DE1920866A1

DE1920866A1 - Reagens fuer einen diagnostischen Test auf Mononucleosis infectiosa und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1920866A1
Application number: DE19691920866
Authority: DE
Inventors: Lerner Robert A
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1968-04-30
Filing date: 1969-04-24
Publication date: 1969-11-20
Also published as: FR2007288A1; CH511029A; CA941739A; NL6906598A; AT291438B; GB1252092A; BE732149A; US3840655A

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT, DIPLOMCHEMIKER

5 EDLN-LINDENTHAL FBTEK-KINTGEN-STRASSB S

Köln, 21. April I969

. Eg/Ax

Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey,

U.S.A.

Reagens für einen diagnostischen Test auf Mononucleosis infectiosa und Verfahren zu seiner Herstellung

Antikörper der Mononucleosia infectiosa des. Menschen sind heterophil, d.h. sie reagieren mit Antigeneh, die nicht rtir ihre Erzeugung verantwortlich sind, Beispielsweioe agglutinieren Antikörper der Mononucleosis infectioaa-aes Menschen bekanntlich mit Hammel- und Pferdeerythrozyten und speziell behandelten Rindererythrozyten. LinerAnzahl von bekannten diagnostischen Tests auf MononucleosLs infectiosa liegt diese Reaktion zu Gründe. Leider ist die Agglutination von Hammel- und Pferdeerythrozyten nicht spezifisch für Antikörper der Mononucleosis infectiosa. Die tritt auch mit Porssmann-Antikörpern auf, so daß ein direkter Agglutinationstest auf Mononucleosis nioht darauf basiert werden kann.

Dieses Problem wird ζ»Zt. -durch Differentialabsorption des zu testenden Serums überwunden. Beispielsweise ist es bekannt, daß nach Absorption von Seren von Mononucleosis infectiosa mit Meersohweinchennierensuspension die Seren noch mit Pferdeerythr'ozyten agglutinieren. Nach Absorption mit Rindererythrozytenstroma agglutinieren die Seren von Mononucleosis infeotiosa mit den Pferdeerythrozyten in nur etwa 30$ der Fälle· Nur etwa 10^ der normalen Seren oder Forssmann-Antikörper enthaltenden Seren agglutinieren

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BAD ORiGiNAl

mit den Pferdeerythrozyten nach. Absorption mit fceex·- schweinchennierensuspension oder Rindererythrozyten's tröma, und die Seren, die agglutinieren, zeigen in sieben von zehn Fällen frühere und/oder stärkere Agglutination naxih Absorption mit dem Rindererythrozytenstronia "als nach Absorption mit der Heeracnv.'einchennieref.saspen-'si on.' Die verbleibenden drei, von zehn Eällen zeigen nur * Agglutination nach Absorption mit Hammelerythroaytenstroma. · - ;

Bei der Durchführung des Tests, der von den zur Zeit ver-? fügbaren Tents am häufigsten angewandt wird,.wird somit das zu testende Serum auf einer Hälfte eines Objektträgers mit Meersoheinchennierensuspension und auf einer zweiten Hälfte eines Objektträgers mit dem Rindererythrozytenstromakombinie.rt.Die Pferdeerythrozyten v.erden zugesetzt, und wenn nach 1 Hinute das Serum auf dem Objektträger, der die Meerschweinchennierensuspension enthält, früher und stärker agglutiniert als auf dem Objektträger, der das Hindererythrozytenstroma enthält, gilt der Test als positiv. Dieser Test ist der wohlbekannte ⁿspot"-Test von Dr· Davidsohn und Br. Lee.

Der vorstehend beschriebene Test ist am spezifischsten und daher am genauestan, wenn rote Blutkörperchen vom Pferd genommen werden_s die nicht formalisiert worden sind. Leider sind diese nicht formalisierten Zellen nur für eine begrenzte Zeit stabil, so daß das Testreagens eine Gebrauchsdauer von nur etwa 3 Monaten hat«

Von der Anmelderin wurde ein direkter Agglutinationstest auf Mononucleosis infectiosa entwickelt. Da die3 ein direkter Test ist, vermeidet er die Verwendung einer Vielzahl von Reagentien und komplizierte und zeitraubende Verfahren· Der Test ist in Bezug auf Genauigkeit den bisher bekannten Tests auf Mononucleosis infectiosa gleichwertig und wird mit einem Reagens durchgeführt, das

