El ácido nucleico pquede ser un ADN genómico o un ARN celular completo o fraccionado. Cuando se utiliza un ARN, puede que se desee convertir primero el ARN en un ADN complementario.

El término “cebador” como se utiliza en el presente documento, significa que engloba cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico que surge en un procedimiento dependiente de la matriz. Normalmente, los cebadores son oligonucleótidos de desde diez a veinte y/o treinta pares de bases de longitud, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden prorpocioanr en forma de cadena doble y/o cadena sencilla, aunque se prefiere la forma de cadena sencilla.

Los pares de cebadores diseñados para hibridarse selectivamente con los ácidos nucelcios correspondientes a secuencias de los genes identificados en el presentete documento se ponen en ocnt acto con el ácido nucleico diana en condiciones que permitan la hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada se pueden seleccionar condiciones de hibridación de alta rigurosidad que solo permitirá la hibridación a secuencias que sean completamente complementarias a los cebadpres. En otros aspectos, la hibridación se puede producir econ una rigurosidad reducida para permitir la amplificación de ácidos nucleicos que contengan una o más faltas de coincidencia con las secuencias de cebador. Una vez hibridado, el complejo cebador matriz se pone en ocnt acto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente de la matriz. Se llevan a cabo múltiples rondas de amplificación, a las que también se hace referencia como “ciclos” hasta que se produce una suficiente cantidad del producto de amplificación.

Varios procedimientos dependientes de la matriz están disponibles para amplificar las secuencias de oligonucleótidos presentes en una matriz de muestra determinada. Uno de los procedimientos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (a la que se hace referencia como PCR™) que se describe en detalle en las Patentes de EE. UU. 4.683.195. 4.683.202 y 4.800.159, y in Innis y col., 1988.

Se puede llevar a cabo un procedimiento de amplificación por PCR™ de transcriptasa inversa para cuantificar la cantidad de ARNm amplificado y son bien conocidos (véase Sambrook y col., 2001; documento WO 90/07641; y Patente de EE. UU. 5.882.864).

Otro procedimiento para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa (“LCR”) desvelada en la Solicitud europea N.° 320308. La Patente de EE. UU. 4.883.750 describe un procedimiento similar a la LCR para la unión de pares de sondas a una secuencia diana. También se puede utlziar un procedimiento basado en la PCR™ y ensayo de ligasa de oligonucleótidos (OLA) desvelado en la Patente de EE. UU 5.912.148 Los procedimientos alternativos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención se desvelan en las Patentes de EE. UU. 5.843.650. 5.846.709. 5.846.783. 5.849.546. 5.849.497. 5.849.547.

5.858.652. 5.866.366. 5.916.776. 5.922.574. 5.928.905. 5.928.906. 5.932.451. 5.935.825. 5.939.291 y 5.942.391, Solicitud GB N.° 2202 328, y en la Solicitud PCT N.° PCT/US89/01025.La Qbeta replicasa, dsecrita en la Solicitud PCT N.° PCT/US87/00880, también se puede utilizar como un procedimiento de amplificación de la presente invención. La amplificación isotérmica como se describe en Walker y col. (1992) también se puede utilizar. Así como la Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), desvelada en la Patente de EE. UU. 5.916.779.

Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), que incluyen la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh y col., 1989; Solicitud PCT WO 88/10315). Solicitud europea N.° 329 822 desvela un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que implica la síntesis cíclica de ARN de cadena sencilla (“ssARN”), ssADN, y ADN de cadena doble (dsADN), que se puede utilizar de acuerdo con la presente invención.

La solicitud PCT WO 89/06700 desvela un esquema de amplificación de ácido nucleico basado en la hibridación de una región promotora/secuencia cebadora con un ADN de cadena sencilla diana (“ssADN”) seguido por la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros procedimientos de amplificación incluyen “RACE” y “PCR de un lado” (Frohman, 1990; Ohara y col., 1989).

3. Detección de ácidos nucleicos

A continuación de cualquier amplificación, puede ser deseable separar y/o aislar el producto de amplificación de la matriz y el exceso de cebadores. En un aspecto los productos de amplificación se separan por electroforesis en agarosa, agarosa-acrilamida, o en gel de poliacrilamida utilizando procedimientos convencionales (Sambrook y col., 2001^).

La separación de ácidos nucleicos también se puede efectuar por técnicas cromatográficas conocidas en la técnica. Hay muchos tipos de cromatografía que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, incluyendo la adsorción, partición, intercambio iónico, hidroxilapatita, filtro molecular, fase inversa, columna, papel, capa fina y cromatografía de gases, así como HPLC.

Los procedimientos de visualización típicos incluyen la tinción de un gel con bromuro de etidio y la visualización de las bandas bajo luz UV. De manera alternativa, si los productos de amplificación están marcados íntegramente con nucleótidos marcados radio o fluorométricamente, los productos de amplificación separados se pueden exponer a una película de rayos X o visualizarse en un espectro de excitación apropiado.

En aspectos particulares, la detección es transferencia de Southern e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas que implican la transferencia de Southern son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase Sambrook y col., 2001). Un ejemplo de lo anterior se describe en la Patente de EE. u U. 5.279.721, que desvela un aparato y un procedimiento automático para la electroforesis y la transferencia de ácidos nucleicos.

Otros procedimientos de detección de ácidos nucleicos que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención se desvelan en las Patentes de EE. UU. 5.840.873. 5.843.640. 5.843.651. 5.846.708. 5.846.717. 5.846.726.

5.846.729. 5.849.487. 5.853.990. 5.853.992. 5.853.993. 5.856.092. 5.861.244. 5.863.732. 5.863.753. 5.866.331.

5.905.024. 5.910.407. 5.912.124. 5.912.145. 5.919.630. 5.925.517. 5.928.862. 5.928.869. 5.929.227. 5.932.413 y 5.935.791.

4. Otros ensayos

Se pueden utilizar otros procedimientos para la exploración genética dentro del ámbito de la presente divulgación, por ejemplo, para detectar mutaciones en muestras de ácidos nucleicos genómicos, ADNc y/o ARN. Los procedimientos que se utilizan para detectar mutaciones puntuales incluyen la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (“DGGE”), análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (“RFLP”), procedimientos de escisión química o enzimática, secuenciación directa de las regiones diana amplificadas por PCR™ (véase anteriormente), análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (“SSCP”) y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento de exploración para mutaciones puntuales se basa en la escisión por RNasa de malas coincidencias de pares de bases en ARN/a Dn o ARN/ARN heterodúplex. Como se utiliza en el presente documento “mala coincidencia” se define como una región de uno o más nucleótidos no emparejados o mal emparejados en una molécula de cadena doble de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN. Esta definición incluye por lo tanto las malas coincidencias debido a mutaciones de inserción/eliminación, así como mutaciones puntuales de bases múltiples o sencillas (por ejemplo, véase la Patente de EE. UU. 4.946.773. Los procedimientos alternativos para la detección de mutaciones de eliminación, inserción o sustitución que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención se desvelan en las Patentes de EE. UU. 5.849.483. 5.851.770.

5.866.337. 5.925.525 y 5.928.870.

G. Procedimientos de trasferencia genética

Los procedimientos adecuados para el suministro de ácido nucleico para efectuar la expresión de las composiciones de la presente divulgación se cree que incluyen virtualmente cualquier procedimiento por el cual un ácido nucleico

(por ejemplo, un ADN o ARN incluyendo vectores víricos y no víricos) se puede introducir en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como es conocido por un experto en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a l suministro directo de ácido nucleico tal como por inyección (Patentes de EE. UU. 5.994.624. 5.981.274. 5.945.100. 5.780.448. 5.736.524. 5.702.932. 5.656.610.

5.589.466 y 5.580.859), incluyendo la microinyección (Harland y Weintraub, 1985; Patente de EE. UU. 5.789.215); electroporación (Patente de EE. UU. 5.384.253); por precipitación en fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973;

Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); utilizando dextrano DEAE seguido por polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982;

Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991); por bombardeo con microproyectiles (Solicitudes PCT N.° WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de EE. UU. 5.610.042; 5.322.783 5.563.055. 5.550.318. 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990;

Patentes de EE. UU. 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE. UU 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación de protoplastos mediada por PEEG (Omirulleh y col., 1993; Patentes de EE. UU. 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985). Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, se pueden transformar estable o transitoriamente orgánulos, células, tejidos u organismos.

H. Componentes y restos lipídicos

En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico, una molécula de aminoácido, tal como un péptido, u otro compuesto de molécula pequeña.

En cualquiera de los aspectos expuestos en el presente documento, la molécula puede ser un polipéptido de rhabdovirus o un modulador polipeptídico de rhabdovirus, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido de rhabdovirus, o alternativamente, una molécula de ácido nucleico que codifica todo o parte del modulador polipeptídico de rhabdovirus. Un lípido es una sustancia que es característicamente insoluble en agua y extraíble con un disolvente orgánico. Los compuestos distintos de los descritos específicamente en el presente documento se entienden por el experto en la técnica como lípidos, y están englobados en las composiciones y procedimientos de la presente divulgación. Un componente lipídico y no lipídico se pueden unir entre ellos sea covalente o no covalentemente.

Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el ser humano). Sin embargo, un lípido normalmente es una sustancia biológica. Los lípidos biológicos se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, glicoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos unidos por un éster y un éter y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o molécula de aminoácido, tal como un péptido, asociado con un lípido se puede dispersar en una solución que contiene un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente a un lípido, estar contenido como una suspensión en un lípido o asociarse de otra manera con un lípido. Un lípido o composición asociada con un virus/lípido de la presente invención no se limita a cualquier estructura en particular. Por ejemplo, pueden estar simplemente intercalados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes ni en tamaño ni en forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura “colapsada”. En otro ejemplo no limitante, también se contempla un complejo lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-virus.

