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Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum
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Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen
oder Humanhämoglobinvarianten.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern
und die Verwendung von diesem zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin,
Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten.
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Es ist bekannt, daß der Nachweis von Humanhämoglobin durch einm Latex-Agglutinationstest
durchgeführt werden kann.
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Bei diesem Test geht man von entsprechenden Antiseren oder Antikörpern
aus, die durch Immunisierung von Kaninchen oder Ziegen gegen Humanhämoglobin erhalten
werden können.
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Bei der Herstellung eines bekannten Latextestreagenz* werden zunächst
nach einer Erhitzungsstufe des Serums der immunisierten Tiere die heterophilen Antikörper
durch Absorption an lyophylisierten, formalinisierten Schafserythrozyten entfernt
und nach der Zugabe von Rivanol-Lösung zu dem Antiserum-überstand wird dieser zentrifugiert
und der dabei erhaltene Überstand mehrmals mit Aktivkohle und nachfolgenden Zentrifugieren
bis zu dessen Klärung behandelt, wonach eine Lyophylisation des geklärten Überstandes
erfolgt. - Das Lyophylisat wird in einer neutralen Kochsalzlösung aufgelöst und
diese Lösung mit handelsüblichen Polystyrol-Latexteilchen behandelt, wobei eine
Beschichtung der Latexteilchen durch Schütteln erfolgt.
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Zur Herstellung eines gebrauchsfähigen Testreagenzes wird diese Latex-Lyophylisat-Mischung
mit Kochsalzlösung weiter verdünnt.
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Eine praktische Anwendung dieses bereits bekannten Testreagenz hat
gezeigt, daß es außerordentlich wünschenswert ist, dessen Empfindlichkeit gegenüber
dem nachzuweisenden Hämoglobin zu vergrößern.
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* E C Adams, K M Layman, Annals of Clinical and Laboratory Science
Band 4 (1974) S.343 ff.
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Neben einer großen Empfindlichkeit beim Nachweis von Humanhämoglobin
sollen weitere Vorteile durch das erfindungsgemäß erhaltene Latexreagenz erreicht
werden, wie z.B. eine außerordentlich gute Spezifität und eine einwandfreie Negativkontrolle.
Dabei sollen die genannten Vorteile auch nach einer Lagerung von vielen Monaten
erhalten bleiben.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines
Latexreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1. aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper
oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit Ammoniumsulfat ausfällt und
abzentrifugiert, 2. die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung
in einem zweiten wässrigen Medium bis zur Sulfatfreiheit dialysiert, 3. die dialysierte
Antikörper(bzw. Antikörperfragment)-fraktion mit einer wässrigen Suspension von
Polystyrol-Latexteilchen vermischt und 4. vorzugsweise bei einer Temperatur von
00C bis 100°C stehen läßt und 5. anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven
Mittel der allgemeinen Formel
worin R eine aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen und
a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und
c vorzugsweise 5 bis 200 ist und gegebenenfalls Polyvinylpyrrolidon versetzt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren geht von Humanhämoglobin-Antikörpern
oder Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern bzw.F(ab)'Fragmenten dieser Antikörper
aus. Wenn auch Verfahren zur Herstellung dieser Ausgangsmaterialien allgemein zum
Stand der Technik gehören, solle die wichtigsten Gesichtspunkte bei der Herstellung
von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wie sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
angewendet werden können, im folgenden kurz angegeben werden: Antikörper gegen Humanhämoglobin
können beispielsweise durch entsprechende Immunisierung von Tieren erhalten werden.
Dabei sind in der Praxis eine Vielzahl von Tieren geeignet, wie beispielsweise Mäuse,
Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Katzen, Hunde, Rinder,Schafe, Schweine, Pferde,
Affen, Ziegen, Enten,Hühner und auch Fische, z.B. Karpfen etc. Wegen der günstigen
Haltungskosten werden dabei insbesondere Kaninchen, Ziegen und Mäuse bevorzugt.
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Geeignete Immunisierungsverfahren mit den genannten Tieren sind beispielsweise
von Adams? EC,Layman, KM: in"Immunochemical Confirmation of Gastrointestinal bleeding:
Annals of Clinical and Laboratory Science 4(1974)343ff." und von Burton, RM et al.:
inAppearance,Properties and Origin of altered Human Hemoglobin in Feces; Laboratory
Investigation 35(1976) ff." beschrieben worden.
