DE2934757A1 - Zusammensetzung zur bestimmung von humanimmunglobulin g, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents
Zusammensetzung zur bestimmung von humanimmunglobulin g, verfahren zu deren herstellung und deren verwendungInfo
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Description
Zusammensetzung zur Bestimmung von Eumanimmunglo"bulin G,
Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur
Bestimmung von Humanimmunglobulin (abgekürzt IgG-), ein Verfahren
zu deren Herstellung sowie auf deren Verwendung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung
zur Bestimmung von Human-IgG- (sowohl qualitativ als
auch quantitativ) mit einer überlegenen Lagerstabilität, die mit guter Reproduzxerbarkeit und einem hohen Grad an
rasen
Genauigkeit zuverlässige Ergebnisse liefern kann, ohne
Störung durch andere Proteine, Vielehe in einer Versuchsprobe enthalten sein können, wobei eine einfache Bestimmungsarbeitsweise und ein einfaches Meßgerät zur Anwendung
gelangen.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG, die aus Teilchen
von einem synthetischen Polymerlatex, vorzugsweise Teilchen
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eines synthetischen Polymerlatices vom Styrol typ aus der
Gruppe von Styrolpolymerem, Styrolcopolyiaeren und den
carboxylierten Produkten oder aminohaltigen carboxylierten Produkten hiervon besteht sowie auf ein Verfahren zur Herstellung
dieser Zusammensetzung und auf die Verwendung der Zusammensetzung.
Human-IgG ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 und ist in einer Konzentration von 1,1 bis 1,7 g/dl
in den Seren von gesunden Menschen enthalten. Es ist als eine der wichtigen Komponenten bekannt, die einen Hauptfaktor
der Humoralimmunität eines Tieres darstellen.
Da der Spiegel oder die Konzentration von Human-IgG im
Blut oder Urin bei Hypogammaglobulinämie (Bypogammagloburinemia),
G-Typ-Myeloma, Glomerularerkrankung und dergleichen variiert,
ist die Bestimmung des Huinan-IgG—Spiegels für die Diagnose
sehr wichtig. Das Human-IgG ist ein Protein, welches die Grlomerulo-Basal-Membran kaum durchdringt, jedoch wenn der
Grad der Erkrankung der Glomerulo-Basal-Membran größer ist, sickert das Human-IgG in größerer Menge in den Urin. Demgemäß
kann der Grad der Störung der Glomeruli der liieren beispielsweise durch Bestimmung der Konzentration des
Human-IgG im Urin erkannt werden. Durch die Bestimmung des Verhältnisses von Albumin/IgG kann dies noch genauer beurteilt
werden. Somit ist das Albumin/IgG-Verhältnis eine wichtige
Information für die Diagnose der !Funktion der Glomeruli der Hieren. Aus dem vorstehenden ist klar ersichtlich, daß
die Bestimmung von Human-IgG für die Diagnose von Nierenerkrankungen
insbesondere von Glooerulonephritis, das Beobachten und Verfolgen des klinischen Verlaufes von diesen
Erkrankungen, die Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln
die
und für Prognose wichtig.
und für Prognose wichtig.
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Es bestand daher ein Interesse für die Entwicklung eines
Verfahrens,nach welchem Human-IgG im Serum oder im Urin
mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit bestimmt werden kann.
Die bisher angewendeten Arbeitsweisen zur Bestimmung von Human-IgG erwiesen sich niht als zufriedenstellend. Diese
bisherigen Arbeitsweisen umfassen z.B. ein Einzelradial-Immunodiffusionsverfahren
(Single Radial Immunodiffusion Method), bei welchem man in einer Agarplatte mit einem
Gehalt an einem Human-IgG-Antikörper Bohrungen vorsieht, eine Versuchsprobe in diese Bohrungen einfüllt und
die Konzentration von Human-IgG aus einem Ausfällungsband
mißt, das mit der Diffusion von dem Human-IgG in der Versuchsprobe erzeugt wird, die Elektrophorese auf verschiedenen
!Prägern und ein Verfahren, das ein Aussalzen einer Versuchsprobe und die nachfolgende Bestimmung des Human-IgG-Spiegels
nach einem Kjeldahl-Verfahren umfaßt.