En ciertos aspectos, una composición lipídica puede comprender aproximadamente un 1 %, aproximadamente un

^{2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 % aproximadamente un 5 %, aproximadamente un}6 ^{%, aproximadamente un 7%, aproximadamente un}8^{%, aproximadamente un 9%, aproximadamente un}10^{%, aproximadamente un}11 ^{%, aproximadamente un}12 ^{%, aproximadamente un 13%, aproximadamente un 14%,}aproximadamente un 15%, aproximadamente un 16%, aproximadamente un 17%, aproximadamente un 18% ^{aproximadamente un 19%,}20^{%, aproximadamente un}21 ^{%, aproximadamente un}22 aproximadamente un 23 %, aproximadamente un 24 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 26 aproximadamente un 27 %, aproximadamente un 28 %, aproximadamente un 29 %, aproximadamente un 30 aproximadamente un 31 %, aproximadamente un 32 %, aproximadamente un 33 %, aproximadamente un 34 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 36 %, aproximadamente un 37 %, aproximadamente un 38 %, aproximadamente un 39 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 41 %, aproximadamente un 42 %, aproximadamente un 43 %, aproximadamente un 44 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 46 %, aproximadamente un 47 %, aproximadamente un 48 %, aproximadamente un 49 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 51 %, aproximadamente un 52 %, aproximadamente un 53 %, aproximadamente un 54 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 56 %, aproximadamente un 57 %, aproximadamente un 58 %, aproximadamente un 59 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 61 %, aproximadamente un 62 %, ^{aproximadamente un 63 %, aproximadamente un 64 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un}66 ^{%, aproximadamente un 67 %, aproximadamente un}68 ^{%, aproximadamente un 69 %, aproximadamente un 70 %,}aproximadamente un 71 %, aproximadamente un 72 %, aproximadamente un 73 %, aproximadamente un 74 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 76 %, aproximadamente un 77 %, aproximadamente un 78 %, aproximadamente un 79 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 81 %, aproximadamente un 82 %, ^{aproximadamente un 83 %, aproximadamente un 84 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un}86 ^{%, aproximadamente un 87 %, aproximadamente un}88 ^{%, aproximadamente un 89 %, aproximadamente un 90 %,}aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, ^{aproximadamente un 99 %, aproximadamente un}100^{%, o cualquier intervalo derivado de estos, de un lípido}particular, tipo de lípido, o un componente no lipídico tal como un fármaco, proteína, azúcar, ácido nucleico u otro material desvelado en el presente documento o como conoce un experto en la técnica. En un ejemplo no limitante, ^{una composición lipídica puede comprender aproximadamente un}10^{% a aproximadamente un}20^{% de lípidos}neutros, y aproximadamente de un 33 % a aproximadamente un 34 % de un cerebrósido, y aproximadamente un 1 % de colesterol. Por lo tanto, se contempla que las composiciones lipídicas de la presente divulgación pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípido, u otros componentes en cualquier intervalo de combinaciones o porcentajes.

IV. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Y REGÍMENES DE TRATAMIENTO

En un aspecto de la presente divulgación, se contempla un procedimiento de tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa o neoplásica, tal como el cáncer, mediante el suministro de un rhabdovirus no VSV, tal como el virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs, y/o virus Bahía Grande. Ejemplos del cáncer contemplado por el tratamiento incluyen el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas, lesiones preneoplásicas del pulmón, cáncer de colon, melanoma, cáncer de vejiga, y cualquier otro cancero tumor que se pueda tratar, incluyendo los cánceres metastáticos o distribuidos sistémicamente.

Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica, en general, se define como la cantidad suficiente para de manera detectable y repetida enlentece, mejora, reduce, minimiza, o limita la extensión de la enfermedad o sus síntomas. Se pueden aplicar definiciones más rigurosas, incluyendo la eliminación, erradicación o cura de la enfermedad.

Preferentemente, los pacientes tendrán una función adecuada de la médula ósea (definida como un recuento ^{absoluto de granulocitos periféricos de >}2.000 ^/mm3 ^{y un recuento de plaquetas de}100^.000^{/mm3), una función}hepática adecuada (bilirrubina < 1,5 mg/dl) y una función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

A. Administración

Para destruir las células, inhibir el crecimiento celular, inhibir las metástasis, disminuir el tamaño del tumor o tejido, e invertir, parar o reducir de otra manera el fenotipo maligno de las células tumorales, utilizando los procedimientos y composiciones de la presente divulgación, generalmente se pondría en contacto una célula hiperproliferativa o neoplásica con una composición terapéutica tal como un virus o una construcción de expresión que codifique un polipéptido. Las vías de administración variaran, naturalmente, con la localización y naturaleza de la lesión, e incluyen, por ejemplo, la administración y formulación intradérmica, transdérmica, parenteral, intravascular, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, regional, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravesical, intratumoral, por inhalación, perfusión, lavado, inyección directa, alimentaria, y oral.

Para efectuar un beneficio terapéutico con respecto a una enfermedad o afección vascular, se pone en contacto una célula vascular con el compuesto terapéutico. Cualquiera de las formulaciones y vías de administración expuestas con respecto al tratamiento o diagnóstico del cáncer también se pueden emplear con respecto a enfermedades y afecciones vasculares.

La inyección intratumoral, o inyección en el sistema vascular tumoral se contempla para tumores separados, sólidos accesibles. La administración local, regional o sistémica también se contempla, particularmente para los cánceres que se ha determinado que es probable que se diseminen sistémicamente. Las partículas víricas se pueden ^{administrar durante al menos o como mucho en 1,2, 3, 4, 5,}6^{, 7,}8^{, 9, 10 inyecciones.}

En el caso de una intervención quirúrgica, la presente divulgación puede utilizarse preoperativamente, para hacer que un tumor inoperable se someta a resección. De manera alternativa, la presente divulgación se puede utilizar en el momento de la cirugía, y/o después, para tratar la enfermedad residual o metastática. Por ejemplo, un lecho de tumor resecado se puede inyectar o perfundir con una formulación que comprende un polipéptido de rhabdovirus o un rhabdovirus, que puede tener o no una mutación, que sea ventajosa para el tratamiento del cancero células cancerosas. La perfusión puede continuar post-resección, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el sitio de la cirugía. El tratamiento posquirúrgico periódico también se ha planeado.

También se puede aplicar la administración continua si fuera apropiado, por ejemplo, cuando el tumor se escinde y el lecho del tumor se trata para eliminar una enfermedad residual microscópica. El suministro mediante una jeringa o catéter se prefiere. Dicha perfusión continúa puede tener lugar durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 2 horas, a aproximadamente 2-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 días, a aproximadamente 1-2 semanas o más después el inicio del tratamiento. En general la dosis de la composición terapéutica mediante la perfusión continua será equivalente a la que se da mediante una inyección única o múltiples inyecciones, se ajusta durante un periodo de tiempo durante el que se produce la perfusión. Se contempla adicionalmente, que se puede utilizar la perfusión de una extremidad para administrar composiciones terapéuticas de la presente invención, particularmente en el tratamiento de melanomas y sarcomas. Los regímenes de tratamiento pueden variar también, y a menudo dependen del tipo de tumor, localización del tumor, progresión de la enfermedad y salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumor necesitarán un tratamiento más agresivo, mientras que, al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar muchos protocolos agotadores. El médico será el más adecuado para tomar dichas decisiones basándose en la eficacia y toxicidad conocidas (si hay) de las formulaciones terapéuticas.

En ciertos aspectos, el tumor que se va a tatar puede que no sea, al menos inicialmente, resecable. Los tratamientos con construcciones víricas terapéuticas pueden aumentar la operabilidad del tumor debido al encogimiento de los márgenes o por eliminación de ciertas partes particularmente invasivas. A continuación de los tratamientos puede ser posible la resección. Los tratamientos adicionales después de la resección servirán para eliminar la enfermedad microscópica residual en el sitio del tumor.

Un curso típico de tratamiento, para un tumor primario o un lecho post-escisión tumoral, implicará múltiples dosis. Un ^{tratamiento de tumor primario típico implica 1,2, 3, 4, 5,}6^{, o más aplicaciones de dosis durante periodos de 1, 2, 3, 4, 5,}6 ^{semanas o más. Se puede repetir un régimen de dos semanas una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más}veces. Durante el curso de tratamiento, se puede reevaluar la necesidad de completar las dosis planeadas.

Los tratamientos pueden incluir “dosis unitarias”. Una dosis unitaria se define como que contiene una cantidad predeterminada de una composición terapéutico. La cantidad que se va a administrar, y la vía y formulación en particular, están dentro de la técnica de los expertos en las técnicas clínicas. Una dosis unitaria no se necesita administrar como una inyección única, sino que puede comprender una infusión continúa durante un periodo de tiempo fijado. La dosis unitaria de la presente invención puede describirse convenientemente en términos de unidades formadoras de placas (ufp) o partículas víricas para las construcciones víricas. Las dosis unitarias varían ^{desde 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 10}13 ^{ufp o pv y más. De manera alternativa, dependiendo del tipo de virus y el título alcanzable, se suministrarán}1 ^a100^{, 10 a 50,}100-1000^{, o hasta aproximadamente}1 ^x10^4,1 ^x10^5,1 ^x10^6,1 ^x10^7,1 ^x10^8,1 ^x10^9,1 ^x10^10,1 ^x10^11,1 ^x10^12,1 ^x10^13,1 ^x10^{14, o}1 ^x1015 ^{o más partículas}víricas (pv) infecciosas al paciente o las células del paciente.

B. Composiciones y formulaciones inyectables

El procedimiento preferido para el suministro de una construcción de expresión o virus que codifica todo o parte de un genoma rhabdovírico a las células cancerosas o tumorales en la presente divulgación es mediante inyección intravascular. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento se pueden administrar de manera alternativa por vía intratumoral, parenteral, intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, transdérmica o incluso intraperitoneal como se describe en las Patentes de EE. UU. 5,543,158, 5.641.515 y 5.399.363.

La inyección de construcciones de ácido nucleico se puede suministrar mediante jeringa o cualquiera otro procedimiento utilizado para la inyección de una solución a condición de que la construcción de expresión pueda pasar a través de un calibre de aguja determinado necesario para la inyección (por ejemplo, véase las Patentes de EE. UU. 5.846.233 y 5.846.225).

