ES2749381T3 - Vectores víricos Isfahan recombinantes - Google Patents

Abstract

Un virus Isfahan competente en replicación, recombinante que comprende un gen de proteína N que codifica una proteína N que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, un gen de proteína P que codifica una proteína P que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, un gen de proteína M que codifica una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, un gen de proteína G que codifica una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y un gen de proteína L que codifica una proteína L que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y que comprende además una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica un polipéptido heterólogo.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores víricos Isfahan recombinantes

Antecedentes

El virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV, de sus siglas en inglés) se ha desarrollado como una plataforma vectorial para una variedad de patógenos humanos (Finke y Conzelmann. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2005, 292:165-200; Jones et al. Nature Medicine. 2005, 11(7):786-90; Kahn et al. Journal of Virology. 2001, 75(22):11079-87; Kapadia et al. Virology. 2005, 340(2):174-82; Reuter et al. Journal of Virology.

2002, 76(17):8900-9; Roberts et al. Journal of Virology. 1999, 73(5):3723-32; Roberts et al. J Virol. 1998, 72(6):4704-11; Rose et al. Cell. 2001, 106(5):539-49), y un vector rVSV optimizado que expresa la proteína gag del VIH-1 ha completado la evaluación clínica (HVTN 090: accesible a través de la web mundial en URL clinicaltrials.gov/). A pesar de estos avances, quedan desafíos en el desarrollo de la plataforma del vector rVSV, incluida la posible inmunidad generada contra las proteínas del vector que pueden interferir con las inmunizaciones de refuerzo posteriores con vectores rVSV. Este posible problema se puede superar cuando los vectores rVSV se usan en regímenes de inmunización de sensibilización-refuerzo heterólogos con otros vectores inmunológicamente distintos (Amara et al. Science. 2001,292(5514):69-74; Amara et al. J Virol. 2002, 76(15):7625-31; Egan et al. AIDS Research and Human Retroviruses. 2005, 21(7):629-43; Hanke et al. J Virol. 1999, 73(9):7524-32; Ramsburg et al. Journal of Virology. 2004, 78(8):3930-40; Santra et al. J Virol. 2007; Xu et al. Journal of Virology. 2009, 83(19):9813-23). El cambio de serotipo de los vectores rVSV, logrado mediante el intercambio de la proteína G de superficie con la de un serotipo de vesiculovirus diferente, también aumenta la inmunogenicidad en los regímenes de sensibilizaciónrefuerzo en ratones (Rose et al. Journal of Virology. 2000, 74(23):10903-10). Sin embargo, la reactividad cruzada de las respuestas inmunes celulares dirigidas hacia las proteínas centrales de rVSV puede limitar este enfoque.

En vista de estas observaciones y posibles limitaciones, existe una necesidad de vectores heterólogos adicionales para su uso solos o en combinación con vectores rVSV.

Sumario

Las realizaciones de la invención incluyen composiciones inmunogénicas y procedimientos relacionados con los vesiculovirus, tales como el virus Isfahan (ISFV, de sus siglas en inglés) solo o en combinación con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y su uso como agentes terapéuticos y/o profilácticos. Determinados aspectos incluyen procedimientos y composiciones inmunogénicas que comprenden un vesiculovirus recombinante que codifica uno o más polipéptidos heterólogos. "Virus recombinante" se refiere a cualquier virión o genoma vírico que sea igual o diferente a un virus de tipo silvestre debido a una reordenación, eliminación, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos en el genoma vírico de tipo silvestre. En particular, la expresión incluye virus recombinantes generados por la intervención de un ser humano. En determinados aspectos, el vesiculovirus es un virus recombinante Isfahan (rISFV, de sus siglas en inglés). En determinados aspectos, el rISFV es un virus competente en replicación. Aplicado a un virus recombinante, "competente en replicación" significa que el virus es capaz de infección celular; replicación del genoma vírico; y producción y liberación de nuevas partículas víricas; aunque no es necesario que una o más de estas características ocurran a la misma velocidad que en el mismo tipo celular infectado por un virus de tipo silvestre, y pueden ocurrir a una velocidad más rápida o más lenta.

En un aspecto adicional, el rISFV comprende (i) una proteína N que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, (ii) una proteína P que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, (iii) una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, (iv) una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y (v) una proteína L que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

El rISFV comprende además una unidad de transcripción (UT) heteróloga. Una unidad de transcripción se refiere a una secuencia polinucleotídica heteróloga (a) flanqueada por una señal de inicio de la transcripción y una señal de parada de la transcripción (que incluye una secuencia de poliadenilación), y (b) que codifica uno o más polipéptidos heterólogos diana. En determinadas realizaciones, la UT heteróloga es la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a o 6a UT en el genoma del virus. En determinados aspectos, la UT heteróloga codifica dos o más polipéptidos heterólogos. En otros aspectos, se incluyen dos UT heterólogas en el genoma del virus, con una UT heteróloga insertada en una posición en el genoma del virus y la segunda UT heteróloga insertada en una posición diferente en el genoma del virus.

Otro mecanismo para expresar una secuencia polinucleotídica heteróloga es unir la secuencia heteróloga a un gen ISF a través de un péptido 2A. Las expresiones "2A", "péptido 2A" o "péptido similar a 2A" se refieren a péptidos que se han utilizado con éxito para generar múltiples proteínas a partir de un único marco de lectura abierto. Estos péptidos son pequeños (18-22 aminoácidos) y tienen secuencias aminoterminales divergentes, pero todos contienen un motivo PGP en el extremo C. A través de un mecanismo de omisión ribosómica, el péptido 2A evita la formación normal de enlaces peptídicos entre una glicina y un resto de prolina en el extremo C del péptido. Estas secuencias de tipo 2A y 2A son conocidas en la materia y pueden seleccionarse fácilmente para dicho uso. Véase, por ejemplo, Szymczak-Workman et al, en Cold Spring Harbor Protocols 2012, doi 10.1101 /pdb.ip067876; y Friedmann y Rossi (eds), Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY Ee .UU., 2007, entre otros. Uno de estos péptidos 2A es el péptido T2A, que se aísla del virus Thosea asigna y tiene la secuencia EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 68). En aspectos adicionales, se puede incluir un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, de sus siglas en inglés) en un gen que codifica al menos dos polipéptidos para permitir la transcripción independiente de la caperuza de la región de codificación cadena abajo. Se conocen varias secuencias de IREs y se pueden seleccionar de la base de datos de IRESite que está disponible en la red mundial en iresite.org.

En determinados aspectos, el gen G de rISFV codifica una proteína G que tiene un truncamiento carboxiterminal, en particular un truncamiento de 20 a 25 aminoácidos. En determinados aspectos, el genoma de rISFV comprende en 3' a 5' una secuencia líder de ISFV, un marco de lectura abierta (ORF, de sus siglas en inglés) de la proteína P de ISFV, un ORF de la proteína M de ISFV, un ORF de la proteína G de ISFV, un ORF de la proteína N de ISFV, un ORF de la proteína L de ISFV y una secuencia de avance de ISFV, junto con la secuencia polinucleotídica heteróloga o la UT heteróloga en cualquier posición dentro del genoma de rISFV. En determinados aspectos, la UT heteróloga se encuentra en la posición 5 del genoma de rISFV. En determinados aspectos, el polinucleótido heterólogo codifica un polipéptido inmunogénico. En otros aspectos, el polinucleótido heterólogo codifica uno o más antígenos. El antígeno puede ser un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno específico de tumor o cáncer, un antígeno parásito o un alérgeno.

Determinadas realizaciones están dirigidas a un rISFV con un orden de genes, de 3' a 5' en relación con el ARN de sentido (-), de N-P-M-G-L-(H), N-P-M-G-(H)-L, N-P-M-(H)-G-L, N-P-(H)-M-G-L, N-(H)-P-M-G-L, (H)-N-P-M-G-L, P-N-M-G-L-(H), P-N-M- G-(H)-L, P-N-M-(H)-G-L, P-N-(H)-M-G-L, P-(H)-N-M-G-L, (H)-P-N-M-G-L, P-M-N-G-L-(H), P-M-N-G-(H)-L, P-M-N-(H)-G- L, P-M-(H)-N-G-L, P-(H)-M-N-G-L, (H)-P-M-N-G-L, P-M-G-N-L-(H), P-M-G-N-(H)-L, P-M-G-(H)-N-L, P-M-(H)-G-N-L, P-(H)-M-G-N-L, (H)-P-M-G-N-L, P-M-G-L-N-(H), P-M-G-(H)-L-N, P-M-G-L(H)-N, P-M-(H)-G-L-N, P-(H)-M-G-L-N o (H)-P-M-G-L-N en el que (H) es una UT que comprende al menos un polinucleótido heterólogo. En determinados aspectos, el rISFV tiene un orden genético P-M-G-N-(H)-L. En determinados aspectos, el genoma de rISFV está codificado en un vector de expresión. En una realización adicional, el vector de expresión es un vector de ADN, por ejemplo, un vector plasmídico. Las expresiones "combinación de genes", "gen barajado", "barajado", "combinado", "reordenamiento génico" y "translocación génica" se usan indistintamente y se refieren a una alteración en el orden de los genes del vesiculovirus en el genoma vírico.

Determinadas realizaciones están dirigidas a un vector de expresión que codifica el ARN recombinante de sentido negativo descrito anteriormente. En determinados aspectos, el vector de expresión es un vector de ADN.

Otras realizaciones están dirigidas a una célula huésped que comprende el vector de expresión descrito anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vector de expresión" pretende incluir un plásmido o virus que es capaz de sintetizar una secuencia polinucleotídica heteróloga codificada por el vector. En determinados aspectos, un vector se puede replicar y expresar un ácido nucleico codificado.

Aún otras realizaciones están dirigidas a una partícula vírica que comprende el ARN recombinante descrito anteriormente. Como se usa en el presente documento, una "partícula vírica" es una entidad infecciosa que proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica uno o más polipéptidos para expresarse en un huésped.

Las composiciones inmunogénicas pueden incluir partículas víricas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes descritos en el presente documento. Determinados aspectos están dirigidos a procedimientos para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.

Los procedimientos y composiciones de la invención pueden incluir un segundo virus terapéutico. Se puede seleccionar un segundo virus entre adenovirus recombinantes u oncolíticos, virus vaccinia, virus de la enfermedad de Newcastle, virus del herpes y rabdovirus. En otros aspectos, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos, el segundo virus terapéutico es un rVSV. En un aspecto adicional, el rVSV codifica el mismo antígeno o un antígeno relacionado presente en o sobre la misma célula u organismo diana.

Se puede administrar un vesiculovirus recombinante (por ejemplo, rISFV como se describe en el presente documento) a un sujeto que necesita una respuesta inmune terapéutica o profiláctica. Las composiciones de vesiculovirus recombinantes se pueden administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces con uno o más vesiculovirus recombinantes. La composición administrada puede tener 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o más partículas víricas o unidades formadoras de placa (ufp). La administración puede ser por vía intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intratumoral (para tumores sólidos), intramuscular, intradérmica, subcutánea, oral o intranasal. En determinados aspectos, las composiciones se administran sistemáticamente, de manera particular, mediante administración intravascular, que incluye inyección, perfusión y similares.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender además administrar una segunda terapia antineoplásica o antibiótica. En determinados aspectos, un segundo agente antineoplásico es un quimioterapéutico, un radioterapéutico, un inmunoterapéutico, cirugía o similar. En otros aspectos, uno segundo tratamiento antibiótico es un antibiótico o un antivírico.

rISFV es serológica y filogenéticamente diferente de rVSV. Esta distinción se puede utilizar para optimizar la eficacia protectora y la inmunogenicidad de un régimen inmunoestimulante. Los vectores rISFV y rVSV se pueden emplear en regímenes de sensibilización-refuerzo. Se puede usar un primer vesiculovirus recombinante en cualquier número de combinaciones con un segundo vesiculovirus recombinante.

El término "proporcionar" o "administrar" se usa de acuerdo con su significado ordinario "suministrar o facilitar para su uso". En algunas realizaciones, se proporciona un antígeno mediante administración directa (por ejemplo, mediante inyección intramuscular), mientras que, en otras realizaciones, el antígeno se proporciona eficazmente mediante la administración de un ácido nucleico que codifica el antígeno. En determinados aspectos, la invención contempla composiciones que comprenden diversas combinaciones de ácido nucleico, antígenos, péptidos y/o epítopos.

En determinados aspectos, una partícula vírica, polipéptido o ácido nucleico puede ser una partícula vírica, polipéptido o ácido nucleico aislado. El término "aislado" puede referirse a una partícula vírica, ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, material bacteriano, material vírico o medio de cultivo (por ejemplo, cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otros productos químicos (por ejemplo, cuando se sintetizan químicamente). Además, un compuesto aislado se refiere a uno que puede administrarse a un sujeto como un compuesto aislado; en otras palabras, el compuesto no puede considerarse simplemente "aislado" si se adhiere a una columna o se integra en un gel de agarosa. Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" o "péptido aislado" es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como un fragmento y/o no está normalmente en el estado funcional. El uso de la palabra "un" o "uno/una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar de error para el dispositivo o procedimiento empleado para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones, se usa para significar "y/o", a menos que se indique explícitamente, se refiere solo a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o".

Como se usa en esta especificación y en la(s) reivindicación(es), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, como "incluyen" e "incluye") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, como "contienen" y "contiene") son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos adicionales no citados o etapas del procedimiento.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la invención, se dan solo a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y ámbito de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones de especificación presentadas en el presente documento.

La Figura 1 es un árbol filogenético de máxima probabilidad del género Vesiculovirus basado en secuencias de nucleótidos del gen N.

La Figura 2 representa los sitios de restricción utilizados en la estrategia de clonación para la generación de un clon de ADNc genómico completo de Isfahan.

La Figura 3A es un diagrama de un vector rISFV [también denominado rISFV-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5] que codifica una poliproteína E3-E2-6K-E1 del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV); La Figura 3B es una transferencia Western que representa la expresión de proteínas del VEEV (carril 3).

La Figura 4 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de la proteína N de varios vesiculovirus. Las regiones de homología de aminoácidos están sombreadas.

La Figura 5 es una fotografía de los tamaños de placa observados generados por varios rISFV que expresan una proteína gag del VIH-1 modificada.

La Figura 6 representa el porcentaje de supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4 [también denominado rISFV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5] que expresa proteínas E3-E1 de la cepa FL93 del virus de la encefalitis equina del este (EEEV, de sus siglas en inglés), seguido de una exposición letal con EEEV-FL93. La Figura 7 representa el porcentaje de supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4 [también denominado rISFV-N4-G3-(VEEV Z^pC E3-E1)5] que expresan proteínas E3-E1 de la cepa ZPC del VEEV, seguido de una exposición letal con VEEV-ZPC.

La Figura 8 representa el porcentaje de supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4 [también denominado rISFV-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5] que expresa proteínas E3-E1 del VEEV-ZPC en 108 o 107 ufp y del serotipo rVSV Indiana N4CT1 (rVSVINN4CT1) [también denominado rVSVIN-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5] que expresa las proteínas E3-E1 del VEEV-ZPC a 108 o 107 ufp, seguido de una exposición letal con VEEV-ZPC. La Figura 9 representa el porcentaje de supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4 que expresan proteínas E3-E1 del EEEV-FL93 y con rISFV-N4 que expresan proteínas E3-E1 del VEEV-ZPC [juntas, también denominadas rISFV-N4G3-(VEEV ZPC E3-E1)5/rIS- FV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5], seguido de una exposición letal con EEEV-FL93.

La Figura 10 representa el porcentaje de supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4 que expresan proteínas E3-E1 del EEEV-FL93 y con rISFV-N4 que expresan proteínas E3-E1 del VEEV-ZPC [juntas, también denominadas rISFV-N4G3-(VEEV ZPC E3-E1)5/rIS- FV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5], seguido de una exposición letal con VEEV-ZPC.

La Figura 11 ilustra los cuatro aminoácidos que se pueden cambiar en la secuencia de la proteína N sin afectar negativamente la función biológica. Un epítopo conocido en ratones BALB/c está subrayado.

La Figura 12 ilustra virus recombinantes probados en el estudio PBS-Mu-062a.

La Figura 13 es un resumen del diseño del estudio PBS-Mu-062a.

La Figura 14 ilustra respuestas ELISpot del interferón gamma (IFN-^y) a un epítopo gag del VIH-1 en el estudio PBS-Mu-062a. La Figura 15 ilustra los rISFV probados en el estudio de sensibilización/refuerzo PBS-Mu-062b. La Figura 16 es un resumen del diseño del estudio PBS-Mu-062b.

LA Figura 17 ilustra respuestas ELISpot del IFN-y a un epítopo dominante único de Gag del VIH-1 en el estudio PBS-Mu-062b.

La Figura 18 ilustra respuestas ELISpot del IFN-y a VSV-N en el estudio PBS-Mu-062b.

La Figura 19 representa los pesos corporales de ratones inmunizados con rISFV-N4G-CTA25(CHIKV GP)1 frente a ratones no inmunizados después de la exposición con el aislado LaReunion de CHIKV.

La Figura 20 representa la hinchazón de la almohadilla plantar de ratones inmunizados con rISFV-N4G-CTA25(CHIKV GP)1 frente a ratones no inmunizados después de la exposición con el aislado LaReunion de CHIKV.

La Figura 21 representa la viremia de ratones inmunizados con rISFV-N4G-CTA25(CHIKV GP)1 frente a ratones no inmunizados después da la exposición con el aislado LaReunion de CHIKV.

