JP2523332B2 - 抗体のクラス判別法 - Google Patents
抗体のクラス判別法Info
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- JP2523332B2 JP2523332B2 JP62190767A JP19076787A JP2523332B2 JP 2523332 B2 JP2523332 B2 JP 2523332B2 JP 62190767 A JP62190767 A JP 62190767A JP 19076787 A JP19076787 A JP 19076787A JP 2523332 B2 JP2523332 B2 JP 2523332B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗体のクラス判別法に関し、更に詳細には抗
原のみを使用し、抗クラス別抗体を使用しない抗体のク
ラス判別法に関する。
原のみを使用し、抗クラス別抗体を使用しない抗体のク
ラス判別法に関する。
ヒトの産生する抗体は、そのほとんどがIgGとIgMに分
類される。そして、この抗体のうちIgMの検出は、細菌
あるいはウイルス感染の程度、感染の既往歴の有無、固
体の反応性など種々の因子の決定診断に重要とされてい
る。
類される。そして、この抗体のうちIgMの検出は、細菌
あるいはウイルス感染の程度、感染の既往歴の有無、固
体の反応性など種々の因子の決定診断に重要とされてい
る。
従来、抗体のクラス判別法としては、エンザイムイム
ノアツセイ法（EIA法）ラジオイムノアツセイ法（RIA
法）、ウエスタンプロツテイング法などが採用されてき
た。このうち、EIA法及びRIA法は、抗原をビーズあるい
はプレートのような担体へ固相し、検体血清中の抗体と
反応させ、更に血清中の抗体と、酵素あるいはラジオア
イソトープが標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体
と反応させて酵素活性を、あるいは、ラジオアイソトー
プを測定するものである。
ノアツセイ法（EIA法）ラジオイムノアツセイ法（RIA
法）、ウエスタンプロツテイング法などが採用されてき
た。このうち、EIA法及びRIA法は、抗原をビーズあるい
はプレートのような担体へ固相し、検体血清中の抗体と
反応させ、更に血清中の抗体と、酵素あるいはラジオア
イソトープが標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体
と反応させて酵素活性を、あるいは、ラジオアイソトー
プを測定するものである。
これらの方法を実施するには酵素あるいはラジオアイ
ソトープが標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体を
必然的に必要とし、反応のステツプ毎に洗浄操作が必要
とされ測定法が煩雑であるという欠点があり、また反応
時間も３時間〜１日と比較的長いため、測定の自動化は
困難であつた。また、特に抗IgM抗体、あるいは、抗IgG
抗体は、検体となる抗体の産生側の種が違うと、ヒトに
限らず動物の種毎に、酵素あるいはラジオアイソトープ
が標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体を調製しな
くてはならないという欠点もあつた。
ソトープが標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体を
必然的に必要とし、反応のステツプ毎に洗浄操作が必要
とされ測定法が煩雑であるという欠点があり、また反応
時間も３時間〜１日と比較的長いため、測定の自動化は
困難であつた。また、特に抗IgM抗体、あるいは、抗IgG
抗体は、検体となる抗体の産生側の種が違うと、ヒトに
限らず動物の種毎に、酵素あるいはラジオアイソトープ
が標識された抗IgM抗体あるいは、抗IgG抗体を調製しな
くてはならないという欠点もあつた。
一方、ウエスタンプロツテイング法は電気泳動を利用
した方法であり、煩雑で、自動化に適さないものであ
る。
した方法であり、煩雑で、自動化に適さないものであ
る。
したがつて、簡便に抗体のクラス判別をおこなうこと
のできる方法の開発が求められていた。
のできる方法の開発が求められていた。
本発明者らは抗原抗体反応について研究を重ねていた
ところ、IgG抗体とIgM抗体ではその凝集反応における挙
動が相異し、これを利用すれば抗体のクラス判別が容易
におこなえることを見出し本発明を完成した。
ところ、IgG抗体とIgM抗体ではその凝集反応における挙
