DE3235924C2

DE3235924C2 -

Info

Publication number: DE3235924C2
Application number: DE3235924T
Authority: DE
Inventors: Ewin Samuel Lennox; Steven Howard Dr Sacks
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: Lonza Group AG
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1982-03-08
Publication date: 1992-01-30
Also published as: US4760026A; WO1982003089A1; JPS58500366A; DE3235924T1; JPH0526470B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biotechnologie und betrifft insbesondere die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als Butgruppenreagenz.

Hintergrund der Erfindung

Das Eindringen von Fremdmaterial (antigenem Material) in den Körper eines zu den Wirbeltieren gehörenden Lebewesen ruft eine Immunreaktion hervor, die verhindern soll, daß das antigene Material den Körper schädigt und die die Entfernung eines solchen Materials aus dem Körper erleichtern soll. Das Immunsystem erreicht dies durch Produktion von Immunoglobulinmolekülen (im folgenden als Antikörper bezeichnet), welche die Eigenschaft besitzen, das Antigenmaterial selektiv zu erkennen und sich an hierfür charakteristische Stellen desselben zu binden. Diese Stellen sind als Determinanten bekannt und ein Antigen kann eines oder mehrere derartiger Determinanten aufweisen. Durch das Immunsystem erzeugte Antikörper haben jeweils nur gegenüber einer Determinante eine Spezifität, doch kann eine Vielzahl unterschiedlicher Antikörper gebildet werden, wenn das Antigenmaterial, gegen welches Antikörper gerichtet sind, mehr als eine Determinante besitzt.

Die Hauptfunktion von Antikörpern ist der Schutz des Körpers vor schädlichem Fremdmaterial durch Agglutination desselben, wodurch die normalen Körperprozesse unterstützt werden, dieses Material zu entfernen.

Die Agglutination von Antigenmaterial durch Antikörper hat jedoch auch eine praktische Bedeutung außerhalb des Körpers auf dem Gebiete der Blugruppenbestimmung.

Rote Blutkörperchen (Erythrocyten) haben auf ihrer Oberfläche eine Anzahl von verschiedenen distinktiven Antigendeterminanten, deren Charakter die Klassifizierung des Blutes in bestimmte Gruppen oder Typen ermöglicht (z. B. A, B, 0, A₁B, A₂B, B_cord). Bei der Transfusion von Blut von einem Spender an einen Empfänger ist es wesentlich, daß das transfundierte Blut die gleiche Blutgruppe wie das Blut des Empfängers hat, da andernfalls das Immunsystem des Empfängers Antikörper gegen die fremden Determinanten auf der Oberfläche der transfundierten Erythrocyten erzeugt. Die Reaktion derartiger Antikörper mit Fremderythrocyten bildet die Basis für die Technik der Blutgruppenbestimmung.

Ganz allgemein kann gesagt werden, daß die Gruppenbestimmung von Blutproben auf der Feststellung einer Agglutination oder sonstigen Ausfällungen von Erythrocyten in der Blutprobe beruht, wenn Antiserum zu den auf der Oberfläche dieser Gruppe von Erythrocyten befindlichen Determinanten zugesetzt wird. Die Agglutination ist ein makroskopischer Effekt, der leicht mit dem Auge erkannt oder automatisch maschinell festgestellt werden kann.

Die Hauptquelle von Reagenzien zur Blutgruppenbestimmung wurde bisher durch die Hyperimmunisierung von Menschen erzielt. Dabei wird in einen Menschen eine beträchtliche, jedoch nicht lethale Dosis eines Blutserums eines von demjenigen des betreffenden Menschen unterschiedlichen Typs eingebracht. Dies ruft die normale immunologische Reaktion hervor, die zu der Produktion von Antinkörpern im Blut dieses Menschen führt, und eine Probe dieses Blutes wird sodann entnommen und daraus ein Antikörperpräparat hergestellt. Ein derartiges Präparat kann zur Bestimmung der Gruppe einer unbekannten Blutprobe verwendet werden, da es eine sichtbare Flokkulation oder Agglutination der Erythrocyten hervorruft, wenn die unbekannte Blutprobe vom gleichen Typ ist, wie das ursprünglich in den menschlichen Serumspender eingeführte Blut.

In der Praxis kennt man zwei Typen von Blutgruppentests (vergleiche F. Dunsford, C. Bowley, Techniques in blood grouping, 2nd edition 1967). Gemäß dem ersten Test wird eine Probe des zu bestimmenden Blutes auf eine Blutgruppen-Testplatte aufgebracht (vergleiche British Pharmacopeoia: Determination of AB0 donors). Diese Blutprobe wird sodann auf der Platte mit einer Antiserumprobe vermischt. Eine dabei erfolgende Agglutination zeigt an, daß die zu bestimmende unbekannte Blutprobe zu der gleichen Blutgruppe gehört wie diejenige, gegenüber welcher das Antiserum erzeugt wurde. In der Praxis werden solche Platten-Agglutinationsblutgruppentests routinemäßig in Notfällen durchgeführt.

Gemäß dem zweiten Typ dieser Tests wird die zu bestimmende Blutprobe mit einem Antiserum in eine in einem Teströhrchen befindliche physiologische Kochsalzlösung eingebracht und während einer Standard-Zeitspanne (2 h) stehen gelassen. Das Auftreten einer Agglutination kann sodann bewertet werden durch die Sedimentation, die innerhalb der Standard-Zeitspanne erfolgt ist. Im Falle von Unglücks- oder Notfällen kann eine Zentrifuge zur Beschleunigung des Testes verwendet werden.

Die Effizenz eines bestimmten Blutgruppentestreagenz wird beurteilt nach der Geschwindigkeit, mit welcher es Agglutinate bildet und nach der Art und Weise, in welcher seine Fähigkeit, als ein Agglutinin zu wirken, mit der Konzentration variiert.

Die erstgenannte dieser Kriterien wird üblicherweise als "Avidität" bezeichnet. Die Aviditätszeit eines bestimmten Blutgruppentestreagenz ist definiert als diejenige Zeit, die vom Zeitpunkt des Vermischens der Blutprobe mit dem Reagenz bis zum Zeitpunkt des Auftretens einer wahrnehmbaren Agglutination der Probe verstreicht.

Zur Bestimmung der Verdünnungscharakteristika eines Blutgruppentestreagenz kann ein Salzlösungs-Agglutinationstiter gemessen werden. Diese Meßung erfolgt in der Weise, daß eine Anzahl von Doppelreihen gleichen Volumens von Salzlösungsverdünnungen des zu bestimmenden Blutgruppentestreagenz hergestellt werden. Zu jeder Verdünnungsprobe wird eine bekannte Menge der entsprechenden Erythrocytensuspension zugesetzt. Die gleiche Menge an Suspension wird zu allen Verdünnungen zugegeben. Jede Verdünnungsprobe wird während einer Standard-Zeitspanne (in der Regel 2 h) stehen gelassen, worauf eine Agglutinationszählung unter einem Mikroskop vorgenommen wird. Die Probe mit der höchsten Verdünnung, bei welcher eine merkliche Agglutination eintritt, wird bestimmt und diese Verdünnung wird als "Salzlösungs-Agglutinationstiter" bezeichnet. Ein Reagenz mit einem hohen Salzlösungs-Agglutinationstiter stellt daher ein potentes Agglutinin dar.