Das Einzelradial-Immunoglobulin-Verfahren hat eine niedrige
Empfindlichkeit und daher den Nachteil, daß es Human-IgG in einer Konzentration unterhalb einer bestimmten Grenze
in einer Versuchsprobe nicht mehr bestimmen kann. Das elektrophoretische Verfahren erfordert eine Konzentration
des Human-IgG oberhalb einer bestimmten Grenze und ferner ist eine kostspielige Einrichtung einschließlich einer
Elektrophorese-Einrichtung und einer Bsstimniungseinrichtung
erforderlich. Das Kjeldahl-Verfahren hat den Nachteil, daß
der Arbeitsgang kompliziert ist.
Insbesondere muß bei der Bestimmung von Human-IgG im Urin der Urin auf das 100 bis 1000-fache konzentriert werden, wenn
diese üblichen Arbeitsweisen angewendet werden, da der
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Gehalt an Human-IgG im Urin gering ist. Hierfür ist ein großer Aufwand
an Arbeit und Zeit erforderlich.
Ein weiteres Beispiel einer bisherigen Technik ist eine
Arbeitsweise, ewelchereine passive Umkehr-Hämagglutinations-
gelangt;, &B
reaktion (EPHA) zur Anwendung womit Human-IgG mit einer
äquivalenten Empfindlichkeit wie bei dem Eadioimmunoassay-Verfahren
mühelos bestimmt werden kann. Da rote Blutkörperchen von einem Tier als Träger verwendet werden, hat diese
Arbeitsweise den Nachteil, daß bei der Herstellung der mit Antikörper sensibilisierten roten Blutkörperchen Vorbehandlungen
der roten Blutkörperchen wie Fixierung der roten Blutkörperchen und Behandlung der roten Blutkörperchen
mit Kupplungsmitteln,z.B. Glutaraldehyd oder Gerbsäure,
erforderlich sind. Da außerdem eine nicht spezifische Reaktion bei der praktischen Bestimmung häufig auftritt, die einem
Antikörper für die als Träger verwendeten roten Blutkörperchen zugeschrieben wird, ist es erforderlich, eine Absorptionsbehandlung an den verwendeten roten Blutkörperchen und
einen Kontrollversuch unter Verwendung von gebräunten oder gegerbten Zellen (tanned cells) auszuführen.
Es wurden nunmehr Untersuchungen durchgeführt, um ein
Mittel zur Bestimmung von Human-IgG zu schaffen, das von den Mangeln und Nachteilen der gebräuchlichen Arbeitsweisen,
wie vorstehend beschrieben, frei ist und zuverlässige Ergebnisse mit einem hohen Niveau an Genauigkeit liefern kann,
wobei ein einfaches Gerät und eine einfache Bestimmungsarbeitsweise
zur Anwendung gelangen. Diese Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, daß nämlich eine Zusammensetzung,
welche Teilchen eines synthetischen Polymerlatices, vorzugsweise Teilchen eines synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp
und einen als Überzug auf die Oberfläche der Teilchen
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aufgebrachten Human-IgG-Antikörper umfaßt, eine überlegene
Lagerstabilität besitzt und bei der raschen Bestimmung der Konzentration von Human-IgG in einer Versuchsprobe mit hoher
Genauigkeit und Zuverlässigkeit und einer guten Reproduzierbarkeit unter Anwendung eines einfachen Meßgerätes und einer
einfachen Bestimmungsarbeitsweise ohne Störung durch andere Proteine, die in der Versuchsprobe enthalten sein können,
sehr brauchbar ist. Es wurde auch gefunden, daß die vorstehend angegebene Zusammensetzung in einfacher Weise hergestellt
werden kann und nicht nur als Latex sondern auch als getrocknetes Produkt gelagert werden kann.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer neuen und ausgezeichneten Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG,
eines Verfahrens zu deren Herstellung und die Verwendung der vorstehend genannten Zusammensetzung.
Human-IgG ist eine Hauptkomponente eines Serumproteins und wird auch im Urin gefunden. Das Ausgangshuman-IgG, das
zur Herstellung eines Human-IgG-Antikörpers in der Zusammensetzung
gemäß der Erfindung verwendet wird, kann nach an sich bekannten Arbeitsweisen hergestellt werden. Es kann
z.B. in gereinigter Form nach einem gebräuchlichen Verfahren erhalten werden, bei welchem man eine Äthanolfraktiön
aus menschlichem Serum mit ü?ri chlor essigsäure und Ammoniumsulfat
behandelt, und durch Ionenaustauschchromatographie. oder dergleichen.Im Handel erhältliches Human-IgG kann
ebenfalls verwendet werden.
