KR102416194B1 - 재조합 이스파한 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

특정한 실시예들은 이종 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 재조합 수포성바이러스 및 동일한 것을 사용하는 방법들에 관한 것이다.

Description

재조합 이스파한 바이러스 벡터{RECOMBINANT ISFAHAN VIRAL VECTORS}
본 출원은 2014년 3월 1일 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 61/946,734의 우선권을 주장하고, 이것은 본 출원에 그 전체가 참조로서 통합된다.
본 발명은 국립 보건원/국립 알레르기 전염병 연구소(National Institutes of Health/National Institute of Allergy and Infectious Disease)에 의해 수여된 N01-AI-30027, HHSN272201000040I, 및 HHSN2720004/D04에 따른 정부지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 확실한 권리(certain right)를 갖는다.
37 CFR 1.821-1.825에 의해 요구된 시퀀스 목록(sequence listing)은 본 출원과 함께 전자적으로 제출된다. 시퀀스 목록은 본 출원에 참조로서 통합된다.
재조합 수포성 구내염 바이러스(Recombinant vesicular stomatitis virus) (rVSV)는 인간 병원체(pathogens)의 범위에 대한 벡터 플랫폼(platform)으로서 개발되고 있고 (Finke and Conzelmann. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2005, 292:165-200; Jones et al. Nature Medicine. 2005, 11(7):786-90; Kahn et al. Journal of Virology. 2001, 75(22):11079-87; Kapadia et al. Virology. 2005, 340(2):174-82; Reuter et al. Journal of Virology. 2002, 76(17):8900-9; Roberts et al. Journal of Virology. 1999, 73(5):3723-32; Roberts et al. J Virol. 1998, 72(6):4704-11; Rose et al. Cell. 2001, 106(5):539-49), 그리고 최적화 rVSV 벡터 발현 HIV-1 gag 단백질은 임상 평가(clinical evaluation)를 완료했다 (HVTN 090: URL clinicaltrials.gov/에서 월드와이드 웹(worldwide web)을 통해 접근 가능함). 이러한 발전들(advances)에도 불구하고, 과제들(challenges)이 rVSV 벡터 플랫폼의 개발에서 여전히 남아있고, 이것은 rVSV 벡터의 후속 부스팅 면역(subsequent boosting immunizations)을 방해할 수 있는 벡터 단백질들에 대해 발생된 잠재적인 면역을 포함한다. 이 잠재적 문제는 rVSV 벡터들이 이종(heterologous) 프라임-부스트(prime-boost) 면역 요법(양생, 처방(투약) 계획)(regimen)에서 다른 면역학적으로 구별되는 벡터들과 함께 사용될 때 극복될 수 있다 (Amara et al. Science. 2001, 292(5514):69-74; Amara et al. J Virol. 2002, 76(15):7625-31; Egan et al. AIDS Research and Human Retroviruses. 2005, 21(7):629-43; Hanke et al. J Virol. 1999, 73(9):7524-32; Ramsburg et al. Journal of Virology. 2004, 78(8):3930-40; Santra et al. J Virol. 2007; Xu et al. Journal of Virology. 2009, 83(19):9813-23). rVSV 벡터들의 혈청형 전환(serotype switching), 다른 수포성바이러스(vesiculovirus) 혈청형의 것과 함께 표면 G 단백질의 교환(swapping)에 의해 달성됨, 또한 생쥐들(mice)에서 프라임-부스트 요법에서 면역원성(immunogenicity)을 향상시킨다 (Rose et al. Journal of Virology. 2000, 74(23):10903-10). 그러나, rVSV 코어 단백질들을 향한 세포성 면역 반응(cellular immune responses)의 교차반응성(cross-reactivity)은 이러한 접근법을 제한할 수 있다.
이러한 관찰점들(observations) 및 잠재적 제한점들의 관점에서, 단독으로 사용하거나 rVSV 벡터들과 함께 사용하기 위한 추가적인 이종 벡터들에 대한 필요가 있다.
본 발명의 실시예들은 수포성 바이러스들에 관련된 면역성 조성물들(immunogenic compositions) 및 방법들을, 예를 들면 이스파한 바이러스(Isfahan virus) (ISFV) 단독 또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)와 함께 그리고 그들의 치료법(therapeutics) 및/또는 예방약(prophylactics)으로서 사용과 같은, 포함한다. 특정 측면들은 하나 또는 그 이상의 이종 폴리펩티드를 코딩하는(endcoding) 수포성바이러스 재조합(recombinant)를 포함하는 면역성 조성물들 및 방법들을 포함한다. "재조합 바이러스(Recombinant virus)"는 야생형(wild-type) 바이러스성 유전체에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 재배열(rearrangement), 삭제, 삽입, 또는 치환으로 인한 야생형 바이러스와 상이하거나 동일한 임의의 바이러스성 유전체(viral genome) 또는 비리온(virion)을 나타낸다. 특히, 그 용어(term)는 인간의 간섭(intervention)에 의해 발생된 재조합 바이러스들을 포함한다. 특정 측면들에서 수포성바이러스는 재조합 이스파한 바이러스(recombinant Isfahan virus) (rISFV)이다. 특정 측면들에서 rISFV는 복제 가능 바이러스(replication competent virus)이다. 재조합 바이러스에 적용된 것과 같이, "복제 가능(replication competent)"는 바이러스가 세포 감염; 바이러스성 유전체의 복제; 및 새로운 바이러스 입자들의 방출 능력이 있다는 것을 의미하고; 그러나 이러한 특징들의 하나 또는 그 이상이 그들이 야생형 바이러스에 의해 감염된 동일한 세포형에서 발생하는 것과 같은 동일한 속도로 발생할 필요는 없고, 더 빨리 또는 더 느린 속도로 발생할 수 있다.
다른 측면에서 rISFV는 하나 또는 그 이상의 (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스에 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질, (ii) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스에 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질, (iii) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스에 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질, (iv) SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스에 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 G 단백질, 또는 (v) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스에 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 포함한다.
특정 실시예들은 N 단백질 유전자, P 단백질 유전자, M 단백질 유전자, G 단백질 유전자, 및 L 단백질 유전자의 4 또는 5를 포함하는 rISFV에 관한 것이다. 특정 측면들에서 rISFV는 이종 폴리펩티드를 코딩하는(encoding) 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 더 포함한다. 특정 실시예들에서 rISFV는 이종 전사 단위(transcription unit) (TU)를 포함한다. 전사 단위는 (a) 전사 시작 신호 및 전사 중지 신호 (폴리아데닐레이션(polyadenylation) 시퀀스를 포함)에 측접하고(flanked), 및 (b) 하나 또는 그 이상의 타겟 이종 폴리펩티드(들)을 코딩하는(encoding) 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. 특정 실시예들에서 이종 TU는 바이러스 유전체에서 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th 또는 6th TU이다. 특정 측면들에서 이종 TU는 두 개 또는 그 이상의 이종 폴리펩티드들을 코딩한다(encodes). 다른 측면들에서 두 개의 이종 TU들은 바이러스 유전체에, 바이러스 유전체에 제1 위치로 삽입된 제1 이종 TU 및 바이러스 유전체에 다른 위치로 삽입된 제2 이종 TU로 포함된다.
다른 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스 발현 메카니즘은 2A 펩티드를 통해 ISF 유전자에 이종 시퀀스가 연결하도록 되어있다. 용어들 "2A", "2A 펩티드" 또는 "2A-유사 펩티드(2A-like peptide)"는 단일 오픈 리딩 프레임(single open reading frame)으로부터 다양한 단백질들을 성공적으로 생성하는데 사용되는 펩티드들을 나타낸다. 이러한 펩티드들은 작고 (18-22 아미노산들) 분기하는(divergent) 아미노-말단 시퀀스들을 가지나, C-말단(C-terminus)에서 모두 PGP 모티프(motif)를 포함한다. 리보솜 스킴 메카니즘(ribosomal skip mechanism)을 통해, 2A 펩티드는 펩티드의 C-말단에서 글리신 및 프롤린 잔기(residue) 사이의 정상 펩티드 결합 형성을 방해한다. 이러한 2A 및 2A-유사 시퀀스들은 당업계(in the art)에게 알려진 것이고 이러한 사용을 위해 이의 없이(readily) 선택될 수 있다. 참조, 예를 들면., Szymczak-Workman et al, in Cold Spring Harbor Protocols 2012, doi 10.1101/pdb.ip067876; and Friedmann and Rossi (eds), Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 2007, among others. 이러한 2A 펩티드 하나인 펩티드 T2A는, Thosea asigna 바이러스로부터 분리되고 시퀀스 EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:68)를 갖는다. 다른 측면들에서 내부리보솜유입점(internal ribosome entry site) (IRES)은 다운스트림(downstream) 코딩 영역(coding region)의 캡(cap) 독립적 전사를 가능하게 하는 적어도 두 개의 폴리펩티드들을 코딩하는(encoding) 유전자에 포함될 수 있다. IRES 시퀀스의 다수는 알려져 있고 월드와이드웹 iresite.org에서 이용 가능한 IRESite 데이터베이스로부터 선택될 수 있다.
특정 측면들에서 rISFV G 유전자는 카복시-말단 절단(carboxy-terminal truncation), 특히 20 내지 25개의 아미노산들의 절단을 갖는 G 단백질을 코딩한다. 특정 측면들에서 rISFV 유전체는 3'에서 5' ISFV 선도 시퀀스(leader sequence), ISFV P 단백질 오픈 리딩 프레임(open reading frame) (ORF), ISFV M 단백질 ORF, ISFV G 단백질 ORF, ISFV N 단백질 ORF, ISFV L 단백질 ORF, 및 ISFV 비번역순서(trailer sequence)를, rISFV 유전체 내의 임의의 자리에서 이종 TU 또는 이종 폴리뉴클레오티드와 함께 포함한다. 특정 측면들에서 이종 TU는 rISFV 유전체의 5번 자리에 위치한다. 특정 측면들에서 이종 폴리뉴클레오티드는 면역성 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 측면들에서 이종 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 항원(antigens)을 코딩한다. 상기 항원(들)은 바이러스 항원(viral antigen), 박테리아 항원(bacterial antigen), 종양-특이(tumor-specific) 또는 암(cancer) 항원, 기생(parasitic) 항원 또는 알레르기원(allergen)일 수 있다.
특정 실시예들은 (-) 센스 RNA(sense RNA)에 관련된 3' 에서 5', 의 N-P-M-G-L-(H), N-P-M-G-(H)-L, N-P-M-(H)-G-L, N-P-(H)-M-G-L, N-(H)-P-M-G-L, (H)-N-P-M-G-L, P-N-M-G-L-(H), P-N-M-G-(H)-L, P-N-M-(H)-G-L, P-N-(H)-M-G-L, P-(H)-N-M-G-L, (H)-P-N-M-G-L, P-M-N-G-L-(H), P-M-N-G-(H)-L, P-M-N-(H)-G-L, P-M-(H)-N-G-L, P-(H)-M-N-G-L, (H)-P-M-N-G-L, P-M-G-N-L-(H), P-M-G-N-(H)-L, P-M-G-(H)-N-L, P-M-(H)-G-N-L, P-(H)-M-G-N-L, (H)-P-M-G-N-L, P-M-G-L-N-(H), P-M-G-(H)-L-N, P-M-G-L(H)-N, P-M-(H)-G-L-N, P-(H)-M-G-L-N 또는 (H)-P-M-G-L-N 여기서 (H)는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 TU임, 유전자 순서를 갖는 rISFV에 관한 것이다. 특정 측면들에서 rISFV는 P-M-G-N-(H)-L 유전자 순서를 갖는다. 특정 측면들에서 rISFV 유전체는 발현 벡터(expression vector)에서 코딩된다. 다른 실시예에서 발현 벡터는 DNA 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터(plasmid vector)이다. 용어들 "유전자 셔플링(gene shuffling)", "셔플된 유전자(shuffled gene)", "셔플링", "유전자 재배열(gene rearrangement)" 및 "유전자 전좌(gene translocation)"는 교환적으로(interchangeably) 사용되고, 바이러스성 유전체에서 수포성바이러스 유전자들의 순서로 변경(alteration in the order of the vesiculovirus genes)을 나타낸다.
특정 실시예들은 상기에서 설명한 재조합 음성 센스 RNA를 코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다. 특정 측면들에서 발현 벡터는 DNA 벡터이다.
다른 실시예들은 상기에서 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 용어 "발현 벡터(expression vector)"는 벡터에 의해 코딩된 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 합성이 가능한 바이러스 또는 플라스미드를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 측면들에서 벡터는 코딩된 핵산(nucleic acid)을 복제 및 발현할 수 있다.
또 다른 실시예들은 상기에서 설명한 재조합 RNA를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 본 발명에서 사용된 것과 같이 "바이러스 입자(virus particle)"는 숙주에서 발현되도록 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 제공하는 감염성 독립체(entity)이다.
면역성 조성물들은 본 발명에서 설명한 재조합 핵산들을 포함하는 바이러스 입자들을 포함할 수 있다. 특정 측면들은 본 발명에서 설명한 면역성 조성물들을 투여함(administering)을 포함하는 대상체(subject)에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법들 및 조성물들은 제2 치료 바이러스(therapeutic virus)를 포함할 수 있다. 제2 바이러스는 재조합 또는 온콜리틱 아데노바이러스(adenoviruses), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 헤르페스 바이러스(herpes viruses), 및 랩도바이러스(rhabdoviruses)로부터 선택될 수 있다. 다른 측면들에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 조성물이다. 특정 측면들에서 제2 치료 바이러스는 rVSV이다. 다른 측면에서 rVSV는 동일한 타겟 세포 또는 유기물에서 또는 내에 존재하는 관련된 항원 또는 동일한 항원을 코딩한다.
재조합 수포성바이러스 (예를 들면, 본 발명에서 설명한 것과 같은 rISFV)는 치료성 또는 예방성 면역 반응이 필요한 대상체에 투여될 수 있다. 재조합 수포성바이러스 조성물은 하나 또는 그 이상의 재조합 수포성바이러스와 함께 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 회 투여될 수 있다. 투여된 조성물(composition administered) 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 그 이상의 바이러스 입자들 또는 플라크 형성 단위(plaque forming unit) (pfu)를 가질 수 있다. 투여(Administration)는 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 동맥내(intra-arterial), 종양내(intratumoral) (고형 종양들에), 근육내(intramuscular), 피내(intradermal), 피하(subcutaneous), 구강(oral), 또는 비강내(intranasal) 루트(route)에 의할 수 있다. 특정 측면들에서, 조성물들은 전신적으로, 부분적으로 혈관 투여에 의해 투여되고, 이것은 주사, 관류(perfusion) 및 유사한 것을 포함한다.
본 발명의 발명들은 제2 항암 또는 항미생물 치료(therapy)를 투여함을 더 포함할 수 있다. 특정 측면들에서, 제2 항암제는 화학요법(chemotherapeutic), 방사선요법(radiotherapeutic), 면역요법(immunotherapeutic), 수술 또는 유사한 것이다. 다른 측면들에서 제2 항미생물 치료는 항생 물질(antibiotic) 또는 항바이러스 물질(antiviral)이다.
rISFV는 혈청학적 및 계통발생적으로 rVSV와 구별된다. 이 차이는 면역 자극 요법들의 면역원성 및 보호적 효능(protective efficacy)을 최적화하는데 이용될 수 있다. rISFV 및 rVSV 벡터들은 프라임-부스트 요법들에서 사용될 수 있다. 제1 재조합 수포성바이러스는 제2 재조합 수포성 바이러스와 함께 조합물들의 수에 관계없이 사용될 수 있다.
용어 "제공(providing)" 또는 "투여(adiministering)"는 "사용하기 위해 공급(supply) 또는 제공(furnish)하는"그 보통의 의미에 따라 사용된다. 일부 실시예들에서, 항원은 직접 투여에 의해 제공되고 (예를 들면, 근육 주사( intramuscular injection)에 의해), 반면 다른 실시예들에서, 항원은 항원을 코딩하는 핵산의 투여에 의해 효과적으로 제공된다. 특정 측면들에서 본 발명은 핵산, 항원들, 펩티드들, 및/또는 에피토프들의 다양한 조합물을 포함하는 조성물들을 고려한다.
특정 측면들에서 바이러스성 입자, 폴리펩티드, 또는 핵산은 분리된 바이러스성 입자, 폴리펩티드, 또는 핵산일 수 있다. 용어 "분리된(isolated)"는 실질적으로 세포 물질, 박테리아 물질, 바이러스 물질, 또는 그들의 소스의 기원(their source of origin)에서 배양 배지 (예를 들면, 재조합 DNA 기술들에 의해 생성될 때), 또는 화학 전구체들(precursors) 또는 다른 화학물질들 (예를 들면, 화학적으로 합성될 때)에서 자유로운 바이러스성 입자, 핵산, 또는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다. 게다가, 분리된 화합물은 분리된 화합물로서 대상체에 투여될 수 있는 하나로 여겨질 수 있다; 다시 말하면, 화합물은 그것이 아가로스 겔에 함입(embedded)되거나 콜럼(column)에 부착된 경우 단순하게 "분리된"으로 고려되지 않을 수 있다. 게다가, "분리된 핵산 단편" 또는 "분리된 펩타이드"는 자연적으로 단편으로서 발생하지 않고/거나 일반적으로 기능적(functional) 상태이지 않은 단백질 단편 또는 핵산이다.
본 발명의 다른 실시예들은 본 출원을 통해 개시된다. 본 발명의 일 측면에 대하여 논의된 임의의 실시예는 본 발명의 다른 측면들 뿐만 아니라 그 반대에 적용된다. 본 발명에 설명된 각 실시예는 본 발명의 모든 측면들에 적용할 수 있는 본 발명의 임의의 실시예로 이해된다. 본 발명에 논의된 임의의 실시예는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물, 및 그 반대에 대하여 시행된 것일 수 있다고 고려된다. 게다가, 본 발명의 조성물들 및 키트들은 본 발명의 방법들을 달성하는데 사용될 수 있다.
단어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"의 사용은 본 명세서 및/또는 청구범위에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용될 때 "하나(one)"를 의미할 수 있고, 그러나 또한 "하나 또는 그 이상(one or more)", "적어도 하나(at least one),"및 "하나 또는 하나 이상(one or more than one)"의 의미와 일치한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "약(about)"은 값을 결정하기 위해 사용되는 방법 또는 장치에 대한 오류의 표준 편차(standard edviation)를 포함하는 값을 나타내는데 사용된다.
청구범위에서 용어 "또는(or)"의 사용은 대안들이 단독 또는 대안들이 상호 배타적(mutually exclusive)임을 참조하는 것으로 명시적으로 지시되지 않는 한, 본 발명이 단독 대안들 및 " 및/또는"을 참조하는 정의를 지원하지 않음에도 불구하고, " 및/또는(and/or)"을 의미하는데 사용된다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 단어들 "포함하는(comprising)" (및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 포함하는(comprising)의 임의의 형태), "가지는(having)" (및 "가지다(have)" 및 "가지다(has)"와 같은 가지는(having)의 임의의 형태 ), "포함하는(including)" (및 "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은 포함하는(including)의 임의의 형태), 또는 "포함하는(containing)" (및 "포함하다(contains)" 및 "포함하다(contain)"와 같은 포함하는(containing)의 임의의 형태)은 포괄적이거나 또는 제한(open-ended)을 두지 않으며, 추가적인, 인용되지 않은 구성요소들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다.
본 발명의 다른 목적들, 특징들 및 장점들은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예들은, 본 발명의 특정 실시예들을 나타내는 동안, 단지 예시적으로서 주어진 것으로 이해되어야 하고, 때문에 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화들(changes) 및 변형들(modifications)은 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
하기 도면들은 본 발명의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면들을 더 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 하나 또는 그 이상의 이러한 도면들을 본 명세서에 나타낸 명세서 실시예들의 상세한 설명과 함께 결합하여 참조로서 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 N 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스들에 기반한 Vesiculovirus 속의 최대-우도(maximum-likelihood) 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 2는 완전한 이스파한 유전체 cDNA 클론(genomic cDNA clone)의 발생에 대한 클로닝 전략(cloning strategy)에서 사용된 제한 자리들을 묘사한다.
도 3A는 베네스웰라마 뇌척수염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus) (VEEV) E3-E2-6K-E1 폴리단백질을 코딩하는 rISFV 벡터 [또는 지정된(designated) rISFV-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5]의 다이어그램이다; 도 3B는 VEEV 단백질들의 발현을 묘사하는 웨스턴 블랏(western blot)이다(레인 3).
도 4는 다양한 수포성바이러스의 N 단백질의 아미노산 시쿼스들의 배열이다. 아미노산 영역들의 상동성(homology)은 음영 처리된다(shaded).
도 5는 변형된 HIV-1 gag 단백질이 발현하는 다양한 rISFV에 의해 발생된 관찰된 플라크 크기들의 사진이다.
도 6은 동부형마 뇌막염 바이러스(eastern equine encephalitis virus)-균주(strain) FL93 E3-E1 단백질들을 발현하는 rISFV-N4 [또는 지정된 rISFV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5]으로 면역화된, 뒤이어 EEEV-FL93로 치명적인 공격받는, 쥐의 생존 백분율을 묘사한다.
도 7은 VEEV-균주 ZPC E3-E1 단백질들을 발현하는 rISFV-N4 [또한 지정된 rISFV-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5]로 면역화된, 뒤이어 VEEV-ZPC로 치명적인 공격받는, 쥐의 생존 백분율을 묘사한다.
도 8은 108 또는 107 pfu에서 VEEV-ZPC E3-E1 단백질들을 발현하는 rISFV-N4 [또한 지정된 rISFV-N4-G3-(VEEV ZPC E3-E1)5] 및 108 또는 107 pfu에서 VEEV-ZPC E3-E1 단백질들을 발현하는 rVSV 인디애나 혈청형(Indiana serotype) N4CT1 (rVSVINN4CT1) [또한 지정된 VSVIN-N4-G3-(VEEVZPCE3-E1)5]으로 면역화된, 뒤이어 VEEV-ZPC로 치명적인 공격받는, 쥐의 생존 백분율을 묘사한다.
도 9는 EEEV-FL93 E3-E1 단백질들을 발현하는 rISFV-N4 및 VEEV-ZPC E3-E1 단백질을 발현하는 rISFV-N4 [함께, 또는 지정된 rISFV-N4G3-(VEEV ZPC E3-E1)5/rISFV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5]로 면역화된, 뒤이어 EEEV-FL93로 치사명적인 공격받는, 쥐의 생존 백분율을 묘사한다.
도 10은 EEEV-FL93 E3-E1 단백질들을 발현하는 rISFV-N4 및 VEEV-ZPC E3-E1를 발현하는 rISFV-N4 [함께, 또는 지정된 rISFV-N4G3-(VEEV ZPC E3-E1)5/rISFV-N4-G3-(EEEV FL93 E3-E1)5]로 면역화된, 뒤이어 VEEV-ZPC로 치사명적인 공격받는, 쥐의 생존 백분율을 묘사한다.
도 11은 생물학적 기능에 음성적으로 영향을 주지 않는 N 단백질 시퀀스에서 변화될 수 있는 네 개의 아미노산들을 도시한다. BALB/c 쥐에서 알려진 에피토프는 밑줄친다.
도 12는 PBS-Mu-062a 연구에서 테스트된 재조합 바이러스들을 도시한다.
도 13은 PBS-Mu-062a 연구 설계의 요약이다.
도 14는 PBS-Mu-062a 연구에서 HIV-1 gag 에피토프에 대한 인터페론 감마(interferon gamma) (IFN-γ) ELISpot 반응들을 도시한다.
도 15는 PBS-Mu-062b 프라임/부스트 연구에서 테스트된 rISFV들을 도시한다.
도 16은 PBS-Mu-062b 연구 설계의 요약이다.
도 17은 PBS-Mu-062b 연구에서 HIV-1 Gag 단일 도미넌트 에피토프(single dominant epitope)에 대한 IFN-γ ELISpot 반응들을 도시한다.
도 18은 PBS-Mu-062b 연구에서 VSV-N에 대한 IFN-γ ELISpot 반응들을 도시한다.
도 19는 CHIKV의 레위니옹(LaReunion) 분리로 공격 후 비면역화된 쥐 대 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된 쥐의 체중을 묘사한다.
도 20은 CHIKV의 레위니옹 분리로 공격 후 비면역화된 쥐 대 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된 쥐의 발바닥 팽윤(footpad swelling)을 묘사한다.
도 21은 CHIKV의 레위니옹 분리로 공격 후 비면역화된 쥐 대 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된 쥐의 바이러스혈증(viremia)을 묘사한다.
도 22는 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된, 뒤이어 CHIKV의 레위니옹 분리로 치명적인 공격받은, 쥐의 생존을 묘사한다.
이스파한 바이러스 (ISFV) 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과(family)에 베스클로바이러스(Vesiculovirus) 속(genus)의 멤버이다. 원형의 랍도바이러스들은 광견병 바이러스(rabies virus) (RV) 및 VSV이다. 랍도바이러스과는 단일 가닥(single strand) 비-분절성(non-segmented) (-) 센스 RNA 유전체들을 갖는 총알 형태 바이러스들의 과이다. 포유류, 어류, 곤충, 또는 식물을 감염시키는 250 이상의 알려진 랍도바이러스들이 있다. 과는 적어도 5개의 속(genera)을 포함한다: (1) 리사바이러스속(Lyssavirus): RV, 다른 포유류 바이러스들, 및 일부 곤충 바이러스들 포함; (2) 베스클로바이러스속(Vesiculovirus): VSV 포함; (3) 에페머로바이러스속(Ephemerovirus): 소 유행열 바이러스(bovine ephemeral fever virus) 포함; (4) 사이토랍도바이러스속(Cytorhabdovirus): 양상추 괴저성 황 바이러스(lettuce necrotic yellow virus) 포함; 및 (5) 뉴클레오랍도바이러스속(Nucleorhabdovirus): 포테이토 누른 오갈병 바이러스 포함.