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Allgemein gilt, daß die Tiere durch Injektion in Kontakt mit dem Antigen
(d.h. Humanhämoglobin und Humanhämoglobinbestandteile) kommen, wobei fast immer
mehrere Injektionen benötigt werden. Die zeitlichen Abstände zwischen den einzelnen
Injektionen, zweckmäßige Antigenmengen, die Art der Injektion und die gegebenenfalls
zusätzliche Verwendung eines Adjuvanten kann von jedem Fachmann anhand des vorliegenden
Einzelfalles ohne weiteres bestimmt werden.
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Neben dieser "in vivo-Immunisierung11 sind auch Methoden der "in vitro-Immunisierung"
bekannt, wobei nicht das Tier sondern Zellen eines Tieres oder sogar eines Menschens
direkt in der Zellkultur mit dem Antigen in Kontakt gebracht werden. Bei dem letztgenannten
Verfahren entnimmt man Zellen z.B. aus nicht immunisierten Tieren und bringt sie
in der Zellkultur erstmals mit dem Antigen zusammen, so daß also die primäre Immunantwort
in vitro ausgeführt wird.
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Derartige Methoden wurden beispielsweise in folgenden Literaturstellen
beschrieben: von Mishell, RJ, Dutton RW in: "Immunization of disßociated spleen
cell.cultures from.normal mice; J.Exp.Med.126 (1967) 423 ff."; von Marbrook, J:
in "Primary immune response in cultures of spleen cells; Lancet II (1967),1279 ff."
und von Lefkovits, I in: "Induction of antibody forming cell clones in microcultures;
Europ. J. Immunol.2 (1972), 360 ff".
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Bei den in diesen Literaturstellen beschriebenen Kulturmethoden werden
Nährmedien benutzt, die durch spezielle Zusatzstoffe und foetales Kälberserum (FCF)
ergänzt worden sind, und die Zellen nach Zugabe des Antigens für einige Tage bei
einer Temperatur von z.B. 37 C inkubiert, wobei sehr oft eine C02-Begasung durchgeführt
wird. Die Zellen werden anschließend von toten Zellen und vom Antigen in an sich
bekannter Weise gereinigt. Sie können auch in geeigneten Fällen fusioniert werden,
wie dieses nachfolgend noch beschrieben wird.
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Zellkulturen können aber auch zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
verwendet werden. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Humanhämoglobin
und Humanhämoglobinbestandteile ist bekannt und beispielsweise von "Stamatoyannopoulos
et al. in:"Mapping of antigenic sites on human haemoglobin by means of monoclonal
antibodies and haemoglobin variants; Lancet II (1981) 952 fr. beschrieben.
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Zur Durchführung dieser Methode kann beispielsweise wie folgt vorgegangen
werden:
Zunächst werden Mäuse mit Humanhämoglobin immunisiert.
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Nach erfolgreicher Immunisierung, die sich durch einen hohen Spiegel
an anti-Humanhämoglobin-Antikörpern im Serum anzeigt, werden die Mäuse getötet und
Milz und Lymphknoten entfernt. Die in den Geweben dieser Organe enthaltenen Zellen
werden isoliert und mit einer 8-Azaguanin-resistenten genetisch identischen Myelanzellinie
fusioniert, in dem sie in zweckmäßig gen Konzentrationen unter Zugabe von Polyäthylenglykol
zusammengegeben werden. Anschließend werden die Zellen in einem Selektivmedium aufgenommen.
Nach etwa 10 bis 14 Tagen werden die ersten Kolonien für das bloße Auge sichtbar,
und es kommt zu einer pH-Wert-Verschiebung im Nährmedium der Zellen. Man kann die
überstände der Zellkulturen aus der Kulturplatte abnehmen und alf Antikörperaktivität
überprüfen. Wenn die überstände die gewünschten Antikörper enthalten, werden die
entsprechenden Zellen der Kulturplatte in Platten und Kulturflaschen weiter vermehrt.