Zwei Probleme ergeben sich offensichtlich bei der Herstellung von Antikörpern gegen Erythrocytendeterminanten bei Anwendung der Technik der Hyperimmunisierung eines Menschen. Erstens stehen Spender für Blutserum nur begernzt zur Verfügung, und außerdem hat sich heutzutage im Hinblick auf die steigende Häufigkeit größerer chirugischer Eingriffe der Bedarf nach Blutgruppenbestimmungen merklich erhöht. Dies führt zu einem Engpaß in der Versorgung mit menschlichem Blutserum, das auch für andere medizinische Zwecke gebraucht wird. Außerdem neigt der Agglutinationseffekt von natürlich erzeugten Antikörpern gegen Erythrocyten zur Erzielung von etwas variierenden Ergebnissen. Eine Ursache hierfür liegt darin begründet, daß die Immunreaktion zur Erzielung eines "Cocktails" von Antikörpern führt, von dem jede Antikörperkomponente eine spezifische Wirkung auf eine Determinante hat, wie oben erläutert wurde. Es ist unmöglich, die verschiedenen Antikörper in diesem Cocktail voneinander zu trennen, weshalb übliche Antisera Gemische von Antikörpern enthalten, wobei die Gemische von Tier zu Tier (selbst bei dem gleichen Genus) und von Tag zu Tag variieren. Der gleiche Determinantensatz liegt nicht auf allen Erythrocyten der gleichen Gruppe vor, was dazu führt, daß die Reaktion sehr variabel ist in zahlreichen Fällen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ein zur Blutgruppenbestimmung geeignetes Reagenz die folgenden Voraussetzungen erfüllen muß

1. Es muß spezifisch sein für das entsprechende Antigen,
2. es muß ausreichend potent sein, um gute makroskopische Reaktionen gegenüber den schwächeren Blutgruppen zu ergeben, und zwar sowohl in Notfällen als auch bei Routinemethoden der Blutgruppenbestimmung,
3. es muß stabil sein unter den Bedingungen des Gebrauchs und
4. es muß leicht verfügbar sein zu vernünftigen Kosten.

Neuere Fortschritte in der Molekularbiologie haben zu einer Technik für die Produktion hochspezifischer Antikörper geführt durch Erzeugung einer Hybridzelle (oder eines Hybridoms) aus einer Antikörper-produzierenden Milzzelle und einer Myelomzelle. Diese Technik von Kohler und Milstein (Eur. J. Immunol, 6, 292-295 (1976); Nature 256, 495 bis 497 (1975); Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)) stellt eine Methode zur Erzeugung einer unbegrenzten Quelle für Antikörper dar. Die dabei erzeugten Antikörper werden als monoklonale Antikörper bezeichnet, da die Hybridzelle, welche sie hervorbringt, nur einen Typ von Immunoglobulinmolekül, d. h. nur Immunoglobulin, das gegen eine Determinante spezifisch ist, produziert. Hybridomzellen vereinigen in sich die beiden wünschenwerten Merkmale von Myelomzellen und Lymphozyten. Das heißt, Myelomzellen sterben nicht ab und können sich selbst in vitro replizieren, während andererseits Lymphozyten die wünschenswerte Eigenschaft haben, Antikörper auszustoßen. Derartige Hybridzellen sind daher eine dauernde Quelle für reines, wohldefiniertes Immunoglobulin. Die Herstellung von Hybridzellen erfolgt in der Regel durch Immunisierung einer Maus mit dem geeigneten Antigen und, nachdem genügend Zeit zum Ablauf der Immunoreaktion gelassen worden ist, wird das Tier getötet und dessen Milz entnommen. Eine Zellsuspension wird sodann aus der Milz hergestellt und diese Suspension wird mit einer Suspension von Mäuse-Myelomzellen vermischt. Polyethylenglykol kann zur Förderung der Fusion der beiden Zellarten eingesetzt werden. Die erhaltenen individuellen Hybridomkulturen, die von einer Lymphozytzelle abstammen, bilden spezifisch einen Typ von Antikörper, d. h. einen Antikörper, der nur gegen eine bestimmte Determinante spezifisch ist.

Diese Technik wurde angewandt von Voak et al (Vox Sanguinis 39, 134-140 (1980)) zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Determinanten von Erythrozyten des A-Typs und es zeigte sich, daß diese monoklonalen anti-A-Körper brauchbare Reagenzien zur Blutgruppenbestimmung darstellen.

Es bestand jedoch die weitverbreitete Meinung, daß die Immunisierung von Mäusen mit Humanblutzellen vom B-Typ nicht zur Bildung von Milzzellen führt, die zu einer Fusion mit Myelomzellen befähigt sind unter Bildung von Hybridomzellen, die anti-B-Immunoglubin hervorbringen (Coombs, Nat. Cancer Inst. Monograph (1963) No. 7, 91).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß dies nicht der Fall ist und daß eine erfolgreiche Fusion leicht erzielbar ist unter Bildung von Hybridomzellen, die hochwirksames monoklonales anti-B ausstoßen und damit ein spezifisches Blutgruppentest-reagenz hoher Avidität, das sich durch einen brauchbaren Salzlösungs-Agglutinationstiter auszeichnet, produzieren. Es hat sich außerdem als möglich erwiesen, eine Gleichgewichtskonstante und eine Dissoziationsratenkonstante für den Immunokomplex, der sich zwischen dem monoklonalen anti-B und den Blutkörperchen von B-Typ bildet, zu definieren. Bisher war eine derartige quantitative Analyse der Festigkeit des zwischen einem Blutgruppentest-Reagenz und roten Blutkörperchen Immunokomplexes nicht möglich, da die bisher bekannten Blutgruppentest-Reagenzien ein Gemisch aus Immunoglobulin unterschiedlicher Spezifität darstellen. Der beste bisher erzielbare Wert war daher ein Durchschnittswert.

Darstellung der Erfindung

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zeichnet sich durch eine Spezifität für eine Antigendeterminante eines Blutkörperchens vom B-Typ aus. Der hier verwendete Ausdruck "Blutkörperchen-B-Typ" umfaßt alle roten Blutkörperchen, die eine oder mehere Antigendeterminanten besitzen, die ausschließlich auf Blutkörperchen vom B-Typ vorliegen. Beispiele für Bluttypen mit derartigen Determinanten sind B, A₁B, A₂B, und B_cord.

Beim erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper handelt es sich vorzugsweise um ein Maus IgM-monoklonales anti-B-Immunoglobulin.

Vorzugsweise besitzt der monoklonale Antikörper die Fähigkeit, eine Agglutination einer Probe von B-Typ-Blut, das diese Determinante aufweist, zu bewirken. Es zeigte sich, daß insbesondere wertvolle derartige Eigenschaften dann resultieren, wenn der monoklonale Antikörper eine Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und den Blutkörperchen vom B-Typ aufweist, die größer als 1,3×10⁷ M^-1, insbesondere größer als 1,2×10⁸ M^-1 ist. Bei den hier und im folgenden angegebenen Werten für die Gleichgewichtskonstante handelt es sich um funktionelle Affinitäten, d. h. um Messungen der Wechselwirkung zwischen polyvalentem Antikörper (IgM) und rotem Blutkörperchen. In dieser Hinsicht unterscheiden sie sich von Intrinsic-Affinitäten, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen univalentem Antikörper (IgG) und Antigen ergeben. Intrinsic-Affinitäten sind nicht direkt vergleichbar mit funktionellen Affinitäten. Die Werte, die für die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper berechenbar sind, hängen vom verwendeten Assay ab, wie dies im folgenden beschrieben wird.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung weist der monoklonale Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und dem Blutkörperchen vom B-Typ der Blutgruppe B auf, die kleiner ist als 2,2×10^-2 s^-1, vorzugsweise niedriger als 7,6×10^-4 s^-1.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung besitzt der monoklonale Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem monoklonalen Antikörper und Blutkörperchen vom B-Typ der Bluttgruppe A₁B, die kleiner ist als 5,0×10^-2 s^-1, vorzugsweise niedriger als 3,4×10^-3 s^-1.

Bei den hier und im folgenden angegebenen Dissoziationskonstanten handelt es sich um funktionelle Affinitäten wie oben beschrieben.