랍도바이러스 음성-센스 바이러스 RNA(rhabdovirus negative-sense viral RNA) (vRNA) 유전체는 대략 50 뉴클레오티드 3'선도 시퀀스 및 대략 60 뉴클레오티드 비-번역된 5'비번역순서(trailer sequence)와 함께 길이에서 약 11-15kb이다. 랍도바이러스 바이러스 유전체 RNA(Rhabdovirus viral genomic RNA) (vRNA)는 일반적으로 5개의 주요 단백질들을 코딩하는 5개의 유전자들을 포함한다: 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N), 인단백질(phosphoprotein) (P), 기질 단백질(matrix protein) (M), 당단백질(glycoprotein) (G), 및 큰 단백질(large protein) (L) (또한 중합효소(polymerase)로 알려짐). 랍도바이러스들은 각 유전자의 5'말단에서 보존된 폴리아데닐레이션 신호 및 각 5개의 유전자들 사이의 짧은 비전사된(untranscribed) 유전자간(intergenic) 영역을 갖는다. 일반적으로 이러한 유전자들은 바이러스 유전체의 3'-N-P-M-G-L-5' 순서이다. 유전자들의 순서는 감염된 세포에서 단백질 발현의 수준들을 나타낸다. 감염성 바이러스를 생성하기 위한 랍도바이러스 유전체의 임의의 조작(manipulation)은 일반적으로 높은 수준에서 감염 및 복제 능력을 유지하기 위한 주요 바이러스 단백질들의 적어도 4, 및 일반적으로 5개를 코딩하는 적어도 5개의 전사 단위들 (TU)을 포함할 것이다.
I. 재조합 수포성바이러스(RECOMBINANT VESICULOVIRUS)
수포성바이러스 유전체들은 추가적인 뉴클레오티드 시퀀스의 적어도 3 킬로베이스(kilobases) (kb)를 스패닝하는(spanning) 하나 이상의 외부 유전자(foreign gene)를 수용하는 것으로 나타난다. 수포성바이러스 벡터들, 충분히 약화됨 (예를 들어, 유전자 셔플링 및/또는 바이러스 단백질들이 절단에 의해), 유전적 안정성이 증명되고, 그리고 바이러스 유전체는 발견 가능한 재조합을 경험하지 않는다. 게다가, 바이러스 복제는 세포질성(cytoplasmic)이기 때문에, 바이러스 유전체(viral genomic) RNA는 숙주 세포 유전체로 통합되지 않는다. 또한, 이러한 음성-가닥 RNA 바이러스들은 비교적 단순하고, 잘-특징지어진 전사 제어 시퀀스들(transcriptional control sequences)을 가지고, 이것은 강한 외부 유전자 발현을 가능하게 한다. 외부 유전자 발현의 수준은 외부 유전자와 관련된 단일 바이러스 3' 전사 프로모터(3' transcription promoter) (참조, 예를 들면, US Patent No. 6,136,585 및 8,287,878, 그 중에서도 특히(among others))의 위치 변화에 의해 조절될 수 있다. 유전자 발현의 3'에서 5'구배(gradient)는 유전체 주형(template)를 따라 진행함에 따라 바이러스 RNA-의존 RNA 중합효소 전사(transcribing)가 유전자 접합들(gene junctions)에서 마주친 전사 중지/시작 신호 각각을 성공적으로 가로지를 것임을 공산가능성 감소에 반영한다. 그러므로, 3'말단 전사 프로모터에 근전하게 위치한 외부 유전자들은 풍부하게 발현되고, 반면 보다 말단 유전체 위치들에 삽입된 것들은 더 적다.
VSV는 상이한 세포형들의 큰 배열(large array)에서 높은 역가(titers)로 복제하고, 바이러스성 단백질들은 지천으로(in great abundance) 발현된다. 이것은 단지 VSV가 강한 기능적 외부 유전자 발현 벡터로서 작용할 뿐만 아니라, 적절한 rVSV 벡터들이 인간 생물학적 제제의 생성을 위해 승인된 세포계(cell lines)에서 제조 수준으로 확장될 수 있음을 의미한다. 이 복제-가능 바이러스 벡터(replication-competent virus vector)는 건강한 사람에서 질병 증상들 또는 병리를, 심지어 실질적인 바이러스 복제에 직면함에도, 거의 없이 생산한다 (Tesh, R. B. et al, 1969 Am. J. Epidemiol., 90:255-61). 추가적으로 VSV로 사람 감염, 따라서 VSV에 대한 이미 존재하는(pre-existing) 면역성, 은 드물다. 그러므로, rVSV는 벡터로서 유용하다.
다양한 rVSV들이 야생형 VSV의 것들과 상이한 유전체 자리들로 "셔플된" 그들의 유전자들과 함께 당업계에게 개시되고 있는 동안 (참조 US Patent No. 8,287,878; US Patent No. 6,596,529, 및 여기에 인용된 참조들), 이것은 돌연변이들의 조합의 일부로서 VSV 유전자 순서에서 네 번째 자리 (N4)에 있을 N 유전자에 유용할 수 있고, 그래서 바이러스는 충분히 약화된다. rVSV를 더 약화하기 위해, G 단백질의 세포질 후미(cytoplasmic tail)가 절단될 수 있다 (G-CT).
상기에서 설명된 rVSV의 다양한 실시예들은 VSV 혈청형 인디애나로부터 유래된 VSV 시퀀스들을 사용한다. 그러나, 다른 알려진 수포성바이러스들 (예를 들면, 이스파한 바이러스) 또는 VSV 혈청형들은 이의 없이 본 명세서의 사상들(teachings)로 주어진 설명된 실시예들의 예시된 시퀀스들로 치환될 수 있다.
본 발명에서 설명된 벡터들의 발생에 사용하기 위해 적합한 프로모터들(promoters)은 구성 프로모터(constitutive promoters), 유도성 프로모터(inducible promoters), 조직-특이 프로모터(tissue-specific promoters) 및 다른 것들로부터 선택될 수 있다. 활성(activity)에서 비제한적이고 본 발명의 핵산 분자들의 발현에 사용된 구성 프로모터의 예들은 제한 없이, International Patent Application WO2004/093906 및 US Patent No. 8,287,878에서 확인된 프로모터들을 포함한다. hCMV 프로모터는 역유전학(reverse genetics) 기술에서 rVSV 구조 목적들(rVSV rescue purposes)로 VSV 단백질들을 발현하는데 사용된다. 사용될 수 있는 다른 pol II 프로모터(pol II promoters)는, 그 중에서도 특히, 유비퀴틴 C(ubiquitin C) (UbiC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase) (PGK) 프로모터, 소 사이토메갈로바이러스(bovine cytomegalovirus) (bCMV) 프로모터, 업스트림(upstream) CMV IV 인핸서(enhancer) (CAGGS)를 갖는 베타-액틴(beta-actin) 프로모터, 및 신장 인자(elongation factor) 1 알파 프로모터 (EF1A)를 포함한다. 특정 실시예에서, T7 RNA 중합효소 프로모터(T7 RNA polymerase promoter)가 사용된다.
본 발명의 특정 실시예들은 재조합 수포성바이러스들, 재조합 이스파한 바이러스 (rISFV) 단독 또는 예를 들어 프라임/부스트 요법에서 재조합 구내염 수포성 바이러스 (rVSV)와 함께 포함, 뿐만 아니라 재조합 수포성바이러스들을 코딩하는 벡터들 및 이러한 재조합 수포성바이러스들 및 벡터들을 이용하는 방법들에 관한 것이다. 재조합 수포성바이러스들은 (10) cDNA 형질주입(transfection)을 사용하거나 (2) 세포로 형질주입된 cDNA들을 사용하여 생성될 수 있고, 이것은 재조합 수포성바이러스를 생성하는데 필요한 트랜스에(in trans) 남은 구성 요소들 또는 활성들을 제공하는 제공하는 미니바이러스(minivirus)로 더 감염된다. 임의의 이러한 방법들 (예를 들면, 미니바이러스, 헬퍼 세포계, 또는 cDNA 형질주입)의 사용, 패키징된 RNA(packaged RNA)를 생성하기 위한 최소 구성 요소들은 (1) N 단백질에 의한 유전체 RNA의 인캡시데이션(encapsidation), 및 (2) 유전체 RNA 등가물(equivalent)의 복제를 위한 cis-작용(cis-acting) 신호들을 포함하는 RNA 분자를 필요로 한다.
복제 요소 또는 리플리콘(replicon)은 3' 및 5' 말단들에서 선도 시퀀스 및 수포성바이러스의 비번역순서를 최소한으로 포함하는 RNA의 가닥이다; (-) 센스 유전체에서, 선도는 3' 말단에서이고 추적자(trailer)는 5' 말단에서이다. 이들 두 개의 복제 신호들 사이에 위치한 RNA는 복제될 수 있다. 선도 및 추적자 영역들은 N 단백질에 의한 인캡시데이션의 목적들 및 초기 전사 및 복제에 필요한 중합효서 결합을 위한 최소 cis-작용 요소들을 포함한다.
재조합 수포성바이러스 유전체 내에 포함된 임의의 유전자를 위해, 유전자는 이러한 유전자들이 발현 및 코딩된 단백질 산물들을 생성할 수 있는 적절한 전사 개시(initiation) 및 종료(termination) 신호들에 측접할 수 있다. 특히, 이종 폴리뉴클레오티드가 사용되고, 이것은 자연으로부터 분리된 것과 같은 바이러스에 의해 코딩되지 않거나 자연적으로 바이러스에서 발견되지 않는 자리(position), 형태(form), 또는 환경(context)에서 코딩 영역을 포함한다.
치료 또는 면역성 조성물로서 사용하기 위한 재조합 수포성바이러스는, 특정 측면들에서, 바이러스 유전자 순서의 재배열을 포함할 수 있다. 특정 측면들에서 N 유전자는 3' 프로모터-말단 자리, 자리 1(position 1)로부터 멀어진다. 다른 측면에서 N 유전자는 자리 2, 3, 4, 또는 5로 이동된다. 특정 측면들에서 N 유전자는 유전체에서 자리 4에 있다.
특정 실시예들에서 재조합 수포성바이러스는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 측면들에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 항원을 코딩한다. 다른 측면들에서 선택된 이종 면역 반응-유도 항원 또는 항원들을 코딩하는 폴리진(polygene) 또는 이종 폴리뉴클레오티드는 유전자 순서의 자리 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 위치된다.
A. 재조합 수포성바이러스 생성
음성-센스, 단일 가닥, 비-분절, 바이러스 RNA 유전체들의 전사 및 복제는 리보핵산단백질(ribonucleoprotein) 중심 (뉴클레오캡시드(nucleocapsid))에서 작용하는 다중체(multimeric) 단백질 복합체의 효소적 활성을 통해 달성된다. 바이러스 시퀀스들은 뉴클레오캡시드 구조로 N 단백질에 의해 단백질막으로 둘러싸여질 때 인지된다(recognized). 뉴클레오캡시드 구조의 유전체 및 안티유전체(antigenomic) 말단 프로모터 시퀀스들은 전사적 또는 복제 경로들을 시작하기 위해 인지된다.
따라서, 본 발명에서 설명된 유전적으로 조작되고 약화된 재조합 수포성바이러스는 하기 예들에서 설명되는 것과 같은 보다 명확하고 당업계에 알려진 구조 방법들(rescue method)에 따라 생성된다. 임의의 적합한 이스파한 바이러스, VSV 균주 또는 혈청형이 사용될 수 있고, VSV 인디애나, VSV 뉴저지(New Jersey), VSV 찬디퓨라(Chandipura), VSV 글래스고(Glasgow), 및 그와 유사한 것을 포함하지만 제한되지는 않는다. 상기에서 설명된 바와 같이, 약화된 형태의 이스파한 바이러스 또는 VSV를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스들에 더하여, 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 또한 선택된 이종 단백질(들)을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스들 또는 오픈 리딩 프레임들 (ORF들)을 코딩한다.
구조(rescue)를 위한 일반적인 (반드시 배타적인 것은 아님에도 불구하고) 상황(circumstances)은 T7 중합효소가 세포 세포질에 바이러스 유전체 cDNA-함유 전사 벡터로부터 안티유전체 (또는 유전체) 단일-가닥 RNA의 전사를 유도하기 위해 존재하는 적절한 포유류 세포를 포함한다. 또한, 공-전자적으로이던 그 직후이던, 이 바이러스 안티-유전체(anti-genome) (또는 유전체) RNA 전사체(transcript)는 핵산단백질(nucleoprotein)에 의해 기능적 주형들로 단백질막으로 둘러싸여지고(encapsidated) 필수 바이러스-특이 trans-작용 단백질들을 발현하는 공-형질주입된 플라스미드들로부터 동시에 생성된 필수 중합효소 구성 요소들에 의해 맞물리게 된다(engaged). 이러한 이벤트들 및 과정들은 바이러스 mRNA들의 선행 전사(prerequisite transcription), 새로운 유전체의 복제 및 증폭 및, 그러므로, 신규한 수포성바이러스 자손(progeny), 다시 말해서, 구조(rescue), 의 생성을 유도한다.
전사 및 발현 벡터들은 일반적으로 숙주 세포에서 발현을 위해 설계된 플라스미드 벡터들이다. 인캡시데이션, 전사, 및 복제에 필요한 trans-작용 단백질들을 코딩하는 분리 핵산 분자를 적어도 하나 포함하는 발현 벡터들은 하나의 발현 벡터로부터 또는 적어도 두 개의 상이한 벡터들로부터 이들 단백질들을 발현한다.
수포성바이러스 유전체의 복제 DNA(cloned DNA) 등가물은 적합한 DNA-의존 RNA 중합효소 프로모터 (예를 들면, T7 RNA 중합효소 프로모터 및 자가-절단(self-cleaving) 리보자임 시퀀스 (예를 들면, 간염(hepatitis) 델타 리보자임) 사이에 놓일 수 있고, 적합한 전사 벡터 (예를 들면, 박테리아 플라스미드)로 삽입될 수 있다. 이 전사 벡터는 RNA 중합효소 (예를 들면, T7 RNA 중합효소)는 5' 및 3' 말단들을 갖는 수포성바이러스 cDNA의 단일-가닥 RNA 카피(copy)를 충실히 전사할 수 있는 것으로부터 쉽사리 조작 가능한 DNA 주형을 제공한다. 바이러스 cDNA 카피의 방향(orientation)과 측면 위치 프로모터(flanking promoter) 및 리보자임 시퀀스들은 안티-유전체 또는 유전체 RNA 등가물들이 전사되는지 아닌지를 결정한다. 또한 새로운 수포성바이러스 자손의 필수 구조(rescue)는 노출된(naked), 단일-가닥 안티-유전체 또는 유전체 RNA 전사체들이 기능적 뉴클레오캡시드 주형들로 단백질막으로 둘러싸여지고, 바이러스 전사 및 복제를 시작하는데 필용한 수포성바이러스-특이 trans-작용 지지 단백질들이다: 바이러스 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 중합효소-관련 인단백질 (P) 및 중합효소 (L) 단백질.
간단하게, 재조합 수포성바이러스를 발생시키는 일 방법은 숙주 세포로 본 발명에서 설명된 핵산 시퀀스를 포함하는 바이러스 cDNA 발현 벡터를 소개함을 포함한다. 특정 측면들에서, 발현 벡터는 T7 프로모터 업스트림의 자리 1(T7 promoter upstream of position 1) (P1), 및 간염 델타 바이러스 리보자임 자리(HDV Rz) 및 T7 종료암호(terminator) 시퀀스 다운스트림의 선택된 재조합 수포성바이러스 핵산 시퀀스의 마지막 자리를 포함한다. T7 프로모터는 T7 RNA 중합효소가 존재할 때 발현 벡터로부터 바이러스 RNA 안티-유전체 전사체들의 합성을 지시한다.
일부 실시예들에서, 방법은 T7 RNA 중합효소를 발현하는 플라스미드를 갖는 숙주 세포를 일시적으로 형질주입함을 더 포함한다. 다른 실시예들에서, 방법은 적어도 수포성바이러스들의 바이러스 단백질들 N, P, 및 L ( 및 선택적으로 M 및 G)를 발현하는 하나 또는 그 이상의 플라스미드들을 갖는 숙주 세포를 공-형질주입함을 포함한다. 일부 실시예들에서, 이러한 수포성바이러스 단백질들은 숙주 세포에서 RNA pol II-의존 발현 시스템을 사용하여 발현된다. 다른 실시예들은 플라스미드 DNA (pDNA) 형질주입 후 재조합 수포성바이러스의 바이러스 단백질들, T7 중합효소, 및 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포들을 열충격(heat-shocking)하는 것과 같은 단계들을 포함한다. 형질주입된 숙주 세포들 또는 형질주입된 숙주 세포들로부터 수득된 상등액(supernatant)은 새로운 신장(expansion) 세포들의 배양물(culture)로 이동될 수 있다. 결집된, 감염성 재조합 수포성바이러스는 그 다음 배양물(culture)로부터 되찾아질 수 있다.
다른 측면들에서, 복제-가능 재조합 수포성바이러스는 당업계에 알려진 기술들을 사용하여 "구조(resqued)"될 수 있고 분리될 수 있다 (Ball, L. A. et al. 1999 J. Virol., 73:4705-12; Conzelmann, 1998, Ann. Rev. Genet., 32:123-162; Roberts and Rose, 1998, Virol., 247:1-6). 참조, 또한, 예를 들면, US Patents 8,287,878; 6,168,943; 및 6,033,886; 및 International Patent Publication No. WO99/02657, 이의 각각은 본 발명에 참조로서 통합된다. 재조합 RNA 바이러스를 생성하는 방법은 당업계에 "구조(rescue)" 또는 "역유전학(reverse genetics)" 방법으로 여겨진다. VSV에 대한 예시적인 구조 방법들은 U.S. Patents 6,033,886 및 6,596,529, 및 PCT Publication WO 2004/113517에 설명되고, 각각은 본 발명에 참조로서 통합된다.
VSV와 같은 바이러스들의 구조함(conducting rescue)에 대한 추가적인 기술들은 U.S. Patent 6,673,572 및 U.S. 공개번호 US2006/0153870에 설명되고, 이것은 본 발명에 참조로서 통합된다.
수포성바이러스들의 구조에 사용되는 숙주 세포들은 재조합 수포성바이러스의 생성에 필요한 필수적인 구성 성분들(constituents)의 벡터들로부터 발Vero cell현되는 것을 가능하게 하는 것들이다. 상기 숙주 세포들은 진핵세포(eukaryotic cell), 척추동물 세포(vertebrate cell)와 같은, 로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포들은 인간 세포, 인간 배아 신장 세포 (예를 들면, 293)와 같은, 로부터 유래된다. 베로 세포들(Vero cells), 뿐만 아리나 세포들의 많은 다른 형들 또한 상기에서 인용된 US 특허들 및 공개된 출원들에서 설명된 것과 같이 숙주 세포로서 사용된다. 특정 실시예들에서, 형질주입-가능 시약(transfection-facilitating reagent)이 세포들에서 DNA 흡수(uptake)를 증가시키기 위해 첨가된다. 많은 이러한 시약들은 당업계에 알려져 있다 (예를 들면, 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), LIPOFECTAMINE® 양이온 용액(cationic lipid) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 EFFECTENE® 양이온 용액 (Qiagen, Hilden, Germany).
구조된 수포성바이러스들은 그 다음 그것의 목적하는 표현형 (플라크 형태와 전사 및 복제 약화)에 대해, in vitro 수단들에 의해 처음으로 테스트된다. 수포성바이러스는 또한 동물 신경병원성(neurovirulence) 모델에서 in vivo 테스트된다. 예를 들어, 쥐 및/또는 페럿(ferret) 모델들은 신경병원성을 검출하기 위해 설립된다. 간단히, 10마리 쥐들의 그룹들은 예상된 LD50 용량(dose) (용량은 동물들의 치사의 50%이다)에 걸친 바이러스 농도들의 각각의 범위로 두개골 내(intra-cranially) (IC)에 주입된다. 예를 들어, 102, 103, 104 및 105 pfu에서 바이러스를 포함하는 IC 접종은 바이러스에 대한 예상된 LD50이 103-104 pfu 범위인 곳에서 사용된다. 바이러스 제형물들은 PBS에서 정제된 바이러스 스톡들(stocks)의 연속적인 희석에 의해 제조된다. 쥐들은 그 다음 필수적인 용량으로, 25 μl의 PBS에서 두개골(cranium)의 위를 통해 주입된다. 동물들은 매일 체중 감소, 병적 상태(morbidity) 및 죽음이 모니터된다. 바이러스 벡터에 대한 LD50은 그 다음 테스트된 농도 범위 이상 쥐의 누적 사망으로부터 계산된다.
체액 면역(humoral immune) 반응들 검출에 의해 면역원성 또는 항원성(antigenicity)을 결정하기 위해, 당업계에 알려진 다양한 면역분석들이 사용되고, 이것은 방사성면역분석(radioimmunoassays), ELISA (효소결합면역흡착측정법 (enzyme linked immunosorbent assay)), "샌드위치" 면역분석, 면역방사계측측정검사(immunoradiometric assay), 겔 확산 침전 반응(gel diffusion precipitation reactions), 면역확산 (immunodiffusion) 분석, in situ 면역분석 (콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지, 예를 들어), 웨스턴 블랏, 면역침강 반응, 응집 분석 (예를 들면, 겔 응집 분석, 혈구응집(hemagglutination) 분석), 보체 고정 분석(complement fixation assay), 면역형광 분석(immunofluorescence assays), 단백질 A 분석, 및 면역전기영동 분석(immunoelectrophoresis assays), 중화반응 분석(neutralization assays), 등과 같은 기술들을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 항체 결합은 1차 항체(primary antibody)에서 표지(label)를 검출하여 측정된다. 다른 실시예에서, 1차 항체는 1차 항체에 대한 2차 항체(secondary antibody) 또는 시약의 결합을 측정하여 검출된다. 다른 실시예에서, 2차 항체는 표지된다. 면역원성을 검출하기 위한 또 다른 실시예에서, T 세포-매개 반응들은 표준 방법들, 예를 들면, in vitro 또는 in vivo 세포 독성 분석, 테트라머 분석(tetramer assays), ELISpot 분석 또는 in vivo 지연형 과민증 분석(delayed-type hypersensitivity assay), 에 의해 분석된다.
용어들 수포성바이러스를 "분리(isolation)" 또는 "분리(isolating)"는 세포 파편(debris) 및 그와 유사한 것들로부터 바이러스 입자들을 배양 및 정제하는 공정을 의미한다. 일례는 수포성바이러스가 생성하는 세포 배양물의 상등액을 포함하는 바이러스를 취하기 위해 세포 파편을 제거하도록 0.1-0.2 마이크론(micron) 포어 크기 필터 (예를 들면, Millex-GS, Millipore)를 통해 통과시키는 것이다. 대안적으로, 비리온들(virions)은 구배, 수크로오스(sucrose) 구배와 같은, 를 사용하여 정제될 수 있다. 재조합 바이러스 입자들은 그 다음 펠릿화될 수 있고 목적되는 어떠한 첨가제 또는 캐리어(carrier)에 재부유(resuspended)될 수 있다. 역가(titers)는 특정한 단백질들에 대한 항체들을 사용하는 간접 면역형광법에 의해 또는 표준 플라크 분석에 의해 결정될 수 있다.
특정 측면들에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 구성 성분들(N, P, M, G, 및/또는 L 단백질들)과 이종 폴리뉴클레오티드를 코딩하거나 포함하는 수포성바이러스들은 본래의 분리된 바이러스에서 나타나지 않는 특정들을 갖는 동안 바이러스가 이종 폴리뉴클레오티드(들)을 발현하는 목적하는 특성들을 갖도록 야생형 바이러스 또는 바이러스 단백질들과 비교하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이들 또는 변형물들로 구조화된다. 본 발명에 설명된 방법들은 본 발명의 조성물들 및 구현 방법들에 대한 프로토콜들의 다양한 예들을 제공한다. 그들은 재조합 DNA 또는 핵산 기술의 사용을 통해 돌연변이된 또는 변형된 바이러스들을 발생시키는 배경을 제공한다.