Las soluciones de los principios activos como base libre o sales aceptables farmacológicamente se pueden preparar en agua mezclad adecuadamente con un tensioactivo, tal como la hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones (Patente de EE. UU. 5.466.468) En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que se pueda suministrar fácilmente en una jeringa. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño necesario de partícula en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede llevar a cabo mediante distintos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorbutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería estar tamponada adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se hace isotónico primero con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral, e intraperitoneal. En esta conexión, los medios acuosos estériles se pueden emplear son bien conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación de la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se va a tatar. La persona responsable de la administración determinará, en cada caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana las preparaciones deberían cumplir las convenciones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza que requieran los gobiernos de los países en los que se van a utilizar las composiciones.

Las composiciones desveladas en el presente documento se pueden formular en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables (formadas con el grupo amino libre de las proteínas) y que se forman con ácidos inorgánicos son, por ejemplo, del ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como el acético, oxálico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo también se pueden derivar de bases inorgánicas, tales como el sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Al formularlas, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad como sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tal como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se utiliza en el presente documento, “vehículo” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, excipientes, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquiera medio convencional o agentes sea incompatible con el principio activo, su uso en las composiciones terapéuticas está contemplado. Los principios activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

La frase “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar cuando se administra a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contienen una proteína como principio activo se entiende bien en la técnica. Normalmente dichas composiciones se preparan como inyectables, sea en soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución, o la suspensión, en un líquido antes de la inyección.

C. Tratamientos de combinación

Los compuestos y procedimientos de la presente divulgación se pueden utilizar en el contexto de enfermedades/afecciones que incluyen el cáncer y la aterosclerosis. Con el fin de aumentar la eficacia de un tratamiento con las composiciones de la presente invención, tal como un rhabdovirus, puede que sea deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de las enfermedades y afecciones. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer se puede implementar con compuestos terapéuticos de la presente invención y otras terapias anticáncer, tales como agentes anticáncer o cirugía.

Se pueden emplear distintas combinaciones; por ejemplo, un rhabdovirus no VSV, tal como el virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs, y/o virus Bahía Grande, es “A” y la terapia anticáncer secundaria es “B”, que puede incluir un segundo rhabdovirus:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de un virus terapéutico o construcciones víricas e la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de esa terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, si existe, del tratamiento vírico. Si se espera que los ciclos de tratamiento se repetirían según fuera necesario. también se contempla que distintas terapias convencionales, así como la intervención quirúrgica se puede aplicar en combinación con la terapia de células cancerosas o tumorales descrita.

1. Terapia anticáncer

Un agente “anticáncer” es capaz de afectar negativamente al cáncer en un sujeto, por ejemplo, destruyendo las células cancerosas, induciendo la apoptosis en las células cancerosas, reduciendo la tasa de crecimiento de las células cancerosas, reduciendo la incidencia o número de metástasis, reduciendo el tamaño tumoral, inhibición del crecimiento tumoral, reducción del suministro sanguíneo a un tumor o células cancerosas, promoviendo una respuesta inmunitaria contra las células cancerosa o un tumor, evitar o inhibir la progresión del cáncer, o aumentar la supervivencia de un sujeto con cáncer. Los agentes anticáncer incluyen agentes biológicos (bioterapia), agentes quimioterápicos, y agentes radioterápicos. Más generalmente, estas otras composiciones se proporcionarían en una cantidad eficaz combinada para destruir o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con el virus o construcción vírica y los agentes o factores múltiples al mismo tiempo. Esto se puede conseguir poniendo en contacto la célula con una única composición o formulación farmacológica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en el que una composición incluye el virus y el otro incluye el segundo agente(s).

La resistencia de las células tumorales a los agentes quimioterápicos y radioterápicos representan un problema principal en la oncología clínica. Un objetivo de la investigación actual contra el cáncer es encontrar maneras para mejorar la eficacia de la quimio y radioterapia combinándolas con la terapia genética. Por ejemplo, el gen de la timidina cinasa (HS-tK) del herpes simple, cuando se suministra a tumores cerebrales mediante el sistema de vector retrovírico, se inducía satisfactoriamente una susceptibilidad al agente antivírico ganciclovir (Culver y col., 1992). En el contexto de la presente invención, se contempla que la terapia con poxvirus se podría utilizar de manera similar en conjunción con una intervención quimioterapéutica, radioterapéutica, inmunoterapéutica, u otras biológicas, además de otros agentes reguladores del ciclo celular o pro-apoptóticos.

De manera alternativa, la terapia vírica puede preceder o seguir al otro tratamiento en intervalos que varían desde minutos a semanas. En realizaciones en las que el otro agente y el virus se aplican por separado a la célula, se aseguraría en general que no expire un periodo de tiempo significativo entre el tiempo de cada suministro, de manera que el agente y el virus seguirían siendo capaces de ejercer ventajosamente un efecto combinado sobre la célula. En dichos casos, se contempla que se puede poner en contacto la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre ellas y, más preferentemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre ellas. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para el tratamiento significativamente, sin ^{embargo, de un lapso de varios días (2, 3, 4, 5,}6 ^{o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5,}6^{, 7 u}8^{) entre las respectivas}administraciones.

a. Quimioterapia

Las terapias del cáncer incluyen una variedad de terapias de combinación con tratamientos basados en químicos y radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, busulfan, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrrubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, etopósido (VP 16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor estrogénico, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de la farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina, y metotrexato. Temazolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier variante análoga o derivada de los anteriores. La combinación de quimioterapia con terapia biológica se conoce como bioquimioterapia.

b. Radioterapia

Otros factores que causan un daño del ADN y que se han utilizado extensamente incluyen los que se conocen comúnmente como rayos y, rayos X, haces de protones, y/o suministro dirigido de radioisótopos a las células tumorales. Otras formas de factores de daño del ADN también se contemplan tal como microondas y radiación UV. Es más probable que todos estos factores efectúen un amplio intervalo de daños sobre el ADN, sobre los precursores de ADN, sobre la replicación y reparación de ADN, y en el ensamblaje y mantenimiento de cromosomas. Los intervalos de dosificación varían para los rayos X desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante periodos de tiempo prolongados (3 a 4 sem), a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la semivida del isótopo, la fuerza y tipo de radiación emitida y la captación por las células neoplásicas.

Las expresiones “puestos en contacto” y “expuestos”, cuando se aplican a una célula, se utilizan en el presente documento para describir el proceso por el cual una construcción terapéutica y un agente quimioterápico o radioterápico se suministran en una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para conseguir la destrucción o estasis celular, ambos agentes se suministran a una célula en una cantidad eficaz combinada para destruir la célula o evitar que se divida.

c. Inmunoterapia

La inmunoterapia, en general, se basa en el uso de células inmunitarias y moléculas efectoras para dirigirse y destruir las células cancerosas. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador de la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de terapia o puede reclutar otras células para efectuar actualmente la destrucción celular. El anticuerpo se puede conjugar también con un fármaco o toxina, (quimioterápico, radionúclido, cadena A de ricino, toxina colérica, toxina pertussis, etc.) y sirve simplemente como agente de direccionamiento. De manera alternativa, el efector puede ser un linfocito que tiene una molécula de superficie que interactúa sea directa o indirectamente, con una célula tumoral diana. Distintas células efectoras incluyen linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad citotóxica directa e inhibición o reducción de ciertos rhabdovirus o polipéptidos de rhabdovirus proporcionarían un beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer.

La inmunoterapia también se puede utilizar como parte de una terapia combinada. La estrategia general para la terapia combinada se expone posteriormente. En un aspecto de la inmunoterapia. La célula tumoral debe tener algún marcador que sea posible direccionar, es decir que no esté presente en la mayoría de otras células, existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para el direccionamiento en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen el antígeno carcinoembrionario, antígeno ^{específico de próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp}68^{, TAG-72, HMFG,}antígeno sialil de Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor estrogénico, receptor de laminina, erbB y p155. Los lisados de células tumorales también se pueden utilizar en la composición antigénica.

Un aspecto alternativo de la quimioterapia es combinar los efectos anticáncer con los efectos inmunoestimulantes. Las moléculas inmunoestimulantes incluyen: citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFN^y, quimiocinas tales ^{como MIP-1, MCP-1, IL}-8 ^{y factores de crecimiento tales como el ligando FLT3. La combinación de moléculas}inmunoestimulantes sea como proteínas o utilizando el suministro genético en combinación con un supresor tumoral se ha demostrado que aumenta los efectos antitumorales (Ju y col., 2000).

Como se ha expuesto anteriormente, los ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son adyuvantes inmunitarios (por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos) (Patentes de EE. U^u. 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides y col., 1998), terapia con citocinas (por ejemplo, interferones a, p y ^y; IL-1, ^gM-CSF y TNF) (Bukowski y col., 1998; Davidson y col., 1998; Hellstrand y col., 1998); terapia genética (por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin y col., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; Patentes de EE. UU. 5.830.880 y 5.846.945) y anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anti-gangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras y col., 1998; Hanibuchi y col., 1998; Patente de E^e. UU. 5.824.311). El herceptin (trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal quimérico (de ratón-humano) que bloquea el receptor HER2-neu (Dillman, 1999). La terapia de combinación del cáncer con herceptin y quimioterapia ha demostrado que es más eficaz que las terapias individuales. Por lo tanto, se contempla que se pueden emplear una o más terapias anticáncer con las terapias relacionadas con rhabdovirus descritas en el presente documento.

(1) Inmunoterapia pasiva

Existen varias estrategias diferentes para la inmunoterapia pasiva del cáncer. Se pueden categorizar ampliamente en los siguientes: inyección de anticuerpos solos, inyección de anticuerpos acoplados a toxinas o agentes quimioterápicos; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radioactivos; inyección de anticuerpos anti-idiotípico; y finalmente, la purga de las células tumorales en la médula ósea.

Preferentemente, se emplean los anticuerpos monoclonales humanos en la inmunoterapia pasiva, ya que producen pocos efectos secundarios o ninguno en el paciente. Sin embargo, su aplicación está limitada de alguna manera por su escasez y hasta ahora solo se han administrado por vía intralesional. Los anticuerpos monoclonales humanos contra los antígenos gangliósidos se han administrado por vía intralesional a pacientes que padecen melanoma cutáneo recurrente (Irie y Morton, 1986). Se observó una regresión en seis de los diez pacientes, a continuación de inyecciones diarias o semanales. En otro estudio, se consiguió un éxito moderado con inyecciones intralesionales de dos anticuerpos monoclonales humanos (Irie y col., 1989).

