DE2746101A1

DE2746101A1 - Verfahren zur bestimmung von immunoglobulinen in menschlicher koerperfluessigkeit

Info

Publication number: DE2746101A1
Application number: DE19772746101
Authority: DE
Inventors: Francis Fremonte Buck
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-10-13
Publication date: 1978-04-27
Also published as: US4092114A; BR7706994A; JPS5352620A; NL7711154A; BE859909A

Description

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AMERICAN CYANAMID COMPANY Wayne, New Jersey/USA

Verfahren zur Bestimmung von Immunoglobulinen in menschlicher

Körperflüssigkeit.

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»iMERICAN CYANAMID CO. Case: 2J)_J 28O

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur indirekten Bestimmung von Immunoglobulinen A, M oder G in menschlicher Körperflüssigkeit, bei dem eine Mischung aus menschlichen Immunoglobulinen IgA, IgM und IgG, die chemisch an Latexteilchen gebunden sind, verwendet wird. Die Methode ist für den qualitativen Nachweis eines dieser Immunoglobuline sowie für die halbquantitative Bestimmung des Gehalts irgendeines dieser Immunoglobuline geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Immunoglobuline A, M oder G in einer Probe menschlicher Körperflüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Probe der menschlichen Körperflüssigkeit mit Antiserum für die Immunoglobuline A, M oder G vermischt und ein Immunoglobulin-Latex-Reagenz, das die Immunoglobuline A, M und G in chemisch an die Latexteilchen gebundener Form enthält, zu der Mischung zusetzt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens werden verdünnte Proben des Serums des Patienten mit einem Antiserum vermischt, das für das zu untersuchende Immunoglobulin spezifisch ist. Eine verdünnte Serumprobe, die das fragliche Immunoglobulin enthält, neutralisiert das Antiserum, wodurch die Agglutination des Immunoglobulin-Latex durch dieses Serum inhibiert oder verhindert wird. Somit stellt die Abwesenheit einer Agglutination ein positives Untersuchungsergebnis dar. Bei Anwendung einer Verdünnungsreihe des Serums des Patienten ist es möglich, die Menge des in dem Serum vorhandenen Immunoglobulins zu bestimmen, indem man die bei der Agglutination erzielten Ergebnisse mit jenen vergleicht, die bei Verwendung eines Vergleichsstandards auftreten. Die Spezifitat des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich dadurch, daß spezifische Antiseren verwendet werden, da das an den Latex gebundene Material eine Mischung von Antigenen umfaßt.

Fs hat sich gezeigt, daß erhöhte Gehalte der Immunoglobuline

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M oder A in dem Serum von Feten einen Hinweis auf chronische intrauterine oder akute perinatale Infektionen darstellt. Das erfindungsgemäße Verfahren und der dabei verwendete Reagenzsatz können auch dazu verwendet werden, den verminderten Spiegel der Immunoglobuline A, M oder G bei älteren Patienten festzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Reagenzsatz sind auch zur Bestimmung des Immunoglobulingehalts in dem Serum von Feten geeignet.

Das verbreitetste, kommerziell erhältliche System zur Bestimmung des Immunoglobulingehalts ist eine Platte, auf der eine radiale Immunodiffusion durchgeführt wird. Bei dieser Methode werden spezifische Antiseren in Agar oder Agarose eingebracht und es bildet sich beim Eindiffundieren der Probe in das Gel ein Ring aus dem bei der Antigen-Antikörper-Reaktion gebildeten Niederschlag. Der Durchmesser des Pings ist der Antigenkonzentration proportional. Im allgemeinen liegt die Zeit zur Entwicklung des Rings im Bereich von 24 bis 48 Stunden, was einen wesentlichen Nachteil darstellt, insbesondere was pränatale Untersuchungen anbelangt. Die Erfindung ermöglicht die Feststellung der Ergebnisse unmittelbar nach Beendigung der Verfahrensmaßnahmen.

Das erfindungsgemäß verwendete Latexreagenz ist mit den Immunoglobulinen G, A und M gekuppelt, d. h. diese drei Antigene sind an die Latexteilchen gebunden. Die Spezifität für ein gegebenes Immunoglobulin basiert auf der Spezifität des verwendeten Antikörpers. Jedes verwendete Antiserum darf nur mit einem der Immunoglobuline reagieren. Beispielsweise ist das Antiimmunoglobulin M monospezifisch insofern, als es nur mit dem auf der Oberfläche des Latex vorliegenden Immunoglobulin M und nicht mit den Immunoglobulinen A oder G reagiert. Mit diesem Latexreagenz ist es dann auch möglich, ein Testsystem zur Bestimmung der Immunoglobuline G oder A zu bilden, wenn man ein Antiserum verwendet, das jeweils nur für eines der betreffenden Immunoglobuline spezifisch ist.