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unendlich lange lagerbeständig ist© ■

Dieser ICest beruht ebenso wie die bekannten Tests auf der Afitilutination des Antikörpers von Iiononucleosis infectiosa des Henscben mit einem heterophilen Antigen, aber hier ist das Antigen sowohl von anderen Antigenen,

φ die mit Antikörpern im menschlichen Serum aßglutinieren, als such von den roten Blutkörperchen isoliert, die das . Antigen trugen. Durch Verwendung des heterophilen Antigens allein an Stelle von roten Blutkörperchen, die das Antigen enthalten, wird die mögliche nicht-spezifische Agglutination von iorssmann-Antikörpern mit anderen heterophilen Antigenen, die an dem roten Blutkörperchen vorhanden sind, vermieden. Hierdurch wird wiederum die Notwendigkeit der Differentialabsorption des zu testenden

Vi) Serums mit Meersehweinchen nieren-' und Rinder-Suspensions-

erythrozytenstroma ausgeschaltet. Da ferner das Testrea-■ £ens das Antigen isoliert von deß Rest der roten Blutkörperchen enthält, hat das Reagens, auf dem der Test be-•ruht, eine unendlich lange iJebrauchsdauer.

Das Reagens, auf dem der Test beruht, ist eine Suspension von feinteiligem Stroma nur des aktiven heterophilen Antigens von Pferde— oder Rindererythrozyten. Das Antigen wird durch geregeltes Beschallen von Rinder- oder Pferdeerythrosyten auf die nachstehend ausführlicher beschriebene Weise erhalten.

In seiner bevorzugten kommerziellen Form enthält das Reagens außerdem etwa 0,25 bis 0,75 VoI.-^ eines entweder mit tierischem oder menschlichem Serum umhüllten synthetischen Latexharzes. Der mit Serum umhüllte Latex macht die Agglutination sichtbar identifizierbar, ohne die Agglutination wesentlich zu beschleunigen oder zu fördern. Das Reagens kann ferner etwa 1 bis 2 Vol.-$ Binderserumalbumin odgl. enthalten, um die Dielektrizitätskonstante des Reagens auf einen Wert zu erhöhen, bei dem die Agglu-

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tination schneller stattfindete

Bei der Durchführung des Tests werden zwei Tropfen des Reagens zusammen mit einem Tropfen des Serums des Patienten auf den Objektträger gebracht. Nach guter Vermischung und Drehen des Objektträgers wird festgestellt, ob Agglutination stattgefunden hat« Der Test auf Mononucleosis infectiosa kann in etwa 2 Minuten beendet sein,

Ao Herstellung und Isolierung des antigenen Stromas

1) Herstellung des Suspendiermittels für die Zellen und Isolierung der Zellen.

Ein geeignetes Zellensuspendiermittel muß vor der Isolierung der roten Blutkörperchen hergestellt werden. Ein geeignetes Medium hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung:

Wasserfreie Dextrose, USP 20,5 g Trinatriumcitrat 8,0 g

Natriumchlorid 4,2 g

Citronensäure 0,55 g

Neomycinsulfat 0,10 g

Cloromycetin 0,33 g

Diese Bestandteile werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 1 verdünnt. Der ρττ-Wert dieses Mediums sollte auf etwa 6,1 bis 6,2 gepuffert werden. Die spezifische Leitfähigkeit sollte wenigstens 6,39 χ 10""' Moh bei 0 bis 1⁰C betragen. Wenn das Suspendiermedium vor dem Gebrauch aufbewahrt werden muß, sollte dies bei 4 bis 6⁰C geschehen.

Vorzugsweise werden rote Blutkörperchen von Pferden verwendet, und die Erfindung wird nachstehend speziell im Zusammenhang hiermit beschrieben, jedoch können auch rote Blutkörperchen von Rindern verwendet werden. Verfahren zur Isolierung von roten Blutkörperchen sind be-

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Bei einer dieser Methoden wird wie folgt gearbeitet: Daa gleiche Volumen des Zellenauapendiermediums für die zu entnehmende Menge von Zellen wird in Flaschen gegeben. Daa Blut wird aseptisch vom rasierten Nacken eines gesunden Pferdes entnommen sind in einer Flasche aufgefangen» Ein Antikoagulans in einer Menge, die dem" aufgefangenen Blut entspricht, v/ird ebenfalls in die Flasche gegeben« Das Blut wird in Zentrifugengläser überführt und 25 Minuten mit 1700 UpM bei 4⁰C zentrifugiert.