Ein Antikörper aus dem Human-IgG, das unter Anwendung der vorstehend beschriebenen bekannten Arbeitsweise erhalten werden
kann, kann hergestellt werden, indem man das IgG als ein Antigen an ein Hier mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines
Antikörpers, z.B. Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen,
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in einer gebräuchlichen Weise zu seiner Immunisierung verabreicht,
das Blut von dem immunisierten Tier nimmt, und den Human--IgG-Antikörper aus dem so erhaltenen Blut abtrennt.
Das bei diesem Verfahren zur Anwendung gelangende Tier kann irgendein Tier mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern
sein. Um jedoch eine große Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung eines großen Tieres bevorzugt. Üblicherweise
sind Kaninchen oder Ziegen geeignet, wobei jedoch das zu verwendende Tier nicht darauf beschränk ist. Die Abtrennung
von einem Human-IgG-Antikörper aus dem diesen enthaltenden
Antiserum kann unter Anwendung von bekannten Maßnahmen durchgeführt werden.
Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Adsorptions-Eluierung unter Anwendung eines unlöslichen
Antigens wird wiederholt.
Verschiedene synthetische Latexteilchen können für die Herstellung
der Zusammensetzung für die Bestimmung von Human-IgG
gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele von Polymeren oder Copolymeren, welche einen solchen Latex bilden, umfassen
Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, aminohaltiges carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol/Butadien-Copolymeres,
carboxyliertes Styrol/Butadien-Copolymeres,
Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres, Vinyltoluol/tertiButylstyrol-Copolymeres,
Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylnitril, Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymeres,
Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyrrolidon und Vinylchlorid/ Acrylat-Copolymeres.
Bevorzugte Teilchen von synthetischen polymeren Latices sind Teilchen von synthetischen polymeren Latices vom Styroltyp
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aus der Gruppe von Styrolpolymerem, Styrolcopolymeren, z.B.
einem Copolymeren von Styrol mit einem Monomeren aus der Gruppe von Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid,
und carboxylierten oder aminohaltigen carboxylierten Produkten hiervon. Diese synthetischen Polymerlatexteilchen können
nach Vorbehandlung ihrer Oberflächen mit einem nicht ionischen oberflächenaktiven Mittel verwendet werden. Beispielsweise
werden diese Teilchen vorzugsweise verwendet, nachdem ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxydtyp
zur Adsorption daran gemäß dem Verfahren gebracht wurde, das in der JP-Offenlegungsschrift ITr. 9716/76, offengelegt
am 26. Januar 1976 beschrieben ist. Beispiele für geeignete nicht ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxydtyp
sind ein Blockcopolymeres von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol,
Polyoxyäthylenalkyläther und Poiyoxyäthylenalkylaryläther.
Gemäß der Erfindung besitzen die synthetischen Polyraerlatexteilchen
vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 /Um,insbesondere 0,1 bis 1 /Um. Zur Erhöhung
der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse einer Bestimmung wird es bevorzugt, Teilchen mit einem relativ engen Bereich der
Größenverteilung zu verwenden. Das spezifische Gewicht der
Latexteilchen beträgt vorzugsweise etwa 0,9 bis 1,4· und insbesondere etwa 1,1 bis etwa 1,3· Ea Falle der Bestimmung
unter Anwendung einer Agglutinationsreaktion auf einer Objektträgerglasplatte können Latexteilchen mit einem breiten
Bereich des spezifischen Gewichts zur Anwendung gelangen. Im Falle eines Mikrotiterverfahrens werden vorzugsweise
Latexteilchen mit einem spezifischen Gewicht von wenigstens 1,1 verwendet.
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Die Zusammensetzung zur Bestimmung von dem Human-IgG gemäß
der Erfindung kann in einfacher Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann sie hergestellt werden, indem man einen
synthetischen Polymerlatex vorzugsweise mit einer Konzentration von 0,05 bis 5 % mit einem Human-IgG-Antikörper mit einer
Konzentration von 0,0001 bis 1 °/o in einem Puffer bei einem
pH-Bereich von vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10, insbesondere etwa 6,5 bis etwa 8 bei einer Temperatur von vorzugsweise
etwa 4 bis etwa 40 0C in Berührung bringt. Das Inberührungbringen
kann unter sanftem Rühren während etwa 30 min bis etwa 24 h ausgeführt werden.