Zur Durchführung des in den Patentansprüchen angegebenen erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Hybridzellen vor dem Klonieren einer Selektion unterworfen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Myelomzellen um NS1-Zellen. Die zur Durchführung des Verfahrens verwendbaren Hybridomzellen sind zur Sekretion des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers befähigt, der als Reagenz zur Blutgruppenbestimmung verwendbar ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Es stellen dar:

Fig. 1 Kurven der im Gleichgewicht befindlichen Bindung von ¹²⁵J-markierten anti-B-Antikörpern mit Erythrocyten der Gruppe B,

Fig. 2 ein modifiziertes Scratchard-Diagramm der im Gleichgewicht befindlichen Bindung von ¹²⁵J-markierten anti-B-Antikörpern mit Erythrocyten der Gruppe B,

Fig. 3 Kurven, welche die Dissoziationsrate von ¹²⁵ J-markierten anti-B-Antikörpern von Erythroycyten der Gruppe B bei 4°C und bei Raumtemperatur zeigen,

Fig. 4 Kurven, welche die Dissoziationsrate von ¹²⁵ J-markierten anti-B-Antikörpern von 2×10⁶ A₁B-Erythrocyten bei Raumtemperatur zeigen.

Allgemeine Beschreibung der Herstellung der Hybridomzellen

Geeignete Mäuse wurden durch Testung von Serumproben für anti-B-Aktivität nach Absorption mit Blutkörperchen der Gruppe 0 zur Entfernung von anti-Spezies-Antikörpern ausgewählt. Einer Maus mit einem anti-B-Agglutinationstiter von 1 : 8 nach der Absorption wurden intraperitoneal 100 µg einer Substanz der Gruppe B in 0,1 ml ergänztem Freund-Medium (Difco Bacto) injiziert, was 5 Wochen später wiederholt und nach weiteren 9 Wochen mit 200 µg B-Substanz in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung durch intravenöse Injektion aufgefrischt wurde. 3 Tage später wurde die Milz entfernt und eine Zellsuspension hergestellt.

Milzzellen (10⁸) wurden fusioniert mit Mausmyelom -NS1-Zellen (10⁷) unter Verwendung von Polyethylenglykol (vergleiche Cotton et al, Eur. J. Immunol., 3, 135-140, (1973); Dunsford and Bowley, Techniques in Blood Grouping 2nd edition 1967; Galfre et al, Nature, 266, 550-552, (1977)). Wachsende Zellhybride wurden selektiert nach ihrer Fähigkeit, eine spezifische anti-B-Aktivität hervorzurufen die im Überstand der Kulturlösung durch Agglutinationstest unter Verwendung von menschlichen A-, B- und 0-Erythrocyten bestimmt wurde. Anti-B-sekretierende Hybride wurden zweimal auf weichem Agar kloniert und gezüchtet eventuell in 1 l Schleuderkulturen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM Gibco Biocult), das ergänzt war mit 5% V/V fötal-Kalbserum (FCS, Sera-Lab). Die klonierten Hybride wurden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Der Gewebekulturüberstand, welcher den monoklonalen Antikörper enthielt, wurde gewonnen durch Zentrifugation zur Entfernung von Zellen und Bruchstücken, Filtration durch Milliporfilter und Zugabe von 10 mM Hepes-Puffer und 0,1% Natriumazid. Aliquote Teile jeder Charge wurden sodann bei 4°C für Routineuntersuchungen oder bei -20°C als Vorratssubstanz aufbewahrt.

Ausführliche Beschreibung der bei der Herstellung der Hybridzellen benutzten Materialien und Methoden Mäuse und Ratten

Als Versuchstiere wurden B10.BR, C3H/He-mg- und andere Mäuse zunächst von OLAC, 1976 Ltd. (Bicester, GB) und später von Medical Research Council, bei denen es sich um von OLAC-Tieren gezüchtete Stämme handelte, erhalten. AKR-Mäuse wurden von Banting and Kingman (York, GB) erhalten. (C3H×BALB/c) F₁-Mäuse und Lou, DA und A0 - Ratten wurden im Tierhaus des Medical Research Council gezüchtet; Wistar, PVG, WAG und Sprague-Dawley-Ratten wurden von Banting and Kingman erhalten.

Die zum Testen und Immunisieren eingesetzten Mäuse waren 6 bis 8 Wochen alt.

Immunisierungen

Bei den Immunisierungen verwendete menschliche Substanz der Gruppe B:

Von Dr. W. Watkins (Clinical Research Centre, Harrow, G. B.), wurde Human-B- (und -A) Substanz erhalten, welche der in Phenol (95%) unlösliche, in Ammoniumsulfat (100%) unlösliche, in Äthanol (45 bis 55%) unlösliche und in Wasser lösliche Extrakt von gefriergetrockneter Ovarialzystenflüssigkeit ist, der nach der Methode von Morgan (1965) gewonnen ist. Es handelt sich dabei um Glykoproteine, die zu 80 bis 85% aus Kohlehydraten (L-Glucose, D-Galactose, N-Acetyl-D-flucosamin, N-Acetyl-D-Galactose), zu 15 bis 20% aus Aminosäuren (vorwiegend aus L-Threonin, L-Serin und L-Prolin) und zu 1 bis 2% aus Salinsäure bestehen. Sie wurden in lyophilisiertem Zustand erhalten und in einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,9%iger Kochsalzlösung gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

Herstellung einer Emulsion von B-Substanz in ergänztem Freund-Medium (CFA)

1 ml B-Substanz in einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,9% Kochsalzlösung wurde zu 1 ml CFA (Difco Bacto, ein Gemisch von Bayol F, Öl und Mannidoleatdetergens mit einem Gehalt an Mycobacterium tuberculosis) zugegeben. Das Gemisch wurde kräftig homogenisiert in zwei 5-ml-Glasspritzen (Chance, Warley, GB), die im rechten Winkel miteinander verbunden waren durch einen 2-Weghahn, und intermittierend auf Eis gekühlt, bis sich (nach 10 bis 20 min) eine weiße Creme gebildet hatte, die nicht dispergierte, wenn ein Tropfen derselben auf Wasser aufgebracht wurde. CFA stellt noch immer eines der besten Hilfsmittel für Immunreaktionen dar (vergleiche Bomford, 1980). Wiederholte Injektionen wurden an verschiedenen Stellen apliziert, da sich eine Granulomatose bilden kann.

Die Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt.

Um geeignete Mäuse aufzufinden, wurde nicht-immunisierten Versuchstieren am Schwanz Blut entnommen und das Serum wurde nach Absorption mit Erythrocyten der Gruppe 0 zur Entfernung von anti-Spezies-Antikörpern nach der Röhrchen-Agglutinationsmethode mit B-Erythrocyten getestet.

6 bis 8 Wochen alten weiblichen B10.BR-Mäusen und C3H/He-mg-Mäusen mit hohem anti-B-Titer wurde intraperitoneal (i. p.) eines der folgenden 3 Präparate injiziert: 100 µg B-Substanz in 0,1 ml CFA (siehe unten), 10 µg B-Substanz im gleichen Medium oder 0,1 ml gepackte, 4mal gewaschene Erythrocyten der B-Gruppe. Den Mäusen wurde 2 Wochen später Blut am Schwanz entnommen.

B10.BR-Mäusen, die einen hohen Serumtiter hatten, wurde eine erneute i. p. Injektion von 100 µg oder 10 µg B-Substanz nach 5 Wochen, oder eine erneute Gabe von 0,1 ml Zellen nach 3, 4 und 5 Wochen nach der ersten Injektion verabreicht. Den Mäusen wurde am Schwanz Blut entnommen nach 1 Woche, 3 Wochen und 6 Wochen nach der letzten Injektion.

9 Wochen nach der zweiten Injektion von 100 µg wurden der B10.BR-Maus 2 200 µg B-Substanz in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung injiziert. 3 Tage später wurde die Milz entnommen und eine Zellsuspension hergestellt zur Fusion mit Myelomzellen.