Puede ser favorable administrar más de un anticuerpo monoclonal dirigido contra dos diferentes antígenos o incluso anticuerpo con múltiple especificidad de antígeno. Los protocolos de tratamiento también pueden incluir la administración de linfocinas u otros amplificadores inmunitarios como se describe por Bajorin y col. (1988). El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos se describe con más detalla en la memoria descriptiva.

(2) Inmunoterapia activa

En la inmunoterapia activa, se administra un péptido, polipéptido o proteína antigénicos, o una composición celular tumoral alogénica o autóloga o “vacuna”, en general con un adyuvante bacteriano distintivo (Ravindranath y Morton, 1991; Morton y col., 1992; Mitchell y col., 1990; Mitchell y col., 1993). En la inmunoterapia del melanoma, los pacientes que daban lugar a una alta respuesta de IgM a menudo sobrevivían mejor que los que no daban lugar o daban lugar a pocos anticuerpos IgM (Morton y col., 1992). Los anticuerpos IgM a menudo son anticuerpos transitorios y la excepción a la regla parece ser los anticuerpos anti-gangliósidos o anticarbohidratos.

(3) Inmunoterapia adoptiva

En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o los linfocitos infiltrados en el tumor, se aíslan in vitro, se activan con citocinas tales como la IL-2 o se transducen con genes de necrosis tumoral y se vuelven a administrar (Rosenberg y col., 1988; 1989). Para conseguir esto, se administraría a una animal o paciente humano una cantidad inmunológicamente eficaz de linfocitos activados en combinación con una composición peptídica antigénica con adyuvante incorporado como se describe en el presente documento. Los linfocitos activados serán más preferentemente células propias del paciente que se aislaron anteriormente de una muestra de sangre o del tumor y se activan (o “expanden”) in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresión de melanoma y carcinoma renal, pero el porcentaje de los que responden era menor en comparación con los que no responden.

d. Genes

En otro ejemplo más, el tratamiento secundario es una terapia genética en la que un polinucleótido terapéutico se administra antes, después o al mismo tiempo que se administra un rhabdovirus. El suministro de un rhabdovirus en conjunción con un vector que codifica uno de los siguientes productos genéticos tendrán un efecto anticáncer combinado en los tejidos diana. De manera alternativa, el rhabdovirus puede modificarse como un vector vírico para incluir el polinucleótido terapéutico. Se engloban dentro de la invención una variedad de proteínas, algunas de las cuales se describen posteriormente. La Tabla 4 enumera distintos genes que pueden dirigirse para la terapia genética de alguna forma en combinación con la presente invención.

(1) Inductores de la proliferación celular

Las proteínas que inducen una proliferación celular se encuentran adicionalmente en distintas categorías dependiendo de la función. Lo que tienen en común todas estas proteínas es su capacidad para regular la proliferación celular. Por ejemplo, una forma de PDGF, el oncogén sis, es un factor de crecimiento secretado. Los oncogenes raramente aparecen a partir de genes que codifican factores de crecimiento, y actualmente, sis es el único factor de crecimiento oncogénico de origen natural conocido. En un aspecto de la presente divulgación se contempla que el ARNm antisentido dirigido a un inductor particular de proliferación celular se utiliza para evitar la expresión el inductor de proliferación celular.

(2) Inhibidores de proliferación celular

Los oncogenes supresores de un tumor funcionan para inhibir la proliferación celular excesiva. La inactivación de estos genes destruye su actividad inhibidora, dando como resultado una proliferación sin regular. Los supresores tumorales incluyen p53, p16 y C-CAM. Otros genes que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención incluyen Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zacl, p73, VHL, MMAC1 / PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, fusiones p27/p16, fusiones p21/p27, genes antitrombóticos (por ejemplo, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fins, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, genes implicados en la angiogénesis (por ejemplo, VEGF, fGf , trombospondina, BAI-1, GDAIF, o sus receptores) y MCC.

(3) Reguladores de la muerte celular programada

La apoptosis o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embrionario normal. Mantenimiento de la homeostasis en tejidos adultos, y supresión de la carcinogénesis (Kerr y col., 1972). La familia Bcl-2 de proteínas y proteasas tipo ICE se ha demostrado que son reguladores importantes y efectores de apoptosis en otros sistemas. La proteína Bcl-2, descubierta en asociación con el linfoma folicular, tiene un papel importante en el control de la apoptosis y aumento de la supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi y col., 1985; Cleary y Sklar, 1985; Cleary y col., 1986; Tsujimoto y col., 1985; Tsujimoto y Croce, 1986). La proteína Bcl-2 evolucionariamente conservada se reconoce ahora como un miembro de una familia de proteínas relacionadas que puede categorizarse como agonistas de muerte o antagonistas de muerte.

Como consecuencia de su descubrimiento, se ha demostrado que la Bcl 2 actúa para suprimir la muerte celular desencadenada por una variedad de estímulos. También es aparente ahora que hay una familia Bcl 2 de proteínas reguladoras de la muerte celular que comparen homologías estructurales y de secuencia. Se ha demostrado que estos miembros de la familia diferentes poseen funciones similares a la Bcl 2 (por ejemplo, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1) o actúan contra la función de Bcl 2 y promueven la muerte celular (por ejemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

e. Cirugía

Aproximadamente el 60 % de personas con cáncer se someterá a cirugía de algún tipo, lo que incluye cirugía preventiva, diagnóstica o de estadificación, curativa o paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento del cáncer que se puede utilizar en conjunción con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente divulgación, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia genética, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la que todo o parte del tejido cancerosos se retira físicamente se escinde y/o se destruye. La resección tumoral se refiere a la retirada física de al menos parte de un tumor. Además de la resección del tumor, el tratamiento por cirugía incluye la cirugía por láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Mohs). Se contempla adicionalmente que la presente divulgación se puede utilizar en conjunción con la retirada de los cánceres superficiales, pre-cánceres o cantidades incidentales de tejido normal.

Con la escisión de parte de todas las células cancerosas, tejido o tumor, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento se puede conseguir por perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia ^{anticáncer adicional. Dicho tratamiento se puede repetir, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5,}6^{, o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5,}6^{, 7,}8^{, 9, 10, 11, o 12 meses. Estos tratamientos también pueden tener}dosificaciones variables.

f. Otros agentes

Se contempla que se pueden utilizar otros agentes en combinación con la presente divulgación para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan la regulación positiva de los receptores de superficie celular y uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a los inductores apoptóticos, u otros agentes biológicos. Los agentes inmunomoduladores incluyen el factor de necrosis tumoral; interferón a, p y y; IL-2 y otras citocinas; F42K y otros análogos de citocinas; o MIP-1, MIP-1p, MCP-1, RANTES, y otras quimiocinas. Se contempla adicionalmente que la regulación positiva de receptores de superficie celular o sus ligandos tales como el ligando Fas/Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando Apo-2) potenciaría la capacidad inductora de apoptosis de la presente invención por el establecimiento de un efecto autocrino o apocrino de células hiperproliferativas. Los aumentos de la señalización intercelular elevando el número de uniones GAP aumentaría los efectos anti-hiperproliferativos en la vecindad de la población de células hiperproliferativas. En otros aspectos, los agentes citostáticos o de diferenciación se pueden utilizar en combinación con la presente divulgación para mejorar la eficacia anti-proliferativa de los tratamientos. Los inhibidores de la adhesión celular se contemplan para aumentar la eficacia de la presente invención. Ejemplos de inhibidores de adhesión celular son los inhibidores de cinasa de adhesión focal (FAK) y lovastatina. Se contemplan adicionalmente otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tales como el anticuerpo c225, que se podrían utilizar en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento. Ha habido muchos avances en la terapia del cáncer siguiendo la introducción de fármacos quimioterápicos. Sin embargo, una de las consecuencias de la quimioterapia es el desarrollo/adquisición de fenotipos resistentes a los fármacos y el desarrollo de resistencias multi-fármacos. El desarrollo de la resistencia a fármacos sigue siendo un obstáculo principal en el tratamiento de dichos tumores y, por lo tanto, hay una necesidad obvia de estrategias alternativas tales como la terapia vírica.

Otra forma de terapia para su uso en conjunción con la quimioterapia, terapia por radiación y terapia biológica incluye la hipertermia, que es un procedimiento en el que el tejido del paciente se expone a altas temperaturas (hasta de 41 °C). los dispositivos de calentamiento externos o internos pueden implicarse en la aplicación de hipertermia local, regional, o del cuerpo completo. La hipertermia local implica la aplicación de calor en un área pequeña, tal como un tumor. El calor puede generarse externamente con ondas con alta frecuencia que se dirige a un tumor desde un dispositivo fuera del cuerpo. El calor interno puede implicar una sonda estéril, que incluyen cables finos calentados o tubos huecos rellenos con agua caliente, antena de microondas implantadas, o electrodos de radio frecuencia.

El órgano o una extremidad de un paciente se calienta por terapia regional, que se consigue utilizando dispositivos que producen alta energía, tal como imanes. De manera alternativa, algo de sangre del paciente se puede retirar y calentar antes de perfundirla en el área que se calentará internamente. El calentamiento de sangre completa se puede implementar también en los casos donde el cáncer se ha diseminado a través del cuerpo. Se pueden utilizar mantas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductoras y cámaras térmicas para este fin.

También se puede utilizar terapia hormonal en conjunción con la presente divulgación o en combinación con cualquier otra terapia del cáncer descrita previamente. El uso de hormonas se puede emplear en el tratamiento de ciertos cánceres tales como un cáncer de mama, próstata, ovárico, o de cuello uterino para disminuir el nivel o bloquear los efectos de ciertas hormonas tales como testosterona o estrógenos. El tratamiento a menudo se utiliza en combinación con al menos una terapia de cáncer como tratamiento.

V. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar distintos aspectos de la divulgación y no significa que limitan la presente divulgación de ninguna manera. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente divulgación se adapta mejor para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como los objetivos, fines y ventajas inherentes a ellas. Los presentes ejemplos, junto con los procedimientos descritos en el presente documento son actualmente representativos de aspectos preferidos, son ejemplares, y no pretenden ser limitantes del ámbito de la divulgación.

Ejemplo comparativo 1

EXPLORACIÓN DE NUEVOS RHABDOVIRUS ONCOLÍTICOS CANDIDATOS

Exploraciones in vitro . Como una exploración inicial para identificar nuevos virus oncolíticos, rhabdovirus de campo aislados se evaluaron en cuanto a su capacidad para destruir células tumorales humanas del panel celular NCI60. Esto fue una estrategia fructífera para los inventores en el pasado para determinar la eficacia relativa de una serie de VSV mutantes como oncolíticos candidatos (que lisan células cancerosas). Inicialmente los inventores han examinado 13 nuevos rhabdovirus que se había determinado anteriormente que se replicaba en células de mamífero. Se contempla que este procedimiento se extendiera para estudiar los rhabdovirus para los cuales hay menos experiencia en cultivo celular. En un esfuerzo para explorar rápida y eficazmente mediante una matriz de 60 células infectadas con 13 virus diferentes, los inventores utilizando un ensayo rápido y barato en un formato de 96 pocillos utilizando la reducción de MTS formazan, o tinción con cristal violeta de las células residuales, para medir el número celular y la viabilidad. Los inventores cultivaron las líneas celulares a un 80 % de confluencia en placas de 96 pocillos y entonces se expusieron en paralelo a los aislados de rhabdovirus de campo de los inventores aumentando las MOI (Moi = 0,0001 - 10 UFP/célula). A las 48 y 96 horas después de la infección, se tiñeron las células con el reactivo MTS acuoso (Promega USA) y se incubaron durante 3 horas para permitir la suficiente formación de formazan. De manera alternativa, las placas de células infectadas se lavaron con tampón para retirar las células muertas, se tiñó con un colorante de cristal violeta, se lavaron para retirar el colorante residual, después de cuyo tiempo se solubilizó el colorante utilizando un detergente. Estas placas se leyeron entonces utilizando un ^{lector de placas multipocillo integrado (Biotek SynergyHT; USA), se ajustó la curva de datos, y se determinó la CE}50 de esta curva. Normalmente, los ensayos se llevaron a cabo por sextuplicado, con retirada del valor más alto y el ^{más bajo de la CE}50^{, y promediando las restantes CE}50 ^{para determinar en último término y valor y un intervalo de}confianza (por ejemplo, véase la FIG. 2).

Como marcador para evaluar si un virus particular infecta/destruye células humanas normales in vitro, se explorarán cultivos de fibroblastos humanos normales, cultivos de epitelio y endotelio y neuronales de la colección de los inventores y los disponibles en el mercado (Cambrex. USA). Los cultivos se infectarán con los virus candidatos (0,1 a 20 ufp/célula) durante 48 y 96 horas. Se detectará la viabilidad celular mediante el ensayo con MTS, o el ensayo con cristal violeta, y se caracterizó adicionalmente marcándolo con anticuerpo D175 caspasa 3 activado (Cell Signaling Technologies, USA) y se detectaron utilizando un anticuerpo secundario conjugado con FITC. Los estudios se harán en paralelo con líneas tumorales humanas y de ratón susceptibles /resistentes conocidas. Se ha utilizado una combinación de células no tratadas y células tratadas con TRAIL y ciclohexamida para establecer el rango dinámico del ensayo, con determinaciones preliminares de factor z significativamente por encima de 0,5.

Otra contingencia es que los virus se puedan replicar y diseminar eficazmente en los cultivos sin destruir rápidamente estas células. Hay también virus potencialmente interesantes, a condición de que su replicación sea selectiva del tumor en la naturaleza, ya que su capacidad lítica se podía aumentar posteriormente mediante modificación recombinante. Para detectar estos virus, los inventores infectaran células del panel celular del NCI 60 con aislados de campo a una MOI baja (0,1 ufp/célula) en pocillos duplicados de una placa de 24 pocillos. Después de una hora, se lavaron los pocillos completamente para retirar los virus introducidos libres, se añadió medio y se incubaron los cultivos durante 72 horas adicionales. Estos sobrenadantes del cultivo se titularon posteriormente sobre una línea celular permisiva (células Vero) para detectar y cuantificar la infección productiva. El lavado final de cada uno de estos se tituló para controlar los virus de entrada residuales. Los virus candidatos superiores en este ensayo se confirmaron en células de cultivo tisular utilizando un antisuero específico del virus y microscopía de fluorescencia convencional.

Clasificación basada en todos los parámetros. Varias propiedades contribuyen a la destrucción oncolítica de las células tumorales incluyendo: la capacidad para inducir apoptosis, la tasa de producción vírica, la cuantificación del virus producido, así como las funciones especiales, tales como la formación sincitial. Los candidatos prometedores de la exploración inicial se caracterizaron adicionalmente con respecto a la inducción de apoptosis (como sed determinó por el ensayo TUNEL (la tinción inmunofluorescente por la caspasa-3 activada), y curvas de crecimiento de una etapa para comparar las cinéticas y cuantificar la producción de virus. Estos estudios sirven como guía para mejorar estas cepas. Por ejemplo: (1) si un virus destruye bien las célula tumorales pero presenta una toxicidad inaceptable para las células normales, los inventores atenuaban este virus utilizando una o más de las estrategias ^{señaladas posteriormente; (}2^{) de manera alternativa, si un virus muestra cinéticas de destrucción más lentas}mientras mantiene una alta tasa de replicación, entonces los inventores pueden añadir un tóxico o transgén terapéutico; (3) Si un virus candidato se replica lentamente aunque es un destructor eficaz, el inventor seleccionará una variante con cinéticas de crecimiento aumentadas para reforzar su potencia.

Por la experiencia de los inventores con VSV y otros virus oncolíticos, han identificado tres criterios de regulación ^{claves in vitro para estrechar la lista de candidatos: (}1^{) destrucción celular tumoral selectiva, (}2^{) replicación} productiva dentro de las células tumorales (independiente de la destrucción), y (3) eficacia en líneas tumorales resistentes a VSV (UACC-62 de melanoma, A431 y NCI-H226 de pulmón, DU-145 de próstata, HL60 de leucemia). Basándose en estos criterios, los resultados de los ensayos de exploración descritos anteriormente se integrarán para recortar la lista para la evaluación adicional en ensayos in vivo preliminares.

Toxicidad y biodistribución in vivo . Las dos vías de administración relacionadas con un cuadro clínico son inyecciones intravenosas (IV) e intracraneales (IC). Los candidatos de cabeza identificados durante la exploración in vitro de toxicidad y biodistribución en ratones después de la infección se evaluaron por estas vías. Los grupos de 3 ^{ratones se infectaron por vía IV a dosis de 1 x 10}5 ^{a 1 x 10}9 ^{ufp, o por IC a 1 x 10}2 ^{a 1 x 10}6 ^{ufp. Además de la}mortalidad, se monitorizará la morbilidad diariamente en cuanto a signos de letargia, deshidratación, pérdida de peso y parálisis de extremidades. La histopatología se llevó a cabo en 2 ratones del grupo de dosis letal mínima (máxima dosis sin alcanzar la dosis letal) de cada infección de virus candidato. El VSV WT y la infección falsa sirve como controles positivo y negativo apropiados, respectivamente. Los órganos se recolectaron de los restantes ratones de este grupo, se homogeneizaron y se titularon como evaluación preliminar de la biodistribución vírica.

Para los virus que presentan un intervalo de dosis letal aceptable, los inventores evaluaron posteriormente la biodistribución en ratones que albergaban un tumor para identificar virus compatibles con la administración sistémica. El inventor emplea tres de los modelos de cáncer existentes del inventor que representan órganos diana ^{muy diferentes de relevancia clínica crítica: (1) carcinoma de colon de ratón CT-26 (1 x 10}5 ^{células) por inyección}intravenosa para formar tumores pulmonares diseminados en ratones Balb/C singénicos (2), carcinoma de mama ^{4T1 de ratón (4 x 10}5 ^{'células) inyectadas en la almohadilla grasa der ratones Balb/C singénicos para formar un único tumor primario con metástasis espontánea, y (3) células de glioblastoma humano U87 (1 x 10}5 ^células)implantadas estereotáticamente en el córtex de ratones atímicos. Se determinó una dosis máxima tolerable para cada virus y vía (IV o IC) a partir de los experimentos de toxicidad preliminares in vivo. Este valor sirve como una dosis terapéutica inicial para los estudios de biodistribución en ratones que albergan un tumor. En los grupos de 3 ratones, se establecieron los tumores durante una semana y entonces se trataron por vía IV o IC con una única dosis de cada virus candidato a su respectiva MTD. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento, se perfundieron los animales con solución salina para aclarar cualquier virus libre de la circulación y se recolectaron los tumores y los órganos, se homogeneizaron y se titularon para cuantificar los virus infecciosos. De esta manera, los inventores determinaron que virus se suministrarían en los sitios tumorales por inyección sistémica, así como la selectividad tumoral relativa de la replicación del virus in vivo.

Reclasificación. Basándose en la toxicidad, biodistribución, suministro sistémico y perfiles de selectividad tumoral en los estudios in vivo, los inventores seleccionaron los mejores candidatos para proceder con la caracterización detallada y el desarrollo posterior.

Ejemplo comparativo 2

CONSTRUCCIONES RECOMBINANTES

Sistema de secuenciación y recombinante. Con el fin de facilitar la investigación y desarrollo rápidos, la producción posterior de material clínico y para asegurar la seguridad y estabilidad de los virus terapéuticos, los inventores clonaron y rescataron formas recombinantes de virus seleccionados.