Der verwendete Puffer kann z.B. eine phosphatgepufferte
Salzlösung (M/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15M NaCl, abgekürzt mit PBS) und eine glycingepufferte
Salzlösung sein. Erwünschtenfalls können 0,01 bis 0,1 %
eines Proteins, z.B. Rinderserumalbumin (abgekürzt mit BSA) bevorzugt einer Antikörperlösung zugesetzt werden,
um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern.
Nach der Beschichtungs- oder Überzugsreaktion wird die Reaktionsmischung mehrmals durch Zentrifugieren in einer
neutralen Salzlösung, z.B. einer glycingepufferten Salzlösung oder PBS gewaschen. Schließlich können die Latexteilchen
mit dem darauf als Überzug aufgebrachten Human-IgG-Antikörper
in ϊοππ einer Suspension in einem Verdünnungsmittel
gelagert werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die durch den Zusatz von etwa 0,1 % von
BSA zu einer mit Glycin gepufferten Salzlösung oder von PBS erhalten wurde. Außerdem wird es bevorzugt, 0,01 bis 0,5 %
Natriumazid (NaN,) dem Verdünnungsmittel zuzusetzen.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG gemäß der Erfindung kann in Form eines Latices,wie vorstehend beschrieben,
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und auch in Form eines getrockneten Produktes sein. Die Zusammensetzung in Form eines getrockneten Produktes kann
erhalten werden, indem man einen Stabilisator, z.B. eine Aminosäure (beispielsweise Glycin oder Natriumglutamat)
oder Dextran dem vorstehend beschriebenen Verdünnungsmittel zusetzt, die Latexzusammensetzung mit dem als Überzug aufgebrachten
Human-IgG-Antikörper in dem Verdünnungsmittel
suspendiert und die Suspension gefriertrocknet. Die Mengen der Aminosäure und von Dextran betragen etwa 1,2 bis etwa
4 Gew.Teile bzw. etwa 1,6 bis etwa 6 Gew.Teile je ^ Gew.Teil
der Latexteilchen.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG gemäß der
Erfindung besitzt eine gute Stabilität sowohl in Form eines Latices als auch in Form eines getrockneten Produkts. Das
getrocknete Produkt kann in stabiler Weise während einer längeren Zeitdauer z.B. in der Größenordnung von mehreren
Jahren, gelagert werden.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung von Human-IgG geschaffen, bei welchem man qualitativ oder quantitativ
das Human-IgG in menschlichem Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung bestimmt, Vielehe synthetische
Polymerlatexteilchen und einen auf die Oberfläche der Latexteilchen als Überzug aufgebrachten Human-IgG-Antikörper
umfaßt.
Pur die Bestimmung können an sich bekannte Maßnahmen angewendet
werden, und beispielsweise kann die Konzentration von IgG in dem Serum oder im Urin mühelos nach dem Mikrotiterverfahren
bestimmt werden. Gemäß dieser Arbeitsweise wird eine bestimmte Menge einer Verdünnungsmittels der vorstehend
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angegebenen Art anteilsweise auf eine Mikroplatte gegossen, worauf eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe, beispielsweise
Serum oder Urin, in die erste Bohrung der Platte eingeführt und allmählich mit einem Verdünnungsmittel verdünnt
wird. Ebenfalls wird eine Verdünnungsreihe in der gleichen Weise unter Verwendung eines Standardantigens hergestellt.
Eine bestimmte Menge von einem mit Human-IgG-Antikörper
sensibilisiertem Latex wird jeder zu bestimmenden Probe zugegeben und damit gemischt. Nach Stehenlassen während
einer bestimmten Zeitdauer bei Raumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutination beobachtet und die absolute
Menge von IgG kann durch Vergleich mit der Standardantigenreihe bestimmt werden.
Nach einer anderen Ausführungsform zur Bestimmung gemäß der Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe
auf eine Objektträgerglasplatte getropft und getrennt wird eine bestimmte Menge einer Human-Ig(J -Lösung mit einer
bekannten Konzentration tropfenweise zugegeben. Eine bestimmte Menge des mit dem Human-IgG-Antikörper sensibilisLerten
Latices wird zu jeder der Proben zugegeben, worauf eine sanfte Oszillationsbewegung ausgeführt wird.