B. 이스파한 바이러스 (ISFV) 구성물(Constructs)
이스파한 바이러스 (ISFV)는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae family)에서 베시클로바이러스속(Vesiculovirus genus)의 멤버이다. ISFV는 1975년 이란(Iran)에서 샌드플라이(sand flies)로부터 처음으로 분리되었다 (Tesh et al. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1977; 26(2):299-306). ISFV는 지리학적으로 제한된 이란 및 일부 이웃 나라들에서 나타나고, 여기에 인간 감염에 대한 혈청학적 증거가 있다 (Tesh et al., The American journal of tropical medicine and hygiene. 1977, 26(2):299-306; Gaidamovich et al., Voprosy Virusologii. 1978, (5):556-60). ISFV로 감염은 아직 인간 질병으로 연결되지 않았고, 원형의 베시클로바이러스(Vesiculovirus), 구내염 수포성 바이러스 (VSV)와 달리, ISFV는 가축류(livestock)에서 원형인 것으로 나타나지 않고/거나 실험적으로 접종된 동물들에서 수포성 병변들(lesions)을 야기하는 것으로 나타나지 않는다 (Wilks and House, J Hyg (Lond). 1986, 97(2):359-68). ISFV는 형태학적으로 VSV와 유사하고 (Tesh et al. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1977; 26(2):299-306) 유사한 유전체 구성(genomic organization)을 가지며, 높은 보존된 복제 및 전사 조절 시퀀스들을 포함한다 (Marriott, Arch Virol. 2005, 150(4):671-80). 그러나, 두 바이러스들 모두 혈청학적으로 구별되고 (Tesh et al. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1977; 26(2):299-306) 수포성바이러스들의 계통학적 분석은 상당한 진화적 분기 (도 1)를 나타내며, 이것은 바이러스 단백질들의 아미노산 배열에 따른다.
이스파한 바이러스는 N, P, M, G, 및 L로 단축된 5개의 주요 바이러스 단백질들을 코딩하는 약 11 kb 비-분절된, 음성-가닥 RNA 유전체를 포함한다. 이스파한 바이러스 유전체에 대한 보체 (5'에서 3')의 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO:1에 제공된다. 음성 센스 RNA 유전체에서 3'에서 5'유전체 순서는 뉴클레오캡시드 (N), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 막관통(transmembrane) 당단백질 (G), 및 중합효소 (L), 다시 말해, 3'-N-P-M-G-L-5'로서 설계된 단백질들을 코딩한다. 뉴클레오캡시드는 유전체 인캡시데이션에 관련된다. 이스파한 바이러스 N 단백질의 예의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO:2로서 제공된다. P 단백질은 RNA 합성에 관련된 인단백질이다. 이스파한 바이러스 P 단백질의 예의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO:3로서 제공된다. M 단백질은 기질 단백질이다. 이스파한 바이러스 M 단백질의 예의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO:4로서 제공된다. G 단백질은 당단백질이다. 이스파한 바이러스 G 단백질의 예의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO:5로서 제공된다. L 단백질은 RNA 합성에 관련된 큰 중합효소이다. 이스파한 바이러스 L 단백질의 예의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO:6으로서 제공된다.
VSV로부터 ISFV의 분기(divergence)는 (1) rVSV 대신에 벡터로서 rISFV를 사용, 그리고 그러므로 VSV 벡터의 반복된 투여와 함께 잠재적 안티-벡터 면역성을 피함; 및 (2) rVSV와 함께 이종 프라임-부스트 요법을 구성하기 위해 제2 수포성바이러스 벡터를 제공하여 치료적 및 예방적 요법들을 돕는데 사용될 수 있다.
C. 구내염 수포성 바이러스 (VSV) 구성물
구내염 수포성 바이러스 (VSV)는 N, P, M, G, 및 L로 단축된 5개의 주요 바이러스 단백질들을 코딩하는 약 11 kb 비-분절된, 음성-가닥 RNA 유전체를 포함한다. VSV G, M, N, P, 및 L 단백질들을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 당업계에 알려져 있다 (Rose and Gallione, 1981, J. Virol. 39, 519-28; Gallione et al., 1981 J. Virol. 39:529-35). 많은 VSV 혈청형들이 알려져 있고 배열되고 있다. VSV (인디애나)의 유전체 시퀀스는 NCBI 데이터베이스에서 접근(Accession) No. NC001560로 제공되고 (참조 SEQ ID NO:7-12), 이것은 본 명세서의 우선일과 같이 본 발명에 통합된다. VSV에 대한 다른 시퀀스들은, VSV (찬디퓨라) 시퀀스들 포함, 상기 데이터베이스에서 이용 가능하다; 예를 들어, 참조 접근 번호들(Nos.) Ay382603, Af128868, V01208, V01207, V01206, M16608, M14715, M14720 및 J04350, 이들 모두는 본 명세서의 우선일과 같이 본 발명에 통합된다. VSV 혈청형은, 뉴저지와 같은, 또한 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (참조, 예를 들면, Accession Nos. VR-1238 및 VR-1239, 이들은 본 명세서의 우선일과 같이 본 발명에 통합된다)와 같은 보관소들(depositories)로부터 이용 가능하다. 다른 알려진 VSV 시퀀스들 및 혈청형들은 당업계에 설명되거나 본 명세서에 걸쳐 인용된 문서들(documents)에서 참조된다, 참조, 예를 들면, International Patent Application No. WO2004/093906 및 US Patent No. 8,287,878, 이들은 본 명세서의 우선일과 같이 본 발명에 통합된다.
II. 면역성 조성물(IMMUNOGENIC COMPOSITIONS)
특정 실시예들은 재조합 수포성바이러스 조성물들 및 포유류 대상체에 투여될 때 항원에 대한 항원-특이 면역 반응을 유도하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명에 유용한 면역성 조성물은 복제-가능, 약화된, 재조합 이스파한 바이러스 (rISFV) 또는 동일한 것을 코딩하는 벡터이다. 특정 실시예뜰에서, 면역성 조성물은 본 발명에서 설명된 재조합 수포성바이러스를 포함한다. 특정 측면들은 본 발명에서 설명된 것과 같은 rISFV에 관한 것이다. 다른 측면에서 rISFV는 하나 또는 그 이상의 항원들을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
A. 항원(Antigens)
특정 실시예들에서 수포성바이러스 (예를 들면, rISFV 단독, 또는 프라임/부스트 요법에서 rVSV와 함께)는 이종 항원을 코딩한다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 용어 "항원(antigen)" 또는 "목적 항원(targeted antigen)"은 임의의 기질, 면역 반응의 대상(target)이 될 수 있는 복합 항원들 (예를 들면, 종양 세포들, 바이러스 감염 세포들, 등)을 포함,를 나타낸다. 항원은 예를 들어, 본 발명에서 설명된 면역성 조성물이 투여되거나 제공된 대상체의 세포-매개 및/또는 체액 면역 반응의 대상일 수 있다. 용어 "항원(antigen)" 또는 "목적 항원(targeted antigen)"은 예를 들어 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양-특이 또는 종양-관련 항원, 기생 항원, 알레르기원, 및 그와 유사한 것의 전부 또는 일부를 포함한다. 항원은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있다. 항원은 추가적으로 B- 및/또는 T- 림프구(lymphocytes)의 생성으로 이어지는 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원의 구조적 측면은, 예를 들면, 삼-차원 형태(conformation) 또는 변형(modification) (예를 들면, 인산화(phosphorylation)), 생물학적 반응을 야기, 본 발명에서 "항원결정기(antigenic determinant)" 또는 "에피토프"로 여겨진다. 항원결정기들 또는 에피토프들은 항체들에 의해, 또는 MHC의 문맥에서, T-세포 수용체들에 의해 인지된 항원의 그 부분들이다.
바이러스 항원은 예를 들어 랍도바이러스 (예를 들면, 광견병 바이러스를 포함하는 리사바이러스속(Lyssavirus)), 알파바이러스(alphaviruses), 간염 바이러스 A, B, C, D 및 E, HIV, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 수두 대상 포진(varicella zoster), 유두종 바이러스(papilloma viruses), 엡스타인바 바이러스(Epstein Barr virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza viruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 콕사키 바이러스(Coxsakie viruses), 피코르나바이러스(picornaviruses), 로터바이러스(rotaviruses), 폭스 바이러스(pox viruses), 리노바이러스(rhinoviruses), 풍진 바이러스(rubella virus), 파보바바이러스(papovavirus), 멈프바이러스(mumps virus), 홍역바이러스(measles virus)로부터의 항원들을 포함한다; 알려진 바이러스 항원들의 일부 비제한적 예들은 하기를 포함한다: 알파바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 nsP1-nsP4, 캡시드, E3, E2, 6K, 및 E1 단백질들; HIV-1 예를 들어 tat, nef, gp120 또는 gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev 또는 이들의 부분 및/또는 조합들; 인간 헤르페스 바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE 또는 gD와 같은 항원들을 갖는 HSV-2, 급초기(Immediate Early) 단백질들 예를 들어 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 및 ICP0, VP16, US6, US8, UL7, UL19, UL21, UL25, UL46, UL47, UL48, UL49 및 UL50, 또는 이들의 부분 및/또는 조합들; 사이토메갈로바이러스, 특히 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 gB 또는 이들의 유도체들; 엡스타인바 바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 gp350 또는 이들의 유도체들; 수두 대상포진 바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 gpl, 11, 111 및 IE63; 간염 바이러스로부터 유래된 항원들 예를 들어 간염 B, 간염 C 또는 간염 E 바이러스 항원(예를 들면, env 단백질들 E1 또는 E2, 코어 단백질(core protein), NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, 또는 HCV의 이들의 부분 및/또는 조합들(part and/or combinations thereof of HCV)); 인유두종 바이러스(human papilloma virus)로부터 유래된 항원들 (예를 들어, 단백질들, 예를 들면, L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, 또는 이들의 부분 및/또는 조합들); 다른 바이러스 병원체(viral pathogens)로부터 유래된 항원들, 예를 들어 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial virus) (예를 들면, F 및 G 단백질들 또는 이들의 유도체들), 플라비바이러스(flaviviruses) (예를 들면, 황열 바이러스(Yellow Fever Virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Virus), 진드기 매개 뇌염 바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis Virus)) 또는 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) (예를 들면, HA, NP, NA, 또는 M 단백질들, 또는 이들의 부분 및/또는 조합들).
종양-특이, 종양-관련, 또는 암 항원은 악성 종양(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병(leukemia)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. rISFV에 의한 이러한 항원들의 발현은 암 세포에 대항하는 세포-매개 면역 반응들의 유도(induction) 및 rISFV에 의한 직접적인 암세포 용해(lysis)를 모두 제공한다. 상기 암들의 더 많은 특정 예들은 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 대장암(colon cancer), 편평세포암(squamous cell cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 교아세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간종양(hepatoma), 대장암(colorectal cancer), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma) 및 다양한 형태의 머리 및 목 암, 신장암(renal cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 후두암(laryngeal cancer), 전립선암(prostate cancer)을 포함한다. 암 항원들은 종양-특이 면역 반응들을 잠재적으로 자극할 수 있는 항원들이다. 이러한 항원들의 일부는, 반드시 발현되지 않지만, 정상 세포들에 의해 코딩된다. 이러한 항원들은 정상 세포들에서 일반적으로 조용한 (다시 말해, 발현되지 않는) 것들, 분화의 특정 단계들에서만 발현되는 것들 및 배아 및 태아 항원들과 같은 일시적으로 발현되는 것들로서 특징지어질 수 있다. 다른 암 항원들은 돌연변이 세포 유전자들, 예를 들어 종양 유전자(oncogenes) (예를 들면, 활성화 ras 종양 유전자), 억제 유전자(suppressor genes) (예를 들면, 돌연변이 p53), 내부 결실(internal deletions) 또는 염색체 전좌(chromosomal translocations)가 원인인 융합 단백질에 의해 코딩된다. 또 다른 암 항원들은 바이러스 유전자, RNA 및 DNA 종양 바이러스에 실시된 것들과 같은, 에 의해 코딩된다. 종양-특이 또는 종양-관련 항원들의 일부 비제한적 예들은 MART-1/Melan-A, gp100, 디펩티딜펩디다아제 IV(Dipeptidyl peptidase IV) (DPPIV), 아데노신 디아미나아제-결합 단백질(adenosine deaminase-binding protein) (ADAbp), 시클로필린 b(cyclophilin b), 결장 관련 항원(Colorectal associated antigen) (CRC)-0017-1A/GA733, 암배항원(Carcinoembryonic Antigen) (CEA) 및 그 면역성 에피토프들 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이항원(Prostate Specific Antigen) (PSA) 및 그 면역성 에피토프들 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선-특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen) (PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, MACE-패밀리 종양항원(MACE-family of tumor antigens) (예를 들면, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-05), GAGE-패밀리 종양 항원 (예를 들면, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나아제(tyrosinase), p53, MUG 패밀리(MUG family) (예를 들면, MUC-1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), E-카데린(E-cadherin), 알파-카테닌(alpha-catenin), 베타-카테닌(beta-catenin) 및 감마-카테닌(gamma-catenin), p120ctn, gp100Pme1117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 대장 선종증 단백질(adenomatous polyposis coli protein) (APC), 포드린(fodrin), 커넥신 37(Connexin 37), Ig-유전자형(Ig-idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드(gangliosides), 인유두종 바이러스 단백질과 같은 바이러스 산물, 스마드 패밀리 종양 항원(Smad family of tumor antigens), Imp-1, P1A, EBV-코딩된 핵 항원(EBV-encoded nuclear antigen) (EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라아제(brain glycogen phosphorylase), SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2를 포함한다.
다른 실시예에서, 약화된 rISFV는, 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 봉입(inclusion) 없이, 안티-암 (온콜리틱) 치료로서 그자체로서(per se) 이용된다. ISFV는 in vitro 및 in vivo 종양 세포 사멸(killing) 특성들을 갖는다. 용어 "온콜리틱(oncolytic)"은 일반적으로 암세포의 성장 중지(halting), 용해(lysing), 또는 사멸할 수 있는 물질(agent)을 나타낸다. 온콜리틱 바이러스에 대하여 상기 용어는 암세포에서 암세포에서 어느 정도로 복제할 수 있고, 사멸, 용해, 또는 암세포 성장의 정지(cessation)를 야기할 수 있으며, 그리고 비암세포들에서 일반적으로 최소 독성을 갖는 바이러스를 나타낸다. rISFV는 본 발명에서 설명된 임의의 방법들을 사용하여 약화된다.
박테리아 항원은 예를 들어 TB 및 나병(leprosy)을 야기하는 마이코박테리아(Mycobacteria), 폐렴쌍구균(pneumococci), 호기성 그람음성 바실러스(aerobic gram-negative bacilli), 마이코플라즈마(mycoplasma), 포도상구균(staphylococcus), 연쇄상구균(streptococcus), 살모넬라균(salmonellae), 클라미디아균(chlamydiae), 또는 나이세리균(neisseriae)으로부터의 항원들을 포함한다.
다른 항원들은 예를 들어 말라리아, 리슈만편모충증(leishmaniasis), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 톡소플라즈마증(toxoplasmosis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 필라리아병(filariasis)와 같은 기생동물(parasites)로부터의 항원, 뿐만 아니라 알레르기원인 항원을 포함한다.
다른 측면에서 ISFV G 유전자는 상기에서 설명된 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스들의 하나 또는 그 이상에 의해 그 전체가 대체될 수 있다. 또 다른 측면에서 ISFV G 유전자는 제2 수포성바이러스즉, 위형(pseudotyped)의 이종 G 유전자 에 의해 대체될 수 있다. 특정 측면들에서 rISFV는 VSV로부터 G 유전자로 위형된 것일 수 있다. VSV G 유전자는 상기에서 열거된 VSV 혈청형들 사이에서 선택될 수 있다.
본 발명의 변형들(variants)에 따라, 면역성 조성물은 적어도 두 개의 목적 항원들, 또는 적어도 두 개의 목적 항원들을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 시퀀스, 또는 적어도 두 개의 목적 항원들을 코딩하는 적어도 두 개의 이종 뉴클레오티드 시퀀스들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.list
특정 실시예들에서 이종 항원은 알파바이러스 항원이다. 알파바이러스들 대부분은 모기-매개 전염을 통해 지구상의 척추동물들을 감염시키고 넓은 숙주 범위를 나타낸다 (Strauss et al., 1994 Microbiol Rev. 58(3):491-562). 가끔, 이 사이클은 질병을 야기하도록 인간과 길들여진 동물들로 번진다. 구세계(Old World) 바이러스들, 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 치군군야바이러스(chikungunya virus), SINV와와 같은,로 인간 감염은 일반적으로 열, 발진, 및 다발성 관절염으로 특징지어지고, 반면, 신세계 바이러스들 베네수엘라마뇌척수염 바이러스 (VEEV), 동부형마 뇌막염 바이러스 (EEEV), 및 서부형마 뇌막염 바이러스 (WEEV)로 감염은 치명적인 뇌염을 야기할 수 있다 (Strauss et al., 1994 Microbiol Rev. 58(3):491-562). 결과적으로 후자의 바이러스들은 냉전 동안 생물학적 무기로서 개발되었고, 최근 영장류의 에어로졸 감염은 그들의 고도로 쇠약 및/또는 치사 특성들을 확인한다 (Reed et al., 2007 The Journal of Infectious Diseases 196:441-450; Reed et al., 2005 The Journal of Infectious Diseases 192:1173-1182; Reed et al., 2004 The Journal of Infectious Diseases 189:1013-1017; Smith et al., 2009 Alphaviruses, p. 1241-1274. In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed.), Clinical Virology. ASM Press, Washington, D.C.). EEEV는 고용량 에어로졸 감염 후 사이노몰구수 마카쿠(cynomolgus macaque)에 대해 균일하게 치명적이고 임의의 바이러스 감염의 가장 높은 자연적인 인간의 경우-사망률 (>50%) 중 하나를 야기한다 (Reed et al., 2007 The Journal of Infectious Diseases 196:441-450). 인간의 VEEV 감염은 일반적으로 치명적이지 않으나, 이 바이러스는 에어로졸에 의해 가장 전염적인 바이러스 중 하나이고 면역 억제적일 뿐만 아니라 고도로 쇠약하게 한다 (Reed et al., 2004 The Journal of Infectious Diseases 189:1013-1017; Smith et al., 2009 Alphaviruses, p. 1241-1274. In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed.), Clinical Virology. ASM Press, Washington, D.C.; Weaver et al., 2004. Annu. Rev. Entomol. 49:141-174). 더구나, 이것은 라틴 아메리카에 걸쳐 광범위한 풍토병(extensive endemic diease)를 야기하고, 이의 의도적인 도입은 수백 수천의 사람들을 감염시키는 말 증폭(equine amplification) 및 모기 전염을 초래할 수 있다. 이러한 특징들(traits)은 NIAID 카테고리 B 병원체 리스트에 뇌염성 알파바이러스들의 배정이 가져온다.
알파바이러스 질병에 대한 허가된 항바이러스 치료 또는 면역성 조성물들이 없기 때문에, U.S 인구는 3 뇌염들(encephalitides)로 자연적인 감염 뿐만 아니라 생물학적 공격에 공격받기 쉽게 남아있다. 효과적인 항바이러스 치료의 개발은 일반적으로 진단이 오직 약 감염 1주 후 전구증상 질병이 뇌염으로 진행된 후에 발생하기 때문에 특별히 도전적이다. 그러므로, 면역(immunization)은 치명적인 질명에 대항하여 보호하기에 가장 좋은 접근이다.
이 미충족 욕구(unmet need)를 해결하기 위해, rISFV는 알파바이러스들 모두에 대한 균-단독 면역성 조성물로서 사용하기 위해, 및/또는 VEEV 및 EEEV E3-E1 당단백질들을 발현하는 rVSV 벡터들을 갖는 이종 프라임-부스트 면역에 사용하기 위해 VEEV 및 EEEV의 E3-E1 당단백질들을 발현하도록 변형되고, 이러한 면역 양상(modality)은 최적의 효능을 위해 필요되어야 한다.
B. 재조합 수포성바이러스의 제형(Formulation or Recombinant Vesiculoviruses)
본 발명에 유용한 면역성 조성물들, 예를 들면, rISFV 단독 또는 프라임/부스트 요법에서 rVSV 조성물들과 함께, 은 면역학적으로 또는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어, 예를 들어 살균수(sterile water) 또는 살균 등장액(isotonic saline), 를 더 포함한다. 면역성 조성물들은 또한 종래의 방식에서 상기 희석제들 또는 캐리어들과 혼합될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것과 같이 언어(language) "약학적으로 허용 가능한 캐리어(pharmaceutically acceptable carrier)"는 임의의 그리고 모든 용매들, 분산매, 코팅(coatings), 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제, 및 이와 같은 것들을 포함하도록 의도된다. 적절한 캐리어는 당업자에게 명백하고 투여의 루트에 많은 부분에서 의존한다. 따라서, 본 발명에서 유용한 면역성 조성물들은 하나 또는 그 이상의 N 단백질 유전자, P 단백질 유전자, M 단백질 유전자, G 단백질 유전자, 및 L 단백질 유전자를 포함; 그리고 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스, 여기서 상기 이종 폴ㄹ뉴클레오티드 시퀀스는 (1) 전사 시작 신호 및 전사 중지 신호에 측접하고, (b) 이종 폴리펩티드를 코딩함; 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어를 더 포함하는 재조합 복제가능 ISFV를 포함할 수 있다.
추가적인 구성 성분들은 면역성 조성물들에 존재할 수 있고, 보존제(preservatives), 표면-활성제(surface-active agents), 및 화학 안정제(chemical stabilizers), 현탄 및 분산제(suspending or dispersing agents)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 안정제, 보조제(adjuvants), 및 보존제는 대상 인간 또는 동물에서 효능에 대한 최적 제형을 결정하기 위해 최적화된다. 적합한 예시적 보존제는 클로로부탄올(chlorobutanol), 포타슘 소르베이트(potassium sorbate), 소르브산(sorbic acid), 설퍼 다이옥사이드(sulfur dioxide), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 파라벤(parabens), 에틸 바닐린(ethyl vanillin), 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀(parachlorophenol)을 포함한다.
사용될 수 있는 적합한 안정화 성분들은, 예를 들어, 카사미노산(casamino acids), 수크로오스, 젤라틴, 페놀 레드(phenol red), N-Z 아민, 모노포타슘 다이포스페이트(monopotassium diphosphate), 락토오스, 락트알부민 가수분해물(lactalbumin hydrolysate), 및 분유(dried milk)를 포함한다. 적합한 표면-활성 기질들은 프로인트 완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant), 퀴논 유사체(quinone analogs), 헥사데실아민(hexadecylamine), 옥타데실아민(octadecylamine), 옥타데실 아미노산 에스테르(octadecyl amino acid esters), 리소레시틴(lysolecithin), 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyl-dioctadecylammonium bromide), 메톡시헥사데실글리세롤(methoxyhexadecylgylcerol), 및 플루로닉 폴리올(pluronic polyols); 폴리아민(polyamines), 예를 들면, 피란(pyran), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 폴리 IC(poly IC), 카보풀(carbopol); 펩티드(peptides), 예를 들면, 무마밀펩티드(muramyl peptide) 및 디펩티드(dipeptide), 디메틸글리신(dimethylglycine), 터프트신(tuftsin); 오일 에멀젼; 및 미네랄 겔(gels), 예를 들면, 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate), 등 및 면역 자극 복합체(immune stimulating complexes) (ISCOMS)를 제한 없이, 포함한다. rISFV들 및 rVSV들 또는 임의의 이들의 폴리펩티드 구성 성분들은 또한 면역성 조성물로서 사용하기 위해 리포솜(liposomes)으로 통합된다. 면역성 조성물은 또한 조성물의 투여의 선택된 모드(mode)에 대해 적합한 다른 첨가제들을 포함한다. 본 발명의 조성물들은 또한 냉동건조된 제형들(lylyophilized formulations)을 포함할 수 있고, 이것은 파우더, 액체, 또는 현탁 제형(dosage forms)을 개발하기 위해 다른 약학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 사용될 수 있다. 참조, 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19th edition (1995), 예를 들면, Chapter 95 Aerosols; 및 International Patent Publication No. WO99/45966, 이들의 사상들(teachings)은 본 발명에 참조로서 통합된다.
이러한 면역성 조성물들은 임의의 종래의 투여 루트를 통해 투여에 적합한 첨가제들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 면역성 조성물은 인간 대상체에 투여하기 위해 예를 들어, 액체(liquids), 분말(powders), 에어로졸(aerosols), 정제(tablets), 캡슐(capsules), 장코팅된(enteric-coated) 정제 또는 캡슐, 또는 좌약의의 형태로 제조된다. 따라서, 면역성 조성물들은 또한 현탁액(suspensions), 용액, 유성 또는 수성 비히클들(vehicles)에서 에멀젼, 페이스트(pastes), 및 이식형 서방성 방출(implantable sustained-release) 또는 생분해성(biodegradable) 제형들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비경구(parenteral) 투여를 위한 제형의 일 실시예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클 (예를 들면, 살균 발열원-프리(pyrogen-free) 수)과 함께 재구성하기 위해 건조 (즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 다른 유용한 비경구적으로-투여 가능한 제형들은 미정질(microcrystalline) 형태에서, 리포솜 조제(liposomal preparation)에서, 또는 생분해성 폴리머 시스템의 구성 성분으로서 활성 성분을 포함하는 것들을 포함한다. 서방성 방출 또는 이식을 위한 조성물들은 약학적으로 허용 가능한 고분자성 또는 소수성 물질들, 에멀젼, 이온 교환 레진, 난용성(sparingly soluble) 폴리머, 또는 난용성 염을 포함할 수 있다.
본 발명에서 설명된 면역성 조성물들은 상기에서 설명된 약학적 조제(preparations)의 타입들에 유용한 종래의, 생리학적으로 허용 가능한 캐리어, 보조제, 또는 다른 활성성분들의 선택에 의해 제한되지 않는다. 이들 약학적으로 허용 가능한 조성물들의 제조는, 적절한 pH 등장(isotonicity), 안정성 및 다른 기존 특징들을 갖는 상기-설명된 구성 성분들로부터, 당업계의 기술 내에 있다.