' Das oben stehende Plasma wird abgehebert und durch ein gleiches Volumen dea Suspendiermediums ersetzt. Das gesamte Gemisch wird zur Isolierung der roten Blutkörperchen noch zweimal zentrifugiert. Die dicht gepackten roten IiL itkörperchen werden in einen Kolben, der das Pferd·.;: · \i.e; suspendiermedium enthält, in einer Menge, die einer öuypension entspricht, die 20 VoI₀-^ rote Blutkörperchen enthält, gegeben und 15 Minuten vorsichtig gemischt,,

Das erstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der roten Blutkörperchen und ihrer Verarbeitung ist bekannt und wird im Rahmen der Erfindung nicht beansprucht. Die Isolierung kann auch nach beliebigen anderen bekannten Verfahren vorgenommen werden.

2) Isolierung des heterophilen Antigens

Die Isolierung des aktiven Antigens gemäß der Erfindung erfolgt durch geregelte Beschallung der Zellen in einem Öuspendiermedium. Hierbei ist die Konzentration der Zellen im Suspendiermedium nicht entscheidend wichtig, jedoch wird eine Konzentration zwischen 17 und 23 VoI₀-^ bevorzugt. Die Zellkonzentration wird unter Verwendung eines Wintrobe-Hämatokritglases nach bekannten Methoden bestätigt. Die suspendierten Zellen werden vorzugsweise bei einer aufgenommenen Leistung zwisohen etwa 6,0 und 15,0 Wattsekunden/om^ bei einer Frequenz zwischen 15 und 25 ffiz beschallt.

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Bei der Durchführung des nachstehend beschriebenen x'ests ist es wichtig, daß das Antigenstroma fein verteilt ist« Wenn die Leistungsaufnahme des Beschallungsapparats viel größer, ist als etwa 15,0 Wattsekunden/enr⁷, sind die Stromastücke nicht feinteilig, sondern körnige Bei der Durchführung des Tests werden mit deia körnigen Ü\,ronia Ergebnisse erhalten, die äußerst schwierig zu deuten sind ο Außerdem können bei höherer Leistnngsaufnaane andere Antigene, z.B. das Forssmann-Antigen, von der Zelle gelöst werden. Wenn die Leistungsaufnahme übermäßig hoch ist, zerfallen die roten Blutkörperchen selbst„ Wenn die Leistungsaufnahme geringer .ist als etv/a 6,0 Watt-Sekunden/ cm , ist die Antigenausbeute bestenfalls äußerst gering, und das Verfahren ist kommerziell nicht durchführbar.

Aus den gleichen Gründen liegt die Schallfrequenz vorzugsweise zwischen 15 und 25 kHz.

Vorzugsweise wird die Bronson-Beschallungsapparatur mit einer breiten Spitze mit jeweils 300 ml der suspendierten Pferdeblutzellen verwendet. Wenn bei einer Eeistungsaufnehme von 125 W und einer Frequenz von 20 kHz 5 bis 10 Sekunden beschallt wird, v/erden die Stromafragmente, die das aktive heterophile Antigen enthalten, nicht von der Zelle abgetrennt. Wenn etwa 15 Sekunden beschallt wird, beginnen die Stromafragmente-, die das aktive heterophile Antigen enthalten, sich von den roten Blutkörperchen zu lösen, jedoch ist die Ausbeute äußerst gering. Die optimale Ausbeute an, Stromafragmenten, die das aktive heterophile Antigen enthalten, wird erhalten, wenn etwa 30 Sekunden beschallt wird. Wenn die Beschallung längere Zeit₈ z.B. etwa 35 Sekunden, durchgeführt wird, trennen sich die Stromafragmente weiterhin ab, aber in größeren körniren Stücken, die eine nicht-spezifische Agglutination auf de« Objektträger bei Verwendung des Reagens zur Folge haben. Wenn die Beschallung bis 45 Sekunden ausgedehnt wird, sind alle Stromafragmente körnig,