Durch Bewertung des sich ergebenden Agglutinationsmusters kann die Konzentration des Human-IgG in der Versuchsprobe
innerhalb weniger Minuten qualitativ bestimmt werden.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG in Form
des Latices oder des getrockneten Produktes ist den Zusammensetzungen überlegen, die durch Überziehen von roten Blutkörperchen
oder einem anderen (Eräger mit Human-IgG erhalten wurden, da aufgrund des Fehlens einer Antigenizität
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des !Trägers selbst nicht-spezifische Reaktionen der er
wünschten Antigen-Antikörperreaktion nicht stattfinden,
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ein Human-IgG-Antikörper direkt auf einen Latex als Überzug
mühelos durch einfaches Eintauchen einer Antikörperlösung in den Latex ohne Verwendung eines Bindemittels aufgebracht
werden kann und diese Zusammensetzung eine ausgezeichnete Lagerbeständigkeit besitzt.
Das Verfahren zur Bestimmung von IgG unter Verwendung des mit dem Human-IgG-Antikörper sensibilisierten Latices
oder seiner Zusammensetzung erlaubt die Bestimmung von mehr
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als 1 ng (1 χ 10 g) von IgG je ml, und kann eine äquivalente oder eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu derjenigen der Radioimmunoassay-Methode erreichen, bei welcher die höchste Empfindlichkeit unter den gebräuchlichen Analysen angenommen wird.
als 1 ng (1 χ 10 g) von IgG je ml, und kann eine äquivalente oder eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu derjenigen der Radioimmunoassay-Methode erreichen, bei welcher die höchste Empfindlichkeit unter den gebräuchlichen Analysen angenommen wird.
Im Hinblick auf die Tatsache, daß die neue Zusammensetzung gemäß der Erfindung aus Latexteilchen und einem darauf als
Überzug aufgebrachten Human-IgG-Antikörper überhaupt nicht
mit anderen Proteinen als dem Human-IgG reagiert, und daß der nicht sensibilisierte Latex überhaupt nicht mit IgG reagiert,
kann gesagt werden, daß der Human-IgG-Antikörper an den
Latex gebunden ist.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Herstellungsbeispielen und Arbeitsbeispielen näher erläutert.
Herstellung von einem Human-IgG-Antikörper:
Human-IgG (hergestellt von Miles Laboratories Inc., USA) wurde als Antigen verwendet. Human-IgG wurde in physiologischer
Salzlösung in einer Konzentration von 4 mg ge ml gelöst.
Die Lösung wurde mit einer gleichen Menge von voll-
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ständigem ireund1sehen Hilfsmittel gemischt. Die Mischung
wurde intramuskulär in einer Menge von 0,2 ml auf 5 Teile jedes von 4 gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von 2,0
"bis 2,5 kg injiziert und 3 Wochen später wurde eine Injektion in gleicher Weise vorgenommen. Nach 2 Wochen wurde 1 ml
einer 0,2 %igen Human-IgG-Salzlösung intravenös Jedem der
Kaninchen injiziert. 3 Wochen nach der letzten- Injektion wurde das Gesamtblut aus der Halsschlagader der Kaninchen
abgenommen und in üblicher Weise zentrifugiert. Das so erhaltene Antiserum wurde bei 56 0C während 30 min gehalten,
wobei etwa 200 ml Antiserum erhalten wurden. Aufgrund der
Tatsache, daß das Antiserum ein einzigesBand mit einem
Antigen gemäß einer Ouchtalony-Methode und der Immunoelektrophorese
bildete, wurde festgestellt, daß das erhaltene Antiserum ein einziger Antikörper war.
Herstellung von unlöslichem Human-IgG:
250 mg von Human-IgG wurden in 5 ml eines 0,1M Phosphatpuffers
(pH 7,0) gelöst und 2,5 %iger Glutaraldehyd wurde tropfenweise der IgG-Lösung unter Rühren zugegeben, bis
ein gelbliches Gel sich bildete. Die Mischung wurde während 3 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Ausfällung wurde
gesammelt, homogenisiert, mit PBS gewaschen, dann mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2,8) und ferner mit PBS gewaschen
und danach bei unterhalb -20 0C aufbewahrt.