수성 용액에서 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고 액체 희석제는 먼저 등장성의 충분한 식염수 또는 글루코스로 녹아야(be rendered)한다. 이들 특정 수성 용액들은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내, 및 복강내 투여에 적합할 수 있다. 이런 이유로, 사용될 수 있는 살균 수성 배지는 본 발명의 관점에서 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 일 용량(one dosage)은 1 ml의 등장 NaCl 용액에 용해될 수 있고 또한 1000 ml의 피하주입 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가될 수 있거나 투입(infusion)의 제안 자리에서 주입될 수 있다 (참조 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 용량의 일부 변동은 반드시 처리되는 대상체의 상태에 의존하여 일어날 수 있다. 투여에 대한 책임이 있는 사람은, 임의의 상황에서, 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 사람 투여에 대해, 조제들은 조성물들이 사용되는 나라들의 정부에 의해 요구되는 멸균율(sterility), 발열원성(pyrogenicity), 일반사항(general safety) 및 순도 표준들(purity standards)을 충족시켜야 한다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, "캐리어(carrier)"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 완충제(buffers), 캐리어 용액, 현탁액, 콜로이드(colloids), 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 약학적 활성 기질을 위한 상기 배지(media) 및 물질(agents)의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 배지 또는 물질이 활성 성분과 부적합한에 있어서는 제외하고는, 치료성 조성물들에서 이의 사용이 고려된다. 보충(Supplementary) 활성 성분들이 또한 조성물로 통합될 수 있다.
구(phrase) "약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)" 또는 "약물학적으로 허용 가능한(pharmacologically acceptable)"은 인간에 투여되었을 때 알레르기 또는 유사한 부반응(untoward reaction)을 생성하지 않는 분자 독립체(entities) 및 조성물들을 나타낸다. 활성 성분으로서 바이러스 입자를 포함하는 수성 조성물의 제조는 당업계에서 잘 이해된다. 일반적으로, 상기 조성물들은 주입 가능한 물질(injectables)로서, 또한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되고; 용액에, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 액체가 주입 전에 또한 제조될 수 있다.
상기에서 설명된 것과 같이, 재조합 수포성바이러스들의 임의의 실시예들은 치료 방법들에 사용될 수 있다. 바람직하게, 이 조성물은 상기에서 설명된 것과 같은 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 다른 구성 성분들과 함께 혼합된다. 일 실시예에서, 병원체에 의해 야기된 감염의 치료 또는 예방은 하나의 유효량의 하나 또는 그 이상의 투여 또는 본 발명에서 설명된 재조합 수포성바이러스들의 조합을 포함한다.
C. 재조합 수포성 바이러스의 투여( Administration of Recombinant Vesiculovirus)
본 발명의 항원성 또는 면역성 조성물들은 인간 또는 다른 포유류 대상체들에 다양한 루트들, 근육내, 종양내, 복강내, 피하, 정맥내, 동맥내, 비강내, 구강, 혀밑샘(sublingual), 볼(buccal), 질(vaginal), 직장(rectal), 비경구(parenteral), 피내, 및 경피(transdermal)를 포함하지만, 제한되지 않는, 에 의해 투여된다 (참조, 예를 들면, International patent publication No. WO 98/20734, 본 발명에 참조로서 통합됨). 적절한 루트는 사용되는 면역성 조성물의 성질, 그리고 환자의 나이, 무게, 성별 및 전반적인 건강의 평가 및 면역성 조성물에 존재하는 항원들, 그리고 주치의에 따른 유사한 인자들에 따라 선택된다.
하기 제공된 예들에서, 면역성 rISFV 조성물들 및 rVSV 조성물들은 모두 개별적으로이던 또는 프라임/부스트 요법에서 함께이던 근육 내에서 (i.m.) 투여된다. 다른 실시예들에서, 상이한 루트들에 의해 rISFV 조성물들 및 rVSV 조성물들이 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, rISFV 조성물은 종래의 방식, 근육내 및 비강내 투여를 포함, 으로 투여될 수 있다. 그러나, 투여의 루트들 및 용량들의 선택은 본 발명에 따라 제한되지 않는다.
면역성 조성물 투여의 순서 및 개별 투여 사이의 기간(time periods)은 본 출원의 방법에 대한 숙주의 정확한 반응들 및 물리적 특성들에 입각한 주치의 또는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 최적화는 당업계 내에서 이상적일 것(to be well)으로 예상된다.
보통, 본 발명의 면역성 조성물(들)의 구성 성분에 대한 적절한 "유효량(effective amount)" 또는 용량의 선택은 또한 투여가 rISFV 단독 또는 rVSV 조성물과 함께 부스트/프라임, 뿐만 아니라 대상체의 물리적 상태, 가장 특히 면역화된 대상체의 전반적인 건강, 나이, 및 체중을 포함, 여부에 근거할 수 있다. 투여 방법 및 루트들과 면역성 조성물들에서 추가적인 구성 성분들의 존재는 또한 rISFV 및 rVSV 조성물들의 용량들 및 양들에 영향을 줄 수 있다. 이러한 선택 및 유효량(effective dose)의 상향 또는 하향 조절은 당업계 내이다. 면역 반응, 보호 반응과 같은, 을 유도하도록, 또는 환자에서 상당한 부작용(adverse side effects) 없이 치료 효과를 생성하도록 요구된 rISFV 및 rVSV의 양은 이들의 인자들에 따라 다양하다.
적절한 용량이 약학적 조성물에서, 상기에서 설명된 바와 같이 제형화되고 (예를 들면, 생리학적으로 호환 가능한 캐리어의 약 0.1 ml 내지 약 2 ml에서 용해됨) 임의의 적합한 수단들로 전달된다. 치료는 다양한 "단위 용량들(unit doses)"를 포함할 수 있다. 단위 용량은 선결정된 치료 조성물의 양을 포함하는 것으로서 정의된다. 투여될 양, 및 특정 방법과 제형은 임상 분야의 당업자 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없고 일정 기간 이상 연속적인 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 편리하게 플라크 형성 단위들 (pfu) 또는 바이러스 구성물에 대한 바이러스 입자들의 관점에서 설명될 수 있다. 단위 용량들은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu 또는 감염성 바이러스 입자들 (vp) 및 그 이상의 범위이다. 대안적으로, 바이러스 및 달성 가능한 역가에 따라, 하나는 1 내지 100, 10 내지 50, 100-1000, 또는 최대 약 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 또는 1x1015 또는 환자 또는 환자의 세포들에 대한 더 높은 vp를 전달할 것이다. 적절한 요량은 설명된 바와 같이 약학적 조성물에서 제형화되고 (예를 들어, 생리학적으로 호환 가능한 캐리어의 약 0.1 ml 내지 약 2 ml에서 용해됨) 임의의 적합한 수단들에 의해 전달된다.
일 실시예에서, rISFV에 대한 단일 또는 부스팅 용량들은 동일하다. 상기 용량들은 일반적으로 1x107 pfu (또는 바이러스 입자들로서 측정된) 내지 1x109 pfu/바이러스 입자들(viral particles)/ml 사이이다. 그러나, 임의의 적합한 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
본 발명에서 설명된 방법들의 두 번째 실시예에서, 재조합 수포성바이러스 (예를 들면, rISFV)의 투여는 하나 또는 그 이상의 동일한 것을 코딩하는 오픈 리딩 프레임들 또는 제1 바이러스에 의해 코딩된 것들과 같은 이종 항원들을 포함하는 제2 재조합 수포성 바이러스 (예를 들면 rVSV)를 포함하는 프라이밍 조성물의 유효량을 포유류 대상체에 투여함에 의해 선도된다. 대안적으로, 제1 바이러스의 투여를 제2 바이러스 투여가 뒤따른다. 어느 요법들에서나(In either regimen), 제1 바이러스 및/또는 제2 바이러스의 일 용량 이상이 투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 예를 들어, rVSV 면역성 조성물은 숙주에 대한 선택된 이종 항원 또는 항원들이 존재하는 프라이밍 rISFV 면역성 조성물의 투여 뒤에 부스팅 조성물로 투여될 수 있다. 포유류 대상체는 그 발현을 지시하는 조절 시퀀스들의 제어 하에서 하나 또는 그 이상의 이종 단백질들을 코딩하는 하나 또는 그 이상 오픈 리딩 프레임들을 포함하는 rISFV를 포함하는 프라이밍 조성물의 유효량이 투여되고, 면역성 rVSV 조성물 전에 약학적으로 허용 가능한 희석제의 유효량이 투여된다. 프라이밍 조성물로서 이용될 때, 이 rISFV 조성물은 한번 또는 한번 이상 부스팅 rVSV 조성물 전에 투여된다.
프라임/부스트 방법의 다른 실시예에서, 프라이밍 rISFV 조성물은 면역성 rVSV 조성물 전에 적어도 한번 투여되거나, 또는 rVSV 면역성 조성물 전 및 후 둘 다에 투여된다.
프라임/부스트 방법의 또 다른 실시예에서, 다중(multiple) rVSV 조성물들은 늦은 부스터들로서 투여된다. 일 실시예에서 적어도 두 rVSV 조성물들이 프라이밍 조성물들에 뒤따라 투여된다.
각 후속(subsequent) 수포성바이러스 조성물은 알려진 혈청형들로부터 그리고 수포성 바이러스 G 단백질의 조작(manipulation)에 의해 제공된 임의의 합성 혈청형들 사이에서로부터 선택된 상이한 혈청형을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 rVSV는 인디애나 혈청형일 수 있고 다른 것은 찬디퓨라 혈청형 또는 뉴저지 혈청형일 수 있다. 다른 실시예에서, 추가적인 rVSV 부스터들은 동일한 혈청형의 것이다. 부스팅 조성물로서 사용될 때, rVSV 조성물들은 프라이밍 rISFV 면역성 조성물들 후 연속으로 투여된다. 약화 및 면역원성의 원하는 균형을 보이는 rISFV들 및 rVSV들은 본 발명에 유용하다.
다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 rISFV 면역성 조성물들의 투여를 하나 또는 그 이상 rVSV 면역성 조성물들의 투여들이 뒤따르고, 그 다음 rISFV 면역성 조성물들의 하나 또는 그 이상의 추가적인 투여들이 뒤따른다.
또 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 rISFV 면역성 조성물들의 투여는 하나 또는 그 이상의 플라스미드 DNA 면역성 조성물들의 투여가 앞서거나 뒤따르고, 상기 플라스미드 DNA(들)은 동일하거나 상이한 이종 폴리펩티드들을 rISFV 면역성 조성물들과 같이 코딩한다.
III. 단백질 조성물(Proteinaceous Compositions)
본 발명의 단백질 조성물들은 바이러스 입자들 및 바이러스 입자들을 포함하는 조성물들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 수포성바이러스들은 바이러스 단백질들 N, P, M, G, 및/또는 L의 폴리펩티드 변형체들; 및/또는 이종 폴리뉴클레오티드들을 포함하도록 조작될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, "단백질(protein)" 또는 "폴리펩티드(polypeptide)"는 폴리머의 아미노산 잔기들(residues)을 나타낸다. 일부 실시예들에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 버전이 사용되고, 그러나, 많은 실시예들에서, 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부가 부재하거나 바이러스를 치료에 더 유용하게 만들기 위해서 변경된다.
"변형된 단백질(modified protein)" 또는 "변형된 폴리펩티드(modified polypeptide)"또는 "변형 단백질(variant protein)" 또는 "변형 폴리펩티드(variant polypeptide)"는 그 화학적 구조 또는 아미노산 시퀀스가 야생형 또는 참조 단백질 또는 폴리펩티드에 대하여 변경된 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시예들에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 작용(function) (단백질들 또는 폴리펩티드들이 다중 활성 및 작용들을 가질 수 있음을 인지)을 가진다. 변형된 활성 또는 기능은 야생형 단백질 또는 폴리펩티드에서 활성 또는 작용, 또는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 바이러스의 특성들에 대하여 일부 다른 방법들로 감소(reduced), 감소(diminished), 배제(eliminated), 강화(enhanced), 개선(improved), 또는 변경(altered)될 수 있다. 변형된 단백질 또는 폴리펩티드가 하나의 활성 또는 기능에 대하여 변경될 수 있음에도 불구하고 다른 측면들에서 야생형 또는 비변경된 활성 또는 기능을 유지할 수 있음이 고려된다. 대안적으로, 변형된 단백질은 완전히 비기능적일 수 있거나 그 동종의(cognate) 핵산 시퀀스는 폴리펩티드가 더 이상 전혀 발현하지 않고, 절단되고, 또는 프레임시프트(frame-shift) 또는 다른 변형의 결과로서 상이한 아미노산 시퀀스를 발현하도록 변형될 수 있다.
폴리펩티드들이 절단에 의해 변형, 이것은 그들은 그들이 해당하는 비변경된 형태 보다 짧게 만듦, 또는 변경된 단백질을 길게 만들 수 있는 융합 또는 도메인 셔플링(domain shuffling)에 의해 변경될 수 있음이 고려된다.
본 발명의 폴리펩티드들의 아미노산 시퀀스 변형들은 치환형(substitutional, 삽입형(insertional), 또는 삭제(deletion) 변형들이다. 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 돌연변이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 또는 그 이상의 폴리펩티드의 비-근접(non-contiguous) 또는 근접 아미노산들 (즉, 단편(segment)), 야생형 또는 비변경된 폴리펩티드들 또는 다른 참조 폴리펩티드들의 비교하면, 에 영향을 줄 수 있다. 수포성바이러스들에 의해 코딩된 다양한 폴리펩티드들은 본 명세서와 함께 제출된 시퀀스 목록 또는 본 발명에서 제공된 관련 공공 데이터 베이스 목록들(public database entries) 및 GenBank Accession Numbers을 참조하여 확인될 수 있다.
삭제 변형들(Deletion variants)은 본래의, 비변경된, 또는 야생형 단백질들의 하나 또는 그 이상의 잔기들이 결핍된다. 잔기들 개개는 삭제될 수 있거나, 도메인 (촉매 또는 결합 도메인)의 전부 또는 일부가 삭제될 수 있다. 수포성바이러스 G 단백질의 세포질 후미(cytoplasmic tail)은 바이러스를 약화시키기 위하여 절단될 수 있다. 예를 들어, rISFV G 단백질은 20 내지 25개의 아미노산들의 카복시-말단 절단을 가질 수 있고, 반면 rVSV G 단백질은 20 내지 28개의 아미노산들의 카복시-말단 절단을 가질 수 있다. 더 약화는 또한 수포성바이러스 유전체에서 N 유전자를 그 본래의 제1 자리로부터 떠나 셔플링하여, 또는 아미노산 자리들 33 및 51에서 비-세포변성(n-cytopathic) (ncp) M 유전자 돌연변이에 의해, U.S. Patent 8,287,878에서 설명된 바와 같이, 달성될 수 있다. 중지 코돈(stop codon)은 절단된 단백질을 발생시키기 위한 코딩 핵산 시퀀스로 도입될 수 있다 (치환 또는 삽입에 의해). 삽입형 돌연변이는 일반적으로 폴리펩티드의 비-말단 지점에서 물질의 첨가를 포함하고, 삽입물(insert)의 특이 타입(specific type)은 목적 단백질의 관련 부분의 위치에서 관련된 단백질의 이종 또는 유사 부분들을 포함하는 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)이다. 이것은 면역반응성 에피토프 또는 단순히 하나 또는 그 이상의 잔기들의 삽입을 포함한다. 말단 부가물들(terminal additions), 일반적으로 융합 단백질들이라 함, 이 또한 발생될 수 있다.
치환형 변형들은 일반적으로 단백질 내에서 하나 또는 그 이상의 자리들에서 하나의 아미노산의 다른 것으로의 교환을 의미하고, 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 특성들을, 다른 기능들 또는 특성들의 상실 또는 상실 없이, 조정하도록 설계될 수 있다. 치환들은 보존적일 수 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 모양 및 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환들은 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, 알라닌(alanine)에서 세린(serine); 아르기닌(arginine)에서 리신(lysine); 아스파라긴(asparagine)에서 글루타민(glutamine) 또는 히스티딘(histidine); 아스파르테이트(aspartate)에서 글루타메이트(glutamate); 시스테인(cysteine)에서 세린; 글루타메이트에서 아스파라긴(asparagine); 글루타메이트에서 아스파르테이트; 글리신(glycine)에서 프롤린(proline); 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신(isoleucine)에서 류신(leucine) 또는 발린(valine); 류신에서 발린 또는 이소류신; 리신에서 아르기닌; 메티오닌(methionine)에서 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌(phenylalanine)에서 티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린에서 트레오닌(threonine); 트레오닌에서 세린; 트립토판(tryptophan)에서 티로신(tyrosine); 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린에서 이소류신 또는 류신:의 변화들을 포함한다. 대안적으로, 치환물들은 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향 받도록 비-보존적일 수 있다. 비-보존적 변화들은 일반적으로 화학적으로 비유사한 것, 극성 또는 비극성에 대해 대전된 아미노산 또는 비대전된 아미노산, 및 그 반대와 같은, 로 잔기의 치환을 포함한다.
용어 "기능적으로 동등한 코돈(functionally equivalent codon)"은 본 바발명에서 동일한 아미노산, 예를 들면 아르기닌 또는 세린에 대한 6개 코돈들과 같은, 을 코딩하는 코돈들을 나타내는 것으로 사용되고, 그리고 또한 생물학적으로 동등한 아미노산들을 코딩하는 코돈들을 나타낸다. 아미노산들 코돈들은 포함한다: 알라닌 (Ala, A) GCA, GCC, GCG, 또는 GCU; 시스테인 (Cys, C) UGC 또는 UGU; 아스파르트산(Aspartic acid) (Asp, D) GAC 또는 GAU; 글루탐산(Glutamic acid) (Glu, E) GAA 또는 GAG; 페닐알라닌 (Phe, F) UUC 또는 UUU; 글리신 (GIy, G) GGA, GGC, GGG 또는 GGU; 히스티딘 (His, H) CAC 또는 CAU; 이소류신 (Ile, I) AUA, AUC, 또는 AUU; 리신 (Lys, K) AAA 또는 AAG; 류신 (Leu, L) UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, 또는 CUU; 메티오닌 (Met, M) AUG; 아스파라긴 (Asn, N) AAC 또는 AAU; 프롤린 (Pro, P) CCA, CCC, CCG, 또는 CCU; 글루타민 (Gln, Q) CAA 또는 CAG; 아르기닌 (Arg, R) AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, 또는 CGU; 세린 (Ser, S) AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, 또는 UCU; 트레오닌 (Thr, T) ACA, ACC, ACG, 또는 ACU; 발린 (Val, V) GUA, GUC, GUG, 또는 GUU; 트립토판 (Trp, W) UGG; 및 티로신 (Tyr, Y) UAC 또는 UAU.
또한 아미노산 및 핵산 시퀀스들이 추가적인 잔기들, 예를 들어 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산들, 또는 5'또는 3'시퀀스들, 을 포함할 수 있음이 이해될 것이고, 그럼에도 불구하고 여전히 필수적으로 본 발명에서 명시된 것일 수 있고, 특정 생물학적 활성을 갖는 것을 포함한다. 말단 시퀀스들의 첨가는 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분들에 측접하는(flanking) 다양한 비코딩 시퀀스들을 포함할 수 있거나 다양한 내부 시퀀스들, 즉, 인트론(introns), 유전자들 내에서 발생하는 것으로 알려진 것을 포함할 수 있는 핵산 시퀀스에 특히 적용된다.
하기는 등가물, 또는 더 향상된, 분자를 생산하기 위해 본 발명에서 설명된 단백질의 아미노산들의 변화에 기반한 논의(discussion)이다. 예를 들어, 특정 아미노산들은 예를 들어, 항체들의 항원-결합 영역들 또는 수용체 분자들에서 결합 자리들과 같은 구조체들과 상호작용 결합 능력의 뚜렷한 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산들로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 기능성 활성으로 정의되는 상호작용 능력 및 단백질의 성질 때문에, 특정 아미노산 치환물들은 단백activity 질 시퀀스에서, 그리고 그 근원적인 폴리뉴클레오티드 시퀀스에서 형성될 수 있고, 그리고 그럼에도 불구하고 유사 특성들을 갖는 단백질을 생성할 수 있다. 따라서 다양한 변화들이 수포성바이러스들의 핵산 시퀀스들에서 형성될 수 있거나 이종 폴리뉴클레오티드가 흥미있는 생물학적 효용성 또는 활성의 뚜렷한 손실 없이 코딩될 수 있음이 발명자에 의해 고려된다.
이러한 변화들 형성에서, 아미노산들의 수치료법의 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에서 생물학적 기능 부여에서 수치료법의 아미노산 인덱스의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다 (Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적인 수치료법 특성이 결과(resultant) 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아들여지고, 이것은 차례로(in turn) 다른 분자들, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 및 이와 유사한 것들, 과 단백질의 상호작용으로 정의된다. 또한 당업계에서 유사 아미노산들의 치환물은 친수성에 근거하여 효과적으로 형성될 수 있음이 이해된다. U.S. Patent 4,554,101는, 본 발명에 참조로서 통함됨, 단백질의 최대 국부 평균 친수성(greatest local average hydrophilicity)이, 이의 인접한 아미노산들의 친수성에 의해 지배된 것으로서, 단백질의 생물학적 특성과 서로 관련 있음을 명시한다. U.S. Patent 4,554,101에 설명된 것과 같이, 하기 친수성 값들은 아미노산 잔기들에 할당된다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); glycine (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 ( 0.5); 히스티딘 *-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 ( 2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 아미노산이 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 동등한 및 면역학적으로 동등한 단백질을 생상할 수 있음이 이해된다. 이러한 변화들에서, 친수성 값들을 갖는 아미노산들의 치환물은 ±2 내인 것이 바람직하고, 이는 ±1 내인 것이 더 바람직하며, 그리고 이는 ± 0.5 내인 것이 특히 더 바람직하다.
상기에서 개설된(outlined) 것과 같이, 아미노산 치환물들은 일반적으로 상대적인 아미노산 측-가지 치환물들의 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 이와 유사한 것들에 근거한다. 다양한 전술 특성들을 참작한 치환물들의 예들은 당업자에게 잘 알려진 것이고 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신. 이러한 변화들 형성에서, 기능적으로 관련된 단백질들의 계통학적 분석이 고려될 수 있다 (참조 도 11 및 그에 묘사된 것과 같이, rISFV N 유전자에서 형성된 네 개의 아미노산 변화들).
IV. 핵산 분자(Nucleic Acid Molecules)
특정 실시예들은 이종 단백질 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 일부 실시예들에서 바이러스 유전체의 전부 또는 부분들은 특정 특성들 및/또는 특징들을 갖는 바이러스, 바이러스 폴리펩티드, 이종 폴리뉴클레오티드, 또는 이종 폴리펩티드를 발생시키기 위해 돌연변이가 되거나(mutated) 변화된다(altered). 폴리뉴클레오티드들은 바이러스 또는 이종 아미노산 시퀀스의 전부 또는 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나, 또는 그들이 바이러스 폴리펩티드를 코딩하지 않거나 추가되거나, 증가되거나, 감소되거나, 또는 제거된 적어도 하나의 기능 또는 활성을 갖는 바이러스 폴리펩티드를 코딩하도록 설계될 수 있다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 용어 분리된 "RNA, DNA, 또는 핵산 단편(RNA, DNA, or nucleic acid segment)"은 전제 유전체 DNA 또는 다른 오염물들(contaminants)로부터 분리된 RNA, DNA, 또는 핵산 분자를 나타낸다. 특정 실시예에서 폴리뉴클레오티드는 다른 핵산들을 떠나 분리된다. "수포성바이러스 유전체(vesiculovirus genome)" 또는 "VSV 유전체(VSV genome),"또는 "ISFV 유전체(ISFV genome)"는 숙주 세포에 바이러스 입자를 수득하도록 제공될 수 있는, 헬퍼 바이러스 또는 트랜스에(in trans) 다른 인자들을 공급하는 상보 코딩 영역들(complementing coding regions)의 존재 또는 부재에서, 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
용어 "상보적 DNA(complementary DNA)" 또는 "cDNA"는 주형으로서 RNA를 사용하여 제조된 DNA를 나타낸다. 이들은 완전한 또는 부분적 유전체 시퀀스가 바람직할 때가 있을 수도 있다.
유사하게, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코딩 시퀀스들 및, 특정 측면들에서, 조절 시퀀스들, 분리된 다른 자연적으로 발생한 유전자들로부터 떠나 실질적으로 분리된 또는 단백질 코딩 시퀀스들을 포함하는 핵산 단편들을 나타낸다. 이 점에 있어서, 용어 "유전자(gene)"은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 (적절한 전사, 번역 후 변형(post-translational modification), 로컬리제이션(localization)에 요구되는 임의의 시퀀스들을 포함)을 코딩하는 핵산 유닛을 간략화 하는데 사용된다. 당업자에 의해 이해될 것과 같이, 이 기능적 용어는 유전체 시퀀스들, cDNA 시퀀스들, 및 작게 설계된 핵상 단편들을, 단백질들, 폴리펩티드들, 도메인들, 펩티드들, 융합 단백질들, 및 돌연변이들을 발현하는, 또는 발현하는데 적용될 수 있는, 포함한다.
본 발명에서 사용되는 핵산 단편들은, 그의 코딩 시퀀스의 길이에 관계 없이, 다른 핵산 시퀀스들, 예를 들면, 프로모터들, 폴리아데닐레이션 신호들, 추가적인 제한 효소 자리들, 다중 클로닝 자리들, 다른 코딩 단편들, 및 이와 유사한 것들, 그래서 그들의 전반적인 길이가 매우 다양할 수 있도록, 과 결합될 수 있다. 그러므로 대부분의 임의의 길이의 핵산 단편이, 바람직하게 의도된 재조합 핵산 프로토콜에서 사용 및 제조의 용이성에 의해 한정되는 전체 길이를 갖는, 사용될 수 있음이 고려된다.