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JJas heterophile Antigen wird anschließend vom Suspendiermedium und vom Rest der roten Blutkörperchen abgetrennt. Dies kann durch Zentrifugieren des beschallten Mediums und anschließende Ausfällung des Antigens aus der oben stehenden Flüssigkeit geschehen. Zur Ausfällung des Antigens wird vorsugsweise Methanol verwendet, jedoch sind zahlreiche andere Substanzen, die ebenso gut geeignet sind, dein Fachmann bekannt. Die Wahl des Fällmittels stellt Iceinen Teil der Erfindung dar. Bei Verwendung von Methanol wird eine gewisse Antigenmenge ohne Rücksicht darauf, Vielehe kethanolkonzentration verwendet wird, ausgefällt. Vom Standpunkt der kommerziellen Zweckmäßigkeit muß jedocli eine maximale Ausbeute an aktivem Antigen angestrebt werden. Hierbei wurde gefunden, daß das Methanol in einer fcenre von wenigstens etwa 50 VoI₀-^o vorhanden sein sollte. Eine nur teilweise Ausfällung der aktiven Fraktion wird erzielt, wenn der Methanolgehalt weit unter etwa 30 Vol.—^ liegt. Beispielsweise kann das beschallte Medium etwa 1 Stunde mit 6500 UpM bei 5°C zentrifugiert werden. Die oben stehende Flüssigkeit wird bei einer Temperatur von 4 bis 6⁰C gehalten und dann auf -5⁰O gekühlt. Bei dieser !Temperatur wird das gleiche Volumen von "!Gütigem Methanol uer oben stehenden Lösung zugesetzt. Die gefällte Lösung wird 15 Minuten gerührt und eine weitere Stunde mit 6500 UpM bei -5°C zentrifugiert« Die oben stehende Flüssigkeit wird abgehebert und verworfen. Das Sediment, d.h. Hämoglobin und das aktive Antigen, wird erneut in 750 ml Kochsalzlösung suspendiert« Diese Maßnahme wird dreimal wiederholt. An diesem Punkt wird die Menge der Salzlösung, in der das Antigen suspendiert wird, auf 350 ml reduziert. Das Zentrifugieren und das Abhebern werden noch zweimal für eine Dauer von 30 Minuten mit 6500 UpM bei 5°C wiederholt. Das Sediment der letzten Zentrifugierung wird in 375 ml Salzlösung suspendiert und 30 Minuten bei 56°O gehalten. Nach erneuter Zentrifugierung wird das Sediment in einem Boratpuffer bei Ρττ 8,6

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BAD ORIGINAL

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τ- θ -

suspendiert* Die endgültige Antigensuspension befindet sich in 375 ml des Boratpuffers bei p_H 8,6. Sie wird bis zum Gebrauch bei 4 "bis 6⁰O aufbewahrt,

B> Reagens
1) Antigen .

Wie bereits erwähnt, besteht das Reagens aus einer Suspension von feinteiligen Fragmenten ausschließlich des aktiven heterophilen AntigenSo Damit das Ergebnis des Tests, bei dem das Reagens verwendet wird, leicht erkennbar ist, muß die Konzentration des aktiven heterophilen Antigens verhältnismäßig hoch seine Das Antigen sollte somit in einer Menge von wenigstens etwa 1,0 oder 1,5 VoI-? vorhanden sein. Wenn das Antigen in viel geringeren Mengen vorhanden ist, "verfehlt" der Test.eine sohwache Mononucleosis infectiosa»

2) Latexteilchen

Wenn der Test auf einem Reagens beruhen würde, das ausschließlich aus einer Suspension des isolierten aktiven heterophilen Antigens besteht, würde das Ergebnis des Tests äußerst schwierig erkennbar sein_e Es ist daher wichtig, daß irgendein Fremdkörper, der die Agglutination nicht wesentlich fördert oder verzögert und nur nach der Agglutination sichtbar identifizierbar ist, in das Reagens einbezogen wird. Beliebige geeignete Substanzen, die diese Eigenschaften haben, können.verwendet werden, jedoch hat es sich gezeigt, daß mit Serum umhüllte Latexteilchen besonders geeignet sind. Bei Zusatz zur Suspension in geringen Mengen sind die Teilchen nicht sichtbar identifizierbar« Nachdem Agglutination stattgefunden hat, durch die eine wesentliche Zahl der Latexteilchen sich an irgendeiner Stelle ansammelt, werden die Teilchen leicht sichtbar, wodurch ein Test mit leicht erkennbarem Ergebnis erhalten wird. Bei Verwendung von Latexteilchen