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Zur Herstellung von besonders hochkonzentrierten Antikörperlösungen
appliziert man die-Antikörper-produzierenden Zellen in den Bauchraum von Mäusen,
wobei diesen vorzugsweise wenige Tage zuvor ein für diesen Zweck im Handel angebotenes
Mineralöl in den Bauchraum gespritzt worden ist. Nach einigen Wochen entwickelt
die Maus eine große Menge an Aszites(=Bairhraumflüssigkei, Tumorzellen und oft auch
solide Tumore, an denen die Maus meistens zugrundegeht. Die Aszites-Flüssigkeit
enthält die gewünschten Antikörper in sehr hoher Konzentration.
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Bei der Kombination von der "in vivo-Immunisierung" mit der "in vitro-Immunisierung"
wird das Tier in oben beschriebener Weise immunisiert,und anschließend werden die
Zellen von Milz und Lymphknoten zusätzlich in der Zellkultur mit dem Antigen inkubiert.
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Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte tierische Serum,
der Zellkulturüberstand oder die Aszites-Flüssigkeit enthalten neben den Antikörpern
bzw. Antikörperfragmenten weitere Proteine, so daß es zweckmäßig ist, eine mit Antikörpern
angereicherte Fraktion auszufällen.
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Diese Ausfällung kann erfindungsgemäß mit festem Ammoniumsulfat vorgenommen
werden. Nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt
man zu diesem Zweck in der Kälte bei etwa O bis 40C dieses Salz hinzu, bis eine
zweckmäßige Konzentration erreicht ist.
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Es ist aber auch möglich, eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung in
Wasser tropfenweise zuzugeben. Gute Ergebnisse werden mit einer Konzentration zwischen
106 bis 291 g, insbesondere etwa 187 g Ammoniumsulfat pro Liter Antikörperhaltiger
Flüssigkeit erhalten. Diese Werte entsprechen etwa einer Endkonzentration von 20
bis 50 %, insbesondere von 33 % Sättigung.
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Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig in Lösung gegangen ist, ist
es vorteilhaft, die Flüssigkeit für weitere 0,5 bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis
2 Stunden zu rühren.
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Die Temperatur, bei der die Ausfällung mit Ammoniumsulfat vorgenommen
wird, ist nicht entscheidend und kann über einen weiten Bereich variieren. Einerseits
wird in der Wärme eine größere Proteinmenge ausgefällt als in der Kälte, andererseits
wird bei einem Arbeiten in der Kälte die enzymatische Aktivität von gegebenenfalls
anwesenden Proteinasen verringert.
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Anschließend wird der Antikörper-haltige Niederschlag zweckmäßig hochtourig
abzentrifugiert und der Überstand dekantiert und verworfen.
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Der Niederschlag wird zweckmäßig in einem Bruchteil des Volumens der
Ausgangsflüssigkeit (beispielsweise ein FünftelY in'einem wässrigen Medium im e.infachsten
Fall in Aqua dest. gelöst.
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Dieses kann vorzugsweise an sich bekannte Puffer, Salze bzw. Serum-Albumin,
Casein oder Gelantine enthalten und einen pH-Wert von 5 bis 10,
vorzugsweise
von 7,2 + 0 ,8 aufweisen, wobei die Molarität zweckmäßig höchstens 2 Mol/Liter beträgt.
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In an sich bekannter Weise wird dieses wässrige Medium bis zur Sulfatfreiheit
gegen ein wässriges Medium dialysiert.
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Es wird bevorzugt, daß dieses wässrige Medium Puffer, vorzugsweise
Phosphatpuffer nach Sörensen enthält und einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise
7,2 + 0,8 und eine Salzkonzentration von maximal 1 Mol/Liter, vorzugsweise unter
0,1 Mol/1iter aufweist. Die Zusammensetzung der zu dialysierenden Lösung und der
wässrigen Lösung gegen die die Dialyse erfolgt, kann dabei identisch sein.
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Durch die Maßnahme der Stufe 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt
es zu einer unspezifischen Anlagerung von den anwesenden Proteinen an der Oberfläche
von den anwesenden Polystyrol-Latexteilchen. Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt,
die Latextteilchen in Form einer wässrigen Suspension zu verwenden, wie sie im Handel
ist.