La Figura 22 representa la supervivencia de ratones inmunizados con rISFV-N4G-CTA25(CHIKV GP)1, seguido de una exposición letal con el aislado LaReunion de CHIKV.

Descripción

El virus Isfahan (ISFV) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV) son miembros del género Vesiculovirus en la familia Rhabdoviridae. Los rabdovirus prototípicos son el virus de la rabia (RV, de sus siglas en inglés) y el VSV. La Rhabdoviridae es una familia de virus en forma de bala que tiene genomas de ARN de sentido (-) de cadena simple no segmentados. Hay más de 250 rabdovirus conocidos que infectan mamíferos, peces, insectos o plantas. La familia comprende al menos 5 géneros: (1) Lyssavirus: que incluye el RV, otros virus de mamíferos y algunos virus de insectos; (2) Vesiculovirus: que incluye el VSV; (3) Ephemerovirus: que incluye el virus de la fiebre efímera bovina; (4) Cytorhabdovirus: que incluye virus del amarilleamiento necrótico de la lechuga; y (5) Nucleorhabdovirus: que incluye el virus del enanismo amarillo de la patata.

El genoma de ARN vírico de sentido negativo (ARNv) de rabdovirus tiene una longitud aproximada de 11 a 15 kb con una secuencia líder de aproximadamente 50 nucleótidos en 3' y una secuencia de avance no traducida de aproximadamente 60 nucleótidos en 5'. El ARN genómico vírico (ARNv) del rabdovirus generalmente contiene 5 genes que codifican 5 proteínas principales: proteína de nucleocápside (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glucoproteína (G) y proteína grande (L) (también conocida como la polimerasa). Los rabdovirus tienen una señal de poliadenilación conservada en el extremo 5' de cada gen y una región intergénica corta no transcrita entre cada uno de los 5 genes. Normalmente, estos genes están en el orden 3'-N-P-M-G-L-5' del genoma vírico. El orden de los genes dicta los niveles de expresión de proteínas en la célula infectada. Cualquier manipulación de un genoma de rabdovirus para producir un virus infeccioso incluirá normalmente al menos cinco unidades de transcripción (UT) que codifican al menos 4, y generalmente 5, de las proteínas víricas principales para mantener la capacidad de infectar y replicarse a niveles altos.

I. VESICULOVIRUS RECOMBINANTES

Se ha demostrado que los genomas de vesiculovirus acomodan más de un gen extraño que abarca al menos tres kilobases (kb) de secuencia de nucleótidos adicional. Los vectores de vesiculovirus, que han sido suficientemente atenuados (mediante, por ejemplo, combinación de genes y/o truncamiento de proteínas víricas), han demostrado estabilidad genética, y el genoma del virus no experimenta recombinación detectable. Además, dado que la replicación vírica es citoplasmática, el ARN genómico vírico no se integra en el genoma de la célula huésped. También, estos virus de ARN de cadena negativa poseen secuencias de control transcripcional relativamente simples y bien caracterizadas, que permiten una expresión consistente de genes extraños. El nivel de expresión de genes extraños puede modularse mediante el cambio de la posición del gen extraño con respecto al promotor único de transcripción vírica en 3' (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 6.136.585 y 8.287.878, entre otras). El gradiente de 3' a 5' de expresión génica refleja la probabilidad decreciente de que la ARN polimerasa dependiente de ARN vírico transcrito transcribirá con éxito cada señal de parada/inicio de la transcripción encontrada en las uniones genéticas a medida que avanza a lo largo de la plantilla del genoma. Por lo tanto, los genes extraños colocados cerca del promotor de transcripción terminal en 3' se expresan abundantemente, mientras que los insertados en posiciones genómicas más distales, menos.

El VSV se replica a títulos altos en una gran variedad de diferentes tipos de células, y las proteínas víricas se expresan en gran abundancia. Esto no solo significa que el VSV actuará como un posible vector de expresión de genes extraños funcionales, sino también, que los vectores rVSV relevantes pueden graduarse a niveles de fabricación en líneas celulares aprobadas para la producción de productos biológicos humanos. Este vector de virus competente en replicación produce pocos o ningún síntoma de enfermedad o patología en seres humanos sanos, incluso ante una replicación vírica sustancial (Tesh, R. B. et al, 1969 Am. J. Epidemiol., 90:255-61). Además, la infección humana con y, por lo tanto, la inmunidad preexistente a, VSV es rara. Por lo tanto, el rVSV es útil como vector.

Si bien se han desvelado una variedad de rVSV en la materia con sus genes "barajados" en posiciones del genoma diferentes de las del VSV de tipo silvestre (véase la Patente de Estados Unidos N.° 8.287.878; la Patente de Estados Unidos N.° 6.596.529, y referencias citadas allí), puede ser útil para que el gen N esté en la cuarta posición (N4) en el orden génico del VSV como parte de una combinación de mutaciones, de modo que el virus esté suficientemente atenuado. Para atenuar más rVSV, la cola citoplasmática de la proteína G puede truncarse (G-CT).

Diversas realizaciones del rVSV descritas anteriormente emplean secuencias VSV procedentes del serotipo VSV Indiana. Sin embargo, otros vesiculovirus conocidos (por ejemplo, el virus Isfahan) o los serotipos VSV pueden sustituirse fácilmente por las secuencias ejemplificadas de las realizaciones descritas dadas las enseñanzas de esta especificación.

Los promotores adecuados para su uso en la generación de vectores descritos en el presente documento pueden seleccionarse de promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de tejido y otros. Los ejemplos de promotores constitutivos que no son específicos en su actividad y se emplean en la expresión de moléculas de ácido nucleico de esta invención incluyen, sin limitación, aquellos promotores identificados en la Solicitud de Patente Internacional N.° WO2004/093906 y la Patente de Estados Unidos N.° 8.287.878. El promotor de hCMV se usa para expresar proteínas del VSV para fines de rescate del rVSV en una técnica de genética inversa. Otros promotores de pol II que pueden usarse incluyen, entre otros, el promotor de ubiquitina C (UbiC), el promotor de fosfoglicerato cinasa (^pG^k , de sus siglas en inglés), el promotor de citomegalovirus bovino (bCMV, de sus siglas en inglés), un promotor de beta-actina con un potenciador de CMV IV cadena arriba (CAGGS) y el promotor alfa del factor de alargamiento 1 (EF1A, de sus siglas en inglés). En determinadas realizaciones, se usa el promotor de ARN polimerasa T7.

Determinadas realizaciones de la invención están dirigidas a vesiculovirus recombinantes, incluidos el virus de Isfahan recombinante (rISFV) solo o en combinación con el virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV), por ejemplo, en un régimen de sensibilización/refuerzo, así como vectores que codifican los vesiculovirus recombinantes y los procedimientos de uso de dichos vesiculovirus y vectores recombinantes. Los vesiculovirus recombinantes se pueden producir (1) utilizando transfecciones de ADNc o (2) ADNc transfectados en una célula, que además se infecta con un minivirus que proporciona en trans los componentes o actividades restantes necesarios para producir un vesiculovirus recombinante. Al usar cualquiera de estos procedimientos (por ejemplo, minivirus, línea celular auxiliar o transfección de ADNc), los componentes mínimos para producir un ARN empaquetado requieren una molécula de ARN que contenga las señales que actúan en cis para (1) la encapsidación del ARN genómico por la proteína N, y (2) la replicación de un ARN genómico equivalente.

Un elemento replicante o replicón es una cadena de ARN que contiene mínimamente en los extremos 3' y 5' la secuencia líder y la secuencia de avance de un vesiculovirus; en el genoma de sentido (-), la líder está en el extremo 3' y la de avance está en el extremo 5'. El ARN colocado entre estas dos señales de replicación puede replicarse. Las regiones líder y de avance contienen los elementos mínimos que actúan en cis para fines de encapsidación mediante la proteína N y para la unión de la polimerasa necesaria para iniciar la transcripción y la replicación.

Para cualquier gen contenido dentro de un genoma de vesiculovirus recombinante, el gen puede estar flanqueado por las señales apropiadas de inicio y terminación de la transcripción que permiten la expresión de esos genes y la producción de productos proteicos codificados. En particular, se usa un polinucleótido heterólogo, que no está codificado por el virus como aislado de la naturaleza o contiene una región codificante en una posición, forma o contexto que no se encuentra de manera natural en un virus.

Un vesiculovirus recombinante para su uso como composición terapéutica o inmunogénica puede, en determinados aspectos, incluir reorganizar el orden génico del virus. En determinados aspectos, el gen N se aleja de la posición proximal del promotor en 3', posición 1. En un aspecto adicional, el gen N se mueve a la posición 2, 3, 4 o 5. En determinados aspectos, el gen N está en la posición 4 en el genoma.

En determinadas realizaciones, el vesiculovirus recombinante comprende un polinucleótido heterólogo. En determinados aspectos, un polinucleótido heterólogo codifica un antígeno. En otros aspectos, el polinucleótido o poligén heterólogo que codifica el antígeno o antígenos inductores de la respuesta inmune heterólogos seleccionados se encuentra en la posición 1, 2, 3, 4, 5 o 6 del orden génico.

A. Producción de vesiculovirus recombinante

La transcripción y replicación de genomas de ARN víricos de cadena negativa, no segmentados y de sentido negativo se logra a través de la actividad enzimática de un complejo proteico multimérico que actúa sobre el núcleo de la ribonucleoproteína (nucleocápside). Las secuencias víricas se reconocen cuando son encapsidadas por la proteína N en la estructura de la nucleocápside. Se reconoce que las secuencias promotoras terminales genómicas y antigenómicas de la estructura de la nucleocápside inician las vías de transcripción o replicación.

Por tanto, se produce un vesiculovirus recombinante atenuado y modificado genéticamente como se describe en el presente documento de acuerdo con procedimientos de rescate conocidos en la materia y, más específicamente, como se describe en los ejemplos a continuación. Se puede usar cualquier virus Isfahan, cepa VSV o serotipo adecuado, incluyendo, aunque no de forma limitativa, VSV Indiana, VSV Nueva Jersey, VSV Chandipura, v Sv Glasgow y similares. Como se ha descrito anteriormente, además de las secuencias polinucleotídicas que codifican formas atenuadas del virus Isfahan o del VSV, la secuencia polinucleotídica también codifica secuencias polinucleotídicas heterólogas o marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican una proteína o proteínas heterólogas seleccionadas.

Las circunstancias normales (aunque no necesariamente exclusivas) para el rescate incluyen una célula de mamífero apropiada en la que la polimerasa T7 está presente en el citoplasma celular para impulsar la transcripción del ARN monocatenario antigenómico (o genómico) del vector de transcripción genómico vírico que contiene ADNc. Ya sea transcripcionalmente conjunta o poco después, esta transcripción de ARN antigénico (o génico) vírico es encapsidada en plantillas funcionales por la nucleoproteína y es activada por los componentes de polimerasa requeridos producidos simultáneamente a partir de plásmidos cotransfectados que expresan las proteínas requeridas que actúan en trans específicas de virus. Estos eventos y procedimientos conducen al requisito previo de la transcripción de ARNm víricos, la replicación y amplificación de nuevos genomas y, por lo tanto, la producción de una nueva progenie de vesiculovirus, es decir, el rescate.

Los vectores de transcripción y expresión son normalmente vectores plasmídicos diseñados para la expresión en la célula huésped. Los vectores de expresión que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas que actúan en trans necesarias para la encapsidación, transcripción y replicación expresan estas proteínas a partir de un vector de expresión o al menos dos vectores diferentes.

Se puede colocar un ADN clonado equivalente de un genoma de vesiculovirus entre un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN adecuado (por ejemplo, el promotor de ARN polimerasa T7) y una secuencia de ribozima auto escindible (porejemplo, la ribozima delta de hepatitis), y se inserta en un vector de transcripción adecuado (por ejemplo, un plásmido bacteriano). Este vector de transcripción proporciona una plantilla de ADN fácilmente manipulable a partir de la cual la ARN polimerasa (por ejemplo, la Ar N polimerasa t 7) puede transcribir fielmente una copia de ARN monocatenario del ADNc de vesiculovirus con los extremos 5' y 3'. La orientación de la copia de ADNc del virus y el promotor flanqueante y las secuencias de ribozima determinan si se transcriben los ARN antigénicos o génicos equivalentes. También se requieren para el rescate de la nueva progenie de vesiculovirus, las proteínas de soporte que actúan en trans específicas de vesiculovirus necesarias para encapsidar los transcritos de ARN génico o antigénico monocatenarios desnudos en plantillas de nucleocápsides funcionales, y para iniciar la transcripción y replicación vírica: la proteína vírica de la nucleocápside (N), la fosfoproteína (P) asociada a polimerasa y la proteína polimerasa (L).

En resumen, un procedimiento para generar un vesiculovirus recombinante comprende introducir en una célula huésped un vector de expresión de ADNc vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento. En determinados aspectos, el vector de expresión comprende un promotor T7 cadena arriba de la posición 1 (P¹), y un sitio de ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV Rz) y una secuencia de terminación T7 cadena abajo de la última posición de una secuencia de ácido nucleico de vesiculovirus recombinante seleccionada. El promotor T7 dirige la síntesis de transcritos de ARN vírico antigenómico a partir del vector de expresión cuando está en presencia de la ARN polimerasa de T7.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además transfectar de manera transitoria una célula huésped con un plásmido que expresa la ARN polimerasa T7. En otras realizaciones, el procedimiento implica además cotransfectar la célula huésped con uno o más plásmidos que expresan al menos las proteínas víricas N, P y L de un vesiculovirus (y opcionalmente M y G). En algunas realizaciones, estas proteínas de vesiculovirus se expresan en la célula huésped usando un sistema de expresión dependiente de ARN polII. Otras realizaciones incluyen etapas tales como el choque térmico de las células huésped que contienen el vector de expresión, la polimerasa T7 y las proteínas víricas de un vesiculovirus recombinante después de la transfección con ADN plasmídico (ADNp). Las células huésped transfectadas o el sobrenadante obtenido de las células huésped transfectadas pueden transferirse a un cultivo de células de expansión frescas. El vesiculovirus recombinante infeccioso ensamblado puede recuperarse luego del cultivo.

En otros aspectos, un vesiculovirus recombinante competente en replicación puede aislarse y "rescatarse" usando técnicas conocidas en la materia (Ball, L. A. et al. 1999 J. Virol., 73:4705-12; Conzelmann, 1998, Ann. Rev. Genet., 32:123-162; Roberts y Rose, 1998, Virol., 247:1-6). Véase, también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 8.287.878; 6.168.943; y 6.033.886; y la publicación de patente internacional N.° WO99/02657. Los procedimientos para producir virus de ARN recombinante se denominan en la materia procedimientos de "rescate" o de "genética inversa". Procedimientos ejemplares de rescate para VSV se describen en las patentes de Estados Unidos 6.033.886 y 6.596.529, y la publicación PCT WO 2004/113517.

Las técnicas adicionales para llevar a cabo el rescate de virus tales como VSV se describen en la Patente de Estados Unidos 6.673.572 y la publicación de Estados Unidos número US2006/0153870.

Las células huésped utilizadas en el rescate de los vesiculovirus son aquellas que permiten la expresión de los vectores de los constituyentes necesarios para la producción de vesiculovirus recombinantes. Dichas células huésped pueden seleccionarse de una célula eucariota, tal como una célula de vertebrado. En general, las células huésped proceden de una célula humana, tal como una célula de riñón embrionario humano (por ejemplo, 293). Las células Vero, así como muchos otros tipos de células, también se usan como células huésped como se describe en las patentes de Estados Unidos y la solicitud publicada citada anteriormente. En determinadas realizaciones, se añade un reactivo facilitador de la transfección para aumentar la absorción de ADN por las células. Muchos de estos reactivos son conocidos en la materia (por ejemplo, fosfato de calcio, lípido catiónico LIPO-FECTAMINE® (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y lípido catiónico EFFECTENE® (Qiagen, Hilden, Alemania).

El vesiculovirus rescatado se analiza luego para determinar su fenotipo deseado (morfología de la placa y atenuación de la transcripción y replicación), primero mediante medios in vitro. El vesiculovirus también se prueba in vivo en un modelo de neurovirulencia animal. Por ejemplo, se establecen modelos de ratón y/o hurón para detectar neurovirulencia. En resumen, grupos de diez ratones son inyectados intracranealmente (IC) con cada uno de un intervalo de concentraciones de virus que abarcan la dosis anticipada de DL⁵⁰ (una dosis que es letal para el 50 % de los animales). Por ejemplo, las inoculaciones IC que contienen virus a 102, 103, 104 y 105 ufp se usan donde la DL⁵⁰ anticipada para el virus está en el intervalo de 103-104 ufp. Las formulaciones de virus se preparan mediante dilución en serie de reservas de virus purificados en PBS. Luego, los ratones se inyectan a través de la parte superior del cráneo con la dosis requerida, en 25 pl de PBS. Los animales se monitorean diariamente por pérdida de peso, morbilidad y muerte. La DL⁵⁰ para un vector de virus se calcula luego a partir de la muerte acumulada de ratones en el intervalo de concentraciones analizadas.