본 발명의 핵산 구성물들은 임의의 소스로부터 전체-길이 폴리펩티드(들)을 코딩할 수 있거나 또는 폴리펩티드(들)의 절단되거나 변형된 버전(version), 예를 들어 이종 펩티드 단편, 을 을 코딩할 수 있음이 고려된다. 핵산 시퀀스는 전체-길이 폴리펩티드를 추가적인 이종 코딩 시퀀스들과 함께, 예를 들어 폴리펩티드의 정제, 수송, 분리, 번역 후 번역, 또는 목적 또는 효능과 같은 치료적 장점들 허용하도록, 코딩할 수 있다. 태그(tag) 또는 다른 이종 폴리펩티드는 폴리펩티드-코딩 시퀀스에 첨가될 수 있다. 용어 "이종(heterologous)"는 변형된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 발견된 자연적으로 발생하는 바이러스에 의해 코딩된 또는 관련된 것과 동일하지 않은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 단편을 나타낸다.
비제한적 예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산 구성물들은 특정 바이러스 단편, 수포성 바이러스 N, P, M, G, 또는 L 유전자와 같은, 에 뉴클레오티드들의 근접합 신축성(contiguous stretch) 또는 상보성을 포함하는 것으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 핵산 단편들은 변형된 폴리펩티드들을 코딩하는 변형된 핵산들을 포함한다. 이러한 시퀀스들은 코돈 중복성 및 기능성 등가성의 결과로서 발생할 수 있다. 기능적으로 동등한 단백질들 또는 펩티드들은 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 생성될 수 있고, 이것은 단백질 구조에서 변화들이, 교환되는 아미노산의 특성들의 고려에 근거하여, 조작 될 수 있다. 인간에 의해 설계된 변화들은 자리-지시된 돌연변이 생성 기술들의 적용을 통해 도입될 수 있다, 예를 들면, 이들의 결실 또는 항원성에 대한 개선을 도입하기 위해. 단백질은 in vivo 단백질의 독성 효과를 감소시키기 위해 변형될 수 있고, 또는 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 바이러스를 포함하는 임의의 치료의 효능을 증가시키기 위해 변형될 수 있다.
재조합 수포성바이러스 벡터들은 삽입형 돌연변이들, 점 돌연변이들(point mutations), 삭제, 또는 유전자 셔플링을 포함하는 다양한 기술들을 사용하여 조종될 수 있다.
재조합 수포성바이러스는 바이러스로 감염된 세포들에서 N (뉴클레오캡시드 단백질) 유전자를 유전체에서 본래 3' 전사 프로모터로부터 더 멀리 (원위(distal)) 있는 자리로 셔플링하여 N mRNA 합성을 감소시키기 위해 디자인될 수 있다. VSV가 인간 병원체로 고려되지 않고, VSV에 대한 기존 면역이 사람 인구에서 드물기 때문에, VSV-유래 벡터들의 개발이 면역성 조성물들 및 유전자 치료와 같은 영역들에서 주목되고 있다. 예를 들어, 연구들은 VSV가 면역성 조성물들, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(hemagglutinin) (Roberts et al., 1999 J. Virol, 73:3723-3732), 홍역 바이러스 H 단백질 (Schlereth et al., 2000 J. Virol, 74:4652-57), 및 HIV-1 env 및 gag 단백질들 (Rose et al., 2001 Cell, 106:539-549) 발현, 에 효과적인 벡터로서 제공할 수 있음을 규명하고 있다.
특정 다른 실시예들에서, 본 발명은 본 발명에서 확인된 (및/또는 참조로서 통합된) 시퀀스들에서 나타내는 것들로부터 근접한 핵산 시퀀스를 그들의 시퀀스 내에 포함하는 재조합 벡터들 및 분리된 핵산 단편들을 고려한다.
또한 본 발명은 특정 핵산 및 아미노산 시퀀스들의 확인된 시퀀스들에 제한되지 않는 것이 이해될 것이다. 재조합 벡터들 및 분리된 핵산 단편들은 그러므로 다양하게 수포성바이러스-코딩 영역들, 기본 코딩 영역에서 선택된 변경들 및 변형들을 베어링하는(bearing) 코딩 영역들을 포함할 수 있거나, 또는 그들은 수포성바이러스-코딩 영역들을 포함함에도 불구하고 더 큰 폴리펩티드들을 코딩할 수 있거나, 또는 변형 아미노산들 시퀀스들을 갖는 생물학적으로 기능적 동등한 단백질들 또는 펩티드들을 코딩할 수 있다.
다양한 실시예들에서, 수포성바이러스 폴리뉴클레오티드 및/또는 이종 폴리뉴클레오티드는 변형될수 있거나 돌연변이가 될 수 있다. 변형들 또는 돌연변이들은 삽입, 삭제, 치환, 재배열, 도치(inversions), 및 이와 같은 것을 포함할 수 있고 특정 단백질들 또는 분자 메카니즘의 변조(modulation), 활성화, 및/또는 불활성화, 뿐만 아니라 기능, 위치, 또는 유전자 산물의 발현 변형을 가져올 수 있다. 사용될 때, 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 생성(mutagenesis)은 다양한 기준(standard), 돌연변이유발 절차들(mutagenic procedures)에 의해 성취될 수 있다 (Sambrook et al, 2001). 돌연변이는 유기물 또는 분자의 구조 또는 기능에서 변화들이 발생하는 프로세스(process)이다. 돌연변이는 단일 유전자, sis 유전자 블록들 또는 유전체 전체의 뉴클레오티드 시퀀스의 변형을 포함한다. 단일 유전자들에서 변화들은 DNA 시퀀스 내에서 단일 뉴클레오티드 염기의 제거, 첨가, 또는 치환을 포함하는 점 돌연변이들의 결과일 수 있거나, 또는 그들은 뉴클레오티드들의 다수의 삽입 또는 삭제를 포함하는 변화들의 결과일 수 있다.
삽입형 돌연변이 생성은 알려진 뉴클레오티드 또는 핵산 단편의 삽입을 통한 유전자의 변형에 근거된다. 이것은 핵산 단편의 일부 타입의 삽입을 포함하기 때문에, 발생된 돌연변이들은 일반적으로 기능-획득(gain-of-function) 돌연변이들 보다 기능-손실(loss-of-function)이다. 그러나, 삽입 발생 기능-획들 돌연변이들의 예들이 있다. 삽입형 돌연변이 생성은 표준 분자 생물학 기술들을 사용하여 성취될 수 있다.
구조-가이드 자리-특이 돌연변이 생성은 단백질-리간드 상호작용 엔지니어링 및 해체(dissection)에 대한 강력한 툴(tool)을 대표한다 (Wells, 1996; Braisted et al., 1996). 이 기술은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 시퀀스 변화들이 선택된 DNA로 도입함에 의한 시퀀스 변형들의 제조 및 테스트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, "G-CT"는 돌연변이(mutated) VSV G 단백질을 나타내고 여기서 코딩된 G 단백질은 이의 세포질 도메인에서 아미노산들의 일부가 절단되거나 삭제되며, 또한 G 단백질의 "세포질 후미 영역(cytoplasmic tail region)"으로서 여겨진다. G-CT1은 이의 마지막 카복시 말단 28 아미노산들이 절단되고, 29 아미노산 야생형 세포질 도메인으로부터 오직 하나의 아미노산을 보유하는 단백질 산물을 야기한다. 다른 G 유전자 절단들은, 예를 들면, 야생형에 대하여, 삭제된 세포질 도메인의 마지막 20 카복시-말단 아미노산 잔기들을 갖는, G-CT9, US Patent No. 8,287,878에서 확인된다. rVSV의 G 단백질을 변경하는 알려진 방법들 중 International Publication No. WO99/32648 및 Rose, N. F. et al. 2000 J. Virol.,74:10903-10에 설명된 방법들이다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 시퀀스플 포함하는 벡터를 나타낸다. 일부 경우들에서, RNA 분자들은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우들에서, 이들 시퀀스들은, 예를 들어, 안티센스 분자들 또는 리보자임들의 생성에서 번역되지 않는다. 발현 벡터들은 다양한 "조절 시퀀스들(control sequences)"을 포함할 수 있고, 이것은 특정 숙주 유기물에서 전사 및 가능한대로(possibly) 사용 가능하게 연결된 코딩 시퀀스의 번역에 필요한 핵산 시퀀스들을 나타낸다. 전사 및 번역을 지배하는 조절 시퀀스들에 더하여, 벡터들 및 발현 벡터들은 다른 기능들을 제공하는 핵산 시퀀스들을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 하부에(infra) 설명된다.
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 시퀀스의 영역인 조절 시퀀스이다. 이것은 조절 단백질들 및 분자들, RNA 중합효소 및 다른 전사 인자들과 같은, 와 결합하는 유전적 요소들을 포함할 수 있다. 구들 "동장 가능하게 결합된(operatively coupled)," "동작 가능하게 연결된(operatively linked)," "조절 하(under control)," 및 "전사 조절 하(under transcriptional control)"은 프로모터가 전사 개시 및/또는 이 시퀀스의 발현을 조절하기 위해 핵산 시퀀스에 관하여 옳은 기능적 위치 및/또는 방향에 있음을 의미한다. 프로모터는 "인핸서(enhancer)"와 함께 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있고, 이것은 핵산 시퀀스의 전자 활성화에 관련된 cis-작용 조절 시퀀스를 나타낸다.
특이 개시 신호가 또한 코딩 시퀀스들의 효율적인 번역을 위해 요구될 수 있다. 이 신호들은 ATG 개시 코돈 또는 인접한 시퀀스들을 포함한다. 이종 전자 조절 신호들은, ATG 개시 코돈을 포함, 제공되어야 할 필요가 있을 수 있다. 전자 조절 신호 및 개시 코돈들은 자연적 또는 합성 모두일 수 있다. 발형의 효율성은 적절한 전사 인핸서 요소들의 포함에 의해 향상될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 내부 리보손 유입점들(internal ribosome entry sites) (IRES) 요소들의 사용은 다중유전자(multigene), 또는 다시스트론성(polycistronic), 메세지들(messages)을 생성하는데 이용될 수 있다. IRES 요소들은 5' 메틸화 캡(Cap) 의존 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 유입점들에서 번역을 시작할 수 있다 (Pelletier and Sonnenberg, 1988). 피코르나바이러스 과의 두 멤버들 (폴리오(polio) 및 뇌심근염(encephalomyocarditis)로부터 IRES 요소들이 설명되고((Pelletier and Sonnenberg, 1988), 뿐만 아니라, 포유류 메세지(mammalian message)로부터의 IRES가 설명된다 (Macejak and Sarnow, 1991). IRES 요소 덕분에, 각 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜들에 접근 가능하다.
벡터들은 다중 복제 자리(multiple cloning site)를 포함하고ligated, 이것은 벡터를 소화하기 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있는 임의의 다중 제한 효소 자리들을 포함하는 핵산 영역이다. (참조 Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997, 이것은 참조로서 본 발명에 통합된다.) "제한 효소 소화(Restriction enzyme digestion)"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 기능하는 효소를 갖는 핵산 분자의 촉매 절단(catalytic cleavage)를 나타낸다. 이러한 제한 효소들의 대부분은 상업적으로 이용 가능하다. 벡터는 이종 시퀀스들이 벡터로 결찰되도록(ligated) MSC 내에서 잘라내는 제한 효소를 사용하여 선형화될 수 있거나 단편화될 수 있다. "리게이션(ligation)"은 두 핵산 단편들 사이에 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합들을 형성하는 공정을 나타내고, 이것은 서로 근접하게 있을 수 있거나 있지 않을 수 있다.
벡터들 또는 구성물들은 적어도 하나의 종료 신호를 포함한다. "종료 신호(termination signal)" 또는 "종료암호(terminator)"는 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사체의 특이 종료에 관련된 핵산 시퀀스들로 구성된다. 따라서, 특정 실시예들에서 RNA 전사체의 생성을 끝내는 종료 신호가 고려된다. 종료암호는 목적하는 메시지 수준을 달성하기 위해 in vivo 필요할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 종료암호들은 임의의 본 발명에서 설명된 알려진 전사의 종료암호 또는 당업자에게 알려진 것을 포함하고, 예를 들어, 유전자의 종료 시퀀스들, 예들 들어 소 생장 호르몬 종료 암호 또는 바이러스 종료 시퀀스들, 예를 들어 SV 40 종료 암호와 같은, 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예들에서, 종료 신호는 전사가능하거나 번역 가능한 시퀀스의 부족, 시퀀스 절단으로 인한 것과 같은, 일 수 있다.
폴리아데닐레이션 신호는 적절한 전사체의 폴리아데닐레이션을 가져오는데 사용될 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 중요할 것으로 생각되지 않는다. 실시예들은 SV40 폴리아데닐레이션 신호 및/또는 소 생장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. 폴리아데닐레이션은 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나 세포질 수송을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 본 발명의 핵산 구성물을 포함하는 세포들은 발현 벡터에서 마커를 포함하여 in vitro 또는 in vivo 확인될 수 있다. 이러한 마커들은 발현 벡터를 포함하는 세포들의 식별을 용이하게 허가하는 세포들에 대한 식별 가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 가능한 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 가능한 마커는 마커의 존재에서 그 선택을 허용하는 것이고, 반면 음성 선택 가능한 마커는 그 존재에서 그 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 가능한 마커의 예는 약물 저항 마커이다. 일반적인 약물 선택 마커의 포함은 클로닝 및 형질전환체(transformants)의 식별을 돕고, 예를 들어, 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 하이그로마이신(hygromycin), DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀(histidinol)에 대한 저항성을 부여하는 유전자들은 선택 가능한 마커들로서 유용하다. 조건들의 구현에 근거한 형질전환체들의 차별(discrimination)을 허용하는 표현형을 부여하는 마커들에 더하여, 그 기준이 비색 분석인 GFP와 같은 스크린 가능한(screenable) 마커들을 포함하는 마커들의 다른 타입들이 또한 고려된다. 대안적으로, 단순성 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus) 티미딘 키나아제(thymidine kinase) (tK) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase) (CAT)와 같은 스크린 가능한 효소들이 활용될 수 있다. 당업자는 또한 면역학적 마커들을 사용하는 방법, 가능한 FACS 분석과 함께, 을 알 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 함께 동시에 발현될 수 있는 한, 중요하게 생각되지 않는다. 선택 가능하고 스크린 가능한 마커들의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려진 것이다.
V. 재조합 수포성바이러스 관련 키트(Kits related to recombinant vesiculovirus)
다른 실시예에서, 본 발명은 면역, 예방, 또는 치료 요법의 투여를 준비하기 위한 약학적 키트를 제공한다. 이 키트는 포유류 또는 척추동물 대상체에서 높은 수준의 항원-특이 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위해 디자인된다. 이 키트는 본 발명에서 설명된 것과 같은 rISFV 조성물을 포함하는 적어도 하나의 면역성 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, rISFV 면역성 조성물의 다중 선패키지된(prepackaged) 용량은 다중 투여를 위한 키트에서 제공된다. 이 키트는 또한 상기에서 설명된 바와 같은 rVSV 면역성 조성물을 포함하는 적어도 하나의 면역성 조성물을 포함한다. 일 실시예에서, rVSV 면역성 조성물의 다중 선패키지된 용량은 다중 투여를 위한 키트에서 제공된다.
이 키트는 또한 본 발명에서 설명된 것과 같은 프라임/부스트 방법에서 면역성 조성물들을 사용하기 위한 지시사항(instructions)을 포함한다. 키트들은 또한 특정 분석법들, 다양한 캐리어들, 첨가제들, 희석제들, 보조제들 및 상술한 것들과 같은 것을 수행하기 위한 지시사항을 포함할 수 있고, 뿐만 아니라, 시린지(syringes), 전기천공 장치(electroporation devices), 스프레이 장치, 등과 같은 조성물들의 투여를 위한 장치를 포함할 수 있다. 다른 구성 성분들은 일회용 장갑(disposable gloves), 오염제거 지침(decontamination instructions), 어플리케이터 스틱들(applicator sticks) 또는 용기들, 다른 조성물들 중 하나를 포함할 수 있다.
VI. 실시예들(EXAMPLES)
하기 실시예들 뿐만 아니라 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하기 위해 포함된다. 실시예들 및 도면들에 개시된 기술들은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자들에 의해 발견된 기술들을 대표하고, 따라서 그 실시를 위해 바람직한 모드들로 구성함이 고려될 수 있음은 당업자에게 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 관점에서, 많은 변화들이 특정 실시예들에서 이루어질 수 있고 이것은 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않는 한 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻고 개시됨이 인식되어야 한다.
실시예 1
이스파한 바이러스 (ISFV)의 분석 및 회복(Analysis and Recovery of Isfahan virus (ISFV))
ISFV 유전체 cDNA 코딩 플라스미드 DNA로부터 재조합 이스파한 바이러스 (rISFV)의 회복을 위한 시스템이 개발되고 있다. 야생형 (wt) rISFV의 안정성 및 약화된 변형 rISFVN4ΔCT25gag1은 고민감성 4-5-주-생(4-5-week-old) NIH Swiss Webster 쥐 두개 내의 신경병원성 모델에서 연구된다. 비변형된 rISFV wt는 LD50>103 PFU를 나타냈고, LD50의 <10 PFU를 갖는 wtVSVIN에 대조적이다. rISFVN4ΔCT25gag1는 LD50>107을 나타냈고, LD50의 <104를 갖는 rVSVINN2CT1에 대조적이다. 이러한 결과들은 rISFV가 본질적으로 VSVIN 보다 낮은 병원성이고 rVSVIN 벡터들과 같은 유사한 안정성 및 면역원성을 달성하기 위해 다중 약화 전략들의 활용(N-셔플, G 단백질의 세포질 후미의 절단)이 필요하지 않을 수 있음을 나타낸다.
이스파한 계통발생학적 분석. 베스클로바이러스속 (genus Vesiculovirus)의 이용가능한 시퀀스들은 GenBank로부터 다운로드된다. N 유전자 시퀀스들은 MUSCLE 알고리즘 (Gouy et al., 2010, Molecular Biology and Evolution 27:221-24; Edgar, 2004. Nucleic Acids Research 32:1792-97)을 활용하여 SeaView (PBIL (Pㆄle Bio-Informatique Lyonnais), France)에서 조정된다. 이 시퀀스들은 오픈 리딩 프레임들 (ORF들)로부터 아미노산 시퀀스들을 추론되고 그 다음 후속 분석을 위해 뉴클레오티드 시퀀스들이 되돌아감(Gouy et al., 2010, Molecular Biology and Evolution 27:221-24; Edgar, 2004. Nucleic Acids Research 32:1792-97)에 의해 조정된다. 최대-공산(Maximum-likelihood) (ML) 분석이 PHYLIP 패키지(package)를 활용하여 수행될 수 있다 (Felsenstein, 1989, Cladistics 5, 164-1663). ML 계통학의 강인성(robustness)은 100번 복제(replicates)의 리샘플링 부트스트랩(bootstrap)에 의해 평가된다. 분석은 속 내에서 두 개의 메인 클러스터들(clusters)을 나타낸다 (도 1). 제1 클러스터는 VSVIN 및 이의 아류형(subtypes), 및 VSVNJ으로 구성되지만, 제2 클러스터는 ISFV, 찬디퓨라, 및 피리바이러스들로 구성된다. 이 데티어는 속 냉에서 ISFV의 관계를 결정하기 위한 이전 혈청학적 분석들과 일치하고, 함께 ISFV이 VSVIN과 멀리 관계가 있음을 나타낸다 ( Tesh et al., Am J Trop Med Hyg. 1977, Mar 26(2):299-306).
이스파한 cDNA 클론의 발생. 낮은 조직 계대배양된 ISFV 분리물은 World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch로부터 수득되었다. 바이러스 유전체 RNA는 배양 상등액으로부터 분리되었고 완전한 ISFV 유전체를 스패닝하는 cDNA 단편들은 역전사(reverse transcription) (RT) 및 PCR 증폭 (RT-PCR)에 의해 생성되었다 (도 2). RT-PCR 산물들 (단편 3-5)은 VSV 뉴저지 (pVSVNJN4CT1HIVgag1)의 전체-길이 유전체 cDNA를 포함하는 플라스미드로 단계적 복제되었다 (도 2). 잔여 단편들 (1-2)은 pBlueScript 플라스미드로 복제되었다(인비트로젠(Invitrogen)).
구조를 위한 지지 플라스미드들, 개별적 ISFV 단백질들(N, P, M, G 및 L)을 발현, 은 각각의 오픈 리딩 프레임들 (ORF)을 pVSVINP 플라스미드의 Nco I 및 Sac I 자리들로 클로닝(cloning)하여 발생되었다 (Witko et al., J Virol Methods. 2006 Jul, 135(1):91-101). Nco I와 호환 가능한 부착 말단(cohesive ends)은 BspH I (N 및 M 유전자들), Pci I (P 유전자) 및 BsmB I (G 및 L 유전자들)을 통해 발생되었다. L 유전자 ORF은 두 개의 cDNA 단편들: 단편 #1 (BsmB I 에서 Avr II), 및 단편 #2 (Avr II 에서 Sac I)의 결합에 의해 조립되었다. 모든 결과 구조 지지 플라스미드들은 뉴클레오티드 시퀀스 분석에 의해 증명되었다.
알파바이러스 엔벨로프 유전자들(envelope genes)을 코딩하는 rISFV 및 rVSV IN 구성물. EEEV 균주 FL93 및 VEEV 균주 ZPC738의 엔벨로프 유전자들 (E3-E2-6K-E1 포함)은 pPBS-ISFV-38(이의 구성은 하기에서 설명됨)로 복제되었다. 게다가, VEEV-ZPC E3-E1 유전자들은 pVSVINN4CT1HIVgag5로 복제되었다. 알파바이러스 유전자들의 각각의 경우는 제한 자리 Xho I 및 Not I을 사용하여 rISFV 또는 rVSV 전사효소의 제어 하에서 삽입된 유전자들을 위치시키는 방식으로 벡터 유전체의 5번 자리에 삽입되었다 (도 3A). 모든 벡터들은 전체-길이 뉴클레오티드 시퀀스 분석에 의해 증명되었고 알파바이러스 단백질들의 발현은 웨스턴 블랏에 의해 확인되었다 (도 3B).
유전자 발현에서 3'에서 5'구배는 수포성바이러스들 (Ball and White, PNAS. 1976, 73(2):442-6; Villarreal et al., Biochemistry. 1976, 15(8):1663-7) 및 다른 음성 센스 RNA 바이러스들 (Conzelmann, Annual review of genetics. 1998, 32:123-62)에 대해 잘 문서화되고 있다. 그러므로, 목적 항원의 최대 발현은 유전체의 첫 번째 자리, 단일 강력한 3' 전사 프로모터와 바로 인접한, 로 전이유전자(transgene)의 삽입에 의해 달성된다. 그러나, 일부 항원들의 높은 발현 수준들은 rVSV 복제에 독성일 수 있고, 이것은 전이유전자 불안정성 및 항원 발현의 상실을 가져온다 (공개되지 않음). 전이 유전자(들)을 3' 전사 프로모터로부터 더 멀리 이동시킴에 의한 독성 항원들, 예를 들면 HIV-1 Env 단백질들, 의 발현 하향 조절은 rVSV 플랫폼까지 테스트된 상이한 병원체들의 범위로부터 모든 목적 항원들 및 Env 발현의 유전적 안정성을 유지하는데 성공적이고 있다. E2/E1 당단백질들이 높은 수준에서 발현되는 경우 rVSV 및 rISFV 복제에 독성일 수 있는 가능성을 고려하기 위해, 약화된 rVSV 및 rISFV 벡터들은 유전체의 5번 자리로부터 E2/E1이 발현됨이 발생되었다.
전체 길이 재조합 이스파한 바이러스 pDNA의 발생
전체 길이 이스파한 바이러스 (ISFV)를 구성하기 위한 스타팅 물질(starting material)은 하기 코딩된 두 개의 서브복제(subcloning) 플라스미드들로 구성된다:
UTMB Plasmid #1 (개명된(renamed) pPBS-ISFV-001): T7 프로모터, VSV Leader, ISFV Leader, N, M, P, G 및 L의 부분적 시퀀스, XhoI/KpnI 자리들을 통해 pBlueScript II SK+로 삽입된, 의 핵산 시퀀스들. 시퀀스들은 3'에서 5'방향으로 삽입되었다.
UTMB Plasmid #2 (개명된 pPBS-ISFV-002): XhoI/RsrII 자리들을 통해 VSVNJN4CT1 백본으로 삽입된 종료암호 및 ISFV L의 부분적 3'시퀀스의 핵산 시퀀스.
상기에 더하여, T7 프로모터의 제어 하에서 개별적으로 ISFV 유전자들 (M, P, N, G, 및 L)을 코딩하는 지지 플라스미드들이 제공된다.