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Nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
liegt im fertigen Latextestreagenz eine Polystyrolsuspensiop vor, welche etwa 0,1
bis 12 Gew.-% Feststoffteilchen enthält. So gibt es handelsübliche Polystyrolsuspensionen
mit 10% Festbestandteilen, welche ggf. auch kleine Mengen an Hilfsstoffen, wie beispielsweise
Stabilisatoren, Antioxidationsmittel usw. enthalten können, und diese können bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren unverändert eingesetzt werden.
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Die zweckmäßige Menge an Latexteilchen im gebrauchsfertigen Te:streagenz
hängt davon ab, daß es im allgemeinen vorteilhaft ist, daß eine Agglutination, welche
bei der bestimmungsmäßigen Verwendung des Reagenz Humanhämoglobin bzw. Humanhämoglobinbestandteile
anzeigt, mit dem bloßen Auge festgestellt werden kann.
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Die TeilChndurchmesser des Polystyrollatex- variieren über einen sehr
weiten Bereich. So können entspre-
chende Latexpartikel mit einem
Durchmesser von 0,0018 bis zu einem Durchmesser von 100 Mikrometer verwendet werden,
wobei ein Labis texteilchen-Durchmesser von 0,005 bis 5linsbesondere 11Mitr«eter
bevorzugt wird.AucEs m dieser Hinsicht ist es zweckmäßig, auf einen Durchmesserbereich
der Latexteilchen zurückzugreifen, welcher in leicht verfügbaren Handelspräparaten
gegeben ist.
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Es liegt in der Natur der Sache, daß die für die Ablagerung der Proteine
verfügbare Oberfläche der suspendierten Polystyrolteilchen von deren Teilchengrößenbereich
abhängt. Je kleiner die Größe der Polystyrolteilchen ist, desto mehr Oberfläche
der Teilchen steht zur Verfügung. Für einen Fachmann ist es dabei ohne weiteres
möglich, für einen gegebenen Teilchengrößenbereich durch einfache Vorversuche eine
für die gewünschte Anlagerung der Proteine ausreichende Menge der Polystyrolteilchen
zu bestimmen. Wird beispielsweise ein Polystyrollatex mit Teilchengrößen von 0,305
Mikrometern oder 0,312 Mikrometern (wie sie bei bestimmten Handelspräparaten gegeben
sind) eingesetzt, so werden mit 5 ccm Suspension mit einem Gehalt von 2 Gew.-% Feststoffteilchen
für 0,5 ccm einerAntikörperfraktion mit etwa 10-20 mg Proteingehalt außerordentlich
gute Ergebnisse erhalten. Es können zum Beispiel bei den oben angegebenen Teilchengrößen
der Polystyrolteilchen auch etwa 10 ccm der Suspension mit 1% des Teilchengehalts
verwendet werden, um beispielsweise 33 mg Protein in 1 ccm Antikörperfraktion zu
binden.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Polystyrollatex--Suspension
mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnt oder das Suspensionsmedium durch diese
vollständig ersetzt. Als Lösungs- oder Verdünnungsmittel für das erfindungsgemäße
Verfahren werden in der Regel blutisotone System verwendet. Als einfachstes Lösungs-bzw.
Verdünnbngsmittel ist 0,9%ige Kochsalzlösung zu nennen, welche gegebenenfalls einen
geeigneten Puffer, wie Phosphatsalz oder Glycin oder Tris-HCl enthält.
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Vorzugsweise werden an dieser Stelle des erfindungsgemäßen Verfahrens
Glycin-gepufferte Kochsalzlösungen eingesetzt, wobei die pH-Werte von 5 bis 10 besonders
bevorzugt werden. Die Pufferlösungen können zweckmäßig Salze, Albumin und/oder Gelatine
bzw. Casein enthalten. Niedermolare Tris-HCl-Puffer oder Phosphatpuffer, welche
bereits bekannt sind, können erfindungsgemäß ebenfalls angewendet werden.
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So kann zur Verdünnung der Polystyrolsuspension beispielsweise eine
Glycin-gepufferte Kochsalzlösung verwendet werden welche eine Molarität von 0,001
bis 2 Mol/Liter, vorzugsweise von 0,01 bis 1,5 Mol/Liter Glycin und NaCl, insbesondere
von 0,I bis 0,9 Mol/Liter Glycin und von 0,1 + 0,05 Mol/Liter NaCl aufweist.