Die Sera wurden wie folgt gesammelt:

0,5 ml am Schwanz entnommenes und in Plastikröhrchen gesammeltes Blut wurden bei 37°C 1 h lang gerinnen gelassen und vom Röhrchen gelöst, um die Retraktion des Gerinnsels zu fördern. Abgetrennte Sera wurden verdünnt mit 0,9% Salzlösung, 20 min in einem 56°C warmen Wasserbad inkubiert und je nach Erfordernis mit 0- oder A₁-Blutkörperchen absorbiert. Aliquote Teile wurden bei -20°C aufbewahrt.

Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Blutgruppe B

Die allgemeine Richtlinie der angewandten Prozeduren folgte den von Kohler und Milstein (Literaturstelle siehe oben) festgelegten Grundprinzipien zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit der gewünschten Reaktivität:

Milzzellen
HGPRT ase+ve
	spezifisch Ig+ve
	terminal differenziert
Myelomzellen	HGPRT ase-ve
	spezifisch Ig-ve
	sterben nicht ab
Hybridzellen	HGPRT ase+ve
	spezifisch Ig+ve
	sterben nicht ab.

Nicht-verschmolzene Myelomzellen haben keine HGPRT ase und sterben daher in selektiven Medium (vergleiche Littlefield, Science 145, 709-710, 1964). Nicht-verschmolzene Milzzellen überleben nicht in Gewebekulturen. Nur Hybride von Milzzellen und Myelomzellen haben sowohl HGPRT ase als auch die Fähigkeit, nicht abzusterben, und überleben daher; diejenigen, welche Antikörper der erforderlichen Spezifität sekretieren, können sodann selektiert werden, d. h. Hybridzellen vereinigen insich die Vorteile beider Stammzellen.

Stammlösungen 50%ige Polyethylenglykol-(P.E.G.)-Lösung

10 g P.E.G. 1500 (BDH Lot 6573370) wurden im Autoklaven behandelt und unmittelbar danach in ein 45°C warmes Wasserbad überführt, worauf 10 ml DMEM bei 37°C zugesetzt wurden.

Aminopterin-Stammlösung 1000X

Aminopterin (Sigma) wurde gelöst zu 0,176 mg/ml in 0,008 M NaOH, leicht erwärmt, und im Dunkeln bei -20°C aufbewahrt.

HT-Stammlösung 100X

136,1 mg Hypoxanthin (Sigma) und 38,75 mg Thymidin wurden durch Erhitzen auf Siedetemperatur in 100 ml DDW gelöst und in aliquoten Teilen von 50 ml bei -20°C aufbewahrt.

50 ml DMEM
50 ml HT 100X

Die fertiggestellte Lösung wurde filtriert (Millipore, Porengröße 0,22 µm) und in aliquoten Teilen von 13 ml bei -20°C aufbewahrt. Beim Auftauen wurde HT durch Erwärmen auf 60 bis 70°C wieder in Lösung gebracht.

HAT-Medium 50X

45 ml DMEM
50 ml HT 100X
5 ml Aminopterin 1000X

Die Lösung wurde filtriert, aufbewahrt und aufgetaut wie oben beschrieben in aliquoten Teilen von 13 ml.

HAT in 20% FCS-DMEM (HAT-Medium) 1X

400 ml DMEM
100 ml FCS (Charge 901112)
  8 ml P/S
  8 ml Glutamin
  6 ml Pyr.
10,6 ml HAT-Medium 50X
   (1,0×10^-4 M Hypoxanthin, 4,0×10^-7 M Aminopterin, 1,6×10^-5 M Thymidin).

HT in 20% FCS-DMM (HT-Medium) 1X

10,6 ml HT 50X wurde anstelle von HAT 50X in der oben angegebenen Formulierung angewandt.

Die folgenden Ausdrücke finden Verwendung:

Serum-frei DMEM
=DMEM+PS+glut.+pyr.
20% FCS-DMEM	=Serum-freies DMEM+20% FCS
HAT-Medium	=20% FCS-DMEM+HAT
HT-Medium	=20% FCS-DMEM+HT

Produktion und frühzeitige Selektion von anti-B-Myleomhybriden

Eine Zellverschmelzung wurde wie von Kohler et al (Literaturstelle siehe oben) vorgenommen. Zur Herstellung wurden die folgenden Medien über Nacht bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft (Leec-incubator) ins Gleichgewicht gebracht: (1) 50% PEG-Lösung; (2) Serumfreies DMEM und (3) 20% FCS-DMEM mit einem Gehalt von 1,5 ml aliquoten Proben, verteilt in 48 Linbro-Gefäßen.

Am Morgen, an dem die Fusion stattfand, wurde die Milz aseptisch entnommen und die Zellen wurden in 10 ml Serum-freies DMEM verteilt und in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Nachdem die Zellzusammenballungen 5 bis 10 min lang sedimentieren gelassen worden waren, wurden Suspensionszellen mit einer Pipette entnommen und 2mal in Serum-freiem DMEM gewaschen. Die eine Milz ergab 1,4 mal 10⁸ Suspensionszellen. 10⁸ derselben wurden gesammelt in 5 bis 10 ml Serum-freiem DMEM. Gleichzeitig wurden 10⁷ Myleom-NSI-Zellen, die in Wirbelkultur (spinner culture) zu 2,6×10⁶/ml wuchsen, 2mal gewaschen und erneut in 5 ml Serum-freiem DMEM suspensiert.

Medien mit einem Gehalt an Milzzellen (10⁸) und Myelomzellen (10⁷) wurden in ein 50-ml-Corning-Röhrchen eingebracht und die Zellen wurden pelletisiert durch Zentrifugation bei 400 g während 5 min, RT, und das Medium wurde so vollständig wie möglich unter Verwendung einer an eine Saugpumpe angeschlossenen Pasteur-Pipette abgesaugt. Während das Röhrchen in einem Becher mit 37°C warmen Wasser gehalten wurde, wurde 1 ml 50%ige PEG-Lösung (bei 37°C ins Gleichgewicht gesetzt) allmählich innerhalb von 1 min zugegeben, worauf eine weitere min lang schwach gerührt wurde mit der für die Zugabe verwendeten Pipettenspitze. Die Suspension wurde sodann verdünnt durch langsame Zugabe von Serum-freiem DMEM (bei 37°C ins Gleichgewicht gesetzt) in einer Rate von 1 ml/min während 2 min, 2 ml/min während 4 min, 10 ml tropfenweise und dann freilaufend bis 50 ml, unter schwachem Schütteln des Röhrchens bei jeder Zugabe. Nach dem Zentrifugieren (400 g während 5 min) wurden die Zellen in 25 ml 20% FCS-DMEM (ins Gleichgewicht gesetzt) suspendiert durch sanftes Pipettieren mit der für die Zugabe verwendeten 24-ml-Pipette. Das Fusionsgemisch in 20% FCS-DMEM wurde sodann in 0,5-ml-Aliquotenteilen in 48 Linbro-Gefäße verteilt, welche 1,5 ml ins Gleichgewicht gesetztes Medium aus 20% FCS-DMEM enthielten.

Als Zuchtzellen wurden die verbleibenden Milzzellen verdünnt und tropfenweise in einer Menge von etwa 4×10⁵/Gefäß zugesetzt. Kulturentröge wurden sodann bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft bei über 45% Feuchtigkeit inkubiert.

Am folgenden Tage (Tag 1) und an den Tagen 2, 3, 7 und 11 nach der Zellfusion wurde die obere Hälfte jedes Kulturmediums entfernt (unter Verwendung einer separaten Pasteur-Pipette für jedes Gefäß, um eine mögliche kreuzweise Verunreinigung zu vermeiden) und ersetzt durch ein gleiches Volumen von HAT-Selektivmedium (Littlefield, 1964), das mit 5% CO₂ in Luft ins Gleichgewicht gesetzt worden war.