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haben diese am zweckmäßigsten einen Durchmesser zwisohen etwa 0,20 und 0,80 tx_t wobei Teilchen mit einem Durchmesser von nicht mehr als 0,30 η bevorzugt werden.

Nicht umhüllte Latexteilchen haben die Neigung, Stoffe an ihrer Oberfläche zu adsorbieren, und zuweilen kann dies zu nicht-spezifischer Vernetzung oder Agglutination führen. Aus diesem Grunde wird entweder menschliches oder tierisohes Serum in das Reagens eingeführt, um die . Latexteilohen zu umhüllen. Wenn jedoch die mit Serum umhüllten Latexteilchen in einer Menge vorhanden sind, die viel größer ist als etwa 0,75 VoI,-#, wird das Testergebnis sohwierig erkennbar*

Unter Berücksichtigung sämtlicher vorstehend genannten Faktoren beträgt daher die anwesende Menge der latexteilchen vorzugsweise etwa 0,25 bis 0,75 Vol.-^. Wie die vorstehende Beschreibung zeigt, steht die verwendete Menge des menschlichen Serums in direkter Beziehung zur vorhandenen Menge des Latex und auch zur Größe der Latexteilohen. Daher ist die Menge des Serums zwar wichtig, jedoch kann die genaue erforderliche Menge nioht definiert werden außer indirekt, d.h. eine genügende Serummenge muß vorhanden sein, um die meisten Latexteilchen zu umhüllen. Wenn beispielsweise Latexteilchen von etwa 0,22 ju in einer Menge von etwa 0,5 Vol.-i» verwendet werden, sollte das Serum im Reagans in einer Menge von etwa 10 bis 15 VoI.-^ vorhanden sein.

Beispielsweise können Dow-Latexteilchen, die einen Durchmesser von 0,22 AX haben, verwendet werden. Die Latexteilohen werden eine Stunde mit 16000 UpM bei 5⁰O in einer 5O$igen Suspension zentrifugiert. Die Teilchen werden erneut in einem Boratpuffer, der einen p_H-Wert von 8,6 ■hat, suspendiert und erneut unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert. Die Latexteilohen werden erneut in einer Konzentration von 4 Vol.-$ im Boratpuffer suspendiert und bei 4 bis 6⁰G gelagert, bis sie für den

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Zusatz zum Reagens gebraucht werden· Unmittelbar vor der Herstellung des Reagens werden 125 ml des 4#igen latex zu 125 ml deaktiviertem Serum gegeben und 1 Stunde vorsichtig gerührt.

3) Einstellung der Dielektrizitätskonstante

Wenn ein Reagens, das nur aus dem aktiven heterophilen ■ Antigen und dem mit Serum umhüllten latex besteht, als Grundlage für einen Test auf Mononucleosis infeotiosa verwendet wird, ist die Agglutination schwach und/oder langsam und das Testergebnis schwierig erkennbar. Dies ist darauf zurückzuführen,.daß das Reagens auf Grund seiner verhältnismäßig niedrigen Dielektrizitätskonstante agglutinationsfeindlioh ist. Daher wird vorzugsweise die Dielektrizitätskonstante in geeigneter Weise durch Zusatz einer proteinartigen Substanz, z.B. einer der Aminosäuren oder Rinder- oder Menschenserumalbumin, erhöht. Bei Zusatz einer zu großen Menge eines solchen Agens ist jedoch eine nicht-spezifische Agglutination die Folge. Wenn beispielsweise Rinderserumalbumin verwendet wird, sollte dieses in einer Menge von etwa 1 bis 2 VoI·-# im Reagens vorhanden sein. Zur Fertigstellung des Reagens werden 250 ml 6$iges Rinderserumalbumin in Kochsalzlösung in geeigneter Weise zu 250 ml der mit Serum umhüllten Latexteilohen im Boratpuffer gegeben und 1 Stunde vorsichtig gerührt· Dieses Gemisoh wird zu 500 ml dea heterophilen Antigens in Boratpuffer gegeben, worauf das endgültige Geniisch 1 Stunde gerührt wird,