Muchos ssARN virus con cadena negativa se han clonado y rescatado utilizando técnicas recombinantes convencionales. Los inventores emplearon estrategias similares que se habían adoptado satisfactoriamente para los virus recombinantes -ssARN conocidos. En resumen, el genoma de un virus candidato se aísla mediante extracción ^{de ARN (Qiagen Corp) a partir de 1 x 10}9 ^{partículas víricas purificadas. El ARN genómico purificado se ceba}entonces con hexámeros aleatorios y se transcribe inversamente a ADNc, que se hace posteriormente de doble cadena y se clona ligando adaptadores EcoRI, se fracciona por tamaño y finalmente se liga en un plásmido bacteriano digerido con EcoRI (pT7Blue; Novagen). El resultado es una biblioteca de fragmentos genómicos que se pueden secuencias fácilmente por técnicas convencionales. Debido a la naturaleza de cebado aleatorio de esta biblioteca, esta estrategia no “captura” el extremo 3 y los extremos 5'. Para hacer esto los inventores ligaron oligos en los extremos 3' o 5' del ^aRⁿgenómico purificado utilizando una ARN ligasa T4. Utilizando los cebadores complementarios para el oligo ligado recientemente que flanquea el genoma, los inventores amplificaron por PCR y clonaron los extremos del genoma para la secuenciación posterior. Esta información de secuencias se utilizó entonces para diseñar cebadores específicos del extremo para amplificar el genoma completo, que se clonó entonces en un plásmido especializado. Este plásmido flanquea el genoma con un promotor T7 en un extremo y una ribozima que auto escinde el delta de hepatitis y una secuencia terminadora T7 en el flanco opuesto. Cuando se transfectan en células A549 que expresan ARN polimerasa T7 (previamente infectadas con un virus vaccinia que expresa T7), este plásmido genera genomas víricos en el citoplasma. En paralelo, las secuencias codificantes de los virus para los genes N, P y L se clonaron en plásmidos de expresión dirigidos por el promotor CMV. La cotransfección de la construcción del genoma con los plásmidos N, P y L en estas células A549 reconstituye el complejo de replicación vírica en el genoma vírico y da como resultado el rescate de virus infecciosos. Como una prueba del principio, los inventores han cuando, modificado genéticamente, y rescatado el virus Maraba utilizando este procedimiento. Véase la FIG. 17 y FIG. 18 para ejemplos de virus relacionados con el Maraba.

Ejemplo comparativo 3

OPTIMIZACIÓN/AUMENTO

Los rhabdovirus no VSV son virus silvestres; y como todos los virus oncolíticos informados hasta hora, incluyendo el VSV, los inventores predicen que estos aislados de campo se benefician de una optimización posterior mediante la selección in vitro y/o estrategias de modificación recombinante. Algunos candidatos pueden necesitar una atenuación (por ejemplo, el virus Maraba) mientras que algunos necesitan un aumento de sus cinéticas replicación y/o destrucción tumoral (por ejemplo, el virus Muir Springs). A continuación, está un sumario de varias estrategias que los inventores emplean para maximizar la eficacia de los virus terapéuticos recién identificados.

Mutaciones modificadas. El VSV bloquea el transporte de ARNm nuclear/citoplasmático como un medio para derrotar la inmunidad innata de la célula huésped. Los inventores habían descrito anteriormente mutaciones modificadas en la proteína M de VSV para incapacitar esta actividad y de esta manera atenuar selectivamente este virus en células normales. Dado que otros miembros del género vesiculovirus también han demostrado esta capacidad (Chandipura, y viremia de primavera de la carpa) y que la mayoría de los vesiculovirus secuenciados hasta ahora (VSV, Chandipura, Piry, Cocal, viremia de primavera de la carpa, Maraba) tienen el motivo de secuencia crítico necesario para esta función del VSV, los inventores contemplaron atenuar los rhabdovirus no VSV de una manera análoga a la que se utiliza para VSV. Sin embargo, otros rhabdovirus tales como el virus de rabia y de la fiebre efímera bovina no tienen este motivo y no bloquean el transporte de ARNm nuclear/citoplásmico y quizá no son propensos a esta estrategia de atenuación. Según haya disponible más información con respecto a la interacción rhabdovirus/huésped de los laboratorios del consorcio y otros, serán posibles modificaciones adicionales guiadas a la estructura/funcionalidad para atenuar estos virus.

Transgenes. Existen ahora varios informes de “armado” de virus oncolíticos con genes suicidas o mediadores inmunitarios para aumentar su potencia. Los inventores se enfocaron en la adición de transgenes para aumentar la citotoxicidad de los virus candidatos que pe sentaban una replicación eficaz, por insuficiente destrucción tumoral. Los inventores han sopesado la prioridad de la lista de transgenes que se van a modificar actualmente en el virus Maraba. En este momento, la clasificación consiste en: (19 factor e inducción de apoptosis (AIF) - un homologa de la oxido reductasa responsable del colapso y degradación de la cromatina de una manera independiente de la caspasa. (2) Harakiri - el miembro pro-apoptótico más potente solo de BH3 de la familia Bcl- responsable de la inducción de apoptosis dependiente de caspasa convencional (Tipo I PCD). (3) XAF1 - un potente gen supresor tumoral e inhibidor directo de la familia IAP. (4) Atg4B - la proteasa clave responsable del inicio de la autofagia (Tipo II PCD).

En último término, los miembros de las rutas intrínseca o extrínseca de la muerte celular se podrían modificar con Tat u otro dominio de transducción proteica para secretarse de las células infectadas con el virus para inducir un testigo de destrucción dentro de la más del tumor. Los inventores siguen siendo conscientes de otros efectos de testigo de destrucción pueden mediarse a través de la inmunidad del huésped contra el virus y/o el tumor. Por lo tanto, una estrategia alternativa sería modificar un transgén, para llevar células a los sitios de la infección. Las pruebas indican que la infección vírica de tumores CT26 de pulmón inducen la infiltración de neutrófilos en el tumor y producen un efecto de destrucción por testigo apoptótico masivo.

Evolución dirigida para mejorar los rhabdovirus oncolíticos. Se han descrito muchos ejemplos de evolución dirigida en los que la fuerza de la replicación de una cepa vírica parental se aumentaba o disminuía mediante pasajes en serie en un cultivo de células de mamífero. Los rhabdovirus son particularmente proclives a este tipo de procedimientos ya que no existente como una entidad única, sino como una población de cepas llamadas cuasiespecies. Los miembros de las cuasi-especies representan mutaciones puntuales del genoma dominante. Cuando se aplica una apropiada presión de selección, el miembro más válido de la población se selecciona, y se convierte en el genoma dominante. Esto tiene una tremenda utilidad en los esfuerzos para construir un virus oncolítico mejor debido a que proporciona una colección de mutantes fáciles de hacer de los que se selecciona una variante con las mejores capacidades oncolíticas. Por lo tanto, para atenuar un determinado candidato, los inventores seleccionaron mutantes de placa pequeña en fibroblastos primarios y posteriormente amplificaron el virus clonado en células tumorales para retro seleccionar las mutaciones no productivas (es decir, mutaciones que se debilitan uniformemente, tal como mutaciones de polimerasa, al contrario, a las discapacidades específicas en células/tejidos normales). Llevando a cabo esto en ciclos repetidos a altas MOI (10 ufp/célula), lo inventores esperan aislar un mutante que mantenga una robusta replicación en células tumorales, aunque hayan perdido la capacidad para infectar productivamente células sanas normales. De manera alternativa, los inventores pueden aumentar la potencia de rhabdovirus no VSV, por selección de replicadores más rápidos, o destructores más letales. Para acelerar la tasa de replicación de un virus candidato, los inventores llevaron a cabo rondas repetidas de infección/ replicación en líneas celulares tumorales, pero en cada ronda siguiente disminuía el tiempo de recolección tras la infección. Esta presión de selección fuerza a los virus a evolucionar hacia la replicación rápida. Si se deseara ^{aumentar la citotoxicidad, los inventores infectaron líneas celulares tumorales resistentes o recalcitrantes}(1 ^x106 células) con virus candidatos (MOI = 1). Las células vivas se tiñeron posteriormente con colorante vital JC1 para detectar eventos de apoptosis precoz mediante citometría de flujo de color dual. Las células que sufrían apoptosis se clasificaron en monocapas de células Vero para recuperar el virus que se replicaba dentro de ellas. Las rondas repetidas de este ensayo, de nuevo con disminución del tiempo de recolección, selecciona un fenotipo más rápidamente letal. Los virus mejorados de esta manera se secuencian para mapear las alteraciones genéticas y que contribuyen a los esfuerzos del análisis de estructura/función de los inventores hacia un mejor entendimiento de la biología de los rhabdovirus y la oncólisis. El panel genético inverso permite una estrategia sin tendencia para mejorar rhabdovirus y representa un buen complemento a los esfuerzos para hacer mejoras mediante modificación recombinante de los transgenes o las mutaciones racionales basadas en los estudios de estructura/función.

Ejemplo 4

ENSAYO IN VIVO DE NUEVOS RHABDOVIRUS ONCOLÍTICOS RECOMBINANTES

Los inventores han escogido el uso de modelos ortotópicos de cáncer ya que recapitulan con más precisión la enfermedad clínica humana. Sin embargo, a diferencia de los modelos de tumor subcutáneo, los tumores ortotópicos no son fácilmente accesibles y por lo tanto difíciles de evaluar sin sacrificar al animal de experimentación. Para resolver este problema, se adoptó una tecnología de creación de imágenes ópticas multimodal que permite la creación de imágenes no invasiva y la medición repetida del crecimiento y regresión de los tumores implantados, así como el desarrollo y regresión de las lesiones metastáticas distales. Los inventores tienen una plataforma altamente sensible completamente integrada de creación de imágenes completas del animal (IVIS 200; Xenogen Corp) que pueden detectar fotones emitidos incluso desde dentro del tejido profundo. Puede medir luz fluorescente emitida por proteínas fluorescentes recombinantes tales como GFP, así como detectar la bioluminiscencia generada por luciferasa. Utilizando genes indicadores de luciferasa específicos del sustrato, uno expresado desde el virus y el otro expresado desde las células tumorales, los inventores pueden medir la bioluminiscencia resultante de la replicación vírica de manera concurrente con las mediciones tumorales. Para hacer esto los inventores han clonado o YFP o una nueva RFP monomérica en fase con luciferasa de luciérnaga o una luciferasa tipo renilla nueva del copépodo marino Gaussia princeps. Entre estas dos secuencias codificantes los inventores han modificado una secuencia de “parada-reinicio” de 30 aminoácidos. Este pequeño motivo viene del virus de la enfermedad del pie y la boca y permite la expresión estequiométrica de dos proteínas a partir de un único ARNm, es muy pequeño y no sufre por la variabilidad de célula a célula como los motivos de un IRE^s. Estas construcciones indicadoras duales se clonaron en vectores de lentivirus, se empaquetaron en el virus, y se utilizaron para establecer unas células 4T1, CT26 y U87 de glioblastoma humano marcadas con un indicador estable. Estas líneas celulares se utilizaron en tres modelos de tumor ortotópico en ratón: las U87 de glioma humano implantadas por vía intracraneal en ratones atímicos CD-1; células 4T1 de carcinoma de mama de ratón implantadas en la almohadilla grasa de hembras Balb/c (modelo de enfermedad metastática agresiva); las CT-15 e carcinoma de colon inyectadas en la vena de la cola de ratones Balb/C (tumores diseminados en el pulmón). La elección del modelo ortotópico se declara con los siguientes criterios: tumor de desarrollo rápido, agresivo, y por lo tanto un desafío para el tratamiento; representa muchas dianas orgánicas diferentes, abarca sistemas tanto de huéspedes inmunocompetentes como inmunocomprometidos.