動が相異し、これを利用すれば抗体のクラス判別が容易
におこなえることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は抗体を含む検体に抗原を添加し、
生じる反応凝集物による所定時間における吸光度変化
を、時間間隔をおいて２回測定し、得られた２つの吸光
度変化の比により検体中の抗体のクラスを判別する方法
を提供するものである。
生じる反応凝集物による所定時間における吸光度変化
を、時間間隔をおいて２回測定し、得られた２つの吸光
度変化の比により検体中の抗体のクラスを判別する方法
を提供するものである。
本発明方法を実施するには、まず、抗体を含む検体中
に抗原を添加する。
に抗原を添加する。
本発明方法において用いられる検体は、血清、リンパ
液等の体液のほか、判定すべき抗体を含有する緩衝水溶
液、生理食塩水溶液等が挙げられる。また、用いられる
抗原については、クラス判別すべき抗体に対する抗原で
あれば特に制限はなく、検体に加える抗原量は、抗体と
同量ないしは過剰量であることが好ましい。更に、本発
明方法において、抗原抗体反応は室温〜40℃、pH5.5〜
8.0の条件で撹拌後に測定することが望ましい。
液等の体液のほか、判定すべき抗体を含有する緩衝水溶
液、生理食塩水溶液等が挙げられる。また、用いられる
抗原については、クラス判別すべき抗体に対する抗原で
あれば特に制限はなく、検体に加える抗原量は、抗体と
同量ないしは過剰量であることが好ましい。更に、本発
明方法において、抗原抗体反応は室温〜40℃、pH5.5〜
8.0の条件で撹拌後に測定することが望ましい。
なお、上記抗原抗体反応において、反応系中に非イオ
ン性界面活性剤を共存せしめると、反応を促進し、更に
反応セル、試薬分注機構の洗浄を容易とし、かつ汎用自
動分析機の光学的部分あるいは試薬分注機構を保護する
ことができるので有利である。用いられる非イオン性界
面活性剤としては、HLB値が12〜20のものが好ましく、
フエニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系界面
活性剤が特に好ましい。より具体的に例えばポリオキシ
エチレンオクチルフエニルエーテル（EO＝30〜100のも
の）、ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル（EO
＝30〜100のもの）、などが挙げられ、これらは単独で
または組み合わせて使用することができる。
ン性界面活性剤を共存せしめると、反応を促進し、更に
反応セル、試薬分注機構の洗浄を容易とし、かつ汎用自
動分析機の光学的部分あるいは試薬分注機構を保護する
ことができるので有利である。用いられる非イオン性界
面活性剤としては、HLB値が12〜20のものが好ましく、
フエニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系界面
活性剤が特に好ましい。より具体的に例えばポリオキシ
エチレンオクチルフエニルエーテル（EO＝30〜100のも
の）、ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル（EO
＝30〜100のもの）、などが挙げられ、これらは単独で
または組み合わせて使用することができる。
次いで生じた反応凝集物による吸光度変化が測定され
る。
る。
吸光度変化の測定は、一般には300〜600nmの波長でお
こなうことが好ましく、また測定は反応開始から０〜15
分以内、好ましくは５分程度の間におこなうことが好ま
しい。なお、最も好ましい吸光度変化の測定は、単位時
間当りの吸光度変化を数回測定し、このデータを最小二
乗法で処理する方法である。
こなうことが好ましく、また測定は反応開始から０〜15
分以内、好ましくは５分程度の間におこなうことが好ま
しい。なお、最も好ましい吸光度変化の測定は、単位時
間当りの吸光度変化を数回測定し、このデータを最小二
乗法で処理する方法である。
叙上の吸光度変化から抗体のクラス判別をおこなうに
は例えば次の如くすれば良い。すなわち反応開始後一定
時間内に間隔を置き、二度に亘つて吸光度変化を測定
し、１度目と２度目の測定値の変化から抗体のクラス判
別をおこなう。
は例えば次の如くすれば良い。すなわち反応開始後一定
時間内に間隔を置き、二度に亘つて吸光度変化を測定
し、１度目と２度目の測定値の変化から抗体のクラス判
別をおこなう。
後記第１図に示す如く、IgM抗体の吸光度変化は、上
に凸の曲線を取る。これに対し、IgG抗体の吸光度変化
は第２図に示す如くほぼ直線となる。したがつて、例え