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Man kann auch lediglich eines der genannten Immunoglobuline an den Latex binden; der Vorteil der Erfindung ist jedoch darin zu sehen, daß man ein einzelnes Nachweisreagenz dazu verwenden kann, die drei hauptsächlichen Iinmunoglobulinklassen nachzuweisen.

Die Mischung aus den Immunoglobulinen, die mit den Latexteilchen verbunden werden, bereitet man aus der Fraktion 111-2,1 des menschlichen Plasmas. Die Herstellung umfaßt eine Zinksalzausfällung, eine Polyäthylenglykol-fraktionierung und eine Caprylsäureausfällung, wozu an sich bekannte Verfahrensweisen angewandt werden. Beispielsweise ist die Herstellung von an dem Immunoglobulin M angereicherten Immunoglobulinen in der US-PS 3 8O8 189 beschrieben.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein indirektes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Immunoglobuline A, M oder G in Körperflüssigkeiten, wie in Serum, dem Rückenmarksserum oder der Rückenmarksflüssigkeit von erwachsenen Menschen etc. und vorzugsweise im menschlichen Serum, das darin besteht, daß man eine Probe der Körperflüssigkeit mit einem Antiserum, das lediglich für eitles der Immunoglobuline A, M oder G spezifisch ist, vermischt und ein Immunoglobulin-Latexreagenz, das die Immunoglobuline A, M und G in chemisch gebundener Form enthält, zu der Mischung zusetzt. Das die Immunoglobuline A, M und G enthaltende Immunoglobulin-Latexreagenz wird dadurch hergestellt, daß man eine Mischung der Immunoglobuline A, M und G chemisch an die Latexteilchen bindet.

Wenn keine Agglutination der Latexteilchen erfolgt, bedeutet dies, daß in der Probe Immunoglobuline A, M oder G vorhanden sind, da der Antikörper (die Antiseren) daran gehindert werden, mit dem Immunoglobulin-Latex zu reagieren. Wenn eine Agglutination des Latex erfolgt, sind in der Probe keine Immunoglobuline A, M oder G vorhanden, da der nichtinhibierte Antikörper ohne weiteres mit dem Latexreagenz reagieren kann. Wenn man das er-

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findungsgemäße Verfahren im Rahmen einer Reihenuntersuchung auf verschiedene Verdünnungen der Proben anwendet, kann man eine halbquantitative Abschätzung der Menge erreichen, in der die Immunoglobuline A, M oder G vorhanden sind, indem man die Ergebnisse mit den Ergebnissen eines Vergleichsstandards vergleicht, der eine bekannte Menge der Immunoglobuline A, M oder G enthält.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagentien können ohne weiteres zu einem Reagenzsatz verpackt werden, der als wesentliche Bestandteile das Immunoglobulin-Latexreagenz, ein vorverdünntes Antiserum, Auftragstäbchen und ein Verdünnungsmittel umfaßt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann man irgendwelche Trägerteilchen verwenden. Geeignet sind Latexträgerteilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis etwa 2,0-um. Besonders bevorzugte Latexträgerteilchen sind die von der Firma Dow Chemical Company, Michigan, USA, in einer Vielzahl von Teilchengrößen vertriebenen Polystyrolteilchen, insbesondere jene mit einer Teilchengröße von 0,79,Um. Das von der Firma Monsanto Chemical Company, Missoure, USA, hergestellte Material Lytron 615, das eine Teilchengröße von 0,15 bis 0,25,um aufweist, ist ebenfalls geeignet.

Im folgenden sei die Erfindung weiter erläutert. Herstellung des Reagenz

Man vermischt 100 mg eines Immunoglobulinpräparats / das die Immunoglobuline A, M und G in 10 ml eines Puffers enthält, der 0,01 Mol pro 1 Phosphat oder Glycin und 0,15 Mol pro 1 Natriumchlorid enthält und einen pH-Wert von 8,2 aufweist, mit 2 ml eines 10 %-igen Latex (Dow Diagnostics, dessen Latexteilchen eine mittlere Teilchengröße von O,79,um aufweisen) und 2 ml einer wäßrigen Lösung, die 4O mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyD-carbodiimid-hydrochlorid pro ml enthält. Man erhitzt

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die Mischung während 10 Minuten in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 5 bis 55°C. Dann kühlt man die Reaktionsmischung ab, zentrifugiert und wäscht dreimal mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,O, der 0,Ol Mol pro 1 Phosphat, 0,15 Mol pro 1 Natriumchlorid und 0,02 % Natriumazid enthält. Das Immunoglobulin-Latexreagenz wird schließlich in dem Phosphat-Natriumchlorid-Azid-Puffer suspendiert, der 0,02 % Natriumtaurocholat und 0,02 X eines oberflächenaktiven Mittels (Triton ^X-IOO) enthält.