Para determinar la inmunogenicidad o antigenicidad mediante la detección de respuestas inmunes humorales, se usan varios inmunoensayos conocidos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando oro coloidal, enzimas o marcadores de radioisótopos, por ejemplo), transferencias Western, reacciones de inmunoprecipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, ensayos de neutralización, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se mide mediante la detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta mediante la medición de la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. En otra realización más para detectar inmunogenicidad, las respuestas mediadas por linfocitos T se analizan mediante procedimientos estándar, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo, ensayos de tetrámero, ensayos ELISpot o ensayos de hipersensibilidad de tipo retardado in vivo.

Los términos "aislamiento" o "que aísla" de un vesiculovirus significan el procedimiento de cultivo y purificación de las partículas del virus a partir de restos celulares y similares. Un ejemplo sería tomar el sobrenadante que contiene el virus de un cultivo celular que produce vesiculovirus y pasarlo a través de un filtro de tamaño de poro de 0,1-0,2 micrómetros (por ejemplo, Millex-GS, Millipore) para eliminar los restos celulares. Alternativamente, los viriones se pueden purificar usando un gradiente, tal como un gradiente de sacarosa. Las partículas víricas recombinantes se pueden granular y resuspender en cualquier excipiente o vehículo que se desee. Los títulos pueden determinarse mediante un ensayo de placa estándar o mediante inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos específicos para proteínas particulares.

En determinados aspectos, los vesiculovirus que codifican o contienen uno o más componentes proteicos (proteínas N, P, M, G y/o L) y un polinucleótido heterólogo se han construido con una o más mutaciones o variaciones en comparación con un virus o proteínas víricas de tipo silvestre de manera que el virus tenga propiedades deseables para expresar polinucleótidos heterólogos, a la vez que tiene características que no están presentes en el virus como se aisló originalmente. Los procedimientos descritos en el presente documento proporcionan varios ejemplos de protocolos para implementar procedimientos y composiciones de la invención. Proporcionan antecedentes para generar virus mutantes o variantes mediante el uso tecnología de ácido nucleico o de ADN recombinante.

B. Construcciones del virus Isfahan (ISFV)

El virus Isfahan (ISFV) es un miembro del género Vesiculovirus en la familia Rhabdoviridae. El ISFV se aisló por primera vez de las moscas de arena en Irán en 1975 (Tesh et al. The American Journal of Tropical Medicine and hygiene. 1977; 26(2):299-306). El ISFV parece estar geográficamente restringido a Irán y algunos países vecinos, en los que hay evidencia serológica de infección humana (Tesh et al., The American journal of tropical medicine and hygiene. 1977, 26(2):299-306; Gaida- movich et al., Voprosy Virusologii. 1978, (5):556-60). La infección con ISFV no se ha relacionado con la enfermedad humana y, a diferencia del Vesiculovirus prototípico, el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el ISFV no parece ciclar en el ganado y/o causar lesiones vesiculares en animales inoculados experimentalmente (Wilks y House, J Hyg (Lond). 1986, 97(2):359-68). El ISFV es morfológicamente similar al VSV (Tesh et al. The American Journal of Tropical Medicine and Higiene. 1977; 26(2):299-306) y tiene una organización genómica similar, que incluye secuencias reguladoras de replicación y transcripción altamente conservadas (Marriott, Arch Virol. 2005, 150(4):671-80). Sin embargo, ambos virus son serológicamente distintos (Tesh et al. The American Journal of Tropical Medicine and Higiene. 1977; 26(2):299-306) y un análisis filogenético de vesiculovirus muestra una divergencia evolutiva sustancial (FIG. 1), basada en una alineación de aminoácidos de las proteínas víricas.

El virus Isfahan comprende un genoma de ARN de cadena negativa no segmentado de aproximadamente 11 kb que codifica cinco proteínas víricas principales abreviadas N, P, M, G y L. La secuencia de nucleótidos del complemento (5' a 3') del genoma vírico Isfahan se proporciona en la SEQ ID NO: 1. El orden genómico de 3' a 5' en el genoma de ARN de sentido negativo codifica proteínas denominadas como nucleocápside (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glucoproteína transmembrana (G) y polimerasa (L), es decir, 3'- N-P-M-G-L-5'. La nucleocápside está implicada en la encapsidación del genoma. Se proporciona una secuencia de aminoácidos de un ejemplo de la proteína N del virus Isfahan como SEQ ID NO: 2. La proteína P es una fosfoproteína implicada en la síntesis de ARN. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de la proteína P del virus Isfahan como SEQ ID NO: 3. La proteína M es una proteína matriz. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de la proteína M del virus Isfahan como SEQ ID NO: 4. La proteína G es una glucoproteína. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de la proteína G del virus Isfahan como SEQ ID NO: 5. La proteína L es una polimerasa grande implicada en la síntesis de ARN. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de la proteína L del virus Isfahan como SEQ ID NO: 6.

La divergencia de ISFV de VSV se puede usar para ayudar a los regímenes terapéuticos y profilácticos mediante (1) el uso de rISFV como un vector en lugar de rVSV, y evitando así el posible vector antiinmunidad con la administración repetida del vector VSV; y (2) la proporción de un segundo vector de Vesiculovirus para constituir un régimen de sensibilización-refuerzo heterólogo con rVSV.

C. Construcciones del virus de la estomatitis vesicular (VSV)

El virus de la estomatitis vesicular (VSV) comprende un genoma de ARN de cadena negativa no segmentado de aproximadamente 11 kb que codifica cinco proteínas víricas principales abreviadas N, P, M, G y L. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas G, M, N, P y L del VSV son conocidas en la materia (Rose y Gallione, 1981, J. Virol. 39, 519-28; Gallione et al., 1981 J. Virol. 39:529-35). Se conocen varios serotipos de V^sV y se han secuenciado. La secuencia genómica del VSV (Indiana) se proporciona con el número de referencia NC001560 en la base de datos NCBI (véase las SEQ ID NO: 7-12). Otras secuencias para el VSV, incluidas las secuencias VSV (Chandipura), están disponibles en esa base de datos; por ejemplo, véanse los números de referencia Ay382603, Af128868, V01208, V01207, V01206, M16608, M14715, M14720 y J04350, los serotipos VSV, tal como Nueva Jersey, también están disponibles en depósitos como la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (véase, por ejemplo, los números de referencia VR-1238 y VR-1239, que se incorporan en el presente documento a partir de la fecha de prioridad de esta solicitud). Otras secuencias y serotipos VSV conocidos se describen en la materia o se mencionan en los documentos citados a lo largo de esta especificación, véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional N.° WO2004/093906 y la patente de Estados Unidos N.° 8.287.878.

II. COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS

Determinadas realizaciones están dirigidas a composiciones de vesiculovirus recombinantes y procedimientos para inducir una respuesta inmune específica de antígeno a un antígeno cuando se administra a un sujeto mamífero. Una composición inmunogénica útil en esta invención es un virus Isfahan (rISFV) recombinante, atenuado, competente en replicación o un vector que lo codifica. En determinadas realizaciones, la composición inmunogénica contiene un vesiculovirus recombinante descrito en el presente documento. Determinados aspectos están dirigidos al rISFV como se describe en el presente documento. En un aspecto adicional, un rISFV comprende un polinucleótido heterólogo que codifica uno o más antígenos.

A. Antígenos

En determinadas realizaciones, un vesiculovirus (por ejemplo, rISFV solo, o en un régimen de sensibilización/refuerzo con rVSV) codifica un antígeno heterólogo. Tal como se usa en el presente documento, el término "antígeno" o "antígeno dirigido" se refiere a cualquier sustancia, incluidos los antígenos complejos (por ejemplo, células tumorales, células infectadas por virus, etc.) que es capaz de ser la diana de una respuesta inmune. Un antígeno puede ser la diana de, por ejemplo, una respuesta inmune mediada por células y/o humoral de un sujeto administrado o provisto de una composición inmunogénica descrita en el presente documento. El término "antígeno" o "antígeno dirigido" abarca, por ejemplo, la totalidad o parte de antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos específicos de tumor o relacionados con tumor, antígenos parásitos, alérgenos y similares. Un antígeno es capaz de unirse a un receptor de linfocitos T o anticuerpo. Un antígeno además es capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o celular que conduce a la producción de linfocitos B y/o T. El aspecto estructural de un antígeno, por ejemplo, conformación tridimensional o modificación (por ejemplo, fosforilación), que da lugar a una respuesta biológica se denomina en el presente documento "determinante antigénico" o "epítopo". Los determinantes antigénicos o epítopos son aquellas partes de un antígeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por los receptores de linfocitos T.

Los antígenos víricos incluyen, por ejemplo, antígenos de rabdovirus (por ejemplo, Lyssavirus, incluido el virus de la rabia), alfavirus, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, VIH, virus del herpes, citomegalovirus, varicela zoster, virus del papiloma, virus de Epstein Barr, virus de paragripe, adenovirus, virus Coxsakie, picornavirus, rotavirus, virus de la viruela, rinovirus, virus de la rubéola, papovavirus, virus de las paperas, virus del sarampión; algunos ejemplos no limitantes de antígenos víricos conocidos incluyen los siguientes: antígenos procedentes de alfavirus tales como proteínas nsP1-nsP4, de la cápside, E3, E2, 6K y E1; de VIH-1 tales como tat, nef, gp120 o gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev o parte y/o combinaciones de los mismos; antígenos procedentes del virus del herpes humano como el HSV-2 con antígenos tales como el gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE o gD, proteínas tempranas inmediatas tales como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 y ICP0, VP16, US6, US8, UL7, UL19, UL21, UL25, UL46, UL47, UL48, UL49 y UL50, o parte y/o combinaciones de las mismas; antígenos procedentes del citomegalovirus, especialmente citomegalovirus humano tal como gB o derivados del mismo; antígenos procedentes del virus Epstein Barr tales como gp350 o derivados del mismo; antígenos procedentes del virus varicela zoster tales como gpl, 11, 111 e IE63; antígenos procedentes de un virus de la hepatitis tal como el antígeno del virus de la hepatitis B, hepatitis C o hepatitis E (por ejemplo, proteínas env E1 o E2, proteína central, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, o parte y/o combinaciones de los mismos de HCV); antígenos procedentes del virus del papiloma humano (por ejemplo, proteínas, por ejemplo, L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, o parte y/o combinaciones de los mismos); antígenos procedentes de otros patógenos víricos, tal como el virus sincitial respiratorio (por ejemplo, proteínas F y G o derivados de las mismas), flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la gripe (por ejemplo, proteínas HA, NP, NA, o M, o parte y/o combinaciones de las mismas).

Los antígenos específicos de tumor, relacionados con tumor o de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. La expresión de dichos antígenos mediante rISFV proporciona tanto la inducción de una respuesta inmune mediada por células contra la célula cancerosa como la lisis directa de células cancerosas mediante rISFV. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, melanoma maligno, cáncer de laringe, cáncer de próstata. Los antígenos del cáncer son antígenos que pueden estimular potencialmente las respuestas inmunes específicas del tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, en células normales. Estos antígenos pueden caracterizarse como los que normalmente son inactivos (es decir, no expresados) en células normales, los que se expresan solo en ciertas etapas de diferenciación y los que se expresan temporalmente, tales como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos cancerosos están codificados por genes celulares mutantes, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de supresiones internas o translocaciones cromosómicas. Aún otros antígenos de cáncer están codificados por genes víricos, como los portados en virus tumorales de ARN y ADN. Algunos ejemplos no limitantes de antígenos específicos de tumor o relacionados con tumor incluyen MART-1/Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp, de sus siglas en inglés), ciclofilina b, antígeno colorrectal asociado (CCR) - 0017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA, de sus siglas en inglés) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno prostático específico (PSA, de sus siglas en inglés) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, de sus siglas en inglés), receptor de linfocitos T/cadena CD3-zeta, Familia MACE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE- B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, M^a GE-05), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, G^a G^e -1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUG (por ejemplo, MUC-1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfa-fetoproteína, E-cadherina, alfa-catenina, beta-catenina y gamma-catenina, p120ctn, gp100Pme1117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de la poliposis adenomatosa de colon (APC, de sus siglas en inglés), fodrina, Conexina 37, Ig-idiotipo, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como las proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, Imp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2.

En otra realización, se utiliza un rISFV atenuado per se, es decir, sin la inclusión de una secuencia polinucleotídica heteróloga, como un agente terapéutico antineoplásico (oncolítico). El ISFV posee propiedades de destrucción de células tumorales in vitro e in vivo. El término "oncolítico" normalmente se refiere a un agente que es capaz de destruir, lisar o detener el crecimiento de una célula cancerosa. En términos de un virus oncolítico, el término se refiere a un virus que puede replicarse hasta cierto punto en una célula cancerosa, causar la muerte, la lisis o el cese del crecimiento de las células cancerosas y, por lo general, tiene efectos tóxicos mínimos en las células no cancerosas. El rISFV se atenúa utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

Los antígenos bacterianos incluyen, por ejemplo, antígenos de micobacterias que causan tuberculosis y lepra, neumococos, bacilos aerobios gramnegativos, mycoplasma, staphylococcus, streptococcus, salmonellae, chlamydiae, o neisseriae.

Otros antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos de parásitos tales como malaria, leishmaniosis, tripanosomiasis, toxoplasmosis, esquistosomiasis, filariasis, así como antígenos que son alérgenos.

En otro aspecto, el gen G del ISFV puede reemplazarse en su totalidad por una o más de las secuencias polinucleotídicas heterólogas descritas anteriormente. En otro aspecto más, el gen G del ISFV puede reemplazarse por un gen G heterólogo de un segundo vesiculovirus, es decir, seudotipado. En determinados aspectos, un rISFV se puede seudotipar con un gen G del VSV. El gen G del VSV se puede seleccionar entre los serotipos del VSV enumerados anteriormente.

De acuerdo con las variantes de la invención, la composición inmunogénica comprende al menos dos antígenos dirigidos, o una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica al menos dos antígenos dirigidos, o al menos dos secuencias de nucleótidos heterólogos que codifican al menos dos antígenos dirigidos, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, el antígeno heterólogo es un antígeno de alfavirus. La mayoría de los alfavirus infectan a vertebrados terrestres a través de la transmisión por mosquitos y exhiben un amplio intervalo de huésped (Strauss et al., 1994 Microbiol Rev. 58(3):491-562). Ocasionalmente, estos ciclos se extienden a humanos y animales domésticos para causar enfermedades. Las infecciones en seres humanos con virus del Viejo Mundo como el virus del río Ross, el virus de la chikungunya y el SINV se caracterizan normalmente por fiebre, erupción cutánea y poliartritis, mientras que las infecciones con los virus del Nuevo Mundo, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), el virus de la encefalitis equina del este (EEEV) y el virus de la encefalitis equina occidental (WEEV, de sus siglas en inglés) pueden causar encefalitis mortal (Strauss et al., 1994 Microbiol Rev. 58(3):491-562). Como consecuencia, los últimos virus se desarrollaron como armas biológicas durante la guerra fría, y las recientes infecciones por aerosoles de primates confirman sus propiedades altamente debilitantes y/o letales (Reed et al., 2007 The Journal of Infectious Diseases 196:441-450; Reed et al., 2005 The Journal of Infectious Diseases 192:1173-1182; Reed et al., 2004 The Journal of Infectious Diseases 189:1013-1017; Smith et al., 2009 Alphaviruses, págs. 1241-1274. En D. D. Richman, R. J. Whitley, y F. G. Hayden (ed.), Clinical Virology. ASM Press, Washington, D.C.). El EEEV es uniformemente letal para los macacos cangrejeros después de una alta dosis de infección por aerosoles y causa una de las tasas de mortalidad por causas humanas más altas (> 50 %) de cualquier infección vírica (Reed et al., 2007 The Journal of Infectious Diseases 196:441-450). La infección por VEEV en seres humanos no suele ser mortal, pero este virus es uno de los virus más infecciosos por aerosol y es altamente debilitante e inmunosupresor (Reed et al., 2004 The Journal of Infectious Diseases 189:1013-1017; Smith et al., 2009 Alphaviruses, págs. 1241-1274. En D. D. Richman, R. J. Whitley, y F. G. Hayden (ed.), Clinical Virology. ASM Press, Washington, D.C.; Weaver et al., 2004. Annu. Rev. Entomol. 49:141-174). Asimismo, causa una enfermedad endémica extensa en toda América Latina, y su introducción intencional podría provocar la amplificación equina y la transmisión de mosquitos para infectar a cientos de miles de personas. Estos rasgos han dado como resultado la asignación de los alfavirus encefalíticos a la lista de patógenos de categoría B del NIAID.

Debido a que no existen tratamientos antivíricos o composiciones inmunogénicas con licencia para las enfermedades alfavíricas, la población de Estados Unidos sigue siendo vulnerable a un ataque biológico, así como a infecciones naturales con las 3 encefalitis. El desarrollo de un tratamiento antivírico eficaz es particularmente expuesto porque los diagnósticos generalmente ocurren solo después de que las enfermedades prodrómicas han progresado a encefalitis aproximadamente una semana después de la infección. Por lo tanto, la inmunización es el mejor enfoque para proteger contra la enfermedad mortal.

Para abordar esta necesidad insatisfecha, el rISFV se ha modificado para expresar las glucoproteínas E3-E1 de VEEV y EEEV para su uso como composición inmunogénica independiente para ambos alfavirus, y/o para su uso en regímenes de inmunización de sensibilización-refuerzo heterólogos con vectores rVSV que expresan glucoproteínas E3-E1 del VEEV y EEEV, en caso de que dicha modalidad de inmunización sea necesaria para una eficacia óptima.