Reinigung von einem Human-IgG-Antikörper:
Eine gleiche Menge einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung
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wurde dem Antiserum zugegeben, worauf gründlich, gemischt
wurde. Die Mischung wurde während 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die sich ergebende Ausfällung wurde mittels
Zentrifuge gesammelt, mit °»5 gesättigter AmmoniumsulfatlÖsung
gewaschen und dann gegen PBS dialysiert. Dann wurde unlösliches Human-IgG dem Dialysat zugegeben und die Mischung
wurde bei Raumtemperatur während 30 min stehengelassen und dann in eine überstehende Flüssigkeit und eine Ausfällung
zentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit wurde erneut unlösliches Human-IgG zugegeben und die Mischung wurde in
gleicher V/eise behandelt. Die beiden Ausfällungen wurden vereinigt, und mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäure-Puffer
(pH 2,8) zugegeben. Die Mischung wurde während 5 rain geschüttelt und zentrifugal aufgetrennt.
Die Ausfällung wurde erneut mit dem Glycin-Salzsäure-Puffer behandelt. Die sich, ergebenden überstehenden Flüssigkeiten
wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert, wobei ein gereinigter Antikörper erhalten wurde.
Herstellung von einem mit Human-IgG-Antikörper sensibilisierten
Latex:
Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Industry
Co., Ltd.; SDL 59; spezifisches Gewicht 1,14; Teilchendurch.-messer
0,9 /im) wurde mit PBS so verdünnt, daß die Konzentration
der Teilchen 0,25 % erreichte, und dann wurde eine gleiche Menge eines mit PBS auf das 60-fache verdünnten
gereinigten Antikörpers zugegeben. Die Mischung wurde bei 37 °C zwei Stunden lang gehalten und dann zentrifugiert.
Die Latexteilchen wurden gesammelt, mit PBS und dann mit einem Yer-
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dünnungsmittel gewaschen. Dann wurden die Latexteilchen auf eine Konzentration von 0,25 % unter Verwendung eines Verdünnungsmittels
suspendiert,um einen mit Human-IgG-Antikörper
sensibilisierten Latex zu bilden.
Wenn dem sensibilisierten Latex eine Human-IgG-Lösung zugesetzt
wurde, trat eine Agglutination auf. Es fand Jedoch keine Agglutination statt, wenn Albumin-, ßp-Mikroglobulin-,
Immunglobulin-M-und Immunglobulin-A-Lösungen Jeweils zugegeben
wurden.
Das verwendete Verdünnungsmittel war PBS mit einem Gehalt von 0,07 °/o BSA und 0,1 % Hatriumazid.
Arbeitsbeispiel 2
Bestimmung von Human-IgG:
Bestimmung von Human-IgG:
Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde Jeweils in eine Bohrung einer Mikroplatte vom V-Typ gegossen
und 0,025 ml Serum oder eines mit einem geeigneten Verdünnungsmittel
verdünnten Serums wurden der ersten Bohrung zugesetzt, und allmählich mit einem Verdünnungsmittel nach
einem Serienzweifachverdünnungsverfahren verdünnt. Ebenfalls wurden 0,025 ml einer Standardlösung mit einem Gehalt
von 0,1 /Ug von Human-IgG Je ml der ersten Bohrung einer ·
anderen Reihe zugegeben und in ähnlicher Weise verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des mit Human-IgG-Antikörpers sensxbilisierten
Latex in Jede der Bohrungen gegossen und nach ausreichendem Vermischen wurde bei Raumtemperatur während mehr
als 10 h stehengelassen, um den Endpunkt der Agglutination zu beobachten. Wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion auftrat,
wurden die Latexteilchen auf der gesamten Oberfläche
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des Bodens einer Bohrung dispergiert. Venn keine Antigen-Antikörper-Seaktion
stattfand, sammelten sich die Latexteilchen in der Mitte von jeder Bohrung. Auf diese Weise
kann der Endpunkt einer Agglutination beurteilt werden.
In Übereinstimmung mit der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wurde die Menge von IgG bei 6 auf das 100-fache verdünnten
Urinproben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.