Durchführung des erfindunqsqemäßen Verfahrens

Für eine qualitative Untersuchung wird das Verfahren auf einem Glasobjektträger durchgeführt, der mit 3 bis 6 ovalen Vertiefungen versehen ist. In der ersten Stufe bringt man einen Tropfen der verdünnten, zu untersuchenden Probe (menschliches Serum, Rückenmarksserum oder Rückenmarksflüssigkeit etc. von Erwachsenen) zusammen mit einem Tropfen eines Antiserums, beispielsweise menschliches Immunoglobulin M, in jede ovale Vertiefung. (Die Antiseren für die Immunoglobuline G, A oder M werden in Kaninchen oder Ziegen mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen hergestellt und in der geeigneten Weise verdünnt.) Dann vermischt man das Antiserum und die Probe mit einem Auftragsstäbchen und verrührt die Mischung während etwa 30 Sekunden durch Drehen des Objektträgers. In der zweiten Stufe gibt man einen Tropfen des Immunoglobulin-Latexreagenz, das die Immunoglobuline A, M und G enthält, zu jeder Mischung aus der Probe und dem Antiserum, mischt mit dem Auftragsstäbchen durch und rührt die Suspension durch Drehen des Objektträgers während 3 Minuten. Wenn keine Agglutination der Latexteilchen erfolgt, so weist dies darauf hin, daß die Probe in der angegebenen Verdünnung Immunoglobulin M enthält, da der Antikörper an einer Reaktion mit dem Immunoglobulin-Latexreagenz gehindert wird. Wenn eine Agglutination des Latex auftritt, ist kein Immunoglobulin M in der Probe vorhanden, da der nichtinhibierte Antikörper ohne weiteres mit dem Latexreagenz reagieren kann. Wenn

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die erfindungsgemäße Untersuchungsmethode quantitativ durchgeführt werden soll, führt man Reihenuntersuchungen mit verschiedenen Verdünnungen der Probe durch, wodurch eine halbquantiative Abschätzung der Menge des vorhandenen Immunoglobulins M erreicht werden kann, indem man einen Vergleich mit einem Vergleichsstandard durchführt, der eine bekannte Menge Inununoglobulin M enthält.

Zu Vergleichszwecken wurde eine Analyse von 25 Proben normalen Rückenmarksserums bezüglich des Immunoglobulin M-gehalts unter Anwendung des erfindungsgemäßen indirekten ImmunoglobulinLatex-Objektträgertests und der Untersuchung, bei der eine radiale Immunodiffusion auf Platten der Firma Kallestad Laboratories, Minnosota, USA und Behring Diagnostics American Hoechst Corporation, New Jersey, USA angewandt wird, durchgeführt, wobei sich eine ausgezeichnete Korrelation der beiden Methoden bezüglich des Gehalts von Immunoglobulin M in dem Rückenmarksserum ergeben hat. Eine ähnlich gute Korrelation erzielt man, wenn man die beiden verschiedenen Untersuchungsmethoden zur Bestimmung des Gehalts an Immunoglobulin G und Immunoglobulin A in menschlichem Serum von Erwachsenen und von Immunoglobulin A in Rückenmarksserum durchführt.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Bestimmung der immunoglobuline A, M oder G in einer Probe menschlicher Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet .. daß man eine Probe der menschlichen Körperflüssigkeit mit Antiserum für die Immunoglobuline A, M oder G vermischt und ein Immunoglobulin-Latexreagenz, das die Immunoglobuline A, M und G in chemisch an die Latexteilchen gebundener Form enthält, zu der Mischung zusetzt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren im Rahmen einer Reihenuntersuchung auf verschiedene Verdünnungen der Probe anwendet und die Ergebnisse mit den Ergebnissen vergleicht, die man mit einem Vergleichsstandard erzielt hat.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Körperflüssigkeit Serum einsetzt.

Reagenzsatz zur Bestimmung der Immunoglobuline A, M oder G in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß er als wesentliche Bestandteile ein Immunoglobulin-Latexreagenz, das die Immunoglobuline A, M und G in chemisch an die Latexteilchen gebundener Form enthält, ein vorverdünntes Antiserum für die Immunoglobuline A, M oder G, einen Vergleichsstandard und ein Verdünnungsmittel umfaßt..

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ORIGINAL INSPECTED