B. Formulación de vesiculovirus recombinantes

Las composiciones inmunogénicas útiles en esta invención, por ejemplo, el rISFV solo o en un régimen de sensibilización/refuerzo con composiciones del rVSV, comprenden además un diluyente, excipiente o vehículo inmunológicamente o farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Las composiciones inmunogénicas también se pueden mezclar con dichos diluyentes o vehículos de una manera convencional. Tal como se usa en el presente documento, el lenguaje "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración a seres humanos u otros huésped vertebrados. El vehículo apropiado es evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran parte de la vía de administración. Por tanto, las composiciones inmunogénicas útiles en esta invención pueden comprender un ISFV recombinante replicable que comprende uno o más de un gen de proteína N, un gen de proteína P, un gen de proteína M, un gen de proteína G y un gen de proteína L; y que comprende además una secuencia polinucleotídica heteróloga, en la que dicha secuencia polinucleotídica heteróloga (a) está flanqueada por una señal de inicio de la transcripción y una señal de parada de la transcripción, y (b) codifica un polipéptido heterólogo; y un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Pueden estar presentes componentes adicionales en las composiciones inmunogénicas, incluyendo, pero no se limitan a conservantes, agentes tensioactivos y estabilizadores químicos, agentes de suspensión o dispersantes. Normalmente, los estabilizantes, adyuvantes y conservantes se optimizan para determinar la mejor formulación para la eficacia en el ser humano o animal diana. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol.

Los ingredientes estabilizadores adecuados que pueden usarse incluyen, por ejemplo, casaminoácidos, sacarosa, gelatina, fenol rojo, N-Z amina, difosfato monopotásico, lactosa, hidrolizado de lactalbúmina y leche en polvo. Las sustancias tensioactivas adecuadas incluyen, sin limitación, adyuvante incompleto de Freund, análogos de quinona, hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, péptido y dipéptido de muramil, dimetilglicina, tuftsin; emulsiones de aceite; y geles minerales, por ejemplo, fosfato de aluminio, etc. y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS). Los rISFV y los rVSV o cualquiera de sus componentes polipeptídicos también pueden incorporarse a los liposomas para su uso como composición inmunogénica. Las composiciones inmunogénicas también pueden contener otros aditivos adecuados para el modo seleccionado de administración de la composición. Las composiciones de la invención también pueden implicar formulaciones liofilizadas, que pueden usarse con otros excipientes farmacéuticamente aceptables para desarrollar formas de dosificación en polvo, líquidas o en suspensión. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19a edición (1995), por ejemplo, Capítulo 95 Aerosols; y la publicación de patente internacional N.° WO99/45966.

Estas composiciones inmunogénicas pueden contener aditivos adecuados para la administración a través de cualquier vía de administración convencional. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la invención se prepara para administración a sujetos humanos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico o supositorios. Por tanto, las composiciones inmunogénicas también pueden incluir, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. En una realización de una formulación para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o granular) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones útiles administrables por vía parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble.

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento no están limitadas por la selección de los vehículos, adyuvantes u otros ingredientes convencionales fisiológicamente aceptables útiles en las preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos anteriormente. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables, a partir de los componentes descritos anteriormente, que tienen una isotonicidad, estabilidad y otras características convencionales de pH apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto, (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosis necesariamente ocurrirá dependiendo de la condición del sujeto a tratar. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por los gobiernos de los países en los que se usan las composiciones.

Tal como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los principios activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administra a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una partícula vírica como principio activo se entiende bien en la materia. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección.

Como se ha descrito anteriormente, cualquiera de las realizaciones de los vesiculovirus recombinantes puede usarse en estos procedimientos de tratamiento. Deseablemente, esta composición se mezcla con un diluyente farmacéuticamente aceptable u otros componentes como se describió anteriormente. En una realización, el tratamiento o prevención de una infección causada por un patógeno implica la administración de una o más cantidades eficaces de uno o una combinación de los vesiculovirus recombinantes descritos en el presente documento.

C. Administración del vesiculovirus recombinantes

Las composiciones antigénicas o inmunogénicas de esta invención se administran a un ser humano u otros sujetos mamíferos mediante una variedad de vías que incluyen, aunque no de forma limitativa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intranasal, oral, sublingual, bucal, vaginal, rectal, parenteral, intradérmica y transdérmica (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.° WO 98/20734, que se incorpora en el presente documento por referencia). La vía apropiada se selecciona según la naturaleza de la composición inmunogénica utilizada, y una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y los antígenos presentes en la composición inmunogénica, y factores similares por un médico que lo trate.

En los ejemplos proporcionados a continuación, tanto las composiciones inmunogénicas del rISFV como las composiciones del rVSV se administran por vía intramuscular (i.m.) individualmente o en combinación en un régimen de sensibilización/refuerzo. En otras realizaciones, es deseable administrar las composiciones del rISFV y las composiciones del rVSV por diferentes vías. Por ejemplo, la composición del rISFV puede administrarse por medios convencionales, incluida la administración intramuscular e intranasal. Sin embargo, la selección de dosis y vías de administración no son limitaciones de esta invención.

El orden de administración de la composición inmunogénica y los períodos de tiempo entre administraciones individuales pueden seleccionarse por el médico tratante o un experto en la materia en función de las características físicas y las respuestas precisas del huésped a la aplicación del procedimiento. Se espera que dicha optimización esté dentro de la habilidad de la técnica.

En general, la selección de la "cantidad eficaz" o dosis apropiada para los componentes de la(s) composición(es) inmunogénica(s) de la presente invención también se basará en si la administración es solo del rISFV o sensibilización/refuerzo con una composición del rVSV, así como la condición física del sujeto, más especialmente, incluyendo la salud general, edad y peso del sujeto inmunizado. El procedimiento y las vías de administración y la presencia de componentes adicionales en las composiciones inmunogénicas también pueden afectar las dosis y cantidades de las composiciones de rISFV y rVSV. Dicha selección y ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis eficaz está dentro de la habilidad de la técnica. La cantidad de rISFV y rVSV requerida para inducir una respuesta inmune, como una respuesta protectora, o para producir un efecto terapéutico en el paciente sin efectos secundarios adversos significativos varía según estos factores.

Se formula una dosis adecuada en una composición farmacéutica, como se describió anteriormente (por ejemplo, se disuelve en aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2 ml de un vehículo fisiológicamente compatible) y se administra mediante cualquier medio adecuado. Los tratamientos pueden incluir varias "dosis unitarias". La dosis unitaria se define como que contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica. La cantidad a administrar, y la vía y formulación particulares, están dentro de la habilidad de aquellos en las artes clínicas. No es necesario administrar una dosis unitaria como una inyección única, pero puede comprender una infusión continua durante un período de tiempo establecido. La dosis unitaria de la presente invención puede describirse convenientemente en términos de unidades formadoras de placa (ufp) o partículas víricas para construcciones víricas. Las dosis unitarias varían entre 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ufp o partículas víricas (pv) infecciosas y más. Alternativamente, dependiendo del virus y el título alcanzable, se suministrará de 1 a 100, 10 a 50, 100-1000, o hasta aproximadamente 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, o 1x1015 o más pv para el paciente o para las células del paciente. Se formula una dosis adecuada en una composición farmacéutica como se describe (por ejemplo, se disuelve en aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2 ml de un vehículo fisiológicamente compatible) y se administra mediante cualquier medio adecuado.

En una realización, las dosis únicas o de refuerzo para rISFV son las mismas. Dichas dosis están generalmente entre 1x107 ufp (o medidas como partículas víricas) y 1x109 ufp/partículas víricas/ml. Sin embargo, cualquier dosis adecuada se determina fácilmente por los expertos en la materia.

En la segunda realización de los procedimientos descritos en el presente documento, la administración de un vesiculovirus recombinante (por ejemplo, rISFV) está precedida por la administración a un sujeto mamífero de una cantidad eficaz de una composición de sensibilización que comprende un segundo vesiculovirus recombinante (por ejemplo, rVSV) que comprende uno o más marcos de lectura abiertos que codifican los mismos antígenos o heterólogos que los codificados por el primer virus. Alternativamente, la administración del primer virus se sigue por la administración del segundo virus. En cualquier régimen, se puede administrar más de una dosis del primer virus y/o el segundo virus.

De acuerdo con la presente divulgación, por ejemplo, la composición inmunogénica del rVSV puede administrarse al huésped como una composición de refuerzo posterior a la administración de la composición inmunogénica de rISFV de sensibilización que presenta el antígeno o antígenos heterólogos seleccionados . Al sujeto mamífero se le administra una cantidad eficaz de una composición de sensibilización que comprende un rISFV que comprende uno o más marcos de lectura abiertos que codifican una o más proteínas heterólogas bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su expresión y un diluyente farmacéuticamente aceptable antes de la composición inmunogénica del rVSV. Cuando se usa como composición de sensibilización, esta composición del rISFV se administra una o más de una vez antes de la composición de refuerzo del rVSV.

En otra realización del procedimiento de sensibilización/refuerzo, la composición de sensibilización del rISFV se administra al menos una vez antes de la composición inmunogénica del rVSV, o se administra tanto antes como después de la composición inmunogénica del rVSV.

En otras realizaciones adicionales del régimen de sensibilización/refuerzo, se administran múltiples composiciones del rVSV como refuerzos posteriores. En una realización, se administran al menos dos composiciones del rVSV después de las composiciones de sensibilización.

Cada composición de vesiculovirus subsiguiente puede tener un serotipo diferente seleccionado de serotipos conocidos y de cualquier serotipo sintético proporcionado mediante la manipulación de la proteína G de vesiculovirus. Por ejemplo, un rVSV puede ser el serotipo Indiana y el otro puede ser el serotipo Chandipura o el serotipo Nueva Jersey. En otra realización, los refuerzos del rVSV adicionales son del mismo serotipo. Cuando se usa como composición de refuerzo, las composiciones del rVSV se administran en serie, después de las composiciones inmunogénicas del rISFV de sensibilización. Los rISFV y los rVSV que muestran un equilibrio deseado de atenuación e inmunogenicidad son útiles en este aspecto.

En otra realización más, la administración de una o más de las composiciones inmunogénicas del rISFV se sigue por una o más administraciones de las composiciones inmunogénicas del rVSV, y luego se sigue por una o más administraciones adicionales de las composiciones inmunogénicas del rISFV.

En otra realización más, la administración de una o más de las composiciones inmunogénicas del rISFV está precedida o seguida por la administración de una o más composiciones inmunogénicas de ADN plasmídico, en donde el ADN plásmido codifica los mismos o diferentes polipéptidos heterólogos como las composiciones inmunogénicas del rISFV.

III. COMPOSICIONES PROTEICAS

Las composiciones proteicas de la invención incluyen partículas víricas y composiciones que incluyen las partículas víricas. En determinadas realizaciones, los vesiculovirus se genomanipularán para incluir variantes de polipéptidos de proteínas víricas N, P, M, G y/o L; y/o polinucleótidos heterólogos. Tal como se usa en el presente documento, una "proteína" o "polipéptido" se refiere a un polímero de restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones, la totalidad o parte de una proteína o polipéptido vírico está ausente o alterada para hacer que el virus sea más útil para la terapia.

Una "proteína modificada" o "polipéptido modificado" o "proteína variante" o "polipéptido variante" se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química o secuencia de aminoácidos está alterada con respecto al tipo silvestre o una proteína o polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, una proteína o polipéptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (que reconoce que las proteínas o polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). La actividad o función modificada se puede reducir, disminuir, eliminar, aumentar, mejorar o alterar de alguna otra manera con respecto a esa actividad o función en una proteína o polipéptido de tipo silvestre, o las características del virus que contiene dicho polipéptido. Se contempla que una proteína o polipéptido modificado se pueda alterar con respecto a una actividad o función pero retener aún la actividad o función de tipo silvestre o no alterada en otros aspectos. Alternativamente, una proteína modificada puede ser completamente no funcional o su secuencia de ácido nucleico afín puede haber sido alterada para que el polipéptido ya no se exprese en absoluto, se trunque o exprese una secuencia de aminoácidos diferente como resultado de un cambio de marco u otra modificación.

Se contempla que los polipéptidos pueden modificarse mediante truncamiento, haciéndolos más cortos que su forma inalterada correspondiente o por fusión o combinación de dominios que puede hacer que la proteína alterada sea más larga.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención pueden ser variantes de sustitución, inserción o deleción. Una mutación en un gen que codifica un polipéptido puede afectar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos (es decir, segmento) de un polipéptido, en comparación con un polipéptido de tipo silvestre o inalterado u otro polipéptido de referencia. Se pueden identificar varios polipéptidos codificados mediante vesiculovirus por referencia a la lista de secuencias presentada con esta solicitud o con los números de referencia de GenBank y las entradas de bases de datos públicas relacionadas proporcionadas en el presente documento.

Las variantes de deleción carecen de uno o más restos de la proteína nativa, inalterada o de tipo silvestre. Se pueden eliminar los restos individuales, o se puede eliminar todo o parte de un dominio (tal como un dominio catalítico o de unión). La cola citoplasmática de la proteína G del vesiculovirus puede truncarse para atenuar el virus. Por ejemplo, la proteína G del rISFV puede tener un truncamiento carboxiterminal de 20 a 25 aminoácidos, mientras que la proteína G del rVSV puede tener un truncamiento carboxiterminal de 20 a 28 aminoácidos. Se puede lograr una mayor atenuación mediante la combinación también el gen N de su primera posición nativa en el genoma del vesiculovirus, o mediante una mutación del gen M no citopático (ncp) en las posiciones de aminoácidos 33 y 51, como se describe en la Patente de Estados Unidos 8.287.878. Se puede introducir un codón de parada (mediante sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción normalmente implican la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido, un tipo específico de inserto es un polipéptido quimérico que incluye porciones homólogas o similares de una proteína relacionada en lugar de la porción relacionada de una proteína diana. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente uno o más restos. También se pueden generar adiciones terminales, normalmente llamadas proteínas de fusión.

Las variantes de sustitución normalmente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se reemplaza con uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la materia e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a serina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de modo que se vea afectada una función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservadores generalmente implican la sustitución de un resto con uno que es químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o no cargado, y viceversa.

La expresión "codón funcionalmente equivalente" se usa en el presente documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tales como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes. Los codones de aminoácidos incluyen: Alanina (Ala, A) G^cA, GCC, GCG, o GCU; Cisteína (Cys, C) UGC o UGU; Ácido aspártico (Asp, D) GAC o G^a U; Ácido glutámico (Glu, E) GAA o GAG; Fenilalanina (Phe, F) UUC o UUU; Glicina (GIy, G) GGA, GGC, GGG o GGU; Histidina (His, H) CAC o CAU; Isoleucina (Ile, I) AUA, AUC, o AUU; Lisina (Lys, K) AAA o AAG; Leucina (Leu, L) UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, o CUU; Metionina (Met, M) AUG; Asparagina (Asn, N) AAC o AAU; Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, o CCU; Glutamina (Gln, Q) CAA o CAG; Arginina (Arg, R) AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, o CGU; Serina (Ser, S) AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, o UCU; Treonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG, o ACU; Valina (Val, V) GUA, GUC, GUG, o GUU; Triptófano (Trp, W) UGG; y Tirosina (Tyr, Y) UAC o UAU.

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir restos adicionales, tales como aminoácidos N o C terminales adicionales, o secuencias en 5' o 3', y aún así ser esencialmente como se establece en el presente documento, incluyendo tener determinada actividad biológica. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificantes que flanquean las porciones en 5' o 3' de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que ocurren dentro de los genes.

Lo siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteína descrita en el presente documento para crear una molécula equivalente, o incluso mejorada. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas receptoras. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, determinadas sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia de proteínas y en su secuencia polinucleotídica subyacente y, sin embargo, producen una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, los inventores contemplan que se pueden hacer varios cambios en las secuencias de ácido nucleico de vesiculovirus o en un polinucleótido heterólogo codificado sin pérdida apreciable de utilidad o actividad biológica de interés.

Haciendo dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica a una proteína se entiende generalmente en la materia (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, a Dn , anticuerpos, antígenos y similares. También se entiende en la materia que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente en base a la hidrofilia. La Patente de Estados Unidos 4.554.101, establece que la mayor hidrofilia media local de una proteína, según lo regido por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la Patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácidos: arginina (+ 3,0); lisina (+ 3,0); aspartato (+ 3,0 ± 1); glutamato (+ 3,0 ± 1); serina (+ 0,3); asparagina (+ 0,2); glutamina (+ 0,2); glicina (0); treonina (- 0,4); prolina (- 0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina *- 0,5); cisteína (- 1,0); metionina (- 1,3); valina (- 1,5); leucina (- 1,8); isoleucina (- 1,8); tirosina (2,3); fenilalanina (- 2,5); triptófano (- 3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y aún producir una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de ± 1, y aquellos dentro de ± 0.5 son aún más particularmente preferidos.

Como se describió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos de sustituciones que tienen en cuenta las diversas características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Haciendo dichos cambios, se puede considerar el análisis filogenético de proteínas relacionadas funcionalmente (véase la Figura 11 y los cuatro cambios de aminoácidos realizados en la proteína N del rISFV, como se representa en el mismo).