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Tabelle I : Agglutinationswert von Latex
Tr. | Gesunder Erwachsener (32 Jahre alt, männlich) Gesunder Erwachsener (43 Jahre alt, männlich) Gesunder Erwachsener (22 Jahre alt, männlich) Nierenkranker (47 Jahre alt, männlich) SEB-Erkrankter (32 Jahre alt, weiblich) An Nierenentzündung Erkrankter (53 Jahre alt, männlich) |
123 4- 5 6 7 8 | Konzen tration in der Probe (mg/1) |
Standard-IgG-Konzentration (ng/ml) |
50 25 12,5 6,25 3,12 1,J56 0,78 0,39 | 2 4 2 über 32 16 16 |
|
Lgglutinationsmuster | + + + | ||
I | + + + + ---- |
Anmerkung: +: positiv} -: negativ
- lir -
Arbeitsbeispiel 5 Bestimmung von Human-IgG mit Obgektträgeraggregation:
PolystyroHatex (ein Produkt von Dow Chemical; Teilchendurehmesser
0,22 + 0,006 yum; spezifisches Gewicht 1,05) wurde auf 1 % mit einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer (pH 8,4)
verdünnt und eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers wurde zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 0C
stehengelassen und dann zentrifugiert, um den Latex abzutrennen. Der Latex wurde einmal mit einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer
gewaschen und auf eine Konzentration von 1 % in einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer mit einem Gehalt von 1 %
BSA zur Bildung eines sensibilisierten Latex suspendiert.
50 /ul einer Human-IgG-Lösung mit einer Konzentration von
10 ^ug/ml, 5 yug/ml, lyug/ml, 0,5 yug/ml oder 0,1 yug/ml
wurden tropfenweise getrennt auf ein Objektträgerglas gegeben.
Dann wurden 50 yul des erhaltenen sensibilisierten
Latex tropfenweise auf die Oberseite hiervon zugesetzt und unter schwachem Rühren während weniger Minuten wurde die
Reaktion beobachtet. Ein Agglutinationsmuster trat in Erscheinung, wenn die Konzentration der Human-IgG-Lösung
10 /Ug/ml, 5 /Ug/ml und 1 /Ug/ml betrug, ein Agglutinationsmuster
trat jedoch nicht auf, wenn die Konzentration 0,5 yug/ml
und 0,1 /Ug/ml betrug.
Nach der vorstehenden Arbeitsweise wurde der Gehalt an Human-IgG bei 6 auf das 10-fache verdünnten Urinproben
bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
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Tabelle II: Agglutinationswert von Latex
Versuchsprobe | Agglutinations- muster |
Konzentration in der Probe (mg/1) |
Urin (verdünnt auf das 10-fache) |
||
Gesunder Erwachsener (32 Jahre alt, männlich) |
weniger als 5 | |
Gesunder Erv/achsener (43 Jahre alt, männlich) |
Il | |
Gesunder Erwachsener (22 Jahre alt, männlich) |
ic | |
Nierenkranker (47 Jahre alt, männlich) |
+ | mindestens 10 |
An SLE-Erkrankte (32 Jahre alt, weiblich) |
ti | |
An Nierenentzündung Erkrankter (35 Jahre alt, männlich) |
* | Il |
Kontrolle | 10 5 1 0,5 0,1 | |
Standard-IgG Konzentration (yug/ml) Agglutinationsmuster |
■Arbeitsbeispiel 4
Bei Ausführung der gleichen Behandlung wie in Arbeitsbeispiel 1 wurde ein Latex sensibilisiert, gewaschen und in einem Verdünnungsmittel
mit einem Gehalt von 0,5 % Glycin und 0,7 % Dextran T-10 (Produkt von Pharmacia line Chemicals Co., Ltd.,
Schweden) so suspendiert, daß die Konzentration der Latexteilchen 1,25 % erreichte. Die Suspension wurde dann in üblicher
Weise gefriergetrocknet, wobei eine Zusammensetzung
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•von Latexteilchen mit einer Empfindlichkeit gegenüber einem
Human-IgG-Antikörper erhalten wurde.
Ein Verdünnungsmittel wurde der in Arbeitsbeispiel 4 erhaltenen
Latexteilchenzusammensetzung mit einer Empfindlichkeit gegenüber Human-IgG—Antikörper zugegeben. Dann wurde unter Anwendung
der gleichen Arbeitskreise wie in Arbeitsbeispiel 2 die Menge von IgG- im Serum und Urin bestimmt. Es wurden ähnliche
Ergebnisse erhalten.