Die Kulturen wurden täglich auf Hybridwachstum und mögliche Verunreinigung durch Hefezellen oder Mikroorganismen inspiziert, wobei die Kulturen so kurz wie möglich außerhalb des Inkubators gelassen wurden. Sobald das Wachstum der Zellmonoschicht kurz vor dem Zusammenfließen war (etwa 14 bis 21 Tage nach der Zellfusion), was in etwa dem Zeitpunkt entsprach, wo das Medium einen Farbumschlag von Phenolrot von rot nach gelb bewirkte, wurden die Kulturüberstände zunächst getestet (durch Agglutination mit roten Blutkörperchen der Gruppe A, B und 0). Positive Kulturen wurden an diesem Tag unterteilt durch Suspendieren der Zellen mit einer 1-ml-Pipette und Überführung von 1 ml der Zellsuspension in 1 ml HAT-Medium (bei 37°C ins Gleichgewicht gesetzt); die ursprüngliche Kultur wurde mit HAT-Medium aufgefüllt. Die aufgeteilten Kulturen wurden in separaten Inkubatoren gezüchtet, um gegen einen Inkubatorausfall Vorsorge zu treffen, und sie wurden periodisch durch Agglutination getestet und sobald wie möglich in flüssigem N₂ in FCS, das 10% DMSO enthielt, eingefroren. Negative Kulturen wurden erneut getestet, sobald das Medium Gelbfärbung zeigte. Einer etwaigen Verunreinigung durch Hefezellen oder Mikroorganismen wurde dadurch begegnet, daß 45%iger EtOH zugegeben und nach 5 min die Kultur angesaugt und das leere Gefäß mit EtOH gewaschen wurde. Irgendwelches verspritztes oder verschüttetes Medium auf dem Kulturtrog wurde immer sofort abgesaugt.

Nach 4 bis 10 Tagen nach der ursprünglichen Testung der Fusionsgefäße wurden Subkulturen erneut getestet und aliquote Teile positiver Kulturen wurden eingefroren oder für das Klonen zubereitet.

Isolierung von anti-B-sekretierenden Hybridklonen

Das Klonieren von Zellen von selektierten Kulturen erfolgte auf Weichagar, wie dies von Cotton et al beschrieben ist (Literaturstelle siehe oben). Eine Lösung von 0,5% Agar in HAT-Medium wurde hergestellt durch Zugabe von 50 ml 1%igem Agar (Difco Bacto) in 0,9%iger Salzlösung zu 50 ml HAT-DMEM 2X (100 ml 2X DMEM+4 ml P/S+4 ml glut.+3 ml pyr.+75 ml FCS+7,8 ml 50X HAT), wobei die beiden Lösungen eine Temperatur von 45°C aufwiesen. Das Agargemisch wurde in 9-cm-Petrischalen (Nunc) zu 15 ml/Schale einpepettiert und bei abgenommenem Deckel in einem laminarsaugenden Gewebekultur-Abzugsschrank 5 min lang verfestigen gelassen, worauf in einem begasten Inkubator 30 min lang ins Gleichgewicht gesetzt wurde.

Zu 1 ml Zellen in einer Reihe von 6 Dreifachverdünnungen in Linbro-Gefäßen mit DMEM wurde 1 ml 0,5% Agar HAT-DMEM zugegeben. Das 2-ml-Gemisch wurde über dem verfestigten Agar gleichmäßig ausgebreitet, wie zuvor luftgetrocknet und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft inkubiert.

Nach 14 bis 20 Tagen hatten sich diskrete makroskopische Zellkolonien gebildet, von denen viele aus Einzelzellen stammten. Diese wurden aus Schalen, welche die geringste Zahl von Kolonien (normalerweise 10 bis 20) enthielten, entnommen unter Verwendung einer fein gezogenen Pasteuer-Pipette, und in Linbro-Gefäße eingeimpft, welche 1 ml HAT-DMEM, ins Gleichgewicht gesetzt in einem begasten Inkubator, enthielten.

Nach dem üblichen Zyklus von Kulturwachstum, Testung auf Agglutination, Aufteilung der Kulturen und Einfrieren von einigen derselben in flüssigem N₂, wurden selektierte Klone HAT entzogen durch Reihentransfer der Hälfte der Kultur in ein gleiches Volumen von HT-Medium für 2 bis 3 Passagen und danach in 20% FCS-DMEM, was insgesamt 5 bis 6 Tage beanspruchte.

Zellen wurden wie zuvor rekloniert, jedoch in 20% FCS-DMEM, das 0,5% Agar enthielt. 2mal klonierte Linien wurden selektiert, und zwar (1) im Hinblick auf ihre Fähigkeit, daß der Kultur-Überstand eine starke Agglutination mit roten Blutkörperchen ergab und (2) im Hinblick auf ein rasches Wachstum von Zellen hoher Dichte. Ausgewählte Klone wurden adaptiert an das Wachstum in niedrig-konzentriertem FCS durch Reihentransfer alle 2 Tage der Hälfte der Kultur auf Medien, die 10%, 5% bzw. 2,5% FCS enthielten.

Klonieren durch Begrenzung der Verdünnung mit Zuchtzellen

Die Methode wurde bei Hybridzellen angewandt, die nicht zufriedenstellend wuchsen, wenn sie in geringer Dichte auf Agar ausgebreitet wurden. Zellsuspensionen wurden in einer 2fach Reihe auf 1 bis 32 verdünnt in Linbro-Gefäßen, wobei verschiedene Reihen hergestellt wurden. Zu entsprechenden Reihen wurden 100 µl Nährmedium zugegeben, das einen Typ der folgenden Zuchtzellen enthielt:

(1) 4×10⁵ B10.BR-Thymuszellen
(2) 4×10⁵ B10.BR Milzzellen
(3) 4×10⁵ bestrahlte 3T3 Mausfibroblastzellen (20 000 rad bei 1 rad/s)
(4) 4×10⁵ Mitomycin-behandelte* B10.BR Thymuszellen
(5) 4×10⁵ Mitomycin-behandelte* B10.BR-Milzzellen
(6) keine

* 0,1 ml Mitomycin C (Sigma) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in EBSS wurde zu 1 ml Medium mit einem Gehalt an 10⁷ Zellen zugesetzt, worauf 30 min bei 37°C inkubiert und 3mal gewaschen wurde.

Das Hybridzellenwachstum wurde bei geringen Verdünnungen auf Eignung zur Entnahme isolierter Kolonien überprüft.

Aufbewahrung von Hybridzellen in flüssigem N₂

Gefrorenes Hybridgut wurde aus exponentiell wachsenden Zellen bei 2 bis 8×10⁵ Zellen/ml hergestellt. Pelletisierte Zellen aus 10 ml Kulturüberstand wurden resuspendiert in 2 ml 90% FCS - 10% DMSO (d. h. zu etwa 10⁶/ml) und aufgeteilt in 2 sterile Friergefäße (10⁶/Gefäß). Die Gefäße wurden 2 bis 4 h auf Eis gekühlt, dann über Nacht in der Dampfphase eines Linde-Tanks mit flüssigem N₂ und schließlich in flüssiges N₂ eingetaucht. Auf diese Weise erfolgt die Kühlung der Zellen in einer Rate von etwa 1°C/min.

Zum Züchten von Zellen aus gefrorenen Beständen wurde ein Gefäß in einem Wasserbad von 37°C rasch aufgetaut und der Inhalt wurde langsam verdünnt in 10 ml Nährmedium. Pelletisierte Zellen (400 g, 5 min) wurden resuspendiert in 5 ml 5-10% FCS-DMEM.

Gefäße mit 10⁷ Zellen wurden aus Wirbelkulturen hergestellt, so daß eine 50-ml-Kultur sofort gestartet werden konnte.