IV. MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO

Determinadas realizaciones están dirigidas a composiciones y procedimientos que incluyen polinucleótidos que son capaces de expresar todo o parte de una proteína o polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, todas o partes de un genoma vírico están mutadas o alteradas para generar un virus, polipéptido vírico, polinucleótido heterólogo o polipéptido heterólogo con determinadas propiedades y/o características. Los polinucleótidos pueden codificar un péptido o polipéptido que contiene la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos vírica o heteróloga, o estar genomanipulados para que no codifiquen un polipéptido vírico o codifiquen un polipéptido vírico que tenga al menos una función o actividad añadida, aumentada, reducida o eliminada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "segmento de ARN, ADN o ácido nucleico" aislado se refiere a una molécula de ARN, ADN o ácido nucleico que se ha aislado del ADN genómico total u otros contaminantes. En determinadas realizaciones, el polinucleótido se ha aislado sin otros ácidos nucleicos. Un "genoma de vesiculovirus" o un "genoma de VSV", o un "genoma de ISFV" se refiere a un polinucleótido que puede proporcionarse a una célula huésped para producir una partícula vírica, en presencia o ausencia de un virus auxiliar o regiones codificantes complementarias que suministran otros factores en trans.

La expresión "ADN complementario" o "ADNc" se refiere al ADN preparado usando ARN como plantilla. Puede haber ocasiones en que se prefiera la secuencia genómica total o parcial.

De manera similar, un polinucleótido que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ácido nucleico que incluye secuencias codificantes y, en determinados aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente lejos de otras secuencias codificantes de proteínas o genes de origen natural. A este respecto, el término "gen" se usa por simplicidad para referirse a una unidad de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido o péptido (incluidas las secuencias requeridas para la transcripción, modificación postraduccional o localización adecuadas). Como entenderán los expertos en la materia, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc y segmentos de ácido nucleico genomanipulados más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes.

Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de codificación y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferiblemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido.

Se contempla que las construcciones de ácido nucleico usadas en la presente invención pueden codificar polipéptido(s) de longitud completa de cualquier fuente o codificar una versión truncada o modificada del (de los) polipéptido(s), por ejemplo, un fragmento de péptido heterólogo. Una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia polipeptídica de longitud completa con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo, para permitir la purificación del polipéptido, el transporte, la secreción, la modificación postraduccional o los beneficios terapéuticos tales como el direccionamiento o la eficacia. Se puede añadir un marcador u otro polipéptido heterólogo a una secuencia que codifica el polipéptido. El término "heterólogo" se refiere a un polipéptido, polinucleótido o segmento del mismo que no es el mismo que el polipéptido, polinucleótido modificado, o que se encuentra asociado o codificado por el virus de origen natural.

En un ejemplo no limitante, se pueden preparar una o más construcciones de ácido nucleico que incluyen un tramo contiguo de nucleótidos idénticos o complementarios a un segmento vírico particular, tal como un gen N, P, M, G o L del vesiculovirus.

Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención abarcan ácidos nucleicos modificados que codifican polipéptidos modificados. Dichas secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional. Se pueden crear proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que se pueden genomanipular cambios en la estructura de la proteína, en función de las consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Los cambios diseñados por seres humanos pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras en la antigenicidad o falta de ella. Una proteína se puede modificar para reducir los efectos de toxicidad de la proteína in vivo, o para aumentar la eficacia de cualquier tratamiento que implique a la proteína o un virus que comprenda dicha proteína.

Los vectores de vesiculovirus recombinantes pueden manipularse usando una variedad de técnicas que incluyen mutaciones de inserción, mutaciones puntuales, deleciones y barajado de genes.

Se puede diseñar un vesiculovirus recombinante para reducir la síntesis de ARNm de N en células infectadas con virus al barajar el gen N (proteína de la nucleocápside) en una posición en el genoma que está más lejos (distal) del promotor de transcripción en 3' nativo. Debido a que el VSV no se considera un patógeno humano, y la inmunidad preexistente al VSV es rara en la población humana, el desarrollo de vectores procedentes del VSV ha sido un foco en áreas tales como composiciones inmunogénicas y terapia génica. Por ejemplo, los estudios han establecido que el VSV puede servir como un vector eficaz para composiciones inmunogénicas, que expresan hemaglutinina del virus de la gripe (Roberts et al., 1999 J. Virol, 73:3723-3732), proteína H del virus del sarampión (Schlereth et al., 2000 J. Virol, 74:4652-57) y las proteínas env y gag del VIH-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106:539-549).

En determinadas otras realizaciones, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucleico contigua a la mostrada en las secuencias identificadas en el presente documento.

También se entenderá que esta invención no se limita a las secuencias particulares de ácido nucleico y aminoácidos de estas secuencias identificadas. Los vectores recombinantes y los segmentos de ácido nucleico aislados, por lo tanto, pueden incluir diversas regiones codificantes de vesiculovirus, regiones codificantes que tienen alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos más grandes que, sin embargo, incluyen regiones codificantes de vesiculovirus, o pueden codificar proteínas o péptidos biológicamente funcionales equivalentes que tienen secuencias de aminoácidos variantes.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido de vesiculovirus y/o un polinucleótido heterólogo puede estar alterado o mutado. Las alteraciones o mutaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones, reorganizaciones, inversiones y similares, y pueden dar como resultado la modulación, activación y/o inactivación de determinadas proteínas o mecanismos moleculares, así como también alterar la función, ubicación o expresión de un producto génico. Cuando se emplea, la mutagénesis de un polinucleótido se puede lograr mediante una variedad de procedimientos mutagénicos estándar (Sambrook et al, 2001). La mutación es el proceso mediante el cual se producen cambios en la función o estructura de un organismo o molécula. La mutación puede implicar la modificación de la secuencia de nucleótidos de un solo gen, bloques de genes o genomas completos. Los cambios en genes individuales pueden ser consecuencia de mutaciones puntuales que implican la eliminación, adición o sustitución de una base de nucleótidos única dentro de una secuencia de ADN, o pueden ser consecuencia de cambios que implican la inserción o eliminación de grandes cantidades de nucleótidos.

La mutagénesis insercional se basa en la modificación de un gen mediante la inserción de un nucleótido o fragmento de ácido nucleico conocido. Debido a que implica la inserción de algún tipo de fragmento de ácido nucleico, las mutaciones generadas son generalmente pérdidas de función, en lugar de mutaciones de ganancia de función. Sin embargo, hay ejemplos de inserciones que generan mutaciones de ganancia de función. La mutagénesis insercional se puede lograr utilizando técnicas estándar de biología molecular.

La mutagénesis específica de sitio guiada por estructura representa una herramienta poderosa para la disección e ingeniería de interacciones proteína-ligando (Wells, 1996; Braisted et al., 1996). La técnica proporciona la preparación y prueba de variantes de secuencia mediante la introducción de uno o más cambios de secuencia de nucleótidos en un ADN seleccionado.

Tal como se usa en el presente documento, "G-CT" se refiere a un gen G del VSV mutado en el que la proteína G codificada se trunca o se elimina de algunos de los aminoácidos en su dominio citoplasmático (carboxiterminal), también conocida como la "región de la cola citoplasmática" de la proteína G. G-CT1 se trunca de sus últimos 28 aminoácidos carboxilo terminales, lo que da como resultado un producto proteico que retiene solo un aminoácido del dominio citoplasmático de tipo silvestre de veintinueve aminoácidos. Otros truncamientos del gen G se identifican en la Patente de Estados Unidos N.° 8.287.878, por ejemplo, G-CT9, que tiene los últimos veinte restos de aminoácidos carboxiterminales del dominio citoplasmático eliminados, con relación al tipo silvestre. Entre los procedimientos conocidos para alterar la proteína G del rVSV se encuentran las tecnologías descritas en la publicación internacional N.° WO99/32648 y Rose, N. F. et al. 2000 J. Virol., 74:10903-10.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y, posiblemente, la traducción de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen infra.

Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico a la que se controla el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos génicos que se unen a proteínas y moléculas reguladoras, tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones "posicionado operativamente", "acoplado operativamente", "ligado operativamente", "bajo control", y "bajo control transcripcional" significan que un promotor está en una ubicación y/u orientación funcional correcta en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia. Un promotor puede o no usarse junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

También se puede requerir una señal de inicio específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de traducción heterólogas, incluido el codón de iniciación ATG. La señal de control traduccional y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.

En determinadas realizaciones de la invención, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES, de sus siglas en inglés) se usa para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de escaneo de ribosomas de la traducción dependiente de Cap metilada en 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonnenberg, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonnenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamíferos (Macejak y Sarnow, 1991). En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficaz.

Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS, de sus siglas en inglés), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de los cuales puede usarse junto con la tecnología recombinante estándar para digerir el vector. (Véase Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997, "Restriction enzyme digestion" que se refiere a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solo en ubicaciones específicas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles comercialmente. Un vector puede linealizarse o fragmentarse usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para permitir que las secuencias heterólogas se liguen al vector. "Ligadura" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden o no ser contiguos entre sí.

Los vectores o construcciones pueden comprender al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" se compone de las secuencias de ácido nucleico implicadas en la terminación específica de una transcripción de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en determinadas realizaciones se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de una transcripción de ARN. Puede ser necesario un terminador in vivo para lograr niveles de mensaje deseables. Los terminadores contemplados para su uso en la invención incluyen cualquier terminador de transcripción conocido descrito en el presente documento o conocido por un experto en la materia, que incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, como por ejemplo el terminador de hormona de crecimiento bovino o secuencias de terminación víricas, como por ejemplo el terminador SV40. En determinadas realizaciones, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.

Se puede usar una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada de una transcripción. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la invención. Las realizaciones incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad de la transcripción o puede facilitar el transporte citoplasmático.

En determinadas realizaciones, las células que contienen una construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula permitiendo una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos. Por lo general, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de los transformantes en función de la implementación de las condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores, incluidos los marcadores que se pueden examinar, tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Alternativamente, se pueden utilizar enzimas detectables tales como la timidina cinasa (tc) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunitarios, posiblemente junto con el análisis FACS. No se cree que el marcador utilizado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y detectables.

V. KITS RELACIONADOS CON VESICULOVIRUS RECOMBINANTES

En otra realización más, la presente invención proporciona un kit farmacéutico para la administración rápida de un régimen inmunogénico, profiláctico o terapéutico. Este kit está diseñado para su uso en un procedimiento para inducir un alto nivel de respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto mamífero o vertebrado. El kit puede contener al menos una composición inmunogénica que comprende una composición de rISFV como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se proporcionan múltiples dosis preempaquetadas de la composición inmunogénica de rISFV en el kit para administraciones múltiples. El kit también contiene al menos una composición inmunogénica que comprende una composición de rVSV como se describe en el presente documento. En una realización, se proporcionan múltiples dosis preempaquetadas de la composición inmunogénica de rVSF en el kit para administraciones múltiples.

El kit también contiene instrucciones para usar las composiciones inmunogénicas en un procedimiento de sensibilización/refuerzo como se describe en el presente documento. Los kits también pueden incluir instrucciones para realizar determinados ensayos, diversos vehículos, excipientes, diluyentes, adyuvantes y similares descritos anteriormente, así como aparatos para la administración de las composiciones, tales como jeringas, dispositivos de electroporación, dispositivos de pulverización, etc. Otros componentes pueden incluir guantes desechables, instrucciones de descontaminación, bastones aplicadores o recipientes, entre otras composiciones.

VI. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos, así como las figuras, se incluyen para demostrar realizaciones preferentes de la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas desveladas en los ejemplos o figuras representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, pueden considerarse modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1

ANÁLISIS Y RECUPERACIÓN DEL VIRUS ISFAHAN (ISFV)

Se ha desarrollado un sistema para la recuperación del virus Isfahan recombinante (rISFV) del ADN plasmídico que codifica el ADNc genómico de ISFV. La seguridad de rISFV de tipo silvestre (t, de sus siglas en inglés) y la variante atenuada rISFVN4ACT25 gagl se estudió en un modelo de neurovirulencia intracraneal de ratón NIH Swiss Webster de 4-5 semanas de edad altamente sensible. El rISFV tw no modificado exhibió una DL⁵⁰ > 103 UFP, en contraste con wtVSVIN con una DL⁵⁰ de < 10 UFP. rISFVN4ACT25 gagl exhibió un DL⁵⁰ > 107, en contraste con rVSVINN2CT1 con una DL⁵⁰ de 104. Estos resultados indican que el rISFV es fundamentalmente menos patógeno que VSVⁱⁿ y puede no requerir la utilización de estrategias de atenuación múltiple (N-barajado, truncamiento de la cola citoplasmática de la proteína G) para lograr una seguridad e inmunogenicidad similares a los vectores de rVSViN. Análisis filogenético de Isfahan. Las secuencias disponibles del género Vesiculovirus se descargaron de Gen-Bank. Las secuencias de genes N se alinearon en SeaView (PBIL (Pole Bio-Informatique Lyonnais), Francia) utilizando el algoritmo MUSCLE (Gouy et al., 2010, Molecular Biology and Evolution 27:221-24; Edgar, 2004. Nucleic Acids Research 32:1792-97). Las secuencias se alinearon deduciendo secuencias de aminoácidos de marcos de lectura abiertos (ORF) y luego volviendo a secuencias de nucleótidos para análisis posteriores (Gouy et al., 2010, Molecular Biology and Evolution 27:221-24; Edgar, 2004. Nucleic Acids Research 32:1792-97). El análisis de máxima verosimilitud (MV) se realizó utilizando el paquete PHYLIP (Felsenstein, 1989, Cladistics 5, 164-1663). La robustez de la filogenia de MV se evaluó mediante un nuevo muestreo con reemplazamiento de 100 réplicas. El análisis reveló dos grupos principales dentro del género (Figura 1). El primer grupo consiste en VSVⁱⁿ y sus subtipos, y VSV^nj, mientras que el segundo grupo está compuesto por los virus ISFV, Chandipura y Piry. Estos datos están en congruencia con los análisis serológicos previos para determinar la relación del ISFV dentro del género, y en conjunto indican que el ISFV está relacionado de forma distante con VSVⁱⁿ (Tesh et al., Am J Trop Med Hyg. 1977, Mar 26(2):299-306).

Generación de clon de ADNc de Isfahan. Se obtuvo un aislado de ISFV con bajo cultivo de tejido del World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses en la University of Texas Medical Branch. El ARN genómico vírico se aisló de los sobrenadantes de cultivo y se generaron fragmentos de ADNc que abarcaban el genoma completo de ISFV mediante transcripción inversa (TI) y amplificación mediante PCR (RT-PCR) (Figura 2). Los productos de RT-PCR (fragmentos 3-5) se clonaron por etapas en un plásmido que contenía el ADNc genómico de longitud completa del VSV Nueva Jersey (^pVSV^njN4CT1 VlHgag1) (Figura 2). Los fragmentos restantes (1-2) se clonaron en el plásmido pBlueScript (Invitrogen).

Los plásmidos de soporte para rescate, que expresan proteínas del ISFV individuales (N, P, M, G y L), se generaron mediante la clonación de los respectivos marcos de lectura abiertos (ORF) en los sitios Nco I y Sac I del plásmido pVSVin P (Witko et al. J Virol Methods. julio de 2006, 135(1):91-101). Los extremos cohesivos compatibles con Nco I se generaron mediante BspH I (genes N y M), Pci I (gen P) y BsmB I (genes G y L). El gen L de ORF se ensambló mediante la unión de dos fragmentos de ADNc: fragmento n.° 1 (BsmB I a Avr II) y fragmento n.° 2 (Avr II a Sac I). Todos los plásmidos de soporte de rescate resultantes se verificaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos.

Construcciones de rISFV y rVSVIN que codifican genes de envoltura de alfavirus. Los genes de envoltura (que abarcan E3-E2-6K-E1) de la cepa FL93 del EEEV y la cepa ZPC738 del VEEV se clonaron en pPBS-ISFV-38 (cuya construcción se describe a continuación). Además, Además, los genes VEEV-ZPC E3-E1 se clonaron en pVSViN N4CT1 VIHgag5. En cada caso, los genes del alfavirus se insertaron en la quinta posición del genoma del vector usando los sitios de restricción Xho I y Not I de tal manera que los genes insertados están bajo el control de la transcriptasa rISFV o rVSV (Figura 3A). Todos los vectores se verificaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos de longitud completa y la expresión de proteínas de alfavirus se confirmó mediante transferencia Western (Figura 3B).

Un gradiente de 3' a 5' en la expresión génica ha sido bien documentado para los vesiculovirus (Ball y White, PNAS.

1976, 73(2):442-6; Villarreal et al., Biochemistry. 1976, 15(8):1663-7) y otros virus de ARN de sentido negativo (Conzelmann, Annual review of genetics. 1998, 32:123-62). Por lo tanto, la expresión máxima de un antígeno diana se logra mediante la inserción del transgén en la primera posición del genoma, inmediatamente adyacente al promotor de transcripción en 3' único fuerte. Sin embargo, los altos niveles de expresión de algunos antígenos pueden ser tóxicos para la replicación del rVSV, lo que lleva a la inestabilidad transgénica y a la pérdida de la expresión del antígeno (no publicado). La regulación a la baja de la expresión de antígenos tóxicos, tales como proteínas Env de VIH-1, al alejar los genes trans más lejos del promotor de la transcripción en 3', ha tenido éxito en mantener la estabilidad genética de la expresión de Env y todos los antígenos diana de un intervalo de diferentes patógenos probados hasta ahora en la plataforma rVSV. Para tener en cuenta la posibilidad de que las glucoproteínas E2/E1 pueden ser tóxicas para la replicación de rVSV y rISFV si se expresan a niveles muy altos, se generaron vectores atenuados de rVSV y rISFV que expresaron E2/E1 desde la quinta posición en el genoma.