전체-길이 ISFV 유전체 cDNA를 포함하는 pPBS-ISFV-008의 구성
ISFV L 삭제된 시퀀스의 삽입. ISFV L의 누락된(missing) 2.4 kb 핵산 시퀀스는 pPBS-ISFV-001 및 pPBS-ISFV-002로 삽입된다. 누락된 단편들은 주형으로서 pT7-IRES-ISFV L 지지 플라스미드와 함께 프라이머들 ISF_59- GTGCGTGGAAGACCGGTACCTCCCATTTGG (SEQ ID NO:13)/ ISF_60- TAATGTTATTGCCGGCGAATTCGAAACTGAATAAATC (SEQ ID NO:14)을 사용하여 PCR로 발생되었다. 사용된 PCR 사이클은: 40 사이클에서 95℃, 2 min; (95℃, 30 초 변성(denaturation)/ 50℃, 30 초 어닐링(annealing)/ 72℃, 2.5 분 신장(elongation)); 72℃, 2 분이다. 시퀀스의 높은 정확도를 보장하기 위해, Pfx50 DNA 중합효소 (인비트로젠(Invitrogen))이 사용되었다. 다음, PCR 산물은 pPBS-ISFV-001와 나란히 제한효소 KpnI 및 NgoMIV로 소화되었다. 제한 소화 산물은 pPBS-ISFV-003를 발생시키기 위해 리게이트 되었다. 2.4kb는 또한 프라이머들 ISF_62- AATAACATTACTCGAGTTCGGTACCTCCCATTTGG (SEQ ID NO:15)/ ISF 63- CAACTTTAAATTCGAAACTGAATAAATCTATC (SEQ ID NO:16)을 주형으로서 pT7-IRES-L 지지 플라스미드와 함께 사용하여 PCR에 의해 발생되었고 pPBS-ISFV-005를 발생시키기 위해 각각 XhoI 및 BstBI를 통해 pPBS-ISFV-002로 삽입되었다. 전체 길이 ISFV L은 pPBS-ISFV-006을 발생시키기 위해 XhoI/ KpnI 제한 자리들을 통한 pPBS-ISFV-001 및 pPBS-ISFV-005의 결합에 의해 복원되었다.
ISFV Leader에 인접한 T7 프로모터의 구성. 적합한 ISFV 구조의 구성을 발생시키기 위해, T7 프로모터 (TAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO:17))는 ISFV 선도 시퀀스(ACGGAGAAAAACAAACCAATTCACGC (SEQ ID NO:18))의 업스트림에 바로 위치되어야 한다. 그러므로, ISFV 선도 시퀀스에 인접한 T7 프로모터의 PCR 증폭은 프라이머 ISF_65- TTGAGCACCTGGTACAGGTATGAATTGATGTGACAC (SEQ ID NO:19)/ ISF_66- GCGTGAATTGGTTTGTTTTTCTCCGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGCCGGCCTCGAGTAAATTAATT (SEQ ID NO:20)를 주형으로서 pPBS-ISFV-001와 함께 사용하여 달성된다. 결과 PCR 증폭은 프라미어들 SF_65- TTGAGCACCTGGTACAGGTATGAATTGATGTGACAC (SEQ ID NO:21) / ISF_67- CGTATTAGCCGGCCTCGAGTAAATTAATT (SEQ ID NO:22)을 사용하여 EcoNI/ NgoMIV 제한 자리들을 생성하는 증폭의 2 라운드에 주형으로서 제공되는 단편을 생성했다. PCT 산물은 그 다음 pPBS-ISFV-007을 발생시키기 위해 EcoNI/ NgoMIV 제한 자리들을 통해 pPBS-ISFV-001로 삽입되었다.
전체 길이 이스파한 바이러스 cDNA를 포함하는 pDNA의 구성. 전체 길이 ISFV 유전체 cDNA를 포함하는 pDNA는 핵산 시퀀스 5'-N1-P2-M3-G4-L5-3' 및 ISFV 선도 시퀀스와 인접한 T7 프로모터를 갖는 pPBS-ISFV-008을 구성하기 위해 제한 효소들 NgoMIV/ SanDI과 함께 pPBS-ISFV-006 및 pPBS-ISFV-007를 소화하여 발생되었다.
rISFV 구조 절차(rISFV Rescue Procedure)
pDNA의 제조. 각 전기천공법(electroporation)을 위해, 표 1에 리스트된 것과 같은 하기 플라스미드 DNA들을 살균 조건들 하에서 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 결합하였다:
Figure 112016095649879-pct00001
* 모든 바이러스 단백질들은 야생형 뉴클레오티드 시퀀스들로부터 발현되었고 전사는 T7 프로모터의 제어 하에서 이다.
** pDNA 양(amounts)은 하나에 전자천공법으로 계산되었다.
DNA 볼륨(volume)은 살균, 누클라아제-프리(nuclease-free) 수 300 μL로 조정되었다. 다음, 60 μl의 3M 소듐 아세테이트(sodium acetate) 및 900 μL 100% 에탄올을 첨가하였고, 혼합물은 밤새 -20 ℃에서 저장하였다. DNA는 14000 rpm에서 30분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 상등액은 흡출하였고(aspirated) DNA 펠릿은 공기 건조되었고 50 μL 살균, 누클라아제-프리 수에서 각 전기천공법을 위해 재현탁하였다.
베로 세포들(Vero cells)의 제조. 표 2에 리스트된 것과 같은 하기 배지를 ISFV의 구조를 위해 사용하였다:
Figure 112016095649879-pct00002
각 전기천공은 약 1.3 근접-합류 T-150 플라스크들 또는 합류 플라스크 하나로부터 세포들을 필요로한다. 각 T150 플라스크의 세포 단층들(monolayers)은 Ca2+ 또는 Mg2+가 없는 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)로 세척하였다. DPBS을 흡출하였고 5 ml의 트립신-EDTA 용액으로 트립신화하였으며, 그 다음 37 ℃에서 5분 동안 배양하였다. 플라스크를 태핑(tapping)함에 의해 세포들을 축출(dislodging) 후, 10 mL 의 Rescue Medium 1을 각 플라스크에 세포들을 현탁하기 위해 첨가하였고 2 플라스트들은 각각 10 mL Rescue Medium 1을 포함하는 50 mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 세포들은 1200 rpm에서 5분 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 상등액을 흡출하였고 세포들은 50 mL 원뿔형 튜브 당 10 mL의 Rescue Medium 2로 재현탁하였고, 이를 1200 rpm에서 5분 동안 4 ℃에서 원심분리가 뒤따른다. 세척물은 버려졌고 세포 펠릿은 0.7 mL의 Rescue Medium 2로 재현탁하였다. 세포 현탁액은 50 μl의 플라스미드 DNA 용액으로 등분된 마이크로퓨즈 튜브로 이동하였고 부드럽게 혼합하였으며, 뒤이어 이를 세포들/DNA를 전기천공 큐벳(cuvette)으로 이동하였다.
전기천공. 세포들은 BTX820 전기천공기에서 하기에 따라 전기천공되었다:
Figure 112016095649879-pct00003
전기천공 후, 모든 샘플들은 실온으로 10분 동안 이동하였고, 그 다음 1mL의 Rescue Medium 1을 큐벳으로 전기천공된 세포들을 재현탁하기 위해 부드럽게 혼합하며 첨가하였다. 세포 현탁액을 그 다음 큐벳으로부터 15 mL를 10 mL의 Rescue Medium 1를 포함하는 원심분리 튜브로 이동시켰고 1200 rpm에서 5분 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 배지는 흡출하였고 세포들은 10 mL Rescue Medium 1에 재현탁하였으며 20 mL Rescue Medium 1을 포함하는 T-150 플라스크들로 이동시켰다. 플라스크는 37 ℃에서 (5% CO2) 3 시간 동안 배양하였고, 43 ℃에서 (5% CO2) 3-5 시간 동안 열충격(heat-shock)시켰으며, 그 다음 장기 배양을 위해 32 ℃로 되돌렸다. 밤새 배양 후 상등액을 25 mL의 새로운 Rescue Medium 1에 위치시켰다. 5-10일 후, 양성 rISFV 구조들은 세포 변성 효과(cytopathic effect) (CPE)를 나타내고, 모아진 세포들의 영역들에 의해 특징지어진다. 구조 상등액은 회수되고; 에탄올/드라이 아이스 욕에서 급속 냉동되며 단일 바이러스 클론(들)은 플라크 픽킹(plaque picking)에 의해 분리되고 뒤이어 바이러스 작업 스톡을 발생시키기 위해 베로 세포들에서 두 라운드의 증폭이 뒤따른다.
ISFV/수포성바이러스 핵단백질 아미노산 얼라인먼트(ISFV/Vesiculovirus Nucleoprotein Amino Acid Alignment)
rISV 핵단백질의 아미노산 시퀀스는 다른 수포성바이러스 핵단백질 시퀀스로 조정된다 (표 3). 매치 백분율(percent matches)은 ISFV 핵단백질 시퀀스에 대한 아미노산 식별(identities)에 기초한다. 시퀀스들에서 상세한 상동성(homology)은 표 4에서 나타낼 수 있다. 아미노산 상동성 영역들은 음영처리된다.
Figure 112016095649879-pct00004
실시예 2
유전자 셔플을 이용한 약화된 rISFV 벡터들의 구성 및 ISFV G의 세포질 후미의 절단(Construction of attenuated rISFV vectors using gene shuffles and truncations of the cytoplasmic tail of ISFV G)
rISFV-N4G5-MCS1의 구성. 플라스미드 pPBS-ISFV-008은 핵산 시퀀스 5'-N1-P2-M3-G4-L5-3' [rISFV의 안티-유전체]를 포함한다. 첨자 숫자들은 각각 ISFV 유전자, P (인단백질 코딩), M (기질 단백질 코딩), G (부착 단백질 코딩), N (뉴클레오캡시드 단백질 코딩) 및 L (중합효소 단백질 코딩)의 유전체 자리를 나타낸다.
플라스미드 pPBS-ISFV-009는 핵산 시퀀스 5'-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6-3' (자리 1에서 추가적인 전자 카세트(cassette)를 갖는 rISFV의 안티-유전체)를 포함한다. 이 식에 따르면, MCS (다중 클로닝 사이트)는 rISFV 안티-유전체 자리 1에 바로 ISFV N의 업스트림에서 빈 전사단위 (TU)이다. 첨자 숫자들은 각각 ISFV 유전자, P (인단백질 코딩), M (기질 단백질 코딩), G (부착 단백질 코딩), N (뉴클레오캡시드 단백질 코딩) 및 L (중합효소 단백질 코딩)의 유전체 자리를 나타낸다.
먼저, ISFV L에서 내부 NheI 자리가 클로닝 목적들로 제거된다: PCR 단편은 프라이머 ISF_68 - AATCTGGAcgcgtctcGCTAGtCAGGCTGATTATTTGAGG (SEQ ID NO:23) / ISF_48 - TTGATATTTCCCCAACTCTAC (SEQ ID NO:24)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-008을 사용하여 발생되었고 각각 pPBS-ISFV-010을 생성하기 위해 AfeI/BsmBI 및 AfeI/NheI -제한 자리들을 통해 pPBS-ISFV-008로 삽입되었다.
부분적 ISFV M-ISFV G- 부분적 ISFV L 시퀀스를 포함하는 두 번째 PCR 단편은 프라이머 ISF_73 - CGCATGCCGTCTCCTTATGTTGATTG (SEQ ID NO:25) / ISF28 - AGCATTCATTATAAGTATGAC (SEQ ID NO:26)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-008을 사용하여 발생되었다. 이 단편은 pPBS-ISFV-011을 생성하기 위해 SphI/AgeI 제한 자리들을 통해 변형된 pT7Blue 클로닝 벡터 (노바겐(Novagen))으로 삽입되었다.
pPBS-ISFV-011로부터 시작하는, 두 개의 연속적인 돌연변이 생성 반응들은 프라이머 파리(paris) ISF_71 - GCTTTTCACAGATGAAGCTAGCTGAAAGTATGAAAAAAACG (SEQ ID NO:27) / ISF_72 - GTTTTTTTCATACTTTCAGCTAGCTTCATCTGTGAAAAGCTTG (SEQ ID NO:28) 및 ISF_69 - AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:29) / ISF_70 - GAATAAAACTGAAGTCATTTTGACACGCGTTTGACCTCTGTTAAT (SEQ ID NO:30)을 사용하여 pPBS-ISFV-013을 발생시키기 위해 수행되었다. pPBS-ISFV-013은 그 다음 BsmBI/AgeI 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-009로부터 유래된 대응하는 벡터 단편들과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-014는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-MCS1-N2-P3-M4-G5-L6-3'이 포함되고, 그러나 pPBS-ISFV-009와 달리 ISFV G 유전자는 예를 들면, ISFV G의 세포질 후미의 절단을 포함하는 ISFV 변형들로 용이한 교환을 허용하는 MluI/NheI 제한 자리들에 측접한다.
자리 4로 N-유전자를 셔플하기 위해 그리고 그러므로 rISFV를 벡터로서 약화시키기 위해, PCR 단편은 프라이머 ISF_84 -CAGCTGGCGGCCGCTAGGAATTCAAATCAACATATATGAAAAAAATCAACAGAGATACAACAATG (SEQ ID NO:31) / ISF20 - ACATAGTGGCATTGTGAACAG (SEQ ID NO:32)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-008을 사용하여 발생되었고 pPBS-ISFV-017을 생성하기 위해 HindIII/NotI 제한 자리들을 통해 변형된 pT7Blue 클로닝 벡터 (Novagen)로 삽입되었다. pPBS-ISFV-017 및 pPBS-ISFV-014는 pPBS-ISFV-019를 발생시키기 위해 pPBS-ISFV-014의 대응하는 벡터 단편으로 pPBS-ISFV-017로부터 BsmBI/NotI-삽입체를 교환(swapping)하여 결합된다.
동시에, pPBS-ISFV-015는 프라이머 ISF_73 - CGCATGCCGTCTCCTTATGTTGATTG (SEQ ID NO:33) / ISF_82 - AGTCATACCGGTCTCGTTAATTTTTTTCATATCTTTCTTCTGCATGTTATAATTC (SEQ ID NO:34)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-008을 사용 및 SphI/AgeI- 제한 자리들을 통해 변형된 pT7Blue 클로닝 벡터 (Novagen)로 이를 삽입하여 단편의 PCR 증폭에 의해 발생되었다. 두 번째 PCR 단편은 ISF_80 - TCGAGAACGCGTTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC (SEQ ID NO:35) / ISF_81 - ATTCCAACGCGTCTCGTTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAGTAAAG (SEQ ID NO:36)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-008을 사용하여 발생되었고, pPBS-ISFV-015로 각각 BsmBI/MluI 및 BsaI/MluI- 제한 자리들을 통해 pPBS-ISFV-016을 발생시키기 위해 삽입되었다.
마지막으로, pPBS-ISFV-016 및 pPBS-ISFV-019는 pPBS-ISFV-019의 대응하는 벡터 단편으로 pPBS-ISFV-016으로부터 BsmBI/Mlul-삽입체를 교환하여(swapping) 결합되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-020는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-MCS1-P2-M3-N4-G5-L6-3'을 포함하고, 여기서 pPBS-ISFV-014와 비교하면 N 유전자는 rISFV의 자리 4로 셔플된다.
rISFV-N4G3-MCS5의 구성. pPBS-ISFV-013으로부터 시작하는, 돌연변이 생성 반응응 프라이머 ISF_90 - GCTTTTCACAGATGAAGCTAGCGCATGCGGCCGCTGAAAGTATGAAAAAAACG (SEQ ID NO:37) / ISF_91 - GTTTTTTTCATACTTTCAGCGGCCGCATGCGCTAGCTTCATCTGTGAAAAGCTTG (SEQ ID NO:38)로 pPBS-ISFV-022를 발생시키기 위해 수행되었다. ISF_92 - CTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGAGGTCAAACTCGAGGATATCGGTACCGAAGGCGCGCCCAGCTGTGCGGCC (SEQ ID NO:39) 및 ISF_93 - GGCCGCACAGCTGGGCGCGCCTTCGGTACCGATATCCTCGAGTTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATACTTTCAG (SEQ ID NO:40)로부터 발생된 올리고뉴클레오티드 링커는 pPBS-ISFV-023을 발생시키기 위해 pPBS-ISFV-022의 NheI/NotI-벡터 단편과 리게이트되었다. PCR 단편은 프라이머 ISF_98 - GAATTCCTCGAGTTGACCTCTGTTAATTTTTTTCATATATGTTGATTTGAATTC (SEQ ID NO:41) 및 ISF_99 - GATGAA GCTAGCTGAAAGTATGAAAAAAATTAACAGGGATCAAAATGACTTCTGTAG (SEQ ID NO:42)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-016을 사용하여 발생되었고 pPBS-ISFV-024를 생성하기 위해 pPBS-ISFV-023으로 XhoI/NheI 제한 자리들읕 통해 삽입되었다.
게다가, PCR 단편은 프라이머 ISF16 - ATCATTCCTTTATTTGTCAGC (SEQ ID NO:43) 및 ISF_100 - TATATGGCTAGC GAAGACAGAGGGATCAAAATGTCTCGACTCAACCAAAT (SEQ ID NO:44)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-017을 사용하여 발생되었고 pPBS-ISFV-025를 생성하기 위해 pPBS-ISFV-017으로 BsmBI/NheI 제한 자리들읕 통해 삽입되었다.
두 올리고뉴클레오티드 링커들은, 각각 ISF_101 - CTAGCCCGGCTAATACGACTCACTATAGGACGGAGAAAAACAAA (SEQ ID NO:45) / ISF_102 - TTGGTTTGTTTTTCTCCGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGCCGGCG (SEQ ID NO:46) 및 ISF_103 - CCAATTCACGCATTAGAAGATTCCAGAGGAAAGTGCTAAC (SEQ ID NO:47) / ISF_104 - CCCTGTTAGCACTTTCCTCTGGAATCTTCTAATGCGTGAA (SEQ ID NO:48)로부터 발생된, 그 다음 pPBS-ISFV-025 (pPBS-ISFV-026 생성하기 위해)의 NheI/BbsI-벡터 단편과 리게이트 되었다. pPBS-ISFV-030, 핵산 시퀀스 5'-P1-M2-N3-G4-L5-3'를 포함하는 플라스미드, 을 생성하기 위해, pPBS-ISFV-026이 BsmBI/NgoMIV 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-020으로부터 유래된 대응하는 벡터 단편들과 리게이트되었다.
마지막으로, pPBS-ISFV-024 및 pPBS-ISFV-030은 pPBS-ISFV-030의 대응하는 벡터 단편들로 pPBS-ISFV-024로부터 BsmBI/AgeI-삽입체를 교환하여(swapping) 결합되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-031은 그러므로 핵산 시퀀스 5'-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6-3'을 포함하고, 여기서 pPBS-ISFV-014와 비교하면 N 유전자는 rISFV의 자리 4에서 셔플된다.
rISFV-N*4G5-MCS1의 구성. rISFV 및 VSV N 단백질들의 아미노산 시퀀스 얼라인먼트가 단지 전반적으로 52 % 상동성을 나타냄에도 불구하고, 얼라인먼트는 강력한, 알려진 H2d 제한적 에피토프(MPYLIDFGL; 도 11 참조)에 대한 매우 근접한 상동성이 증명된다. 다른 수포성바이러스로부터 추가적인 N 단백질들을 갖는 다른 얼라인먼트들은 그러므로 제거하거나(ablate) 또는 이 아미노산 신축성(stretch)에 대한 적어도 rISFV 및 rVSV 사이의 상동성을 감소시키는데 사용된다. pPBS-ISFV-016로부터 시작하는, 돌연변이 생성 반응은 하기 ISFV N: K271Q, A272S, L279M, F282M (ISFV N*)에서 아미노산 변화들을 포함하는 pPBS-ISFV-033을 생성하기 위해 프라이머 ISF_127 - GAAAGACAAGAAGTGGACCAGAGCGATTCCTACATGCCTTACATGATTGATATGGGGATCTCAACCAAATC (SEQ ID NO:49) / ISF_128 - GGTTGAGATCCCCATATCAATCATGTAAGGCATGTAGGAATCGCTCTGGTCCACTTCTTGTCTTTCTTTC (SEQ ID NO:50)로 수행되었다 (도 11 참조). pPBS-ISFV-033은 SanDI/BsrGI 제한효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-037을 생성하기 위해 pPBS-ISFV-024로부터 유래된 대응하는 벡터 단편들과 리게이트되었다. 마지막으로, pPBS-ISFV-037 및 pPBS-ISFV-031은 pPBS-ISFV-031의 대응하는 벡터 단편들로 pPBS-ISFV-037로부터 NheI/Agel-삽입체를 교환하여(swapping) 결합되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-038는 그러므로-유사 pPBS-ISFV-031-항원성 핵산 시퀀스 5'-P1-M2-G3-N4-MCS5-L6-3'를 포함하고, 그러나 코딩된 ISFV N 단백질은 4 아미노산들 변화들 K271Q, A272S, L279M, F282M (ISFV N*)을 가져온다.
모델 항원 HIV-1 gag SDE을 발현하는 약화된 rISFV N 벡터. 플라스미드 pPBS-HIV-055은 절단된 HIV-1 gag 유전자, HIV-1 gag SDE로 불리는 (단일 도미넌트 에피토프), 를 포함하는 표준 클로닝 벡터이다. HIV-1 gag SDE의 아미노산 시퀀스는 하기와 같다: 1MVARASVLGGELDRWEKEEERPGGKKKYKLKEEEWASRELERFAVNPGLETSEGCRQ60I-192GGHQAAMQMLKETINEEA210A-333ILKALGPAATLEEMMTACQGVGGYPYDVPDYAPGHKARV363L(SEQ ID NO:51) 숫자들은 본래의 HIV-1 gag 단백질에서 아미노산 자리들을 나타낸다. 펩티드 "AMQMLKETI" (SEQ ID NO:52)는 BALB/c 쥐에서 T-세포 반응의 강한 유도제가 되는 것이 발견되었고 및 HIV-1 gag SDE는 그러므로 다른 벡터 디자인들의 면역원성을 데스트하는 모델 항원으로 이용된다.
먼저, pPBS-HIV-055는 XhoI/NotI 제한 효소들을 이용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-014로부터 유래된 대응하는 벡터 단편과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-013는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-G5-L6-3'를 포함하고 대응하는 rISFV를 생성하는데 이용된다.
플라스미드 pPBS-HIV-055는 XhoI/NotI 제한 효소들을 사용하여 소화되고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-020으로부터 유래된 대응하는 벡터 단편들과 리게이트되었다. 결과 구성 pPBS-HIV-014는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-G5-L6-3'을 포함한다. 그러므로 대응 rISFV 바이러스는 단일 약화 마커-rISFV의 자리 4로 ISFV N 셔플을 포함한다.
PCR 단편은 프라이머 ISF_83 - TTTTTTGCTAGCTTCACCTGCATAATAGTGGCAAC (SEQ ID NO:53) / ISF_69 -AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:54)로 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-HIV-014을 사용하여 생성되었고 pPBS-ISFV-HIV-014로 MluI/NheI를 통해 pPBS-ISFV-HIV-015을 생성하기 위해 삽입되었으며, 이는 곧 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(GΔCT25)5-L6-3'를 포함한다. 그러므로 대응하는 rISFV 바이러스는 두 개의 약화 마커들: (1) rISFV 안티유전체의 자리 4로 ISFV N의 셔플링 및 (2) 25 아미노산들로 ISFV G의 세포질 후미 (CT)의 말단 절단을 포함한다. ISFV G 단백질의 CT 및 트랜스멤브레인 (TM) 도메인들의 정확한 길이는 VSVIN의 것으로서 잘 특징지어지 않지만, 카복시 말단에 근접한 약 18 아미노산 (aa) 소수성 도메인은 ISFV G 단백질 TM 앵커(anchor)로서 예측된다. 잔여 다운스트림 33 aa 잔기들은 G 단백질 CT를 대표한다.
게다가, pPBS-ISFV-033는 BsmBI/MluI 제한효소들을 이용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-HIV-015로부터 유래된 대응 벡터 단편과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-018은 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N*4-(GΔCT25)5-L6-3'를 포함하였다. rISFV-HIV-015와 비교하면, rISFV-HIV-003에 대응하는 코딩된 ISFV N 유전자는 BALB/c 쥐에 대한 알려진, 강한 T 세포 에피토프 내에서 4개의 아미노산들 변화들 K271Q, A272S, L279M, F282M을 가져왔다.
플라스미드 pPBS-ISFV-HIV-015는 MluI/NheI 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-HIV-013으로부터 유래된 대응 벡터 단편과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-017은 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-(GΔCT25)5-L6-3'을 포함하였다. 그러므로 대응 rISFV 바이러스는 단일 약화 마커-ISFV G 세포질 후미의 절단을 포함한다.
마지막으로, 약화된 rISFV 벡터는 절단된 ISFV GΔCT25 유전자가 VSVNJGCT1 유전자, 28 아미노산들의 세포질 후미에서 유사한 절단을 갖는 NJ 혈청형으로부터 변형된 VSV G가 코딩되는, 에 의해 대체되는 것에서 발생되었다. pPBS-ISFV-HIV-016 [뉴클레오티드 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(VSVNJGCT1)5-L6-3'를 포함]을 생성하기 위해, pPBS-VSV-HIV-054 (MluI/NheI 제한 효소 자리들에 측접하는 VSVNJGCT1 유전자를 포함하는 rVSV 클로닝 벡터)는 MluI/NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었다. 분리된 삽입체는 그 다음 pPBS-ISFV-HIV-015로부터 유래된 대응 벡터 단편들과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-016은 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-N2-P3-M4-(VSVNJGCT1)5-L6-3'를 포함하였고 대응 rISFV를 구조하는데 이용되었다.