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Wie bereits oben angegeben, können als Polystyrollatices handelsübliche
Präparate verwendet werden. Insbesondere solche mit einem Anteil an Festbestandteilen
von 10% sind erfindungsgemäß außerordentlich gut geeignet. Unter dem Begriff "Polystyrol"
sollen sowohl Homo- als auch Mischpolymerisate von Polystyrol und Polystyrolderivaten
verstanden werden. So sind beispielsweise Latices aus Mischpolymeren von Styrol
und Butadien, insbesondere in einem Verhältnis von etwa 95:5 bis 60:40 Gew.-t, aus
t.-Butylstyrol und Vinyltoluol, und aus Styrol und Divinylbenzol (beispielsweise
in einem Verhältnis von 95:5 Gew.-%) erfindungsgemäß sehr gut verwendbar.
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Die dialysierte Antikörper- bzw. Antikörperfragmentfraktion enthält
normalerweise einen beträchtlichen Anteil an Begleitproteinen, wie beispielsweise
Globuline und Albumine.
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Sofern das nicht der Fall ist, ist es zweckmäßig, der für die Beschichtung
verwendeten Antikörperfraktion bzw. Antikörperfragmentfraktion geeignete Proteine
hinzuzugeben,
wofür beispielsweise ein Rinderserumalbuminzusatz
vorteilhaft ist. Der Anteil der Begleitproteinen,bezogen auf die Antikörperfraktionen,
kann über 20%, beispielsweise etwa 20-30% betragen.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die mit der Polystyrolsuspension versetzte Antikörperfraktion zunächst 30 Minuten
bis etwa 24 Stunden (beispielsweise 11+ 3 Stundenjbei Zimmertemperatur belassen,
wobei es zweckmäßig ist, zumindest während eines Teiles dieser Zeit mechanische
Maßnahmen, wie Rütteln, Schuütteln oder Schwenken vorzusehen. Danach ist es zweckmäßig,
die Mischung unter Abkühlung beispielsweise auf 40C für wenigstens 8 Stunden stehen
zu lassen. Dieses Stehenlassen unter Abkühlung kann durch ein Abzentrifugieren und
Abdekantieren nach der oben angegebenen halbstündigen bis 24-stüntligen Handlung
ersetzt werden.
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Als wichtige Maßnahme des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die
Mischung, welche den Polystyrollatex mit der Antikörperfraktion enthält, mit einer
ein oberflächenaktives Mittel der allgemeinen Formel
worin R eine aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen und
a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und
c vorzugsweise 5 bis 200 ist,'enthaItenden Lösung versetzt.
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Die Menge dieses oberflächenaktiven Mittels kann bisl Vol-% DiS vorzugsweise
von 0,0001 bis 0,2 Vol-%, insbesondere
0,015 + 0,1 Vol-%, bezogen
auf das Volumen der Gesamtlösung betragen.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als oberflächenaktives
Mittel der obengenannten Formel ein solches verwendet, bei dem R einen Laurylrest
bedeutet und die Summe der Indizes a, b und c etwa 20 ist, Es ist sehr vorteilhaft,
wenn die oben beschriebene Lösung auch Polyvinylpyrrolidon enthält. Dieses wird
in einer Menge verwendet, daß das Polyvinylpyrrolidon in einer Konzentration von
0,0001 Gew.-% bis 5 Gew.-%, insbesondere von etwa 0,1 oder 0,2 Gew.-% in dem Latereagenz
vorhanden ist.
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Auch das Polyvinylpyrrolidon ist in erfindungsgemäß geeigneter Form
als Handelsprodukt erhältlich. Es kommen insbesondere Materialien mit einem Molekulargewicht
von 1000 bis 400 000 in Betracht. Insbesondere können Vinylpyrrolidonpolymere mit
einem K-Wertvon 10 bis 90, beispielsweise 30 bis 90 ganz speziell mit einem K-Wert
von 40 mit gutem Erfolg eingesetzt werden.