Generación de ADNp de virus Isfahan recombinante de longitud completa.

El material de partida para construir el virus Isfahan (ISFV) de longitud completa consistió en dos plásmidos de subclonación que codificaron lo siguiente:

Plásmido UTMB n.° 1 (renombrado pPBS-ISFV-001): Las secuencias de ácido nucleico del promotor T7, líder del VSV, líder del ISFV, N, M, P, G y una secuencia parcial de L insertada en pBlueScript II SK+ a través de los sitios Xhol/Kpnl. Las secuencias se insertaron en una dirección de 3' a 5'.

Plásmido UTMB n.° 2 (renombrado pPBS-ISFV-002): Secuencia de ácido nucleico de secuencia parcial en 3' de L del ISFV y terminador insertado en la cadena principal VSV^nj N4CT1 a través de los sitios Xhol/Rsrll.

Además de lo anterior, se proporcionaron plásmidos de soporte que codifican genes ISFV individuales (M, P, N, G y L) bajo el control de un promotor T7.

Construcción de pPBS-ISFV-008 que contiene ADNc genómico del ISFV de longitud completa

Inserción de la secuencia eliminada L del ISFV. La secuencia de ácido nucleico ausente de 2,4 kb de L del ISFV se insertó en pPBS-ISFV-001 y pPBS-ISFV-002. El fragmento ausente se generó por PCR usando los cebadores ISF_59- GTGCGT- GGAAGACCGGT ACCTCCCATTTGG (SEQ ID NO:13)/ ISF_60-TAATGTTATTGCCGGCGAATTCGAAACT- GAATAAATC (SEQ ID NO:14) con el plásmido de soporte pT7-IRES-ISFV L como plantilla. El ciclo de PCR utilizado fue: 95 °C, 2 min; (95 °C, desnaturalización de 30 segundos/50 °C, recocido de 30 segundos/72 °C, alargamiento de 2,5 minutos) a 40 ciclos; 72 °C, 2 min. Para garantizar la mayor fidelidad de la secuencia, se usó ADN polimerasa Pfx50 (Invitrogen). A continuación, el producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción Kpnl y NgoMIV junto con pPBS-ISFV-001. Este producto de restricción de digestión se ligó para generar pPBS-ISFV-003. El 2,4 kb también se generó mediante PCR usando los cebadores ISF_62-AATAACATT ACTC- GAGTTCGGTACCTCCCATTTGG (SEQ ID NO:15)/ISF 63-CAACTTTAAATTCGAAACTGAATAAATCTATC (SEQ ID NO:16) con el plásmido de soporte pT7-IRES-L como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-002 a través de Xhol y BstBI, respectivamente, para generar pPBS-ISFV-005. El L del ISFV completo se restauró mediante la combinación de pPBS-lSFV-001 y pPBS-ISFV-005 a través de sitios de restricción Xhol/Kpnl para generar pPBS-ISFV-006.

Construcción del promotor T7 adyacente a la líder del ISFV. Para generar una construcción adecuada para el rescate del ISfV, el promotor T7 (TAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 17)) tuvo que colocarse inmediatamente cadena arriba de la secuencia líder del ISFV (ACGGAGAAAAACAAACCAATTCACGC (SEQ ID NO: 18)). Por lo tanto, la amplificación por PCR del promotor T7 adyacente a la secuencia líder del ISFV se logró usando los cebadores ISF_65- TTGAGCACCTGGTACAGG- TATGAATTGATGTGACAC (SEQ ID NO:19)/ ISF_66-GCGTGAATTGGTTTGTTTTTCTCCGTCCTATAGTGAGTCG- TATTAGCCGGCCTCGAGT AAATTAATT (SEQ ID NO:20) con pPBS-ISFV-001 como plantilla. La amplificación por PCR resultante generó un fragmento que sirvió como plantilla para una segunda ronda de amplificación utilizando los cebadores ISF_65-TTGAGCACCTGGTACAGGTATGAATTGATGTGACAC (SEQ ID NO:21)/ISF_67- CGTATTAGCCGGCCTCGAG-TAAATTAATT (SEQ ID NO:22) para crear los sitios de restricción EcoNI/NgoMIV. El producto de PCR se insertó luego en pPBS-ISFV-001 a través de los sitios de restricción EcoNI/NgoMIV para generar pPBS-ISFV-007.

Construcción de un ADNp que contiene un ADNc del virus Isfahan de longitud completa. Se generó un ADNp que contenía ADNc genómico del ISFV de longitud completa mediante la digestión de pPBS-ISFV-006 y pPBS-ISFV-007 con las enzimas de restricción NgoMIV/SanDI para construir pPBS-ISFV-008 con la secuencia de ácido nucleico 5'-N¹-P²-M³-G⁴-L⁵ -3' y el promotor T7 adyacente a la secuencia líder de ISFV.

Procedimiento de rescate del rISFV

Preparación de ADNp. Para cada electroporación, los siguientes ADN plasmídicos como se enumeran en la Tabla 1 se combinaron en un tubo de microcentrífuga en condiciones estériles:

El volumen de ADN se ajustó a 300 pl con agua estéril, libre de nucleasas. A continuación, se añadieron 60 pl de acetato sódico 3 M y 900 pl de etanol al 100 % y la mezcla se almacenó durante la noche a -20 °C. El ADN se sedimentó mediante centrifugación a 14000 rpm durante 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante se aspiró y el sedimento de ADN se secó al aire y se resuspendió en 50 pl de agua estéril, libre de nucleasas para cada electroporación.

Preparación de células Vero. Los siguientes medios enumerados en la Tabla 2 se usaron para el rescate de ISFV:

Cada electroporación requiere células de aproximadamente 1,3 matraces T-150 casi confluentes o un matraz confluente. Las monocapas celulares de cada matraz T150 se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin Ca2+ o Mg2+. Se aspiró la DPBS y se tripsinizó con 5 ml de solución de tripsina-EDTA, y luego se incubó a 37 °C durante hasta 5 minutos. Después de desalojar las células mediante pulsación del matraz, se añadieron 10 ml de Medio de rescate 1 a cada matraz para suspender las células y se transfirieron 2 matraces a un tubo cónico de 50 ml que contenía 10 ml de Medio de rescate 1. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron con 10 ml de medio de rescate 2 por tubo cónico de 50 ml, seguido de centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El lavado se descartó y el sedimento celular se resuspendió en 0,7 ml de medio de rescate 2. La suspensión celular se transfirió a un tubo de microcentrífuga alicuotado con 50 pl de la solución de ADN plasmídico y se mezcló suavemente, seguido de la transferencia de las células/ADN a una cubeta de electroporación.

Electroporación. Las células se electroporaron en un electroporador BTX820 como sigue:

(continuación)

Después de la electroporación, todas las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió 1 ml de medio de rescate 1 a la cubeta con una mezcla suave para resuspender las células electroporadas. La suspensión celular se transfirió luego de la cubeta a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía 10 ml de medio de rescate 1 y se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El medio se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio de rescate 1 y se transfirieron a matraces T-150 que contenían 20 ml de medio de rescate 1. Los matraces se incubaron a 37 °C (CO² al 5 %) durante 3 horas, seguido de un choque térmico a 43 °C (CO² al 5 %) durante 3-5 horas y luego se volvieron a 32 °C para una incubación a largo plazo. Después de una noche de incubación, el sobrenadante se reemplazó con 25 ml de Medio de rescate 1 nuevo. Los rescates positivos del rISFV mostraron un efecto citopático (CPE, de sus siglas en inglés), caracterizado por regiones de células redondeadas, después de 5-10 días. Se recogió el sobrenadante de rescate; congelado instantáneamente en un baño de etanol/hielo seco y se aisló un solo clon(es) de virus mediante selección de placa seguido de dos rondas de amplificación en células Vero para generar una reserva de trabajo de virus.

Alineación de aminoácidos de la nucleoproteína del ISFV/Vesiculovirus

La secuencia de aminoácidos de la nucleoproteína del ISFV se alineó con otras secuencias de nucleoproteína del vesiculovirus (Tabla 3). Las coincidencias porcentuales se basan en identidades de aminoácidos con la secuencia de nucleoproteína del ISFV. La homología detallada en las secuencias se puede ver en la Figura 4. Las regiones de homología de aminoácidos están sombreadas.

Tabla 3

Ejemplo 2

CONSTRUCCIÓN DE VECTORES RISFV ATENUADOS MEDIANTE BARAJADO DE GENES Y TRUNCACIONES DE LA COLA CITOPLÁSMICA DE G DEL ISFV

Construcción de rISFV-N4G5-MCS1. El plásmido pPBS-ISFV-008 comprende la secuencia de ácido nucleico 5'- N¹-P²-M³-G⁴-L⁵-3' [antigenoma de rISFV]. Los números de subíndice indican la posición genómica de cada gen ISFV, P (que codifica la fosfoproteína), M (que codifica la proteína de la matriz), G (que codifica la proteína de unión), N (que codifica la proteína nucleocápside) y L (que codifica la proteína polimerasa).

El plásmido pPBS-ISFV-009 comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6 -3' (antigenoma de un rISFV con un casete transcripcional adicional en la posición 1). De acuerdo con esta fórmula, el MCS (sitio de clonación múltiple) es una unidad transcripcional (UT) vacía en el rISFV antigénico en la posición 1 inmediatamente cadena arriba de N del ISFV. Los números de subíndice indican la posición antigénica de cada gen ISFV, P (que codifica la fosfoproteína), M (que codifica la proteína de la matriz), G (que codifica la proteína de unión), N (que codifica la proteína nucleocápside) y L (que codifica la proteína polimerasa).

Primero, se eliminó el sitio NheI interno en ISFV L para fines de clonación: Se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_68 - AATCTGGAcgcgtctcGCTAGtCAGGCTGATTATTTGAGG (SEQ ID NO:23) / ISF_48 -TTGATATTTC- CCCAACTCTAC (SEQ ID NO:24) y usando pPBS-ISFV-008 como plantilla y se insertó en pPBS-ISFV-008 a través de los sitios de restricción AfeI/BsmBI y AfeI/NheI, respectivamente, para generar pPBS-ISFV-010.

Se generó un segundo fragmento de PCR que contiene una secuencia parcial de ISFV M - ISFV G - ISFV L parcial con los cebadores ISF_73- CGCAT GCCGTCTCCTT AT GTT GATT G (SEQ ID NO:25) / ISF28 -AGCATTCATTATAAGTATGAC (SEQ ID NO:26) y usando pPBS-ISFV-008 como plantilla. Este fragmento se insertó en un vector de clonación pT7Blue modificado (Novagen) a través de los sitios de restricción SphI/AgeI para generar pPBS-ISFV-011.

A partir de PPBs-ISFV-011, dos reacciones de mutagénesis consecutivas se realizaron usando pares de cebadores ISF 71 - GCTTTTCACAGAT GAAGCTAGCTGAAAGT AT GAAAAAAACG (SEQ ID NO:27) / ISF_72 -GTTTTTTT CATACTTT CAGCTAGCTT CATCTGT GAAAAGCTT G (SEQ ID NO:28) and ISF_69 _ AACAGAGGT CAAACGCGTGT CAAAAT GACTT CAGTTTTATT CAT G (SEQ ID NO:29) / ISF_70 -GAATAAAACTGAAGTCATTTTGACACGCGTTTGACCTCTGTTAAT (SEQ ID NO:30) para generar pPBS-ISFV-013. Luego se digirió pPBS-ISFV-013 usando enzimas de restricción BsmBI/AgeI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-009. La construcción resultante pPBS-ISFV-014 comprendía, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6 -3', pero a diferencia de pPBS-ISFV-009, el gen G del ISFV está flanqueado por los sitio de restricción MluI/NheI que permiten el intercambio fácil con variantes de G del ISFV que comprenden, por ejemplo, truncamientos de la cola citoplasmática de G del ISFV.

Para barajar el gen N en la posición 4 y, por lo tanto, para atenuar rISFV como un vector, se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_84 - CAGCT GGCGGCCGCTAGGAATTCAAATCAACAT AT AT GAAAAAAAT CAACAGA-GAT ACAACAATG (SEQ ID NO:31) / ISF20 - ACATAGTGGCATTGTGAACAG (SEQ ID NO:32) y usando pPBS-ISFV-008 como plantilla y se insertó en un vector de clonación pT7Blue modificado (Novagen) a través de los sitios de restricción HindIII/NotI para generar pPBS-ISFV-017. pPBS-ISFV-017 y pPBS-ISFV-014 se combinaron mediante el intercambio del inserto BsmBI/NotI de pPBS-ISFV-017 en el fragmento de vector correspondiente de pPBS-ISFV-014 para generar pPBS-ISFV-019.

Al mismo tiempo, se generó pPBS-ISFV-015 mediante amplificación por PCR de un fragmento con cebadores ISF_73- CGCATGCCGTCTCCTTATGTTGATTG (SEQ ID NO:33) / ISF_82 -AGTCATACCGGTCTCGTTAATTTTTTTCAT- ATCTTTCTTCTGCATGTTATAATTC (SEQ ID NO:34) y usando pPBS-ISFV-008 como plantilla e insertándolo en un vector de clonación pT7Blue modificado (Novagen) a través de los sitios de restricción SphI/AgeI. Se generó un segundo fragmento por PCR con ISF_80 -TCGAGAACGCGTTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC (SEQ ID NO:35) / ISF_81 -ATTCCAACGCGTCTCGTTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAGTAAAG (SEQ ID NO:36) y usando pPBS-ISFV-008 como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-015 a través de los sitios de restricción BsmBI/MluI y BsaI/MluI, respectivamente, para generar pPBS-ISFV-016.

Finalmente, pPBS-ISFV-016 y pPBS-ISFV-019 se combinaron mediante el intercambio del inserto BsmBI/Mlul de pPBS-ISFV-016 en el fragmento de vector correspondiente de pPBS-ISFV-019. La construcción resultante pPBS-ISFV-020 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-MCS1-P2-M3-N4-Gs-L6 -3', en la que el gen N se ha barajado en la posición 4 del rISFV en comparación con pPBS-ISFV-014.

Construcción de rISFV-N4G3-MCS5. A partir de PPBs-ISFV-013, una reacción de mutagénesis se realizó con cebadores ISF_90 - GCTTTTCACAGATGAAGCTAGCGCATGCGGCCGCTGAAAGTATGAAAAAAACG (SEQ ID NO:37) / ISF_91 - GTTTTTTTCATACTTTCAGCGGCCGCATGCGCTAGCTTCATCTGTGAAAAGCTTG (SEQ ID NO:38) para generar pPBS-ISFV-022. Un enlazador de oligonucleótidos generados a partir de ISF_92 CTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGAGGTCAAACTCGAGGATATCGGTACCG AAGGCGCGCCCAGCTGT-GCGGCC (SEQ ID NO:39) and ISF_93 -GGCCGCACAGCTGGGCGCGCCTTCGGTACCGATATCCTCGAGTTTGAC- CTCTGTTAA TTTTTTTCATACTTTCAG (SEQ ID NO:40) se ligó entonces con el fragmento del vector NheI/NotI de PPBs-ISFV-022 para generar pPBS-ISFV-023. Un fragmento de PCR se generó con cebadores ISF_98 -GAATTCCTCGAGTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC (SEQ ID NO:41) y ISF_99 - GAT-GAA GCTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAG (SEQ ID NO:42) y usando pPBS-ISFV-016 como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-023 a través de los sitios de restricción XhoI/NheI para generar pPBS-ISFV-024.

Además, se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF16 - ATCATTCCTTTATTTGTCAGC (SEQ ID NO:43) and ISF_100 - TATATGGCTAGC GAAGACAGAGGGAT CAAAAT GT CTCGACT CAAC CAAAT (SEQ ID NO:44) y usando pPBS-ISFV-017 como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-017 a través de los sitios de restricción BsmBI/NheI para generar pPBS-ISFV-025.

Dos enlazadores de oligonucleótidos generados a partir de ISF_101 -CTAGCCCGGCT AATACGACT CACT AT AGGACGGA- GAAAAACAAA (SEQ ID NO:45) / ISF_102 -TTGGTTT GTTTTTCTCCGTCCT AT AGT GAGTCGTATT AGCCGGCG (SEQ ID NO:46) y ISF_103 -CCAATT CAC GCATT AGAAGATT CCAGAGGAAAGTGCTAAC (SEQ ID NO:47) / ISF_104 -CCCTGTTAGCACTTTCCTCTGGAATCTTCTAATGCGTGAA (SEQ ID NO:48), respectivamente, se ligaron luego con el fragmento del vector NheI/BbsI de pPBS-ISFV-025 (para generar pPBS-ISFV-026). Para generar pPBS-ISFV-030, se digirió un plásmido que comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-P1-M2-N3-G4-L5-3', pPBS-ISFV-026 usando enzimas de restricción BsmBI/Ngo-MIV y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-020.

Finalmente, pPBS-ISFV-024 y pPBS-ISFV-030 se combinaron mediante el intercambio del inserto BsmBI/AgeI de pPBS-ISFV-024 en el fragmento de vector correspondiente de pPBS-ISFV-030. La construcción resultante pPBS-ISFV-031 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6-3', en la que el gen N se ha barajado en la posición 4 del rISFV en comparación con pPBS-ISFV-014.