Aus den in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß die Menge von IgG in dem Urin von
an verschiedenen Krankheiten erkrankten Patienten einen offensichtlich höheren Wert zeigte als derjenige
von den Urinproben von gesunden Erwachsenen. Demgemäß ist die Bestimmung der Menge von IgG im Urin äußerst viertvoll
für die Diagnose von diesen Erkrankungen.
Getrennt wurde die Menge von IgG im Urin von Menschen unter Verwendung eines mit einem Human-IgG-Antikörper
sensibilisierten Latex gemessen, der in gleicher Weise wie bei d?m Herstellungsbeispiel 5 imcL den nachfolgenden
Arbeitsbeispielen aus dem Antiserum einer Ziege hergestellt worden war. Die Ergebnisse waren völlig die gleichen wie
in den vorstehenden Tabellen angegeben.
Durch die Verwendung des mit Human-IgG-Antikörper sensibilisierten
Latices oder der Zusammensetzung, die den sensibilisierten Latex enthält, gemäß der Erfindung kann die Menge
von IgG innerhalb einer kürzeren Zeitdauer gemessen werden, wenn eine Probe (menschliches Serum oder menschlicher Urin)
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in einer sehr geringen Menge von weniger als 0,03 nil
zur Verfugung stent. Die Empfindlichkeit ist äußerst hocli
und 1 ng von IgG kann je ml der Versuchsprobe "bestimmt
werden. Demgemäß gewährt die Zusammensetzung gemäß der Erfindung wichtige und wertvolle Informationen für die Diagnose
von Hypogammaglobulinemia (Hypogammagloburinemia), Myeloma
vom G-OJyp, glomerulare Erkrankung und verschiedene andere
Erkrankungen und ihr Anwendungsbereich ist sehr breit. Bei der Bestimmung von IgG in Urin war es bisher erforderlich,
den Urin zu konzentrieren. Jedoch ermöglicht die Verwendung des mit Human-IgG-Antikörper sensibilisierten Latices gemäß
der Erfindung die Verwendung von Urin ohne dessen Konzentrierung. Somit ist die Zusammensetzung gemäß der Erfindung besonders
geeignet für die Bestimmung von IgG im Urin.
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Claims (11)
1. Zusammensetzung zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G
(IgG) bestehend aus synthetischen Polymerlatexteilchen und einem als überzug auf die Oberflächen der Latexteilchen aufgebrachten
Human-IgG-Antikörper.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen mittleren Teilchendurchmesser
von 0,01 bis 10 /um besitzen.
J. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Latexteilchen ein spezifisches Gewicht von 0,9 bis 1,4 besitzen.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35
dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen Stabilisator aus der Gruppe von Aminosäuren und Dextran enthält.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Polymerlatexteilchen
Teilchen eines synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp aus der Gruppe von Latices von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren
und den carboxylierten oder aminohaltigen carboxylierten Produkten hiervon sind.
6. Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG gemäß
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Teilchen
eines synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 Aim und einem
spezifischen Gewicht von 0,9 "bis 1,4, ausgewählt aus der
Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und den carboxy-
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lierten oder aminohaltigen cartoxylierten Produkten hiervon,
und einen als Überzug auf die Oberflächen der Latexteilchen aufgebrachten Human-IgG-Antikörpers besteht.
7- Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Latices vorliegt.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines getrockneten
Produktes von dem Latex vorliegt.
9-Verfahren zur Bestimmung von Huraan-IgG, dadurch gekennzeichnet,
daß man Human-IgG im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus
synthetischen Polymerlatexteilchen und einem auf die Oberfläche der Teilchen als Überzug aufgebrachten Human-IgG-Antikörper,
quantitativ oder qualitativ bestimmt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung nach einem Mikrotiterverfahren
ausführt.
11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-IgG, bestehend aus synthetischen
Polymerlatexteilchen und einem auf die Oberfläche der Teilchen aufgebrachten Überzugeines Human-IgG-Antikörpers,
dadurch gekennzeichnet, daß man einen synthetischen Polymerlatex mit einer Konzentration von 0,05 "bis 5 % niit einem
Human-IgG-Antikörper mit einer Konzentration von 0,0001
bis 1 % in einem Puffer bei einem pH von etwa 5 his etwa
10 bei einer Temperatur von etwa 4· bis etwa 40 0C in Berührung
bringt.
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