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Es wurde bereits oben darauf hingewiesen, daß es vorteilhaft ist,
wenn die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Lösungen anorganische
Salze, vorzugsweise Puffer enthalten. Dabei ist es vorteilhaft, Salzmengen von 0,001
bis 1,0 Mol bezogen auf die Gesamtlösung des Polyvinylpyrrolidons zu verwenden.
Auch in diesem Falle gibt ein Phosphatpuffer, welcher der Lösung einen pH-Wert von
5-10, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,6 vermittelt, sehr gute Ergebnisse.
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Im übrigen gelten für den Salzzusatz und die Puffermittel diejenigen
Ausführungen, welche bereits oben für andere Behándiungslösungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens gemacht worden sind. ~ ~ ~
Die Lösung mit der Antikörperfraktion
bzw. Antikörperfragmentfraktion, dem oberflächenaktiven Mittel und gegebenenfalls
dem Polyvinylpyrrolidon ist das gebrauchsfertige Latexreagenz, welches die bereits
oben genannten Vorteile gegenüber entsprechenden Reagenzien nach dem Stand der Technik
aufweist. Es ist über Monate bzw. sogar Jahre hinweg lagerungsfähig.
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Das erfindungsgemaß hergestellte Latextestreagenz kann zum Nachweis
und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humane hämoglobinbestandteilen oder
Humanhämoglobinvarianten in einer Vielzahl von verschiedenen Materialien durchgeführt
werden. So sind entsprechende Untersuchungen von praktisch allen physiologischen
Körperflüssigkeiten, wie z.B. Serum, Plasma, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit,
Magensaft, Duödenalsaft, Galle,Pankreasekret, Schwei4Liquor, Gelenkpunktate (Synovialsekret-),
Fruchtwasser, Lymphe, Ejakulat, Muttermilch und Sputum möglich,insbesondere ist
aber der zuverlässige Nachweis von Blut im Stuhl zur medizinischen Diagnose außerordentlich
wichtig. Mit gutem Erfolg ist auch die gewünschte Bestimmung in allen Körperspulflüssigkeiten,
wie Bronchiallavage- Flüssigkeit, Magenspülflüssigkeit, Drainageflüssigkeit, aber
auch in pathologischen Körperflüssigkeiten, wie Eiter, seröse Wundsekrete, Aszites,
Perikard und sonstige Ergüsse, Abszess-und sonstige Punktate von Zysten, Erbrochenes,
Inhalt von blasenartigen Hauterkrankungen, inklusive der Schleimhaut, möglich. Schließlich
kann der Nachweis und Differenzierung von Hämoglobin und den oben genannten Hämoglobin-artigen
Stoffen auch in angefertigten Extrakten, welche z.B. in der Gerichtsmedizin aus
Stoffen oder von Flächen entfernten Materialien gewonnen werden, mit dem erfindungsgemäß
hergestellten Latextestreagenz vorgenommen werden.
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Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß mit dem erfindungsgemäß hergestellten
Latextestreagenz die Anzahl falscher Ergebnisse, d.h. fehlende Anzeige von Hämoglobin,
obwohl dieses im zu untersuchenden Material vorhanden ist oder das Auftreten von
Agglutination trotz fehlendem Hämoglobin oder Hämoglobin-artigen Stoffen, beträchtlich
reduziert werden kann. Diese volle Spezifität und einwandfreie Negativkontrolle
bleibt auch nach einer Lagerung von vielen Monaten erhalten.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher
erläutert:
Beispiel 1.
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Aus dem Serum des Blutes einer gegen Humanhämoglobin immunisierten
Ziege wurd'en die Antikörper in folgender Weise aufbereitet: Die Antikörper wurden
durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Serum bis zu einer Endkonzentration von 33%
der Sättigung ausgefällt und abzentrifugiert. Die ausgefällte Antikörperfraktion
wurde danach' in 52 mM einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 aufgelöst
und gegen denselben Puffer bis zur Sulfatfreiheit dialysiert.