Nomenklatur von Antikörper-sekretierenden Hybridzellen, z. B. dem anti-B produzierenden Klon NB1/19.112.28

Jeder Hybrid wird mit einem Namen bezeichnet, der sich auf das Fusionsexperiment bezieht, im obigen Falle bezieht sich das N in NB1 auf das Abstammungsmyelom NS1; B bezieht sich auf anti-B-Milzzellen.

Die erste Zahl, hier 19, bezieht sich auf das ursprüngliche unklonierte Kulturgefäß, aus dem dieser Klon abstammt.

Die folgenden Zahlen, hier 112 und 28, definieren die Kulturgefäße, in denen selektierte Klone gezüchtet werden nach der ersten bzw. zweiten Agarklonierung.

Kulturgefäße in einem Linbro-Trog werden nummeriert 1-24 oder bezeichnet A1-1D6. Wenn somit 5 Tröge verwendet werden, geht die Nummerierung der Gefäße von 1-120 oder 1A1-5D6.

Die vollständige Bezeichnung bezieht sich auf den Zellklon, den produzierten monoklonalen Antikörper und dessen Antigenspezifität.

Charakterisierung des monoklonalen anti-B

3 stabile Gewebekulturlinien (NB1/19.112.28, NB1 6.36.36 und NB1/48.30.40) von klonierten anti-B produzierenden Hybridzellen wurden gewonnen aus einer Fusion zwischen Mausmilzzellen, die einer Vorbehandlung durch Antigen der Gruppe B unterworfen worden waren, und einer Mausmyelomline. Der Gewebekulturüberstand, der sekretierten monoklonalen Antikörper enthielt, wurde von jeder der drei Linien separat getestet.

Proben von Human-anti-B vom Blood Group Reference Laboratory (BGRL No. 7327) und von einem kommerziellen Lieferanten wurden verwendet, wobei jede von der gleichen Charge genommen wurde, um die Effizienz des durch die Hybridomzellen gebildeten monoklonalen anti-B zu bestimmen.

Hämagglutinationstests wurden nach der Methode von Dunsford und Bowley (vergleiche oben) durchgeführt. Bei den roten Blutkörperchen handelte es sich um solche von ACD oder um geronnene Proben (vom Reginal Blood Transfusion Centre, Cambrige), die weniger als 7 Tage alt waren und 4mal vor Gebrauch gewaschen wurden. 20%ige Suspensionen von roten Blutkörperchen in physiologischer Kochsalzlösung wurden für die Plattentests verwendet und 2%ige Suspensionen für den Standard-2h-Schwerkraftsedimentations-Röhrchentest. In Steigerungstests wurde Gebrauch gemacht von 2%igen papainisierten Zellsuspensionen oder 20%igem Rinderalbumin. Antikörperverdünnungen erfolgten in physiologischen Kochsalzlösungen.

Im Standard-2h-Sedimentations-Röhrchentest ergaben voll ausgewachsene Kulturüberstände anti-B-Agglutinationstiter, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind.

Tabelle 1

Salzlösungs-Agglutinationstiter (+) dreier monoklonaler anti-B-reagentien im Vergleich mit Human-anti-B

Die Unterschiede zwischen den drei monoklonalen Antikörpern waren reproduzierbar in diesen und anderen der beschriebenen Tests. Der Antikörper NB1/19.112.28 ergab konsistent ausgezeichnete Ergebnisse

Wie zu erwarten war, ergaben A₁B adult- und B cord-Zellen etwas niedrigere Titer als ausgewachsene A₂B und B-Zellen, was den schwächeren B-Status des erstgenannten Zellentyps widerspiegelt.

Alle gestesteten Reagentien ergaben eine angemessene Agglutination mit allen Zelltypen des Testschemas, hervorragend war jedoch die Aktivität von NB1/19.122.28, selbst mit den 6 Beispielen schwacher cord-Blutproben, wie sich aus der Tabelle ergibt. Der Bereich der NB1/19.122.28-Aktivität mit fünf verschiedenen A₁B-Blutproben (in der Tabelle nicht aufgeführt) betrug 256 bis 1024 (Durchschnittstiter 512), verglichen mit 16,32 (Durchschnitt 32) bei Verwendung von BGRL-anti-B.

In weiteren Versuchen wurde der Salzlösungs-Agglutinationstiter von NB1/48- und NB1/19-Reinigungsprodukten mit 2%igen B- und A₁B-Zellen gemesen. Fraktionen von gereinigtem NB1/48 und NB1/19 wurden in der Mikrozentrifuge zentrifugiert und sorgfältig verdünnt und PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung), bis A₂₈₀=1,00 (d. h. bei 100 µg/ml), unter der Annahme, daß A_,280=10. Ammoniumsulfatfraktionen des Kulturüberstands (aus dem die Fraktionen gereinigt wurden) wurden mikrofugiert und verdünnt auf 1/16 in P.B.S. Reihen-Doppeltverdünnungen wurden in P.B.S., pH 7,4, hergestellt durch genaues Pipettieren mit einer Hamilton-Injektionsspritze, die zwischen den einzelnen Pipettierprozeduren 4mal gespült wurde. Aliquote Teile von 25µl jeder Verdünnung wurden in Glasröhrchen inkubiert mit 25µl 2% roten Blutkörperchen (5×10⁶), suspendiert in P.B.S., bei pH 7,4 während 2h bei Raumtemperatur. Zellpellets wurden sorgfältig auf Glasobjektträger überführt und auf Agglutination untersucht. In diesem Versuch wurden Kulturüberstände wie in Tabelle 1 angegeben verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.

In den Plattenagglutinationstest, welche die Antikörperavidität reflektieren, machen die schwächeren Reaktionen von B cord- und A₁B-adult-Zellen im Vergleich mit adult-B- und A₂B-Zellen klarer die anti-B-Aktivitäten der verschiedenen Reagenzien deutlich. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Aviditätzeiten monoklonaler anti-B-Reagentien im Vergleich zum Human-anti-B (Angaben in s)

Mit A₁B- und B cord-Zellen bewirkte monoklonales anti-B NB1/19.122.18, das unkonzentriert und ohne Zusätze angewandt wurde, innerhalb von Sekunden eine starke Agglutinationsreaktion ähnlich derjenigen mit handelsüblichem Reagenz. Obwohl das BGRL-Reagenz makroskopisch adäquate Ergebnisse ergab, waren die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Verklumpung schlechter.

In einem weiteren Versuch wurden die Platten-Agglutinationszeiten von 20% B- und A₁B-roten Blutkörperchen durch NB1/48 und NB1/19- Reinigungsprodukte gemessen. Die verwendeten Reagenzien waren die in Tabelle 2 beschriebenen mit der Ausnahme, daß die roten Blutkörperchen in 20% 2-µl-Aliquotenteilen jeder Verdünnung, vermischt mit 20 µl roten Blutkörperchen auf einer opaken Glasscheibe, zum Einsatz gelangten und regelmäßig gerüttelt wurden. Eine Pedal-gesteuerte Stoppuhr wurde im Moment des Mischens gestartet. Die folgende Tabelle 4 zeigt die Zeit (s) bis zum Eintritt der Agglutination und das Ausmaß der Agglutination nach 5 min. Das Ausmaß der Agglutination ist wie in Tabelle 3 definiert, d. h. 13 V bedeutet, daß+Agglutination nach 13 s eintrat, und daß nach 5 min eine sehr starke Agglutination erfolgt war.

Tabelle 4

Plattenagglutination (s) von 20% B- und A₁B-roten Blutkörperchen durch NB1/19- und NB1/48-Reinigungsprodukte

Die erhaltenen Ergebnisse mit Doppelverdünnungen verschiedener Reagentien sind in der folgenden Tabelle 5 aufgeführt und sie zeigen die relative Wirksamkeit von NB1/19.112.28. So ergab zum Beispiel bei 4facher Verdünnung das Präparat des Kulturüberstands unter Testbedingungen eine zufriedenstellende Reaktion mit A₁B-Zellen im Vergleich zum im Handel verfügbaren anti-B-Serum.