Los primeros estudios son para evaluar las características de la respuesta a la dosis de los modelos de los inventores para identificar una dosis óptima. A partir de los experimentos de toxicidad preliminares, los inventores han definido una MTD para cada una de las cepas candidateas en animales Balb/C que no tenían tumor. Por lo ^{tanto, los inventores ensayaron dosis desde la MTD, disminuyendo en intervalos de medio log hasta}1 ^x103 ^ufp.Utilizando el IVIS para la replicación de imágenes en los tumores establecidos, se estudiaron las cinéticas de suministro de virus inicial y la duración de la replicación posterior en función de la dosis. En estudios paralelos los ratones se sacrificaron durante este momento y se examinaron utilizando microscopía de fluorescencia para determinar cómo afecta la dosis a la capacidad para alcanzar todas las partes del tumor y las lesiones metastáticas distales. El tejido sano se examinó para evaluar la replicación especifica en el tumor. Finalmente, se determinó la seguridad en cada dosis monitorizando los ratones por cualquier signo de morbilidad tal como pérdida de peso, deshidratación y cambios de comportamiento. Las respuestas tumorales a los virus en las comparaciones mano a mano se evaluaron a continuación de un tratamiento de dosis única IV. La sensibilidad y la naturaleza cuantitativa e la tecnología de reacción de imágenes ópticas la hace idealmente adecuada para este fin. Por lo tanto, los tumores se establecieron como se ha descrito anteriormente y se monitorizaron el crecimiento o la regresión tumorales a continuación de la dosificación con los virus y se compararon estos resultados con virus de control inactivados con UV. Basándose en un trabajo previo con VSV, se contempla que una única dosis puede no ser suficiente para una regresión completa y perdurable del tumor. Esto necesita una serie de experimentos para determinar el número más eficaz y el intervalo de dosis. En una estrategia similar a la descrita anteriormente, los inventores utilizan modelos tumorales para desarrollar estrategias de dosificación máxima eficaz. Esto se hace mientras se monitoriza el suministro de virus al tumor, la replicación, duración de la replicación en el lecho del tumor y diseminación a sitios tumorales distantes, en concierto con el crecimiento/remisión del tumor. Además, los inventores examinan la infiltración celular inmunitaria y la activación en lechos tumorales y alrededor de los ganglios linfático utilizando citometría de flujo e inmunohistoquímica como otro parámetro de la actividad oncolítica. En último término, se confirma la eficacia monitorizando estos ratones en cuanto a la supervivencia total y/o tiempo de progresión; comparando los grupos tratados con el virus con los tratados con virus inactivados con UV como control. Un ejemplo del modelo animal se puede encontrar en la FIG. 13.

Ciclo retrógrado para la optimización/aumento. Puede ser que varios ciclos de optimización y luego reensayo sean necesarios para desarrollar en último término un virus terapéutico sumamente eficaz. Por lo tanto, los inventores utilizan los resultados del ensayo in vivo para guiar rondas adicionales de optimización biológica y/o recombinante y luego se reensaya en los modelos tumorales.

Tabla 4. Destrucción celular mediada por rhabdovirus en el panel celular NCI 60 Las células del panel celular NCI ^{60 se colocaron en placas de}6 ^{pocillos hasta una confluencia del 90 %. Estas células se infectaron en diluciones log}con distintos rhabdorvirus como se indica. Después de 48 horas, las monocapas se lavaron, fijaron y tiñeron con cristal violeta para calificar las células viables. Los valores representan las ufp necesarias para destruir el 50 % de las células en 48 h.

VSV

Enfermedad Línea Chandipura Maraba Carajas Isfahan Klamath Sawgrass HR _{maligna celular}

A549-^{PULMÓN NSC ATCC <}102 ^<102 104 105

^{NE >}106

^{PULMÓN NSC EKVX <}102 103 ^>106 103 _{PULMÓN NSC HOP}92 103 103 105 ^<102 ^{PULMÓN NSC H226 >}106 ^>106 104

^{PULMÓN NSC NCI-H23 <}102 ^<102 ^<102 104 ^<102 ^{MELANOMA LOX IMVI <}102 ¹⁰³103 ^<102 ^{■ M ■EElLA AMNSOMMUAA M ME 1L4 SK-}103 ^<102 103 ^>106 105

^{MELANOMA 2 MALME <}102 103 ^<102

^{MELANOMA 3M UACC-}103 105 105 103 105

^{MELANOMA 257 UACC- <}102 ^<102 ^<102 103 ^<102

^{MELANOMA 62 <}102 103 ^>106 ^{LEUCEMIA MOLT-4}103 ^<102 ^{LEUCEMIA K-562}105

OVCAR-3

^{OVÁRICA OVCAR-4}103 ^<102

^{OVÁRICA OVCAR}-8 103 ^<102 105 104 ^>106 104 103 ^{OVÁRICA NE}106 ^>106 ^{NE NE}103 ^{OVÁRICA SK-OV-3 <}102 105 105 ^>106 104 ^{SNC SF-268 <}102 104 104 ^{SNC SF-539 <}102 ^<102 103 104 105 ^{SNC SNB-19}103 104 ^<102 ^<102 _{SNC SNB-75}103 103 _NE105 ^>106 _<102

_COLONh_O2l₉o 104 ^>106 ^{NE NE NE}105

^{COLON 205 <}102 ^<102 ^>106 103 ^{COLON HCT-15}105 104 105 ^>106 103 ^{COLON SW-620 <}102 ^<102 103 105 ^<102

^M _M ^A _A ^M _M ^A _A ^H _M ^S _DA ⁵⁷-^{8T >}106 ^>106 ^>106 104 ^{MAMA MB-435 <}102 ^<10^{2- <}10^2-103 ^<102 ^{RENAL TK-10 <}102 103 104 104 ^{RENAL 786-O}104 ^<102 105 105 105 ^{RENAL ACHN}105 ^l03 105 ^>106 ^{NE <}102 ^{RENAL A498}105 105 ^>106 104 (continuación)

Enfermedad Línea

maligna _celularChandipura Maraba Carajas Isfahan Klamath Sawgrass

^{PRÓSTATA DU-145 <}102 ^>106 ^>106

^{PRÓSTATA PC-3 >}106 ^{NE <}102

COLON DE

^{RATÓN CT26 <}102 ^<102 ^>106 ^{NE <}102

^{Tabla 5.Comparación enfocada entre cuatro rhabdovirus. Las células del panel celular NCI 60 se colocaron en placas de}6 pocllos hasta una confluencia del 90 %. Estas células se infectaron en diluciones log con distintos rhabdorvirus como se indica. Después de 48 horas, las monocapas se lavaron, fijaron y tiñeron con cristal violeta para calificar las células viables.

Los valores representan las ufp necesarias para destruir el 50 % de las células en 48 h.

Chandipura Maraba Carajas WT VSV Pulmón A549 < 102 < 102 104 > 106

H226 > 106 > 106 ¹⁰⁴ < 102 Melanoma M14 103 < 102 103 105

Malme 3M 103 105 105 105 UACC-62 < 102 ¹⁰³ > 106 Leucemia K562 105 103 Ovárico OVCAR4 103 < 102 105 103

^OVCAR8 ^{> 106 > 106 103}SK-OV-3 < 102 105 105 104

SNC SF268 < 102 104 104

SF539 < 102 < 102 ¹⁰³105 Colon HCT-15 105 104 105 103 Mama HS578T > 106 > 106 104 Renal 786-O 104 < 102 105 105

ACHN 105 103 105 < 102 Próstata DU-145 < 102 > 106

PC-3 > 106 < 102

Las diferencias entre los VSV y otros rhabdovirus del panel celular NCI 60 incluyen: (1) destrucción preferente por el virus Maraba en comparación del VSV de A549 de pulmón, M14 de melanoma, UACC-62 de melanoma, SF268 de SNC, SF539 SNC, 786-O renal, DU-145 próstata; (2) destrucción preferente del virus Carajas en comparación con el VSV para M14 melanoma, UACC-62 de melanoma, SF539 de SNC; destrucción preferente por el VsV para H226 de ^{pulmón, K562 de leucemia, OVCAR}-8 ^{ovárico, HCT-15, HS578T de mama, y PC-3 de próstata. Todas las demás}líneas celulares del panel celular 60 muestran susceptibilidades similares al VSV, Maraba y Carajas y Chandipura Tabla 6. Destrucción in vitro de células transformadas e inmortalizadas seleccionadas por los nuevos rhabdovirus. ^{Las células se colocaron en placas de}6 ^{pocillos y se dejaron hasta alcanzar una confluencia del 75 %. Estas}células se infectaron posteriormente con cada virus con un titulo fijo. Se valoraron los cultivos visualmente en cuanto a la muerte celular después de 96 h. 4+ = 100 % obliteradas, 3+ = 75-90 % muertas, 2+ = 50 % muertas,

1+= <30 % muertas, -- = no muertas.