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Eine handelsübliche Polystyrol-Latexsuspension, bei der der Durchmesser
der Latexteilchen etwa 0,305 pm betrug, wurde in einem Volumensverhältnis von 1
(Latexsuspension) zu 4 'gepufferte Kochsalzlösung) mit einer Glyzin-gepufferten
Kcchsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75 gut vermischt. Diese Glyzin-gepufferterKochsalzlösung
war vorher hergestellt worden, indem 467 ccm einer 2 m Glyzinlösung in Wasser zunächst
mit 100 ccm einer 1 m Natriumlauge vermischt wurden.Diese Mischung wurde dann im
Volumenverhältnis von 1:1 mit 0,9 %iger Kochsalzlösung gemischt.
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Zu 5 ccm der verdünnten Polystyrollatex-Suspension wurden nun 0,5
ccm der oben erhaltenen Lösung der Antikörperfraktion zugegeben, wobei in dieser
16,5 mg Protein in den verwendeten 0,5 ccm der Lösung enthalten waren. Es wurde
wiederum gut gemischt.
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Die so erhaltene Mischung wurde zunächst 12 Stunden bei Raumtemperatur
und danach weitere 12 Stunden bei 40C stehengelassen.
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Danach wurden die 5,5 ccm der beschichteten Latexsuspension mit der
gleichen Volumenmenge einer Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung verdünnt, die sowohl
Polyvinylpyrrolidon als auch ein bestimmtes oberflächenaktives Mittel enthielt.
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Diese Lösung war dadurch erhalten worden, daß man zu der bereits oben
beschriebenen Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung 0,1 Vol/tol.% eines oberflächenaktiven
Mittel der obenstehenden FormelI,bei dem R einen Laurylrest bedeutet und die Summe
der Indizes a, b und c etwa 20 ist, zugab. Des weiteren wurde zu der Pufferlösung
auch noch 0,2 Gew/Vol.% an Polyvinylpyrrolidon mit einem k-Wert von 40 zugefügt.
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Die so erhaltene Lösung ist ein Latextestreagenz, welches zum Nachweis
und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobin-Bestandteilen oder
Humanhämoglobin-Varianten mit großem Erfolg verwendet werden kann.
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Beispiel 2.
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Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch ein Polystyrollatex
verwendet wurde, bei dem der Durchmesser der Polystyrollatexteilchen 0,312 pm betrug.
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Beispiel 3.
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Das Verfahren von Beispiel wurde wiederholt, jedoch wurde als Glyzin-gepufferte
Kochsalz lösung eine solche mit einem pH-Wert von 8,2 verwendet, welche 7,505 g
Glyzin; 1 g NaN3; 5,846 g NaCl auf 2 Liter Wasser enthielt. Die Konzentration des
Kochsalz war also 0,1 molar.
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Beispiel 4.
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Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch betrug die Konzentration
an Polyvinylpyrrolidon in der Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung 0,1 Gew./Vol.%.
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Beispiel 5.
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Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde 1 ccm
der Polystyrollatex-Suspension mit 9 ccm der 0,1 m Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung
vermischt. Dazu wurden danp 1 ccmder Antikörperfraktion gegeben, welche also 33
mg Protein enthielten.
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Beispiel 6. (Nachweis von Humanhämoglobin im Stuhl) 1 ccm der in Beispiel
1 verwendeten Glyzin-gepufferten Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75, welche
0,005 % des in Beispiel 1 genannten oberflächenkativen Mittels enthielt, wurden
zu 0,1 bis 0,2 g Stuhl hinzugefügt.
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Nach gründlichem Vermischen wurde zentrifugiert und der Überstand
nochmals durch ein Filter mit 0,45 pm Porenweite filtriert. Das Filter war vorher
mit Glyzin-gepufferter Kochsalzlösung, welche einen Zusatz von 1 SO Albumin enthielt,
vorgespült worden.
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10 ccm Stuhl Suspension wurden danach mit 10 ccm eines Latexreagenz
nach den Beispielen 1-5 vermischt. Bei Anwesenheit von Hämoglobin war nach 1-2 Minuten
die Agglutination mit dem bloßen Auge festzustellen.
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Es ist ersichtlich, daß es vorteilhaft ist, wenn die zu untersuchenden
Materialien in einer isotonen Lösung, beispielsweise einer gepufferten Kochsalzlösung,
die ein oberflächenaktives Mittel der Formel I zweckmäßig in einer Menge bis zu
1 Vol-% gelöst oder suspendiert werden.