Construcción de rISFV-N*4G5-MCS1. Aunque una alineación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas N de rISFV y rVSV reveló solo una homología general del 52 %, la alineación demostró una homología muy cercana para un epítopo restringido H2d fuerte y conocido (MPYLIDFGL; véase la Figura 11). Por lo tanto, se usaron alineaciones adicionales con proteínas N adicionales de otros vesiculovirus para eliminar o al menos reducir la homología entre rISFV y rVSV para este tramo de aminoácidos. A partir de PPBs-ISFV-016, una reacción de mutagénesis se realizó con los cebadores ISF_127 -GAAAGACAAGAAGT GGACCAGAGCGATTCCT ACAT GCCTTACAT GATT GATAT GGG GATCTCAACCAAATC (SEQ ID NO:49) / ISF_128 -GGTTGAGATCCCCATATCAATCATGTAAGGCATGTAGGAATCGCTCTGGTCCACTTC TT- GTCTTTCTTTC (SEQ ID NO:50) para generar pPBS-ISFV-033 que contiene los siguientes cambios de aminoácidos en N del ISFV: K271Q, A272S, L279M, F282M (ISFV N*) (véase la Figura 11). El pPBS-ISFV-033 se digirió usando las enzimas de restricción SanDI/BsrGI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-024 para generar pPBS-ISFV-037. Finalmente, pPBS-ISFV-037 y pPBS-ISFV-031 se combinaron mediante el intercambio del inserto NheI/Agel de pPBS-ISFV-037 en el fragmento de vector correspondiente de pPBS-ISFV-031. La construcción resultante pPBS-ISFV-038 comprende, por lo tanto, como pPBS-ISFV-031, la secuencia de ácido nucleico antigenómico 5'-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6- 3', sin embargo, la proteína N del ISFV codificada transporta los cuatro cambios de aminoácidos K271Q, A272S, L279M, F282M (ISFV N*).

Vectores atenuados de rISFVN que expresan el antígeno modelo gag SDE del VIH-1. El plásmido pPBS-VIH-055 es un vector de clonación estándar que comprende un gen gag del VIH-1 truncado llamado gag SDE de lVIH-1 (epítopo dominante único). La secuencia de aminoácidos de gag SDE del VIH-1 es la siguiente: 1MVARASVLGGELDRWEKEEERPGGKKKYKLKEEEWASRELERFAVNPGLETSEGCRQ 60I-192GGHQAAMQMLKETINEEA210A-333ILKALGPAATLEEMMTACQGVGGYPYDVPDYAPGHKARV363L (SEQ ID NO:51) Los números indican las posiciones de aminoácidos en la proteína gag del VIH-1 nativa. Se encontró que el péptido "AMQMLKETI" (SEQ ID NO: 52) es un inductor fuerte de una respuesta de linfocitos T en ratones BALB/c y, por lo tanto, se usó gag SDE del VIH-1 como prueba de antígeno modelo de inmunogenicidad de diferentes diseños de vectores.

Primero, se digirió pPBS-VIH-055 usando las enzimas de restricción XhoI/NotI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-014. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-013 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(H IV-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-G^s-L6 -3' y se usó para crear el rISFV correspondiente.

El plásmido pPBS-VIH-055 se digirió usando las enzimas de restricción XhoI/NotI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-020. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-014 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-G5-L6 -3'. Por lo tanto, el virus rISFV correspondiente comprende un único marcador de atenuación: un ISFV N barajado en la posición 4 del rISFV.

Se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_83 - TTTTTTGCTAGCTTCACCTGCATAATAGTGGCAAC (SEQ ID NO:53) / ISF_69 - AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:54) y usando pPBS-ISFV-VIH-014 como plantilla y se insertó en pPBS-ISFV-VIH-014 a través de MluI/NheI para generar pPBS-ISFV-VIH-015, que ahora comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(GACT25)5-L6-3'. Por lo tanto, el virus rISFV correspondiente comprende dos marcadores de atenuación: (1) el barajado de N del ISFV en la posición 4 del rISFV antigénico y (2) el truncamiento del extremo distal de la cola citoplasmática (CC) de G del ISFV mediante 25 aminoácidos. La longitud precisa de los dominios CC y transmembrana (TM) de la proteína G del ISFV no se ha caracterizado tan bien como los de VSVIN, pero se predice un dominio hidrófobo aproximado de 18 aminoácidos (aa) cerca del extremo carboxilo como el anclaje TM de la proteína G del ISFV. Los restantes 33 restos cadena abajo representan la CC de la proteína G.

Además, pPBS-ISFV-033 se digirió usando las enzimas de restricción BsmBI/MluI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-VIH-015. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-018 comprendía, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3- N*4-(GACT25)5-L6 -3'. En comparación con rISFV-VIH-015, el gen N del ISFV codificado en el rISFV-VIH-003 correspondiente llevaba los cuatro cambios de aminoácidos K271Q, A272S, L279M, F282M dentro del epítopo de linfocitos T fuerte conocido para ratones BALB/c.

El plásmido pPBS-ISFV-VIH-015 se digirió usando las enzimas de restricción Mlul/Nhel y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-VIH-013. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-017 comprendía, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-(GACT25)5-L6-3'. Por lo tanto, el virus rISFV correspondiente comprende un único marcador de atenuación: el truncamiento de la cola citoplasmática de G del ISFV.

Finalmente, se generó un vector rISFV atenuado en el que el gen truncado ISFV GACT25 fue reemplazado por el gen VSV^nj GCT1, que codificó una G del VSV modificada del serotipo NJ con truncamiento similar en la cola citoplasmática de 28 aminoácidos. Para generar pPBS-ISFV-VIH-016 [que comprende la secuencia de nucleótidos 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(VSVnj GCT1)5-L6-3'], pPBS-VSV-VIH-054 (vector de clonación del rVSV que contiene un gen VSVNJ GCT1 flanqueado por los sitios de enzimas de restricción MluI/NheI) se digirió usando las enzimas de restricción MluI/NheI. El inserto aislado se ligó luego con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-VIH-015. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-016 comprendía, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-(VSVnj G CT1)5-L6-3' y se usó para rescatar el correspondiente rISFV.

La atenuación de todos los rISFV que expresan gag SDE del VIH-1 se probó in vitro mediante ensayo en placa. Los tamaños de placa observados fueron los siguientes (Figura 5): rISFV-VIH-013 = rISFV-VIH-14 > rISFV-VIH-15 = rISFV-VIH-017 > rISFV-VIH- 018 = rISFV-VIH-016.

Además de las construcciones de rISFV descritas anteriormente, se usaron dos vectores de rVSV atenuados generados a partir de los siguientes plásmidos en los experimentos de inmunización de sensibilización/refuerzo:

pPBS-VSV-VIH-106 comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(G CT1)5-L6-3' y todos los genes del vector (P, M, N, G CT1 y L) proceden del serotipo VSV Indiana. El rVSVIN procedente de este plásmido se usó en el estudio representado en la Figura 16.

pPBS-VSV-VIH-122 comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(G CT1)5-L6-3', genes del vector (P, M, N y L) procedentes del serotipo VSV Indiana, y el gen del vector G CT1 procede del serotipo VSV NJ. El rVSVNJ procedente de este plásmido se usó en el estudio representado en la Figura 16.

Estabilización del truncamiento de la cola citoplasmática de G del ISFV. Numerosos rISFV atenuados que comprenden un gen ISFV GACT25 (por ejemplo, rISFV-VIH-015 y rISFV-VIH-018) se pasaron ampliamente en cultivo de células Vero para determinar la estabilidad de este marcador de atenuación. En el paso 10, prácticamente todos los rISFV extendieron la cola citoplasmática por dos aminoácidos para contener esencialmente un gen rISFV GACT23. De este modo, los rISFV probados cambiaron el codón de parada del gen ISFV GACT25 en un codón para un aminoácido y luego usaron una alternativa en el codón de parada dos codones cadena abajo. Por lo tanto, se examinaron dos manipulaciones de la unión del gen ISFV GACT25 - L por su capacidad para estabilizar el marcador de atenuación ISFV GACT25 en rISFV:

A) Combinando la señal de parada transcripcional (subrayado) y traduccional (negrita) para el casete transcripcional que contiene ISFV GACT25:

El último aminoácido de ISFV GACT25 cambia de arginina a valina.

B) Usando el 3'-NCR de VSVin G CT1 presente en vectores prototípicos rVSVIN-N4CT1 como 3'-NCR para el casete de expresión ISFV GACT25:

Los resultados mostraron que solo el enfoque (B) estabilizó el marcador de atenuación ISFV GACT25 durante el paso extenso de los virus rISFV correspondientes (por ejemplo, rISF-VIH-020) en cultivo de células Vero.

Enfoque A - Construcción

Para manipular la unión del gen ISFV GACT25 - L, se digirió pPBS-ISFV-VIH-018 usando las enzimas de restricción MluI/NheI y se insertó en un fragmento de vector correspondiente procedente de un vector de clonación pT7Blue modificado (Novagen) para generar pPBS-ISFV-049.

Primero, una reacción de mutagénesis se realizó en pPBS-ISFV-049 con los cebadores ISF_140 -CTATTATGCGTATGCGAGACGCGTCTCGTATGAAAAAAACGAATCAACAGAG (SEQ ID NO:58) / ISF_141 -CTGTTGATTCGTTTTTTTCATACGAGACGCGTCTCGCATACGCATAATAGTG (SEQ ID NO:59) para generar pPBS- ISFV-051. Además, se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_146 - A^a TTAACGTCTC AGAGATTGCAGCGAACCCCAGTGCGGCTGCTGTTTCTTTC (SEQ ID NO:60) / ISF_69 -AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:61) y usando pPBS-ISFV-031 como plantilla. Junto con un enlazador de oligonucleótidos generados a partir de ISF_144 -TCTCTGTGATCCTGATCATCGGACTGAT- GAGGCTGCTGCCACTACTGTGCAGGTGAG (SEQ ID NO:62) y ISF_145 -CTAGCTCACCTGCACAGTAGTGGCAGCAGCCTCATCAGTCCGATGATCAGGATCACA (SEQ ID NO:63), el fragmento de PCR (MluI/BsmBI) se insertó en pPBS-ISFV-049 a través de MluI/NheI para generar pPBS-ISFV-056. En comparación con pPBS-ISFV-049, la secuencia de nucleótidos que codifica la región transmembrana de ISFV GACT25 en pPBS-ISFV-056 se ha modificado silenciosamente para reducir la riqueza de A/T. Se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_147 - CTAG- GCGCGTCTCGCATACGCACAGTAGTGGCAG (SEQ ID NO:64) / ISF_69 - AACAGAGGT CAAACGCGTGTCAAAAT - GACTT CAGTTTT ATT CATG (SEQ ID NO:65) y usando pPBS-ISFV-056 como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-051 a través de MluI/BsmBI para generar pPBS-ISFV-059. El plásmido pPBS-ISFV-059 se digirió usando las enzimas de restricción MluI/AgeI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-VIH-018. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-021 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6-3', tiene cambios de nucleótidos silenciosos en la transmembrana región de ISFV GACT25 para reducir la riqueza de A/T en comparación con la secuencia nativa, y el codón de parada de ISFV GACT25 es parte de la parada transcripcional en la unión del gen ISFV GACT25 - L.

Enfoque B - Construcción

El plásmido pPBS-ISFV-056 se digirió usando las enzimas de restricción MluI/NheI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-VSV-VIH-020, que contiene una secuencia antigénica de un vector rVSV atenuado (N4CT1) que expresa gag del VIH-1 del primer casete transcripcional. La construcción resultante pPBS-ISFV-057 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag)¹-VSV P²-VSV M³-VSV N⁴- ISFV GACT255-VSV L6 -3' y, por lo tanto, el 3'-NCR de G CT1 del VSV está vinculado al marco de lectura abierto que codifica ISFV GACT25.

Se generó un fragmento de PCR con los cebadores ISF_148 - TGTTAGCGTCTCTCATAAAAATTAAAAACT-CAAATATAATTG (SEQ ID NO:66) y ISF_69 - AACAGAGGT CAAACGCGTGTCAAAATGACTT CAGTTTTATT CATG (SEQ ID NO:67) y usando pPBS-ISFV-057 como plantilla e insertado en pPBS-ISFV-051 a través de MluI/BsmBI para generar pPBS-ISFV-058.

Finalmente, se digirió pPBS-ISFV-058 usando las enzimas de restricción MluI/AgeI y el inserto aislado se ligó con un fragmento de vector correspondiente procedente de pPBS-ISFV-VIH-018. La construcción resultante pPBS-ISFV-VIH-021 comprende, por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico 5'-(VIH-1 gag SDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6 -3', tiene cambios de nucleótidos silenciosos en la región transmembrana de ISFV GACT25 para reducir la riqueza de A/T en comparación con la secuencia nativa, y comprende el 3'-NCR de VSV GCT1 en la unión del gen ISFV GACT25-L.

Ejemplo 3

ESTUDIOS DE ANIMALES

Se realizó una serie de estudios en ratones para investigar la seguridad y eficacia relativas de las composiciones inmunogénicas que comprenden vectores rISFV que expresan proteínas de alfavirus. El modelo DL⁵⁰ intracraneal (IC) de ratón se usó para una evaluación primaria de la seguridad del vector debido a las propiedades conocidas de neurovirulencia de los vesiculovirus y virus relacionados (Olitsky et al., Journal of Experimental Medicine. 1934, 59:159-71; Frank et al., Am J Vet Res. 1945, Jan:28-38; Sabin et al., Journal of Experimental Medicine. 1937, 66:15-34; Rao et al., Lancet. 2004, 364(9437):869-74). La eficacia se evaluó en estrictos modelos de exposición a VEEV y EEEV.

Neurovirulencia de vectores rISFV. Se realizó un estudio piloto para investigar las propiedades de neurovirulencia del rISFV no modificado y una variante altamente atenuada que expresa gag del VIH-1 (rISFV-N4 GACT25 VIHgagl). Se utilizó un vector rVSViN N2CT1 con una DL⁵⁰ conocida de estudios previos como control positivo (Clarke et al., J Virol. 2007, Feb;81(4):2056-64). Grupos de 10 ratones Swiss Webster hembra de cinco semanas de edad se inocularon con 25 pl de diluciones en serie de 10 veces de cada virus a través de la ruta intracerebral (IC) y se observó letalidad en los animales durante 21 días. PBS se usó como control para el proceso de inyección (Tabla 4).

Se observó letalidad limitada en animales inyectados con vectores rISFV y, en consecuencia, no se pudo determinar una DL⁵⁰ (Tabla 4). Por el contrario, rVSViN N2CT1 causó letalidad y se determinó una DL⁵⁰ (104 ufp) similar a la determinada en estudios previos (Tabla 4). Estos datos sugieren que rISFV es inherentemente menos neurovirulento que rVSVIN, que demostró una DL⁵⁰ de 5-10 unidades formadoras de placa (UFP) en su forma no modificada (Clarke et al., J Virol. 2007, Feb;81(4):2056-64).

Tabla 4. Título de DL⁵⁰ de vectores rISFV y rVSVIN en ratones Swiss Webster Construcción vírica N Dosis (ufp) ^Supervivenci DL⁵⁰ (ufp)

a (%)

10 107 100

10 106 100

rISFV N4ACT25 VIHgagl 10 105 100 > 107

10 104 100

10 103 100

10 104 50

rVSVIN N2CT1 10 103 90 104

10 102 90

10 103 80

rISFV 10 102 100 > 103

10 101 100

PBS 10 100

Eficacia protectora de los vectores rISFV. Se realizó una serie de estudios para investigar el potencial del rISFV como vector para la protección contra la infección y la enfermedad por alfavirus. Para estos estudios, se inmunizaron ratones hembra CD-1 de 4 a 6 semanas de edad por vía intramuscular usando un volumen de dosis de 50 pl. Los ratones fueron expuestos con 104 UFP de VEEV-ZPC o EEEV-FL93 inyectados por vía subcutánea. Todos los procedimientos y el cuidado de los animales se ajustaron a las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

Protección a corto plazo contra la exposición a VEEV y EEEV. Para determinar si los vectores rISFV-N4G3 que codifican E3-E1 de VEEV-ZPC o EEEV-FL93 en la quinta posición podrían proteger contra la exposición letal con VEEV y EEEV, se inmunizaron cohortes de ratones CD-1 con 108 UFP de los vectores y luego se expusieron 3-4 semanas después de la inmunización (Tabla 5). Después de la inmunización, se detectó fácilmente una respuesta de anticuerpo neutralizante en ratones inmunizados con rISFV- N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1) 5, mientras que se detectó poco anticuerpo neutralizante en animales inmunizados con rISFV- N4G3-(VEEV-ZPC) 5 (Tablas 6, 7). Independientemente de la respuesta de anticuerpos, todos los animales estaban protegidos contra la exposición letal a EEEV-FL93 y VEEV-ZPC (Figura 6 y Figura 7).