Ejemplo comparativo 5

RHABDOVIRUS QUIMÉRICOS

Un problema potencial con las composiciones víricas oncolíticas es el potencial de una respuesta inmunitaria en un paciente. Dicha respuesta inmunitaria puede truncar la eficacia de aplicaciones adicionales del virus oncolítico ya que una parte significativa del virus se puede neutralizar por el sistema inmunitario del paciente. Para evitar este problema sería preferible tener una pluralidad de composiciones víricas oncolíticas que sean inmunológicamente distintas. En este caso se puede aplicar un virus oncolítico diferente a un paciente para cada terapia posterior proporcionando de esta manera una actividad oncolítica sostenida que esté mínimamente afectada por la respuesta inmunitaria del huésped. En este punto, se construyeron varias composiciones víricas pseudotipadas y se ensayaron en cuanto a su capacidad para infectar células.

Par estudiar la posibilidad de la utilización de rhabdovirus oncolíticos que comprendan distintas proteínas G a partir de varios de los rhabdovirus, se construyeron distintos virus recombinantes. Cada recombinante incluía el armazón de VSV Indiana de tipo silvestre (genes N, P, M y L) a menos de que se especifique otra cosa. Además, los recombinantes incluían un gen indicador de luciferasa, sea de luciérnaga (FL) o de renilla (RL) entre el gen G y el gen L. La nomenclatura general utilizada para hacer referencia a los recombinantes es RVRaGx, donde RVR significa Rhabdovirus recombinante, (a) denota el origen de la proteína G o el gen tipo proteína G y (x) denota el número de versión.

RVR con proteína G de Isfahan. Se clonó un genoma de RVR en el vector pNX2VSV de manera que los sitios de restricción XhoI y NheI flanqueaban los genes G o tipo G. Se añadió la secuencia de parada inicio vírica al extremo 30 de todos los genes G o tipo G que codificaban la siguiente secuencia: CTCGAGGGTATGAAAAAAACTAACAGATATCACGGCTAG (SEQ ID NO: 25). El virus recombinante se pseudotipó con la proteína G de Isfahan que tiene una identidad de secuencia proteica del 37 % en comparación con VSV G Ind. El RVR que comprendía el indicador FDL se denominó RVRIsf (Isfahan) G1 (en el que la versión 1 indica la presencia del gen indicador FL).

Además, los estudios de neutralización con anticuerpo demostraron que el suero que comprende anticuerpos de ratones inmunizados con VSV WT no neutralizaban significativamente la actividad del RVR Isf G1 in vitro.

Además, cuando se inyectaron los ratones los ratones inmunizados con VSV WT con el RVRIsfG1 el virus con el ^{polipéptido Isf G es capaz de evadirse del sistema inmunitario. Como se muestra en la FIG.}6^{C, el RVRIsfG1 era}detectable en distintas localizaciones de los ratones inmunizados después de la inoculación vírica. El nivel de RVRIsfG1 que se detecta en los ratones inmunizados era similar al nivel detectado en animales de control intactos ^(FIG.6^{A). Por otra parte, no se detectaron virus en ratones inmunizados a los que se inoculó con VSV (FIG.}6^{B). Por}lo tanto, los virus oncolíticos que comprenden el polipéptido G de Isf escapan de la respuesta inmunitaria del huésped al que se administró previamente VSV in vivo.

Estos resultados se confirmaron adicionalmente inyectando tumores en ratones intactos inmunizados con VSV o virus recombinante y se determinó que el virus se producía a partir de las inyecciones. Como se muestra en la FIG.

7, el virus recombinante inyectado en los tumores de ratones inmunizados o intactos producía grandes cantidades de virus de al progenie. Por otra parte, la propagación de VSV inyectado en ratones inmunizados era apenas detectable.

^{Se construyeron también dos RVR adicionales que comrendían el Isf. El RVRisfG}2 ^{comprende un indicador genético RL en lugar del indicador genético FL del RVRIsfG1. También, el RVRIsfG}3 ^{comprende una proteína G VSV-Isf}quimérica. La proteína quimérica (SEQ ID NO: 19) comprende el ectodominio G de Isfahan con el dominio de G transmembrana y la cola citoplasmática de VSV.

RVR con proteína G de Chandipura. La G de Chandipura tiene una homología de secuencia proteica del 42 % con la G de VSV (Indiana). Se utilizó la misma estrategia de clolnación descrita anteriormente para construir el ^{RVRohaG1. Una curva de crecimiento de una etapa con RVRohaG}1 ^{demostraba que produce cantidades de virus similares en comparación con VSV (FIG.}8^{). Además, el RVR tenía una citotoxicidad similar en comparación con el}VSV (FIG. 9).

RVR con proteína G de Maraba. La G de Maraba tiene una homología de secuencia proteica el 83 % con la G de VSV (Indiana). Este es el primer informe de la secuencia de la proteína G de Maraba proporcionada como una secuencia de ADN en la SEQ ID NO: 20. Se utilizó la misma estrategia de clonación descita anteriormente para ^{construir RVRMarG1. Una curva de crecimiento de una etapa con RVRMarG}1 ^{demostraba que el título de virus}recombinante era mayor que el de VSV a las 48 y 72 h. Por lo tanto, el cambio de proteína G puede estabilizar el ^{virus y de esa manera aumentar el rendiminto (FIG. 10). Además, se demostró que el RVRMarG}1 ^{era citotóxico (FIG.}

11^{). Además, los ensayos de neutralización con anticuerpos demostraron que el suero de ratones inmunizados con VSV WT no neutralizaban la actividad de RVRMarG}1 ^{indicando que el RVE es capaz de evasión inmunitaria.}

RVR con Proteína G de Muir Springs. La G de Muir Springs tiene una homología de secuencia del 25,4 % con la G de VSV (Indiana). La secuencia de G de Muir Springs se proporciona en la SEQ ID NO: 21 (aminoácidos) y SEQ ID NO: 22 (ADN). Se utilizó la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir el RVRmuG 1.

RVR con proteína G del virus Klamath. Los experimentos de pseudotipado confimraron que la proteína G de ^{Klamath es funcional en un entorno con pH bajo (}6^,8^{), a diferencia de la G de VSV. Esto es de gran importancia ya}que se sabe que el centro tumoral es hipóxico y ácido. Por lo tanto, puede ser una ventaja tener un virus que pueda replicarse en dicho entorno. El VSV HRGFP-Klamath pseudotipado se generó de manera que los viriones contenían el genoma de un virus pero las proteínas de envoltura de ambos virus por co-infección en células CT26. 24 horas depuse de la co infección se recolectó el sobrenadante y se titularon las partículas pseudotipadas. El virus pseudotipado se utilizó entonces (junto con un virus de control para infectar células diana en medios de dos diferentes acideces. Los resultados muestran que la proteína G de Klamath era responsable de la capacidad de infección del virus a pH bajo.

Esencialmente se utilizó la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir el RVRKlaG2. Sin embargo, a diferencia de las estrategias previas, este recombinante incluye la G de Klamath además de la G de VSV (Indiana).

RVR con proteína G de virus Farmington (Far). El virus Farmington es un no vesiculovirus que no es neurotrópico y demuestra la formación de grandes sincitios.

RVR con proteína G de virus Bahía Grande (Bah). El virus Bahía Grande es un no vesiculovirus que no es neurotrópico.

RVR con proteína Env del retrovirus JSR. Como el VSV tiene una neurotoxicidad conocida, una estrategia por la que un ^vS^vrecombinante no infectara las neuronas sería ventajosa. La Env JSR es originalmente del gen de envoltura (Env) no neurotrópico de un retrovirus JSRV (un virus no neurotrópico). Se generó una quimera que comprendía el ectodominio Env del JSRV con el dominio transmembrana y cola citoplasmática de G de VSV (secuencia de ADN proporcionada como SEQ ID NO: 23).

RVR con proteína G de Ébola. El Ébola es un virus no neurotrópico con una glicoporteían que funciona como receptor de unión y media en la fusión con la membrana. La proteína G contiene un sitio de escisión furin en la posición de aminoácidos 497-501. Los productos de la escisión (GP1 y GP2) se unen por enlaces disulfuro y se piensa que actúan como un posible señuelo para neutralizar anticuerpos o como inmunomodulador. Sin embargo el sitio de escisión furin no es necesario para la infección ni el tropismo. La secuencia del ADN de la proteína G del Ébola se proporciona como SEQ ID NO: 24.

Referencias

Patente de EE. UU. 4.554.101

Patente de EE. UU. 4.683.195

Patente de EE. UU. 4.683.202

Patente de EE. UU. 4.684.611

Patente de EE. UU. 4.800.159

Patente de EE. UU. 4.879.236

Patente de EE. UU. 4.883.750

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Tronche y col., Mol. Cell Biol., 9(11):4759-4766, 1989.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un rhabdovirus oncolítico Farmington para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano mediante cirugía o terapia.

2. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un rhabdovirus oncolítico Farmington para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto en el que la composición se va a administrar al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el cáncer.

3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el cáncer es metastático.

4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la composición se administra mediante administración intraperitoneal, intravascular, intramuscular, intratumoral, subcutánea o intranasal, en particular en la que la composición se administra mediante administración intratumoral o intravascular.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la composición se administra múltiples veces.

6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la administración de una terapia anticáncer adicional.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la terapia anticáncer adicional es quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia.

8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la terapia anticáncer adicional comprende la administración al sujeto de un segundo virus oncolítico.

9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el segundo virus oncolítico es un virus vaccinia, herpesvirus, adenovirus, alfavirus, parvovirus o rhabdovirus.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el segundo virus oncolítico es un virus vaccinia.

11. Un rhabdovirus oncolítico Farmington para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto en el que el rhabdovirus oncolítico Farmington es para administrar al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el cáncer.

12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o el rhabdovirus Farmington para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en los que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central, cáncer pancreático, cáncer prostático, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer gastrointestinal, linfoma, cáncer de colon, melanoma, y cáncer de vejiga, en particular en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de mama, sistema nervioso central, melanoma, pulmón, ovárico, pancreático, de colon, de próstata y renal.

13. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o el rhabdovirus Farmington para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en los que el sujeto es un ser humano.

14. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o el rhabdovirus Farmington para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en los que el cáncer es un cáncer del sistema nervioso central.