0. Testmethode

Bei einer Ausführungsform des Tests wird ein Tropfen des zu testenden Serums zusammen mit 2 Tropfen des Reagens auf einen schwarzen Objektträger gegeben. Das Serum und das Reagens werden gut gemischt und der Objektträger gedreht. Nach etwa 2 Minuten wird festgestellt» ob Agglutination stattgefunden hat. Wenn Agglutination eintritt,

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bedeutet dies einen positiven Test auf Mononuoleosls infectiosa, während das I"_ehlen von Agglutination bedeutet, dai3 keine Antikörper von Mononuoleosis infeotiosa vorhanden sind. Wenn dieser Test unter "Verwendung 5. von Serum, das Forssmana-Antigen enthält, und von normalem Serum wiederholt v/ird, darf keine Agglutination erkennbar sein. Bei der Durchführung dieses Tests unter Verwendung des Reagens, dessen Herstellung vorstehend beschrieben wurde, wurde mit normalem Serum oder Serum, das Forssmann-Antigen enthält, keine Agglutination beobachtet« Eine Agglutination 4+ wird mit Serum von Mononuoleosis infectiosa, das einen hohen Titer hat, festgestellt.

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Claims

- Yc -

F a t ". η tans ρ ruche

1) Verfahren zur Isolierung des heterophilen Antirens von i'iotionuclosis infectiosa aus Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man die 'Erythrozyten in in einem Suspendiermedium beschallt, das beschallte Medium zentrifugiert unü das Antigen aus der ouen EJteilenden Flüssigkeit ausfällte

'λ) Verfahren zur Isolierung des heterophilen Antigens von Kononucleosis infectiosa aus P:"erde- und Rinder—' erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß uan die Erythrozyten in einem Suapendiermedium bei einer zugef'ührten Leistung von etwa 6,0 bis 15₉O Watt-Selcunde/cm bei einer Frequenz von etwa 15 "bis 25 kHz beschallt, das beschallte Medium zentrifugiert und das aktive lieterophile "Antigen aus der oben stehenden Flüssigkeit ausfällt.

5) Reagens für einen diagnostischen Test auf llononucleosis infectiosa,, dadurch gekennzeichnet, daß es das aktive heterophile Antigen von Pferde- oder Rindererythrozyten in einem Suspendiermedium enthält, das keine anderen Antigene, die für andere Antikörper, die im Serum des Menschen zu finden sind, heterophil sind, und keine roten Blutkörperchen, die das heterophile Antigen trugen, enthält.

4) Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch geregelte Beschallung von suspendiertem Pferde- unö Rindererythrozyten bei einer Leistungsaufnahme von etwa 6_s0 bis 15 Watt-Sekunden/cn, Zentrifugieren des beschallten Mediums und Ausfällung des Antigens aus der oben stehenden Flüssigkeit isoliert worden ist.

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5) Reagens für einen diagnostisches i?est auf i-:ononacleosis ini'ectiosa, dadurch gekennzeichnet, da Λ- es eine Suspension von feinteiliMem Strcnia nur de'j aktiven heterophiler. Antigens von Pferde- öler Rindererythrozyter. .md etv/a C,25 bis 0,75 VoI,-5» eines mit tieriacherä oder menschlichem üerun umhüllten synthetischen Latexhax'zea enthält, der vorhanden ist, um die Agglutination physikalisch identifizierbar zu machen, wobei die Latexteilchen Kit dera oerura übe-zogen worden sind, um zu verhindern, da.; daa Latexharz die Agglutination wesentlich fördert.

ό) Reagens nach Anspruch 5, dadurch jekennzeichnet, daß das 5erau in einer kenge von etv/a "10 bia 15 VoI.-^ and aas Antigen in einer Menge von v/enigstens etv/a 1,5 7ol.-j^-e vorhanäer. ist.

7) Reagens nach Anspruch 6, dadurch geicennzeichnet, da3 es außerdem etwa 1 bi3 2 VoI»-5& Rinderseruiaalbuinin enthält.

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