Tabelle 5

Einfluß der Verdünnnung auf die Aviditätszeiten (s) von anti-B-Reagentien mit A₁B-Zellen

Nicht jeder monoklonale Antikörper mit AB0-Spezifität ist zur Blutgruppenbestimmung gleichermaßen geeignet. In den hier gegebenen Beispielen waren zwei der drei monoklonalen anti-B-Verbindungen als Blutgruppenreagenzien weniger geeignet, wobei jedoch deren Eigenschaften mit denen des BGRL-Standards vergleichbar waren.

Die Spezifität des monoklonalen anti-B erlaubt die Meßung einer quantitativen funktionallen Affinität. Die funktionelle Affinität kann auf zweierlei Weise ausgedrückt werden.

Erstens kann die funktionelle Affinität als eine Gleichgewichtskonstante für die Assoziationsreaktion zwischen einem Molekül von monoklonalem anti-B IgM und einer B-Determinante (des entsprechenden immunochemischen Typs) auf ein Erythrocyt ausgedrückt werden. Die Gleichgewichtskonstante (im folgenden mit K bezeichnt) wird erhalten, indem zunächst die Gleichgewichts-Bindungsmenge von ¹²⁵J-markierten anti-B-Antikörpern mit Gruppe B-Erythrocyten bei verschiedenen Konzentrationen des in der Lösung vorliegenden bindungsfähigen Antikörpers gemessen wird. Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Alle Tests wurden als Doppelbestimmung durchgeführt. Lineare Verdünnungsreihen von ¹²⁵J-markiertem NB1/19 und NB1/48 wurden in Pufferlösung (0,8% BSA-EBSS+10 mM Hepes+0,1% NaN₃, pH 7,4) hergestellt durch genaues Einpipettieren unter Verwendung einer Hamilton-Injektionsspritze, die zwischen dem Gebrauch in den einzelnen Röhrchen 5mal gespült wurde. 25-µl-Anteile des ¹²⁵J-markierten Antikörpers wurden zu 1,5 ml Beckman-Mikrofugierröhrchen zugegeben, worauf 15 µl Puffer mit einem Gehalt an 2×10⁶ frischen Zellen der Gruppe B zugesetzt wurden. Die Probengemische wurden bei 4°C auf einer Rolle inkubiert. Nach 6 h wurden 1,5 ml eiskalte Pufferlösung rasch zugegeben und unmittelbar danach schloß sich eine 15 s lange Mikrozentrifugenbehandlung und die Entfernung des Überstands an, wobei die Zeit von der Zugabe des Puffers bis zum Einschalten der Mikrozentrifuge 2 bis 4 s betrug. In Vergleichs-Inkubationsversuchen wurden 2×10⁶ A₁-Zellen durch B-Zellen ersetzt und die Bindungswerte von ¹²⁵J-markiertem NB1/19 und NB1/48, die 1,2 bis 2,0% bzw. 0,9 bis 1,2% der zugesetzten bindungsfähigen Impulse betrugen, wurden von den Versuchswerten abgezogen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 wiedergegeben, wo die Menge an gebundenem ¹²⁵J-Antikörper (cpm×10^-3) aufgetragen ist gegen die Menge an zugesetztem bindungsfähigem Antikörper (µg) für NB1/19 und NB1/48. Anhand dieser Kurven ist es möglich, ein modifiziertes Scratchard-Diagramm der Gleichgewichtsbindungscharakteristika von ¹²⁵J-markiertem anti-B mit Gruppe B-Erythrocyten herzustellen. Ein derartiges Diagramm ist in Fig. 2 gezeigt, wo Werte für sowohl NB1/19 als auch NB1/48 wiedergegeben sind, wobei für letztere Verbindung die Kurve im vergrößertem Maßstab in dem Einsatzbild wiedergegeben ist. In beiden Fällen ergibt eine Extrapolierung auf die X-Achse die Menge an gebundenem Antikörper bei Sättigung.

Die Gleichgewichtskonstante kann aus dem Scratchard-Diagramm leicht errechnet werden.

Alternativ kann die funktionelle Affinität als eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für die Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes ausgedrückt werden, der zwischen einem Molekül aus monoklonalem anti-B-IgM und einer B-Determinante (des entsprechenden immunochemischen Typs) auf einem Erythrocyt gebildet ist. Die Dissoziationsgeschwindigkeits- oder Dissoziationsratenkonstante (im folgenden _k-1 bezeichnet) kann aus einer Kurve der Dissoziation mit der Zeit eines ¹²⁵J-markierten monoklonalen anti-B von Erythrocyten berechnet werden durch Messung des Gradienten einer Tangente an die Dissoziationskurve, die durch die Zeit 0 konstruiert ist.

In einem Versuch wurde die Dissoziationsrate von ¹²⁵J-markiertem anti-B-Antikörper von Gruppe B-Erythrocyten bei 4°C und RT gemessen unter Bedingungen eines Überschusses an kaltem Antikörper. 25-µl-Anteile von ¹²⁵J-markiertem NB1/19 (bindungsfähiger Antikörper: 6,0×10⁵ cpm, 50 ng) oder NB1/48 (9,0×10⁵ cpm; 124 ng) wurden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht, und danach 25 µl Puffer (0,8% BSA-EBSS+10 mM Hepes+0,1% NaN₃, pH 7,4), der 2×10⁶ Gruppe B-Erythrocyten enthielt. Die Gemische wurden bei 4°C auf einer Rolle inkubiert. Nach 1 h wurde zu 4 dieser Röhrchen 1,5 ml eiskalte Pufferlösung rasch zugesetzt und die Zellen wurden sofort pelletisiert mit einer 15 s Rotation einer Eppendorf-Mikrozentrifuge. Der Überstand wurde schnell entfernt und die Zellen wurden zur Messung der gebundenen Radioaktivität (cpm) überführt.

Zu den verbliebenen Teströhrchen, die 2 h lang inkubiert waren, wurden 25 µl eines 125fachen Ammoniumsulfatkonzentrats von NB1/19-Kulturüberstand, verdünnt 1/10 in Puffer, zugesetzt. Die 75-µl-Gemische wurden sodann bei 4°C oder RT auf einer Rolle inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten (15 min bis 24 h) wurden 1,5 ml kalte Pufferlösung zugegeben und die Zellen wurden sofort pelletisiert und wie oben angegeben gezählt. In Kontroll-Inkubationsversuchen wurden 2×10⁶ A1-Zellen anstelle der Gruppe B-Zellen eingesetzt und die Bindung von NB1/19 und NB1/48 nach einer Inkubation von 1 h bei 4°C, welche 1,1% bzw. 1,9% der zugesetzten Impulse betrug, wurde von den Versuchswerten abgezogen. Die Bindung wurde sodann ausgedrückt als Prozent der Impulse, die am Ende der 2h-Vorinkubationsperiode gebunden waren. 100% Bindung durch ¹²⁵J-markiertes NB1/19 und NB1/48 betrug 9,1×10⁴ cpm bzw. 715×10⁴ cpm.

Im endgültigen Reaktionsgemisch lag kaltes NB1/19 in mindestens 40fachem Überschuß über markierten Antikörper vor unter der Annahme, daß die Konzentration an monoklonalem Antikörper im Kulturüberstand mindestens 10 µl/ml beträgt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben, in der gezeigt wird:

a) die Dissoziation über eine 24-h-Periode und
b) die ersten 45 min, die auf eine vergrößerte Zeitskala aufgetragen sind.