Tabla 5. Diseño del estudio para los estudios de exposición a VEEV-ZPC y EEEV-FL93 Inmunización Exposición Grupo ^{Construcción de}

_{inmunización} Dosis (ufp) Vía Número

_animale Virus Dosis (ufp) Vía

1 ^{rISF-N4G3-(VEEV ZPC E3} VEEV

_E1)5 108 IM 10 _ZPC 104 SC VEEV

2 PBS IM 10 ZPC 104 SC

rISF-N4G3-(EEEV FL93 E3 EEEV

3 E1)5 108 IM 10 FL93 104 SC

EEEV

4 PBS IM 12

FL93 104 SC

Tabla 6. Respuesta de anticuerpos neutralizantes en ratones inmunizados con rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3- E1)5

PRNTsq

N.° de animal Día 14 Día 21

1 40 80

2 0 0

3 40 20

4 40 320

5 40 160

(continuación)

PRNTsq

N.° de animal Día 14 Día 21

6 40 80

7 80 80

8 0 80

9 160 40

10 40 160

Media 48 102

DE 45 93

Tabla 7. Respuesta de anticuerpos neutralizantes en ratones inmunizados con rISFV-N4G3-VEEV-ZPC E3-E1 )5

PRNTsq

N.° de animal Día 21 Día 28

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 40

5 0 0

6 0 0

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 0 0

Titulación de dosis y estudio de inmunidad a largo plazo. Los animales se inmunizaron con 108 o 107 UFP de rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 o rVSVIN N4G(^ct-1)3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 (Tabla 8). Después de la inmunización, se pudo detectar una respuesta de anticuerpos neutralizantes del VEEV en la mayoría de los animales inmunizados con rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 a ambas dosis (Tabla 9). Se detectaron respuestas de anticuerpos neutralizantes más consistentes en todos los animales inmunizados con rVSVIN N4G(ct-1)3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 (Tabla 10). Sin embargo, como se observó en el estudio anterior, independientemente de la respuesta de anticuerpos neutralizantes al VEEV, todos los animales estaban protegidos después de la exposición letal (Figura 8).

Tabla 8. Titulación de dosis y diseño del estudio de inmunidad a largo plazo

Inmunización ^{Exposición (4 y 30 semanas después de} _{la infección)}

Grupo ^{Construcción de} Dosis

_{inmunización} Vía ^{N.° de}

_male Virus Dosis Vía ^{N.° de} (ufp) _ani (ufp) _animales 1 ^{rISF-N4G3-(VEEV ZPC}

_{E3-E1 )5} 108 IM 10 VEEV

_ZPC 104 SC 5

2 ^{rISF-N4G3-(VEEV ZPC} 107 IM 10 VEEV

_{E3-E1 )5 ZPC} 104 SC 5 rVSVIN

3 N4G(^ct-1)3-(VEEV-ZPC 108 IM 10 ^VEEV

ZPC 104 SC 5 _{E3-E1 )5}

rVSVIN

4 N4G(^ct-1)3-(VEEV-ZPC 107 IM 10 ^VEEV

ZPC 104 SC 5 _{E3-E1 )5}

5 PBS IM 10 ^V

_Z ^E _P ^E _C ^V

104 SC 5

Tabla 9. Res uesta de anticuer os neutralizantes en ratones inmunizados con rISFV-N4G3- VEEV-ZPC E3-E1)5

continuación

Tabla 10. Respuesta de anticuerpos neutralizantes en ratones inmunizados con rVSViN-N4G(cT-i)3-(VEEV-ZPC E3-

E15

Eficacia de las composiciones inmunogénicas combinadas. Dado que una composición inmunogénica debería proporcionar protección contra más de un alfavirus, se diseñó un estudio para investigar si los animales inmunizados simultáneamente con rlSFV- N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 y rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5 podrían protegerse contra la exposición letal contra EEEV-FL93 y VEEV-ZPC (Tabla 11). Como en estudios anteriores, se detectaron anticuerpos neutralizantes contra EEEV-FL93 y VEEV-ZPC en casi todos los ratones (Tablas 12 y 13) y todos los animales inmunizados se protegieron contra la exposición letal a EEEV-FL93 (Figura 9) o VEEV-ZPC (Figura 10). Estos resultados demuestran que las composiciones inmunogénicas combinadas pueden proporcionar protección contra la exposición letal de múltiples alfavirus.

Tabla 12. Respuesta de anticuerpos neutralizantes contra EEEV-FL93 en ratones inmunizados con rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5 y rISFV-N4G3-VEEV ZPC E3-E1)5

PRNTsq

N.° de animal Día 14 Día 21

1 80 160

2 40 80

3 80 80

4 80 320

5 40 80

6 80 160

7 80 80

8 40 80

9 80 160

10 40 320

Media 64 152

DE 21 96

Tabla 13. Respuesta de anticuerpos neutralizantes contra VEEV-ZPC en ratones inmunizados con rISFV-N4G3-______________________ (EEEV-FL93 E3-E1)5 y rISFV-N4G3-VEEV ZPC E3-E1)5______________________

PRNTsq

N.° de animal Día 14 Día 21

1 0 20

2 0 20

3 20 40

4 40 20

5 40 20

6 20 20

7 80 80

8 0 0

9 80 80

10 0 20

Media 28 32

DE 32 27

Ejemplo 4

ESTUDIO PBS-MU-062 DE SENSIBILIZACIÓN/REFUERZO CON VECTORES RVSV Y RISFV EN RATONES BALB/C

Se realizó una serie de estudios en ratones para evaluar un régimen de sensibilización/refuerzo usando rVSV y rISFV que codifican un epítopo dominante único (SDE, de sus siglas en inglés) Gag del VIH en ratones Balb/c. Estos estudios se diseñaron para cumplir con dos objetivos de estudio: (a) PBS-Mu-062a: para estudiar la inmunogenicidad de dos nuevos vectores rISFV-VIH gag SDE en ratones, y para seleccionar el candidato preferido para un futuro estudio de sensibilización/refuerzo con rVSVIN N4CT1Gag, y (b) PBS-Mu-062b: para comparar las respuestas inmunes obtenidas utilizando la combinación de sensibilización/refuerzo de rVSVNJ/rVSVIN y rISFV/rVSVIN.

PBS-Mu-062a: Para este estudio, se comparó la inmunogenicidad relativa de dos vectores de expresión de gag del VIH basados en rISFV candidatos con el objetivo de avanzar en la construcción más inmunogénica en futuros estudios de sensibilización/refuerzo con vectores de expresión de gag del VIH basados en rVSVIN. Se proporciona un resumen del diseño del estudio PBS-Mu-062a en la Figura 13. Para este estudio, se inmunizaron ratones BALB/c (n = 5/grupo) mediante inyección intramuscular con 107 ufp de los vectores que expresan gag del VIH indicados en la Figura 12 y, diez días después, los esplenocitos se recogieron y se analizaron para detectar la secreción del IFN-y específico de gag SDE del VIH y del conjunto de péptidos N del rVSVIN mediante análisis ELISpot (Figura 14). En este estudio, la inmunización con rISFV-VIH-016 (rISFV) dio como resultado una respuesta ELISpot media de interferón-Y de gag del VIH de 236 ± 74 SFC/106 esplenocitos, una respuesta que no fue significativamente diferente a la respuesta ELISpot específica de gag SDE del VIH (147 ± 32 SFC/106 esplenocitos) provocada por el otro rISFV-VIH gag candidato rISFV-VIH-018 (rISFVN*) (Figura 14, izquierda). De manera importante, el vector rISFV-VIH-018, que codifica una proteína N vírica con una serie de mutaciones en un epítopo restringido a H2d conocido, mostró una tendencia reducida a provocar respuestas ELISpot específicas del conjunto de péptidos N antivector rVSVIN N (45 ± 15 SFC/106 esplenocitos) en comparación con el rISFV-VIH gag candidato rISFV-VIH-016 (140 ± 59 SFC/106 esplenocitos) que codifica un gen N vírico de tipo silvestre (Figura 14, derecha). Basándose en estos resultados, se eligió rISFVN* (rISFV-VIH-018) para su uso en experimentos posteriores de rVSV/rISFV de sensibilización/refuerzo.

PBS-Mu-062b: Para este experimento, se comparó la inmunogenicidad relativa de varios regímenes de inmunización de sensibilización/refuerzo utilizando vectores basados en rVSV exclusivamente frente a una combinación de vectores basados en rISFV y rVSV. Se proporciona un resumen del diseño del estudio PBS-Mu-062b en la Figura 16. Para este experimento, se inmunizaron ratones BALB/c (n = 5/grupo) mediante inyección intramuscular con 107 ufp de los vectores que expresan SDE rgVF VIH gag descritos en la Figura 15 en combinación con la construcción rVSVIN VIH gag SDE (Figura 12). Los ratones se inmunizaron en un esquema de 0 y 4 semanas. Una semana después de la inmunización final, se recogieron los esplenocitos y se analizaron para determinar la secreción de IFN-y específica del SDG gag del VIH (Figura 17) y específica del conjunto de péptidos N del rVSVIN (Figura 18) mediante análisis ELISpot. En este estudio, los ratones inmunizados con el régimen de sensibilización/refuerzo de rVSVNJ/rVSVIN demostraron una respuesta de ELISpot específica de SDE gag del VIH (2.330 ± 412 SFC/106 esplenocitos) que fue significativamente menor (p < 0,05) que la respuesta observada en ratones inmunizados con el régimen heterólogo de sensibilización/refuerzo de rISFVN*/rVSVIN (4.758 ± 183 SFC/106 esplenocitos) (Figura 17). Este aumento significativo de dos veces en la respuesta de ELISpot del IFN-y específica de SDE gag del VIH en comparación con los ratones inmunizados con rVSVNJ/rVSVIN no se vio afectado al cambiar el orden del régimen heterólogo (rVSVIN/rISFVN*; 5.870 ± 1.258 SFC/106 esplenocitos) o por la presencia de un gen N vírico de tipo silvestre en el vector rISFV (rISFV/rVSVIN; 5.061 ± 890 SFC/106 esplenocitos) (Figura 17). Como se muestra en la Figura 18, los regímenes heterólogos de sensibilización/refuerzo de rISFVN*/rVSVIN y rVSVIN/rISFVN* produjeron respuestas de ELISpot medias significativamente menores (p < 0,05) del IFN-y específicas del conjunto de péptidos N del rVSVIN (451 ± 67 y 408 ± 55 SFC/106 esplenocitos, respectivamente) en comparación con el régimen rVSVNJ/rVSVIN (2.794 ± 456 SFC/106 esplenocitos) o el régimen rISFV/rVSVIN (1.459 ± 238 SFC/106 esplenocitos).

Los estudios mencionados anteriormente demuestran claramente que los regímenes de inmunización heterólogos de sensibilización/refuerzo de rISFV/rVSVIN y rVSVIN/rISFV provocaron respuestas de ELISpot del IFN-^y significativamente más altas que el régimen de inmunización rVSVNJ/rVSVIN en ratones. Asimismo, la mutación N* del rISFV redujo las respuestas de reacción cruzada a N del rVSV, aunque esto no dio lugar a un aumento en la respuesta de ELISpot del IFN-^y específico de gag SDE del VIH.

Ejemplo 5

ESTUDIO DEL VECTOR RISFV QUE EXPRESA LA GLUCOPROTEÍNA DEL VIRUS DE CHIKUNGUNYA EN RATONES A129

El virus Chikungunya (CHIKV) es un virus transmitido por mosquitos del género Alfavirus en la familia Togaviridae. La infección por CHIKV en seres humanos produce fiebre alta, cefalea, vómitos, erupción cutánea y artritis dolorosa. La artritis, que puede persistir durante meses o incluso años (Powers y Logue. J. Gen. Virol. 2007, 88:2363-2377), es el sello distintivo de una infección por CHIKV generalmente autolimitante. Sin embargo, en epidemias recientes en el subcontinente indio y las islas del Océano Índico, que afectaron a más de 1,5 millones de personas, algunas personas han mostrado síntomas más graves, como encefalitis, enfermedad hemorrágica y mortalidad (Schwartz y Albert. Nature Rev. Microbiol. 2010, 8:491-500). La propagación más reciente y rápida del CHIKV en las islas del Caribe y las Américas (Powers. J. Gen. Virol. 2015, 96:1-5) ha generado una necesidad aún más urgente de composiciones inmunogénicas contra el CHIKV.

El CHIKV tiene un genoma de ARN de 11,8 kb con sentido positivo único, que codifica cuatro proteínas no estructurales (nsP 1-4) y cinco proteínas estructurales (C, E3-E2-6K-E1). Las proteínas estructurales se escinden de un precursor para generar las glucoproteínas de la cápside y la envoltura (Strauss y Strauss. Microbiol. Rev. 1994, 58:491-562). Las proteínas E2 y E1 forman un heterodímero estable y los heterodímeros E2-E1 interactúan para formar la espícula que se encuentra en la superficie del virus. E2 se forma como un precursor llamado PE2 o p62 que se divide en E2 y E3. Hay un pequeño péptido hidrófobo llamado 6K que se produce como un enlazador entre E2 y E1. Cuando se procesa la poliproteína E3-E2-6K-E1, se producen las glucoproteínas E2 y E1, que luego forman los heterodímeros de glucoproteína E2-E1 (Strauss y Strauss, páginas 497-499).

El punto de partida para construir un vector rISFV atenuado que expresa la glucoproteína E2-E1 fue el plásmido denominado pVSVAG-CHIKV, que se recibió del Dr. John Rose (Universidad de Yale) (Chattopadhyay et al. J. Virol.

2013, 87:395-402). Este plásmido contenía una secuencia génica optimizada de Chikungunya E3-E2-6K-E1 (Genscript, Inc.) en lugar del gen G del VSV dentro del ADNc genómico del rVSV. La secuencia CHIKV-E3-E2-6K-E1 se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:

Cebador Alfa_001: GGGCCCACTCGAGAACATGAGCCTGGCCATCCCCGTG (contiene el sitio XhoI y la secuencia Kozak) (SEQ ID NO: 69)

Cebador Alfa_002: 61/ (Contiene el sitio Notl y el sitio Nhel) (SEQ ID NO: 70)

El producto de PCR resultante se digirió con las enzimas de restricción Xho/NotI y se clonó en ADNc del vector rVSVN4CT1. Este ADNc de vector se amplificó y se digirió con las enzimas de restricción Xhol/NotI y el inserto liberado que codifica las proteínas CHIKV-E3-E2-6K-E1 se clonó en pPBS-ISFV-VIH-015 digerido con XhoI/NotI (descrito anteriormente en el Ejemplo 2). El ISFV recombinante (rISFV) que codifica las proteínas CHIKV-E3-E2-6K-E1 se rescató de este ADNp como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. El resultado fue un rISFV-N4 G-CTA25(CHIKV GP)1 denominado virus pPBS-ISF-Alpha-003 que expresa ^c HⁱKV-GP desde la primera posición en el

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un virus Isfahan competente en replicación, recombinante que comprende un gen de proteína N que codifica una proteína N que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, un gen de proteína P que codifica una proteína P que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, un gen de proteína M que codifica una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, un gen de proteína G que codifica una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y un gen de proteína L que codifica una proteína L que tiene una secuencia de aminoácidos que es 90, 95, 98 o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y que comprende además una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica un polipéptido heterólogo.

2. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que la secuencia polinucleotídica heteróloga está flanqueada por una señal de inicio de la transcripción y una señal de parada de la transcripción.

3. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido heterólogo codifica un polipéptido inmunogénico.

4. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido heterólogo codifica uno o más antígenos, preferentemente el antígeno es un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno específico de tumor o cáncer, un antígeno parásito o un alérgeno.

5. El virus Isfahan de la reivindicación 4, en el que el antígeno es un antígeno vírico.

6. El virus Isfahan de la reivindicación 5, en el que el antígeno vírico es del virus Chikungunya.

7. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que la secuencia polinucleotídica heteróloga se ubica en la posición 1, 2, 3, 4, 5 o 6 del genoma del virus Isfahan.

8. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que el gen de la proteína N se ubica en la posición 1, 2, 3, 4 o 5 del genoma del virus Isfahan.

9. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que el gen de la proteína G codifica una proteína G que tiene un truncamiento carboxiterminal, preferentemente, la proteína G tiene un truncamiento carboxiterminal de 20 a 25 aminoácidos.

10. El virus Isfahan de la reivindicación 1, en el que la secuencia polinucleotídica heteróloga se ubica en la posición 5 y el gen de la proteína N se ubica en la posición 4 del genoma del virus Isfahan.

11. Una célula huésped que comprende el virus Isfahan de la reivindicación 1.

12. Una composición inmunogénica que comprende un virus Isfahan competente en replicación, recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición inmunogénica que comprende un virus Isfahan competente en replicación, recombinante de la reivindicación 12, para su uso en la inducción de una respuesta inmune específica de antígeno a un antígeno en un sujeto mamífero que comprende administrar la composición inmunogénica de la reivindicación 12.

14. Un kit de inmunización de sensibilización-refuerzo para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho kit:

(a) una composición de Isfahan que comprende un virus Isfahan competente en replicación recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y (b) una composición de virus de estomatitis vesicular que comprende un virus de estomatitis vesicular competente en replicación recombinante que codifica un gen de proteína N, un gen de proteína P, un gen de proteína M, un gen de proteína G, un gen de proteína L y una secuencia polinucleotídica heteróloga, en la que dicha secuencia polinucleotídica heteróloga (i) está flanqueada por una señal de inicio de la transcripción y una señal de parada de la transcripción, y (ii) codifica un polipéptido heterólogo; y un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(c) instrucciones para la administración de la composición de Isfahan antes o después de la composición del virus de la estomatitis vesicular.

15. Las composiciones inmunogénicas de la reivindicación 14, para su uso en la inducción de una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto mamífero que comprende administrar las composiciones inmunogénicas de la reivindicación 14 en un régimen de sensibilización-refuerzo en el que la composición de Isfahan se administra antes o después de la composición del virus de la estomatitis vesicular.