HIV-1 gag SDE를 발현하는 모든 rISFV들의 약화는 플라크 분석에 의해 in vitro 테스트되었다. 관찰된 플라크 크기들은 하기와 같다 (도 5): rISFV-HIV-013 = rISFV-HIV-14 > rISFV-HIV-15 = rISFV-HIV-017 ≥ rISFV-HIV-018 = rISFV-HIV-016.
상기에서 설명된 rISFV 구성물들에 더하여, 하기 플라스미드들로부터 생성된 두 개의 약화된 rVSV 벡터들이 프라임-부스트 실험들에 사용되었다.
pPBS-VSV-HIV-106는 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(GCT1)5-L6-3'를 포함하고 모든 벡터 유전자들 (P, M, N, G CT1 및 L)은 VSV 인디애나 혈청형으로부터 유래된다. 이 플라스미드로부터 유래된 rVSVIN은 도 16에서 묘사된 연구에 이용되었다.
pPBS-VSV-HIV-122는 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-P2-M3-N4-(GCT1)5-L6-3를 포함하고, 벡터 유전자들 (P, M, N, 및 L)은 VSV 인디애나 혈청형으로부터 유래되며, 그리고 벡터 유전자 G CT1은 VSV NJ 혈청형으로부터 유래된다. 이 플라스미드로부터 유래된 rVSVNJ는 도 16에 묘사한 연구에 이용되었다.
ISFV G의 세포성 후미의 절단 안정화(Stabilizing the truncation of the cytoplasmic tail of ISFV G). ISFV GΔCT25 유전자 (예를 들면, rISFV-HIV-015 및 rISFV-HIV-018)를 포함하는 많은 약화된 rISFV들은 이 약화 마커의 안정성을 결정하기 위해 광범위한 베로 세포 배양에서 계대된다. 계대 10에서 사실상 모든 rISFV들은 필수적으로 rISFV GΔCT23 유전자를 포함하도록 두 개의 아미노산들에 의해 세포질 후미가 확장된다. 그러므로, 테스트된 rISFV들은 ISFV GΔCT25 유전자의 정지 코돈을 아미노산을 위한 코돈으로 변화시키고 그 다음 더 다운스트림의 두 코돈들을 대안적인 정지 코돈 프레임에서 사용하였다(then used an alternative in frame stop codon two codons further downstream). ISFV GΔCT25 - L 유전자 접합(junction)의 두 조작은 그러므로 rISFV에서 약화 마커 ISFV GΔCT25를 안정화하는 그들의 능력을 조사하였다:
A) ISFV GΔCT25를 포함하는 전사 카세트에 대한 전사(밑줄 친(underscored)) 및 번역(굵은(bold)) 중지 신호를 결합:
Figure 112016095649879-pct00005
ISFV GΔCT25의 마지막 아미노산은 아르기닌에서 발린으로 변화된다.
B) ISFV GΔCT25 발현 카세트에 대한 3'-NCR로서 원형의 rVSVIN-N4CT1 벡터들에 존재하는 VSVIN GCT1의 3'-NCR 사용:
Figure 112016095649879-pct00006
결과는 오직 접근 (B)가 베로 세포 배양에서 대응 rISFV 바이러스들의 확장된 계대 동안 ISFV GΔCT25 약화 마커를 안정화시킴을 나타낸다.
접근 A-구성
ISFV GΔCT25-L 유전자 접합을 조종하기 위해, pPBS-ISFV-HIV-018는 MluI/NheI 제한효소들을 사용하여 소화되었고 pPBS-ISFV-049를 생성하기 위해 변형된 pT7Blue 클로닝 벡터 (Novagen)으로부터 유래된 대응 벡터 단편으로 삽입되었다.
먼저, 돌연변이 생성 반응은 프라이머 ISF_140 - CTATTATGCGTATGCGAGACGCGTCTCGTATGAAAAAAACGAATCAACAGAG (SEQ ID NO:58) / ISF_141 - CTGTTGATTCGTTTTTTTCATACGAGACGCGTCTCGCATACGCATAATAGTG (SEQ ID NO:59)로 pPBS-ISFV-049에서 pPBS-ISFV-051을 생성하기 위해 수행되었다. 게다가, PCR 단편은 프라이머 ISF_146 - AATTAACGTCTC AGAGATTGCAGCGAACCCCAGTGCGGCTGCTGTTTCTTTC (SEQ ID NO:60) / ISF_69 - AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:61) 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-031를 사용하여 발생되었다. ISF_144 - TCTCTGTGATCCTGATCATCGGACTGATGAGGCTGCTGCCACTACTGTGCAGGTGAG (SEQ ID NO:62) 및ISF_145 - CTAGCTCACCTGCACAGTAGTGGCAGCAGCCTCATCAGTCCGATGATCAGGATCACA (SEQ ID NO:63)으로부터 발생된 올리고뉴클레오티드 링커와 함께 PCR 단편 (MluI/BsmBI) pPBS-ISFV-056를 생성하기 위해 MluI/NheI를 통해 pPBS-ISFV-049로 삽입되었다. pPBS-ISFV-049와 비교하면, pPBS-ISFV-056에서 뉴클레오티드 시퀀스 코딩 ISFV GΔCT25의 트랜스멤브레인 영역이 조용히 A/T 풍부(richness)를 감소시키도록 변형된다. PCR 단편은 ISF_147 - CTAGGCGCGTCTCGCATACGCACAGTAGTGGCAG (SEQ ID NO:64) / ISF_69 - AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:65) 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-056를 사용하여 발생되었고 pPBS-ISFV-059를 생성하기 위해 MluI/BsmBI를 통해 pPBS-ISFV-051로 삽입된다.
플라스미드 pPBS-ISFV-059는 MluI/AgeI 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-HIV-018로부터 유래된 대응 벡터 단편과 리게이트되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-021는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6-3'을 포함하고, ISFV GΔCT25의 트랜스멤브레인 영역에서 본래의 시퀀스와 비교하여 A/T 풍부를 감소시키기 위해 조용한 뉴클레오티드 변화들을 가지며, ISFV GΔCT25의 중지 코돈은 ISFV GΔCT25-L 유전자 접합에서 전사 중지의 일부이다.
접근 B-구성
플라스미드 pPBS-ISFV-056는 MluI/NheI 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-VSV-HIV-020로부터 유래된 대응 벡터 단편과 리게이트 되었으며, 이것은 첫 번째 전사 카세트로부터 HIV-1 gag를 발현하는 약화된 rVSV vector (N4CT1)의 안티-유전체 시퀀스를 포함한다. 결과 구성 pPBS-ISFV-057는 그러므로 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag)1-VSVP2-VSVM3-VSVN4-ISFVGΔCT255-VSVL6-3'를 포함하고 그에 의해 VSV G CT1의 3'-NCR는 ISFV GΔCT25를 코딩하는 오픈 리딩 프레임과 연결된다.
PCR 단편은 프라이머 ISF_148 - TGTTAGCGTCTCTCATAAAAATTAAAAACTCAAATATAATTG (SEQ ID NO:66) 및ISF_69 - AACAGAGGTCAAACGCGTGTCAAAATGACTTCAGTTTTATTCATG (SEQ ID NO:67) 그리고 주형으로서 pPBS-ISFV-057을 사용하여 생성되었고 pPBS-ISFV-058을 생성하기 위해 MluI/BsmBI을 통해 pPBS-ISFV-051로 삽입된다.
마지막으로, pPBS-ISFV-058는 MluI/AgeI 제한 효소들을 사용하여 소화되었고 분리된 삽입체는 pPBS-ISFV-HIV-018로부터 유래된 대응 벡터 단편과 리게이트 되었다. 결과 구성 pPBS-ISFV-HIV-021은 핵산 시퀀스 5'-(HIV-1 gag SDE)1-N*2-P3-M4-G5-L6-3'를 포함하고, 본래의 시퀀스와 비교하여 A/T 풍부를 감소시키기 위해 ISFV GΔCT25의 트랜스멤브레인 영역에서 조용한 뉴클레오티드 변화들을 가지며, ISFV GΔCT25-L 유전자 접합에서 VSV GCT1의 3'-NCR을 포함한다.
실시예 3
동물 연구들(ANIMAL STUDIES)
일련의 쥐 연구들을 알파바이러스 단백질들을 발현하는 rISFV 벡터들을 포함하는 면역성 조성물들의 관련된 안정성 및 효능을 조사하기 위해 수행하였다. 쥐 두개- 내 (IC) LD50 모델을 수포성바이러스들 및 관련 바이러스들의 알려진 신경병원성 특성들로 인해 벡터 안정성의 1차 평가(primary assessment)를 위해 사용하였다 (Olitsky et al., Journal of Experimental Medicine. 1934, 59:159-71; Frank et al., Am J Vet Res. 1945, Jan:28-38; Sabin et al., Journal of Experimental Medicine. 1937, 66:15-34; Rao et al., Lancet. 2004, 364(9437):869-74). 효능은 엄격한 VEEV 및 EEEV 챌린지 모델들에서 평가하였다.
rISFV 벡터들의 신경병원성. 견본 연구(pilot study)를 비변형된 rISFV 및 HIV-1 gag (rISFV-N4 GΔCT25 HIVgag1)를 발현하는 고도록 약화된 변형의 신경병원성 특성들을 확인하기 위해 수행하였다. 이전 연구들로부터 알려진 LD50과 함께 rVSVINN2CT1 벡터는 양성 대조군으로서 활용되었다 (Clarke et al., J Virol. 2007, Feb;81(4):2056-64). 10 5-주-생의 그룹들, 여성 Swiss Webster 쥐는 각 바이러스의 25 μL의 연속 10배 희석액(serial 10-fold dilution)으로 두개 내 (IC) 루트를 통해 IC 배양되었고 동물들은 21일에 대한 치사율을 관찰하였다. PBS는 주입 공정에 대한 대조군으서 이용하였다 (표 4).
제한된 치사율이 rISFV 벡터들이 주입된 동물들에서 관찰되었고 그 결과 LD50은 결정되지 않을 수 있다(표 4). 대조적으로, rVSVINN2CT1은 이전 연구들에서 결정된 것과 유사한 치사율 및 LD50 (104)을 야기함이 결정되었다 (표 4). 이 데이터는 rISFV가 rVSVIN 보다 선천적으로 낮은 신경 병원성임을 제안하고, 이것은 비변형된 형태에서 LD50의 5-10 플라크 형성 단위 (PFU)로 증명된다 (Clarke et al., J Virol. 2007, Feb;81(4):2056-64).
표 4. Swiss Webster rISFV 및 rVSVIN 벡터들의 LD50 역가
Figure 112016095649879-pct00007
rISFV 벡터들의 보호 효능. 일려의 연구들을 알파바이러스 감염 및 질병에 대항하는 보호를 위한 벡터로서 rISFV의 잠재력을 확인하기 위해 수행하였다. 이 연구들을 위해, 4-6-주-생 여성 CD-1 쥐가 50 μL 용량 볼륨을 사용하여 근육내 루트에 의해 면역화되었다. 쥐는 그 다음 피하로 주입된 VEEV-ZPC 또는 EEEV-FL93의 104 PNU로 공격되었다. 모든 동물들 관리 및 절차들은 Institutional Animal Care and Use Committee 가이드라인들에 따른다.
VEEV 및 EEEV 챌린지에 대한 단기 보호. VEEV-ZPC 또는 EEEV-FL93를 5번 자리에서 코딩하는 rISFV-N4G3 벡터들이 VEEV 및 EEEV로 치명적인 공격에 대해 보호할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, CD-1 쥐의 집단을 벡터들의 108 PNU로 면역화하였고 그 다음 3-4 주 후-면역(post-immunization) 면역성 테스트했다(challenged) (표 5). 면역에 이어, 중화 항체 반응이 rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5로 면역화된 쥐에서 순조롭게 검출되었지만, rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC)5로 면역화된 동물들에서 적은 중화 항체(little neutralizing antibody)가 검출되었다 (표 6, 7). 항체 반응에 관계 없이, 모든 동물들은 치명적인 EEEV-FL93 및 VEEV-ZPC 공격에 대해 보호되었다 (도 6 및 도 7).
표 5. VEEV-ZPC 및 EEEV-FL93 공격 연구들에 대한 연구 디자인
Figure 112016095649879-pct00008
표 6. rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5로 면역화된 쥐에서 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00009
표 7. rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC)5로 면역화된 쥐에서 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00010
용량 적가 및 장기 면역 연구(Dose Titration and Long-term Immunity study). 동물들은 rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 또는 rVSVINN4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5의 108 또는 107 PFU로 면역화되었다 (표 8). 면역 후, VEEV 중화 항체 반응은 가장 rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5-면역화된 동물들에서 모든 용량들로 검출될 수 있다 (표 9). 더 활발한 중화 항체 반응들이 rVSVINN4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5로 면역화된 모든 동물들에서 검출되었다 (표 10). 그러나, 이전 연구에서 관찰된 것과 같이, VEEV에 대한 중화 항체 반응에 상관 없이, 모든 동물들은 치명적인 공격에 따라 보호되었다 (도 8).
표 8. 용량 적가 및 장기 면역 연구 디자인
Figure 112016095649879-pct00011
표 9. rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5로 면역화된 쥐에서 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00012
표 10. rVSVIN-N4G(CT-1)3-(VEEV-ZPCE3-E1)5로 면역화된 쥐에서 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00013
혼합된 면역성 조성물들의 효능. 면역성 조성물이 하나 이상의 알파바이러스로부터 보호를 제공하기 때문에, 연구는 동시에 rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5 및 rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5로 면역화된 동물들이 치명적인 EEEV-FL93 및 VEEV-ZPC 모두에 대한 치명적인 공격에 대해 보호될 수 있는지 조사하기 위해 디자인되었다 (표 11). 이전 연구들에서와 같이, EEEV-FL93 및 VEEV-ZPC 모두에 대한 중화 항체들이 거의 모든 쥐에서 검출되었고 (표 12 및 13) 모든 면역화된 동물들이 치명적인 EEEV-FL93 (도 9) 또는 VEEV-ZPC (도 10) 공격에 대해 보호되었다. 이 결과는 혼합된 면역성 조성물들이 다중 알파바이러스들로부터의 치명적인 공격에 대한 보호를 제공할 수 있음을 증명한다.
표 11. 혼합된 면역 연구 디자인
Figure 112016095649879-pct00014
*그룹 1 동물들은 각 바이러스의 108 pfu로 면역화되었다.
표 12. rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5 및 rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5로 면역화된 쥐에서 EEEV-FL93에 대한 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00015
표 13. rISFV-N4G3-(EEEV-FL93 E3-E1)5 및 rISFV-N4G3-(VEEV-ZPC E3-E1)5로 면역화된 쥐에서 VEEV-ZPC에 대한 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00016
실시예 4
BALB/c 쥐에서 rVSV 및 rISFV 벡터들로 프라임/부스트 연구 PBS-Mu-062
일련의 쥐 연구들을 Balb/c 쥐에서 HIV Gag 단일 도미넌트 에피토프 (SDE)를 코딩하는 rVSV 및 rISFV를 사용하는 프라임/부스트 요법을 평가하기 위해 수행하였다. 이 연구들은 두 연구 목적들: (a) PBS-Mu-062a: 쥐에서 두 새로운 rISFV-HIV gag SDE 벡터들의 면역원성 연구하기 위해, 그리고 rVSVINN4CT1Gag로 미래 프라임/부스트 연구를 위한 바람직한 후보를 선택하기 위해, 및 (b) PBS-Mu-062b: rVSVNJ/rVSVIN 및 rISFV/rVSVIN의 프라임/부스트 결합을 이용한 유도된 면역반응들을 비교하기 위해, 을 충족하도록 설계되었다.
PBS-Mu-062a: 이 연구를 위해, 두 후보자 rISFV-기반 HIV gag 발현 벡터들의 상대적인 면역원성을 rVSVIN 기반 HIV gag-발현 벡터들의 미래 프라임/부스트 연구들에 가장 면역원성인 구성의 발전(advancing)을 목표로 비교하였다. PBS-Mu-062a 연구의 요약은 도 13에서 제공한다. 이 연구를 위해, BALB/c 쥐 (n=5/그룹)는 도 12에서 개설된 HIV gag-발현 벡터들의 107 pfu를 근육내로 주사하여 면역화되었고 10일 후, 비장 세포(splenocytes)를 회수하였고 HIV gag SDE 및 rVSVIN N 펩티드 풀-특이(pool-specific) IFN-γ 분비를 ELISpot 분석으로 테스트하였다 (도 14). 이 연구에서, rISFV-HIV-016 (rISFV)으로 면역화는 평균 236±74 SFC/106 비장세포의 HIV gag SDE-특이 인터페론-γ ELISpot 반응을 가져오고, 반응은 다른 rISFV-HIV gag 후보 rISFV-HIV-018 (rISFVN*)에 의해 유도된 HIV gag SDE-특이 ELISpot 반응 (147±32 SFC/106 비장세포) 보다 크게 다르지 않다 (도 14, 왼쪽). 중대하게, 벡터 rISFV-HIV-018은, 알려진 H2d-제한된 에피토프에서 일련의 돌연변이들을 갖는 바이러스 N 단백질을 코딩함, 야생형 바이러스 N 유전자를 코딩하는 rISFV-HIV gag 후보 rISFV-HIV-016 (140±59 SFC/106 비장 세포)과 비교하여 안티-벡터 rVSVIN N 펩티드-풀 ELISpot 반응들 (45±15 SFC/106 비장 세포)을 끌어내는 감소된 경향을 나타냈다 (도 14, 오른쪽). 이 결과들에 근거하여, rISFVN* (rISFV-HIV-018)이 후속 rVSV/rISFV 프라임/부스트 실험들에 사용되도록 선택된다.
PBS-Mu-062b: 이 실험을 위해, rISFV 및 rVSV 기반 벡터들의 조합 대(versus) rVSV 기반 벡터들을 배타적으로 사용하여 다양한 프라임/부스트 면역 요법들의 상대적인 면역원성을 비교하였다. PBS-Mu-062b 연구 디자인을의 요약은 도 16에 나타낸다. 이 실험을 위해, BALB/c 쥐 (n=5/그룹)는 도 15에서 개설된 rISFV HIV gag SDE 발현 벡터들을 rVSVIN HIV gag SDE 구성과 함께 107 pfu를 근육내로 주사하여 면역화 되었다 (도 12). 쥐는 0 및 4주의 스케쥴에 따라 면역화 되었다. 마지막 면역화 후 1주, 비장 세포가 회수되었고 HIV gag SDE-특이 (도 17) 및 rVSVIN N 펩티드 풀-특이 (도 18) IFN-γ 분비를 ELISpot 분석하여 테스트 하였다. 이 연구에서, rVSVNJ/rVSVIN 프라임/부스트 요법으로 면역화된 쥐는 이종 rISFVN*/rVSVIN 프라임/부스트 요법으로 면역화된 쥐에서 나타나는 반응(4,758±183 SFC/106 비강 세포) 보다 크게 낮은 (p<0.05) HIV gag SDE-특이 ELISpot 반응 (2,330±412 SFC/106 비강 세포)를 증명했다 (도 17). HIV gag SDE-특이 IFN-γ ELISpot 반응에서 rVSVNJ/rVSVIN 면역된 쥐와 비교하여 상당한 두 배 증가(significant two-fold increase)는 이종 요법의 순서의 변화에 의해 영향을 받지 않았거나 (rVSVIN/rISFVN*; 5,870±1,258 SFC/106 비강 세포) 또는 rISFV 벡터에서 야생형 바이러스 N 유전자의 존재에 의해 영향을 받지 않았다 (rISFV/ rVSVIN; 5,061±890 SFC/106 비강 세포) (도 17). 도 18에서 나타낸 것과 같이, 이종 rISFVN*/rVSVIN 및 rVSVIN/rISFVN* 프라임/부스트 요법들은 rVSVNJ/rVSVIN (2,794±456 SFC/106 비강 세포) 또는 rISFV/rVSVIN (1,459±238 SFC/106 비강 세포)요법과 비교하여 상당히 낮은 (<0.05) 평균 rVSVIN N 펩티드 풀-특이 IFN-γ ELISpot 반응들 (각각 451±67 및 408±55 SFC/106 비강 세포)을 유도했다.
상기 언급된 연구들은 명확하게 이종 rISFV/rVSVIN 및 rVSVIN/rISFV 프라임/부스트 면역화 요법들이 쥐에서 rVSVNJ/rVSVIN 면역화 요법이 했던 것 보다 상당히 높은 IFN-γ ELISpot 반응들을 유도했음을 입증한다. 게다가, rISFV N* 돌연변이는 rVSV N에 대한 교차반응성(cross-reactive)이 감소되었고, 하지만 이는 HIV gag SDE-특이 IFN-γ ELISpot 반응의 증가를 초래하지 않았다.
실시예 5
A129 쥐에서 치군군야 바이러스 당단백질 발현 rISFV 벡터의 연구(Study of rISFV Vector Expressing Chikungunya Virus Glycoprotein in A129 Mice)
치군군야 바이러스 (CHIKV)는 토가바이러스과(Togaviridae family) 알파바이러스 속의 모기 매개 바이러스(mosquito borne virus)이다. 인간에서 CHIKV 감염은 고열, 두통, 구토, 피부 발진 및 고통스런 관절염(painful arthritis)을 가져온다. 관절염은, 몇 달 또는 심지어 몇 년동안 지속될 수 있음 (Powers and Logue. J. Gen. Virol. 2007, 88:2363-2377), 일반적으로 자기-제한(self-limiting) CHIKV 감염의 특징이다. 그러나, 최근 인도양 섬들 및 인도 대륙에서의 전염병에서, 150만명 이상 감염시킴, 일부 사람들은 뇌염, 출형성질병(hemorrhagic disease), 및 사망(mortality)을 포함하는 보다 심각한 증상들을 나타냈다 (Schwartz and Albert. Nature Rev. Microbiol. 2010, 8:491-500). 카리브해 섬들 및 아메리카에서 CHIKV의 더 최근이고 급속한 확산 (Powers. J. Gen. Virol. 2015, 96:1-5)은 CHKIV에 대한 면역성 조성물들에 대한 더욱 더 긴급한 필요를 발생시켰다.
CHIKV는 단일, 양성 센스, 11.8 kb RNA 유전체, 4개의 비구조 단백질들 (nsP 1-4) 및 5개의 구조 단백질들 (C, E3-E2-6K-E1)를 가진다. 구조 단백질들은 캡시드 및 엔벨로프 당단백질들을 생성하기 위해 전구체로부터 절단된다 (Strauss and Strauss. Microbiol. Rev. 1994, 58:491-562). 안정한 헤테로다이머(heterodimer) 및 E2-E1 헤테로다이머들로부터의 E2 및 E1 단백질들은 바이러스 표면에서 발견되는 스파이크(spike)를 형성하도록 상호작용한다. E2는 E2 및 E3로 절단되는 PE2 또는 p62로 불리는 전구체로서 형성된다. E2 및 E1 사이의 링커로서 생성되는 6K라 불리는 작은 소수성 펩티드가 있다. E3-E2-6K-E1 폴리단백질이 처리될 때, E2 및 E1 당단백질들이 생성되고, 이것은 그 다음 E2-E1 당단백질 헤테로다이머들을 형성한다 (Strauss and Strauss. pages 497-499).
E2-E1 당단백질을 발현 약화된 rISFV 벡터를 구성하는 시작점은 pVSVΔG-CHIKV 디자인된 플라스미드이고, 이것은 John Rose (Yale University)로부터 얻었다 (Chattopadhyay et al. J. Virol. 2013, 87:395-402). 이 플라스미드는 rVSV 유전체 cDNA 내에 VSV G 유전자에 놓인 치군군야 E3-E2-6K-E1 유전자 시퀀스 (Genscript, Inc.)를 포함했고 최적화했다. CHIKV- E3-E2-6K-E1 시퀀스는 하기 프라이머들을 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다:
Primer Alpha_001: GGGCCCA CTCGAG AACATGAGCCTGGCCATCCCCGTG (XhoI 자리 및 Kozak 시퀀스 포함함) (SEQ ID NO:69)
Primer Alpha_002: 61/(NotI 자리 및 NheI 자리 포함함) (SEQ ID NO:70)
결과 PCR 산물은 Xho/NotI 제한 효소들로 소화되었고 rVSVN4CT1 벡터 cDNA로 복제되었다. 이 벡터 cDNA는 그 다음 Xho/NotI 제한 효소들로 증폭되었고 소화되었으며 CHIKV-E3-E2-6K-E1 단백질들을 코딩하는 방출된 삽입체는 Xho/NotI 소화된 pPBS-ISFV-HIV-015로 복제되었다 (상기 실시예 2에서 설명됨). CHIKV-E3-E2-6K-E1 단백질을 코딩하는 재조합 ISFV (rISFV)는 그 다음 상기 실시예 1에서 설명된 것과 같은 pDNA로부터 구조되었다. 결과는 rISFV 유전체의 첫 번째 자리로부터 CHIKV-GP을 발현하는 pPBS-ISF-Alpha-003 바이러스 디자인된 rISFV-N4 G-CTΔ25(CHIKV GP)1(rISFV-N4 G-CTΔ25(CHIKV GP)1 designated pPBS-ISF-Alpha-003 virus)이고, 여기서 CHIKV-GP는 CHIKV-E3-E2-6K-E1를 대표한다.