In einem weiteren Versuch wurde die Dissoziationsrate von ¹²⁵J-markierten anti-B-Antikörpern von 2×10⁶ B- oder A₁B-Erythrocyten bei RT unter den Bedingungen eines Überschusses an kaltem Antikörper bestimmt. Die Versuchsbedingungen waren identisch mit denjenigen, die im Zusammenhang mit Fig. 4 beschrieben sind, jedoch mit der Ausnahme, daß nach der Zugabe von kaltem Antikörper zum Antigen-markierten Antikörperkomplex die Zellen pelletisiert wurden in 2-min-Intervallen während einer Zeitspanne von 10 min. Die Auswertung der Ergebnisse war ebenfalls identisch. Die folgenden Bedingungen und Werte wurden angewandt bzw. erhalten:

Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben, in der darstellen:

Kurve i) Erythrocyten der B-Gruppe und
Kurve ii) Erythrocyten der Gruppe A₁B.

Die funktionellen Affinitäten, die in den oben angegebenen Versuchen gemessen wurden, und die Eigenschaften, die durch andere, oben beschriebene Tests gemessen wurden, sind in den folgenden Tabellen 6 und 7 zusammengefaßt bezüglich der Wirkung von NB1/19.112.18 bzw. NB1/48.30.40.

Tabelle 6

Charakteristika des monoklonalen anti-B-Antikörpers NB1/19.122.28 auf B- und A₁B-rote Blutkörperchen

Tabelle 7

Charakteristika des monoklonalen anti-B-Antikörpers NB1/48.30.40 auf B- und A₁B-rote Blutkörperchen

Es wurden noch weitere Tests durchgeführt zur Untersuchung der Effizenz von NB1/19.112.28 als Blutgruppenbestimmungsreagens in automatischen Blutgruppenbestimmungsmaschinen, zur Untersuchung seiner Selektivität bei Verwendung von papainisierten roten Blutkörperchen und zur Untersuchung seiner thermischen Stabilität.

Automatische Blutgruppenbestimmungstests wurden durchgeführt mit dem neuesten Autogrouper 16C mit optischer Dichteablesung und Microprocessor-Ausdruck. Die Reagenzien wurden verstärkt durch Verwendung von 1% Methylcellulose und 0,25% Bromelin.

Monoklonaler Antikörper NB1/19.112.28 - Kulturüberstand, verdünnt 1 in 15, wurde im Autogrouper 16C getestet mit 844 Citrat-versetzten Spenderblutproben. Die in der folgenden Tabelle 8 aufgeführten Ergebnisse waren aufgezeichnet und waren die gleichen, wie sie mit BGRL-anti-B, verdünnt 1 in 10, von den gleichen Proben erhalten wurden. Keines der Reagentien ergab falsche positive oder falsche negative Resultate.

Tabelle 8

Automatische Blutgruppenbestimmung von Spenderblut mit monoklonalem anti-B NB1/19.112.28

In den oben beschriebenen Röhrchen- und Platten-Salzlösungstests und in den automatisierten Tests unter Verwendung von Zellen, die mit 1% Methylzellulose und 0,25% Bromelin verstärkt worden waren, reagierte monoklonales anti-B niemals mit A₁- oder 0-Zellen. Die anti-B-Spezifität von NB1/19.112.28 wurde auch beibehalten mit papainisierten roten Blutkörperchen und unter Verwendung von 20% Albumin, wie die folgende Tabelle 9 zeigt. Erkennbare Verstärkung von NB1/19.112.28-Agglutinationsaktivität war in diesen Test festzustellen und besonders ausgeprägt mit A₁B-Zellen, die mit Papain versetzt waren.

Tabelle 9

Auswirkung von Papain und 20% Albumin auf Agglutinationstiter bei Raumtemperatur

Zur Durchführung der Stabilitätstests wurden aliquote Teile von 2 ml unverdünntem NB1/19.112.28-Kulturüberstand verschiedenen Bedingungen ausgesetzt und danach bei Raumtemperatur erneut auf Titer und Avidität getestet.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen führte zu keiner Verminderung der anti-B-Aktivität, wie sich aus der folgenden Tabelle 10 ergibt.

Tabelle 10

Stabilität von monoklonalem anti-B (NB1/19.112.28) gegenüber Einfrieren/Auftauen

Die durchgeführten Tests zur Bestimmung der thermischen Stabilität über kurze Zeitspannen zeigten, daß monoklonales anti-B stabil ist bei der Lagerung bei -20°C und 4°C und bei der Inkubation bei 56°C, wie die folgende Tabelle 11 zeigt.

Tabelle 11

Temperaturempfindlichkeit von NB1/19.112.28

Der unverdünnte Kulturüberstand hatte eine Wirksamkeit, die mindestens gleich derjenigen eines hyperimmunen handelsüblichen Reagenz war, ohne daß Zusätze verwendet wurden. Er ergibt eine rasche Plattenreaktion mit dichter Agglutination, die geeignet ist zur Bestimmung der schwächeren Typen von B (A₁B- und B cord-Zellen), mit denen der Fachmann bei der routinemäßigen Blutgruppenbestimmung befaßt ist. Er kann auch in zuverlässiger Weise für automatisches Ausdrucken von Blutgruppen verwendet werden.

Zweimal klonierte Antikörper-produzierende Hybridzellenlinien wurden angepaßt an das Wachstum in großen Gewebekulturgefäßen und, nach wiederholter Passage, sekretieren sie kontinuierlich Antikörper mit gleichförmigen Eigenschaften. Große Volumen aktiven Kulturüberstands, die durch kontinuierliches Wachstum erzeugt sind, haben den Vorteil, daß sie weitaus weniger Auslesetests benötigen, als zur Zeit zur Erzeugung des gleichen Volumens Human-Reagenz aus einer großen Zahl von individuell ausgewählten Serumspendern erforderlich sind, was die Testsarbeitsbelastung wesentlich erleichtert. Außerdem können die ohnehin niedrigen Kosten (zur Zeit etwa £5) für Materialien, die zur Herstellung von 1 l wirksamen Kulturüberstand benötigt werden, noch weiter vermindert werden durch Verwendung eines angemessen verdünnten Präparats von aktivem Überstand (vergleiche Tabelle 5).

Claims

1. Monoklonaler Antikörper mit Spezifität für eine Antigendeterminante eines Blutkörperchens vom B-Typ, erhältlich aus Hybridomzellen, die durch Fusion einer Myelomzelle mit einer Milzzelle von einer Maus, der humanes Blut B-Antigen injiziert wurde, gewonnen sind.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der eine Agglutination mit einer Probe von Blutkörperchen vom B-Typ bewirkt.

3. Monoklonaler Antikörper nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der von Maus-Milzzellen abstammende Antikörper eine Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und den Blutkörperchen vom B-Typ aufweist, die größer als 1,3×10⁷ M^-1 ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und den Blutkörperchen vom B-Typ größer als 1,2×10⁸ M^-1 ist.

5. Monoklonaler Antikörper nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der von Maus-Milzzellen abstammende Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und den B-Typ-Blutkörperchen der Blutgruppe B aufweist, die kleiner als 2,2×10^-2 s^-1 ist.

6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und dem B-Typ-Blutkörpcherchen der Blutgruppe B kleiner als 7,6×10^-4 x^-1 ist.

7. Monoklonaler Antikörper nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der von Maus-Milzzellen abstammende Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und B-Typ-Blutkörperchen der Blutgruppe A₁B aufweist, die kleiner als 5,0×10^-2 s^-1 ist.

8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und B-Typ Blutkörperchen der Blutgruppe A₁B kleiner als 3,4×10^-3 s^-1 ist.

9. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelle, die zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-8 fähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß man einer Maus humanes Blut-B Antigen injiziert, die Maus tötet, ihr die Milz entnimmt und eine Suspension von Milzzellen bildet,

- die Milzzellen mit Maus-Myelomzellen unter Bildung von Hybridomzellen dusioniert und
- die Hybridomzellen kloniert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Myelomzellen NS1-Zellen einsetzt.

11. Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nach den Ansprüchen 9 und 10 erhältliche Hybridomzelle verwendet.

12. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach den Ansprüchen 1 oder 2 als Reagenz zur Blutgruppenbestimmung.