구조된 바이러스는 Vero E6 세포 단층들 (ATCC CCL-81)에서 정제되고 증폭된 플라크이다. 동물 연구들을 위해, 바이러스 벡터는 10% 수크로오스 쿠션(sucrose cushion)을 통한 원심분리에 의해 감염된 BHK-21(ATCC CCL-10) 세포 상등액으로부터 정제되었다. 정제된 바이러스는 PBS, pH 7.0 에서 재현탁되었고, 수크로오스 포스페이스(sucrose phosphate) (SP) 안정화제 (7mM K2HPO4, 4mM KH2PO4, 218mM 수크로오스)와 혼합되었으며, 에탄올/드라이 아이스에서 스냅 동결(snap frozen) 및 -80 ℃에서 사용할 때까지 저장되었다.
연구는 첫 번째 자리로부터 CHIKV-GP을 발현했던 상기에서 설명된 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1 벡터를 포함하는 면역성 조성물의 효능 및 안정성을 조사하기 위해 수행하였다. 1형 인터페론에 대한 수용체가 결실된 11-21로 번호화된 쥐 (A129 쥐)를 그들의 왼쪽 발바닥에 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1의 1 X 107 pfu로 면역화하였다. 오른쪽 발바닥은 대조군으로서 제공하기 위해 주사하지 않았다. 1-10으로 번호화 된 A129 쥐는 다른 대조군들로서 면역화하지 않았다. 모든 21 쥐들은 왼쪽 발바닥에 CHIKV의 레위니옹 분리(LaReunion isolate)의 10 μl 용량의 1 X 104 pfu로 주사하였고 팽윤을 측정하였다. 오른쪽 발바닥 높이(height) 또한 내부 대조군(internal control)로서 측정하였다. 왼쪽 발의 발바닥 높이들은 주사 당일에 하지 않았다. 이전 데이터는 왼쪽 및 오른쪽 발의 크기들이 동일했다.
도 19에서 나타낸 바와 같이, rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된 쥐 11-21은 공격 후 그들의 체중들을 유지했고, 반면 비면역화된 쥐는 4일 후-공격을 통해 중량이 감소했다.
도 20에서 나타낸 바와 같이, 면역화된 쥐 11-21은 3일에 작은(minor) 왼쪽 발바닥 팽윤을 가졌고 이것는 5일에 해결되었다. 대조적으로, 비면역화된 쥐 1-10은 왼쪽 발바닥 팽윤을 가졌고 이것은 4일 동안 계속 증가했다. 쥐의 양쪽 그룹들은 오른쪽 발바닥 팽윤이 없었다.
도 21에서 나타낸 바와 같이, 면역화된 쥐 11-21은 1일 또는 2일에 혈액에서 바이러스 혈증(viremia)이 없음을 증명했다 [100 pfu/ml의 검출 한계 이하]. 대조적으로, 비면역화된 쥐 1-10은 1일에 바이러스 혈증의 증상들을 가졌고, 이것은 2일에 거의 1 X 107 pfu/ml로 증가했다.
3일에, 모든 비면역화된 쥐는 발바닥 팽윤, 헝클어진 털(ruffled fur) 및 무기력(lethargy) 포함하는 질병(illness)의 증상들을 나타냈다. 대조적으로, 모든 면역화된 쥐는 외관 및 행동에서 정상적이었다. 도 22에서 나타낸 바와 같이, 5일에, 모든 10 비면역된 쥐는 질병에 굴복했다. 대조적으로, 모든 11 면역된 쥐는 질병의 증상들 없이 살아남았다.
모든 rISFV-N4G-CTΔ25(CHIKV GP)1로 면역화된 쥐는 표 14에 나타낸 바와 같이(굵은 숫자들은 양성 결과를 나타낸다) 1일, 7일, 및 21일 후-면역된 혈청(sera)으로부터 플라크 감소 중화 역가들 (PRNT80)에 의해 결정된 것과 같이 21일에 혈청전환되었다(seroconverted):
표 14. 치군군야 당단백질을 발현하는 rISFV로 면역화된 쥐에서 CHIKV에 대한 중화 항체 반응
Figure 112016095649879-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Nasar, Farooq Matassov, Demetrius Gorchakov, Rodion V. Hamm, Stefan V. Nowak, Rebecca V. Seymour, Robert L. Eldridge, John H. Tesh, Robert B. Clarke, David K. Weaver, Scott C. <120> Recombinant Isfahan Viral Vectors <130> UTMB0395USP1 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11088 <212> DNA <213> Isfahan Virus <400> 1 acggagaaaa acaaaccaat tcacgcatta gaagattcca gaggaaagtg ctaacaggga 60 tcaaaatgac ttctgtagta aagaggattg ctactggctc aagtgtgttg gcagtactac 120 ccgccaatga agaccctgta gagtttccag gggactattt tttgcaaaat ccgggaaaaa 180 taagggtgtg catcaacaga aaattagacg ttgccacact ccgccaatac gtctacgagg 240 gactaaaaaa tggggatgtc catgtgtgtc acatcaattc atacctgtac caggtgctca 300 aagacaccag agatgaggcc caaagtgatt ggatatcttt cggagtgtcc cttgcagtca 360 aaggtggcat tgtcagtgta tttgacaccc ttatgattga ggattacagg ggagaggctc 420 cggatgggag gaaatgcgat ggaagaacca tcgacgatga caaatggctg ccaatgttaa 480 tcctcggcct atacagggtg tcgagagcga cacaagaaga ctacaaaaag tcactactgc 540 agaaactcta cgctcagtgc aagctgagga gtcctcaagc tgaagaatta gttgaagacg 600 cagcagaatt ttatgaagtt tggtccaatg attcaaactt cctaaaattg gttgcagcaa 660 ttgacatgtt ctttcacaaa ttcaaaaacc atgcagatgc aggcttgaga 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aacaataccc aagacaacag attgaagaag ttgtgtacag cattcggaaa tcccaaaatt 7500 gctcaattcc gctattcgca catagagaaa ttgttggaag atcctacgag cttgaatata 7560 tcgatgggca tgagtgcagc caacctgttg aagagcgaaa ttaagaagaa ccttctgcgg 7620 aaaagaagga ctattgggaa tagcattgtt agggacgccg taacctatat acactctgaa 7680 gacgaaaaga tcagatctta cttgtggagt ataaatcctc tattccccag atttttgagt 7740 gaattcaaat caggcacttt catgggagtt gcatctagtg tggtcagcct atttcagaac 7800 tccagaacca ttagaaatgt ttttaaagat tatatgagtt ctgcgattga tgagttgatt 7860 accaaaagtg aagtgaactc cttggagcat ttgtgtaaat ataagggtgt ccgcaatttc 7920 gatcaagtct ggaaatgttc tgctagccag gctgattatt tgaggagatt atcctggggt 7980 agaaaagttc ttgggactac aatccctcat ccattagaaa tgcttggagc gggcacaatc 8040 aagaataatt cctccacttg ttgtgagcat tccggccagg attacatctc ggtattttgt 8100 cccaaaggaa taagcaatgt gctcatagaa agaggcccta tggcagcata cctagggtca 8160 aaaacatctg agtctacttc tattcttcaa ccatgggaga aagagagcaa aatcccgatc 8220 atcaaaagag ctactcgatt aagagatgcc attcattggt ttgtggagcc aagctccaac 8280 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tcccatgttc aagacggtcg acttagttca 10200 aacagaattt agtagttctc aaacgtctga agtatatatg gtatgtaaag gtttgaagaa 10260 attaatcgat gaacccaatc ccgattggtc ttccatcaat gaatcctgga aaaacctgta 10320 cgcattccag tcatcagaac aggaatttgc cagagcaaag aaggttagta catactttac 10380 cttgacaggt attccctccc aattcattcc tgatcctttt gtaaacattg agactatgct 10440 acaaatattc ggagtaccca cgggtgtgtc tcatgcggct gccttaaaat catctgatag 10500 acctgcagat ttattgacca ttagcctttt ttatatggcg attatatcgt attataacat 10560 caatcatatc agagtaggac cgatacctcc gaacccccca tcagatggaa ttgcacaaaa 10620 tgtggggatc gctataactg gtataagctt ttggctgagt ttgatggaga aagacattcc 10680 actatatcaa cagtgtttag cagttatcca gcaatcattc ccgattaggt gggaggctgt 10740 ttcagtaaaa ggaggataca agcagaagtg gagtactaga ggtgatgggc tcccaaaaga 10800 tacccgaact tcagactcct tggccccaat cgggaactgg atcagatctc tggaattggt 10860 ccgaaaccaa gttcgtctaa atccattcaa tgagatcttg ttcaatcagc tatgtcgtac 10920 agtggataat catttgaaat ggtcaaattt gcgaagaaac acaggaatga ttgaatggat 10980 caatagacga atttcaaaag 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1575 Glu Ile Arg His Ala Cys Lys Phe Gly Ile Ala Lys Asp Asn Asn 1580 1585 1590 Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro Trp Gly Arg Glu Ser Arg Gly Thr 1595 1600 1605 Ile Thr Thr Ile Pro Val Tyr Tyr Thr Thr Thr Pro Tyr Pro Lys 1610 1615 1620 Met Leu Glu Met Pro Pro Arg Ile Gln Asn Pro Leu Leu Ser Gly 1625 1630 1635 Ile Arg Leu Gly Gln Leu Pro Thr Gly Ala His Tyr Lys Ile Arg 1640 1645 1650 Ser Ile Leu His Gly Met Gly Ile His Tyr Arg Asp Phe Leu Ser 1655 1660 1665 Cys Gly Asp Gly Ser Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu Leu Arg Glu 1670 1675 1680 Asn Val His Ser Arg Gly Ile Phe Asn Ser Leu Leu Glu Leu Ser 1685 1690 1695 Gly Ser Val Met Arg Gly Ala Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala Leu 1700 1705 1710 Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu Thr 1715 1720 1725 Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp Asp 1730 1735 1740 Tyr Phe Leu Arg Leu Lys Ala Gly Leu Gly Leu Gln Ile Asp Leu 1745 1750 1755 Ile Val Met Asp Met Glu Val Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu Lys 1760 1765 1770 Ile Glu Thr Asn Val Arg Asn Tyr Val His Arg Ile Leu Asp Glu 1775 1780 1785 Gln Gly Val Leu Ile Tyr Lys Thr Tyr Gly Thr Tyr Ile Cys Glu 1790 1795 1800 Ser Glu Lys Asn Ala Val Thr Ile Leu Gly Pro Met Phe Lys Thr 1805 1810 1815 Val Asp Leu Val Gln Thr Glu Phe Ser Ser Ser Gln Thr Ser Glu 1820 1825 1830 Val Tyr Met Val Cys Lys Gly Leu Lys Lys Leu Ile Asp Glu Pro 1835 1840 1845 Asn Pro Asp Trp Ser Ser Ile Asn Glu Ser Trp Lys Asn Leu Tyr 1850 1855 1860 Ala Phe Gln Ser Ser Glu Gln Glu Phe Ala Arg Ala Lys Lys Val 1865 1870 1875 Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Gly Ile Pro Ser Gln Phe Ile Pro 1880 1885 1890 Asp Pro Phe Val Asn Ile Glu Thr Met Leu Gln Ile Phe Gly Val 1895 1900 1905 Pro Thr Gly Val Ser His Ala Ala Ala Leu Lys Ser Ser Asp Arg 1910 1915 1920 Pro Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Met Ala Ile Ile 1925 1930 1935 Ser Tyr Tyr Asn Ile Asn His Ile Arg Val Gly Pro Ile Pro Pro 1940 1945 1950 Asn Pro Pro Ser Asp Gly Ile Ala Gln Asn Val Gly Ile Ala Ile 1955 1960 1965 Thr Gly Ile Ser Phe Trp Leu Ser Leu Met Glu Lys Asp Ile Pro 1970 1975 1980 Leu Tyr Gln Gln Cys Leu Ala Val Ile Gln Gln Ser Phe Pro Ile 1985 1990 1995 Arg Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Gly Gly Tyr Lys Gln Lys Trp 2000 2005 2010 Ser Thr Arg Gly Asp Gly Leu Pro Lys Asp Thr Arg Thr Ser Asp 2015 2020 2025 Ser Leu Ala Pro Ile Gly Asn Trp Ile Arg Ser Leu Glu Leu Val 2030 2035 2040 Arg Asn Gln Val Arg Leu Asn Pro Phe Asn Glu Ile Leu Phe Asn 2045 2050 2055 Gln Leu Cys Arg Thr Val Asp Asn His Leu Lys Trp Ser Asn Leu 2060 2065 2070 Arg Arg Asn Thr Gly Met Ile Glu Trp Ile Asn Arg Arg Ile Ser 2075 2080 2085 Lys Glu Asp Arg Ser Ile Leu Met Leu Lys Ser Asp Leu His Glu 2090 2095 2100 Glu Asn Ser Trp Arg Asp 2105 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 gtgcgtggaa gaccggtacc tcccatttgg 30 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 taatgttatt gccggcgaat tcgaaactga ataaatc 37 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 aataacatta ctcgagttcg gtacctccca tttgg 35 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 caactttaaa ttcgaaactg aataaatcta tc 32 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 taatacgact cactatagg 19 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 acggagaaaa acaaaccaat tcacgc 26 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 ttgagcacct ggtacaggta tgaattgatg tgacac 36 <210> 20 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 gcgtgaattg gtttgttttt ctccgtccta tagtgagtcg tattagccgg cctcgagtaa 60 attaatt 67 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 ttgagcacct ggtacaggta tgaattgatg tgacac 36 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 cgtattagcc ggcctcgagt aaattaatt 29 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 aatctggacg cgtctcgcta gtcaggctga ttatttgagg 40 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 ttgatatttc cccaactcta c 21 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 cgcatgccgt ctccttatgt tgattg 26 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 agcattcatt ataagtatga c 21 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 gcttttcaca gatgaagcta gctgaaagta tgaaaaaaac g 41 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 gtttttttca tactttcagc tagcttcatc tgtgaaaagc ttg 43 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 aacagaggtc aaacgcgtgt caaaatgact tcagttttat tcatg 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gaataaaact gaagtcattt tgacacgcgt ttgacctctg ttaat 45 <210> 31 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 cagctggcgg ccgctaggaa ttcaaatcaa catatatgaa aaaaatcaac agagatacaa 60 caatg 65 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 acatagtggc attgtgaaca g 21 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 cgcatgccgt ctccttatgt tgattg 26 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 agtcataccg gtctcgttaa tttttttcat atctttcttc tgcatgttat aattc 55 <210> 35 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 tcgagaacgc gtttgacctc tgttaatttt tttcatatat gttgatttga attc 54 <210> 36 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 attccaacgc gtctcgttaa cagggatcaa aatgacttct gtagtaaag 49 <210> 37 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 gcttttcaca gatgaagcta gcgcatgcgg ccgctgaaag tatgaaaaaa acg 53 <210> 38 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 gtttttttca tactttcagc ggccgcatgc gctagcttca tctgtgaaaa gcttg 55 <210> 39 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 ctagctgaaa gtatgaaaaa aattaacaga ggtcaaactc gaggatatcg gtaccgaagg 60 cgcgcccagc tgtgcggcc 79 <210> 40 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggccgcacag ctgggcgcgc cttcggtacc gatatcctcg agtttgacct ctgttaattt 60 ttttcatact ttcag 75 <210> 41 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 gaattcctcg agttgacctc tgttaatttt tttcatatat gttgatttga attc 54 <210> 42 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 gatgaagcta gctgaaagta tgaaaaaaat taacagggat caaaatgact tctgtag 57 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 atcattcctt tatttgtcag c 21 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 tatatggcta gcgaagacag agggatcaaa atgtctcgac tcaaccaaat 50 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 ctagcccggc taatacgact cactatagga cggagaaaaa caaa 44 <210> 46 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 ttggtttgtt tttctccgtc ctatagtgag tcgtattagc cggcg 45 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 ccaattcacg cattagaaga ttccagagga aagtgctaac 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 ccctgttagc actttcctct ggaatcttct aatgcgtgaa 40 <210> 49 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 gaaagacaag aagtggacca gagcgattcc tacatgcctt acatgattga tatggggatc 60 tcaaccaaat c 71 <210> 50 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 ggttgagatc cccatatcaa tcatgtaagg catgtaggaa tcgctctggt ccacttcttg 60 tctttctttc 70 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 51 Met Val Ala Arg Ala Ser Val Leu Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu 1 5 10 15 Lys Glu Glu Glu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Glu Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly 35 40 45 Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Gly Gly His Gln Ala Ala 50 55 60 Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Ile Leu Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln 85 90 95 Gly Val Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Pro Gly His 100 105 110 Lys Ala Arg Val Leu 115 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 52 Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 53 ttttttgcta gcttcacctg cataatagtg gcaac 35 <210> 54 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 aacagaggtc aaacgcgtgt caaaatgact tcagttttat tcatg 45 <210> 55 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 gtgcgtatga aaaaaacgaa tcaacagagt tcatcatgga tgagtactct gaagaaaagt 60 ggggcgattc 70 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Met Asp Glu Tyr Ser Glu Glu Lys Trp Gly Asp 1 5 10 <210> 57 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 gtgcaggtga gctagccgcc tagccagatt ctatgtttgg accaaatcaa cttgtgatac 60 catgctcaaa gaggcctcat tatatttgag tttttaattt ttatgaaaaa aacgaatcaa 120 cagagttcat catggat 137 <210> 58 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 ctattatgcg tatgcgagac gcgtctcgta tgaaaaaaac gaatcaacag ag 52 <210> 59 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 ctgttgattc gtttttttca tacgagacgc gtctcgcata cgcataatag tg 52 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 aattaacgtc tcagagattg cagcgaaccc cagtgcggct gctgtttctt tc 52 <210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 aacagaggtc aaacgcgtgt caaaatgact tcagttttat tcatg 45 <210> 62 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 tctctgtgat cctgatcatc ggactgatga ggctgctgcc actactgtgc aggtgag 57 <210> 63 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 ctagctcacc tgcacagtag tggcagcagc ctcatcagtc cgatgatcag gatcaca 57 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 64 ctaggcgcgt ctcgcatacg cacagtagtg gcag 34 <210> 65 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 aacagaggtc aaacgcgtgt caaaatgact tcagttttat tcatg 45 <210> 66 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 tgttagcgtc tctcataaaa attaaaaact caaatataat tg 42 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 67 aacagaggtc aaacgcgtgt caaaatgact tcagttttat tcatg 45 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Thosea asigna virus <400> 68 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro

Claims (25)

  1. SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질을 코딩하는 N 단백질 유전자, SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질을 코딩하는 P 단백질 유전자, SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질을 코딩하는 M 단백질 유전자, SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 갖는 G 단백질을 코딩하는 G 단백질 유전자, 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 코딩하는 L 단백질 유전자를 포함하고; 및
    이종(heterologous) 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 더 포함하는,
    재조합 복제 가능 이스파한 바이러스(recombinant replication competent Isfahan virus).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이스파한 바이러스는, (ⅰ) 전사 시작 신호 및 전사 정지 신호에 플랭크되고(flanked), (ⅱ) 상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 이종 전사 단위(heterologous transcription unit)를 포함하고,
    상기 이종 전사 단위는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 번째 유전자로 위치하는
    이스파한 바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이종 폴리뉴클레오티드는 면역성(immunogenic) 폴리펩티드를 코딩하는,
    이스파한 바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이종 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 항원(antigens)을 코딩하는,
    이스파한 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항원은 바이러스 항원(viral antigen), 박테리아 항원(bacterial antigen), 종양-특이(tumor-specific) 또는 암(cancer) 항원, 기생(parasitic) 항원 또는 알레르기원(allergen)인,
    이스파한 바이러스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항원은 바이러스 항원인.
    이스파한 바이러스.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 이스파한 바이러스 유전체(genome)의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6번 자리에 위치하는,
    이스파한 바이러스.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 N 단백질 유전자는 이스파한 바이러스 유전체의 1, 2, 3, 4 또는 5번 자리에 위치하는,
    이스파한 바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 G 단백질 유전자는 카복시-말단 절단(carboxy-terminal truncation)을 갖는 G 단백질을 코딩하는,
    이스파한 바이러스.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 G 단백질은 20 내지 25개의 아미노산의 카복시-말단 절단을 갖는,
    이스파한 바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 상기 이스파한 바이러스 유전체의 5번 자리에 위치하고 상기 N 단백질은 상기 이스파한 바이러스 유전체의 4번 자리에 위치하는,
    이스파한 바이러스.
  12. 제1항의 이스파한 바이러스를 포함하는,
    숙주 세포(host cell).
  13. SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질을 코딩하는 N 단백질 유전자, SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질을 코딩하는 P 단백질 유전자, SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질을 코딩하는 M 단백질 유전자, SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 갖는 G 단백질을 코딩하는 G 단백질 유전자, 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 코딩하는 L 단백질 유전자를 포함하고 이종(heterologous) 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스 더 포함하는 재조합 복제 가능 이스파한 바이러스;
    및 약학적으로 허용 가능한 희석제(diluent), 첨가제(excipient) 또는 캐리어(carrier)를 포함하는,
    면역성 조성물(immunogenic composition).
  14. 제13항에 있어서,
    상기 이스파한 바이러스는, (ⅰ) 전사 시작 신호 및 전사 정지 신호에 의해 플랭크되고(flanked), (ⅱ) 상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 이종 전사 단위(heterologous transcription unit)를 포함하고,
    상기 이종 전사 단위는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 번째 유전자로 위치하는,
    면역성 조성물.
  15. 삭제
  16. 포유류 대상체에서 항원-특이 면역 반응을 유도하기 위한 면역(immunization) 키트로서, 상기 키트는:
    (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질을 코딩하는 N 단백질 유전자, SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질을 코딩하는 P 단백질 유전자, SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질을 코딩하는 M 단백질 유전자, SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 갖는 G 단백질을 코딩하는 G 단백질 유전자, SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 코딩하는 L 단백질 유전자, 및 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 코딩하는 재조합 복제 가능 이스파한 바이러스로서, 여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 이종 폴리펩티드를 코딩하고(encoding), 여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 (i) 전사 시작 신호 및 전사 중지 신호에 측접하고, (ii) 이종 폴리펩티드를 코딩하는, 재조합 복제 가능 이스파한 바이러스; 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어를 포함하는, 프라이밍(priming) 조성물; 및
    (b) N 단백질 유전자, P 단백질 유전자, M 단백질 유전자, G 단백질 유전자, 및 L 단백질 유전자, 및 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 코딩하는(encoding) 재조합 복제 가능 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)로서, 여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 (i) 전사 시작 신호 및 전사 중지 신호에 측접하고, (ii) 이종 폴리펩티드를 코딩하는, 재조합 복제 가능 수포성 구내염 바이러스; 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어를 포함하는, 부스팅(boosting) 조성물을 포함하는,
    키트.
  17. 삭제
  18. 포유류 대상체에서 항원-특이 면역 반응을 유도하기 위한 면역(immunization) 키트로서, 상기 키트는:
    (a) N 단백질 유전자, P 단백질 유전자, M 단백질 유전자, G 단백질 유전자, L 단백질 유전자, 및 이종 전사 단위(heterologous transcription unit)를 코딩하는(encoding) 재조합 복제 가능 수포성 수포성 구내염 바이러스(VSV)로서, 여기서 상기 이종 전사 단위는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하며, 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 (ⅰ) 전사 시작 신호 및 전사 정지 신호에 의해 플랭크되고(flanked), (ⅱ) 이종 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 이종 전사 단위는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 번째 유전자로 위치하는, 재조합 복제 가능 수포성 수포성 구내염 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어를 포함하는, 프라이밍(priming) 조성물; 및
    (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질을 코딩하는 N 단백질 유전자, SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질을 코딩하는 P 단백질 유전자, SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질을 코딩하는 M 단백질 유전자, SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 갖는 G 단백질을 코딩하는 G 단백질 유전자, SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 코딩하는 L 단백질 유전자, 및 이종 전사 단위(heterologous transcription unit)를 포함하는 재조합 복제 가능 이스파한 바이러스(ISFV)로서, 여기서 상기 이종 전사 단위는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 (ⅰ) 전사 시작 신호 및 전사 정지 신호에 의해 플랭크되고(flanked), (ⅱ) 상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하며, 상기 이종 전사 단위는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 번째 유전자로 위치하는, 재조합 복제 가능 이스파한 바이러스; 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 첨가제 또는 캐리어를 포함하는, 부스팅(boosting) 조성물을 포함하는,
    키트.
  19. 삭제
  20. SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 갖는 N 단백질을 코딩하는 N 단백질 유전자, SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 갖는 P 단백질을 코딩하는 P 단백질 유전자, SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 갖는 M 단백질을 코딩하는 M 단백질 유전자, 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 갖는 L 단백질을 코딩하는 L 단백질 유전자를 포함하는,
    재조합 복제 가능 이스파한 바이러스.
  21. 제20항에 있어서,
    이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 더 포함하고, 여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 이종 폴리펩티드를 코딩하는(encoding),
    재조합 복제 가능 이스파한 바이러스.
  22. 제20항에 있어서,
    이종 바이러스 표면 단백질 유전자를 추가로 포함하며, 여기서 상기 이종 바이러스 표면 단백질 유전자는 이스파한 바이러스 G 단백질 유전자를 대체하는(replace),
    재조합 복제 가능 이스파한 바이러스.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 이종 바이러스 표면 단백질 유전자는 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질 유전자인,
    재조합 복제 가능 이스파한 바이러스.
  24. 삭제
  25. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스 항원은 치군군야 바이러스(Chikungunya virus)로부터인,
    이스파한 바이러스.
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