ば第１回の測定値（Ａ）と第２回目の測定値（Ｂ）につ
いて、その比（A/B）を取れば容易に検体中の抗体のク
ラスがIgMであるかIgGであるか判断される。
に凸の曲線を取る。これに対し、IgG抗体の吸光度変化
は第２図に示す如くほぼ直線となる。したがつて、例え
ば第１回の測定値（Ａ）と第２回目の測定値（Ｂ）につ
いて、その比（A/B）を取れば容易に検体中の抗体のク
ラスがIgMであるかIgGであるか判断される。
一般に第１回目の測定（Ａ）を抗原抗体反応開始後０
〜２分以内に、第２回目の測定（Ｂ）を３分以上でおこ
なつた場合、抗体のクラスがIgMであるときの比A/Bは2.
5〜100程度であり、IgGであるときは0.2〜２程度である
ので、容易に抗体のクラス判別をおこなうことができ
る。
〜２分以内に、第２回目の測定（Ｂ）を３分以上でおこ
なつた場合、抗体のクラスがIgMであるときの比A/Bは2.
5〜100程度であり、IgGであるときは0.2〜２程度である
ので、容易に抗体のクラス判別をおこなうことができ
る。
本発明によれば酵素あるいはラジオアイソトープで標
識されたIgM抗体若しくはIgGを使用せず、しかも担体等
を用いることなく容易かつ経済的に抗体のクラス判別を
おこなうことができる。
識されたIgM抗体若しくはIgGを使用せず、しかも担体等
を用いることなく容易かつ経済的に抗体のクラス判別を
おこなうことができる。
更に、本発明方法によれば吸光度変化の測定は反応後
10分程度以内に終了させることができるので、現在汎用
の生化学用自動分析機に適用可能とし特殊な専用分析機
を必要としない有利なものである。
10分程度以内に終了させることができるので、現在汎用
の生化学用自動分析機に適用可能とし特殊な専用分析機
を必要としない有利なものである。
次に実施例を挙げ、本発明を説明する。
実施例１ すでにEIA−サンドイツチ法とウエスタンブロツテイ
ング法によりクラス同定のなされている抗体について、
下記の機器、試薬及び操作方法により反応過程吸光度変
化を求めた。IgM抗体についての吸光度変化を第１図
に、IgG抗体についての吸光度変化を第２図に示す。ま
た、得られた吸光度変化図から、19回目〜21回目（第２
試薬添加後１〜１分40秒）の吸光度変化と30回目〜32回
目（同４分40秒〜５分20秒）の吸光度変化の比率を求め
た。この結果を第１表に示す。
ング法によりクラス同定のなされている抗体について、
下記の機器、試薬及び操作方法により反応過程吸光度変
化を求めた。IgM抗体についての吸光度変化を第１図
に、IgG抗体についての吸光度変化を第２図に示す。ま
た、得られた吸光度変化図から、19回目〜21回目（第２
試薬添加後１〜１分40秒）の吸光度変化と30回目〜32回
目（同４分40秒〜５分20秒）の吸光度変化の比率を求め
た。この結果を第１表に示す。
（１） 使用機器 日立7050型自動分析装置 （２） 試薬 （ｉ） 第１試薬（R1） HEPES緩衝液（pH7.2） ………0.05M NoCl ………0.15M アジ化ソーダ ………0.1重量％ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル ………7.2重量％ （ii） 第２試薬（R2） SLOの調製 Ａ群溶連菌をトツド・ヘヴイト培地で16〜20時間培養
し、菌体を除去した上清から硫酸アンモニウム塩析によ
りSLOを得たこのSLOを0.005Mリン酸緩衝液で充分に透析
し、溶血価1000単位/mlに調整し、凍結乾燥する。
し、菌体を除去した上清から硫酸アンモニウム塩析によ
りSLOを得たこのSLOを0.005Mリン酸緩衝液で充分に透析
し、溶血価1000単位/mlに調整し、凍結乾燥する。
SLO液の調製 で調製したSLOを、第１試薬と同様な成分液で溶血
価1000単位/mlとなるよう溶解し、第２試薬とした。
価1000単位/mlとなるよう溶解し、第２試薬とした。
（３） 操作方法 まず反応セル中に水のみを入れた、セルブランクの34
0nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後、検体血清20
μ及び第１試薬350μを入れ、１回目の吸光度を測
定した。以後20秒間隔で計32回、10分間にわたり測定し
た。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の演算機構
により自動的に各測定値より差し引かれる。第１試薬の
添加５分後に第２試薬50μを添加し、凝集反応を開始
させた。
0nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後、検体血清20
μ及び第１試薬350μを入れ、１回目の吸光度を測
定した。以後20秒間隔で計32回、10分間にわたり測定し
た。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の演算機構
により自動的に各測定値より差し引かれる。第１試薬の
添加５分後に第２試薬50μを添加し、凝集反応を開始
させた。
（４） 結 果 第１図及び第２図から明らかなように、SLO抗原液を
添加後、IgG型抗体の反応は粗直線的に反応しIgM型抗体
の反応は大きく曲つている。従つて、抗体の濃度を規定
し、どちらかの抗体の反応の傾きを対照にすればIgM型
抗体かIgG型抗体なのか判定できる。
添加後、IgG型抗体の反応は粗直線的に反応しIgM型抗体
の反応は大きく曲つている。従つて、抗体の濃度を規定
し、どちらかの抗体の反応の傾きを対照にすればIgM型
抗体かIgG型抗体なのか判定できる。
また、下の第１表の如く、吸光度変化図から時間間隔
をおいた２点の吸光度の変化を読み取り、この比を求め
れば容易に抗体のクラスがIgGであるかIgMであるか判断
することができる。
をおいた２点の吸光度の変化を読み取り、この比を求め
れば容易に抗体のクラスがIgGであるかIgMであるか判断
することができる。
第１図はIgM抗体の抗原抗体反応後の吸光度変化を示す
図面であり、第２図はIgG抗体の吸光度変化を示す図面
である。
図面であり、第２図はIgG抗体の吸光度変化を示す図面
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅田 衛 東京都豊島区巣鴨２丁目11番１号 日水 製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 昭53−52620（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−38656（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】抗体を含む検体に抗原を添加し、生じる反
応凝集物による所定時間における吸光度変化を、時間間
隔をおいて２回測定し、得られた２つの吸光度変化の比
により検体中の抗体のクラスを判別する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62190767A JP2523332B2 (ja) | 1987-07-30 | 1987-07-30 | 抗体のクラス判別法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62190767A JP2523332B2 (ja) | 1987-07-30 | 1987-07-30 | 抗体のクラス判別法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6435266A JPS6435266A (en) | 1989-02-06 |
| JP2523332B2 true JP2523332B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=16263383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62190767A Expired - Lifetime JP2523332B2 (ja) | 1987-07-30 | 1987-07-30 | 抗体のクラス判別法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2523332B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5344623A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Novel immunoassay |
| US4092114A (en) * | 1976-10-20 | 1978-05-30 | Fisher Scientific Company | Indirect latex test for determination of immunoglobulins |
| JPS5938656A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-02 | Tetsuo Tomiyama | 抗体の免疫グロブリンクラス別検出法 |
| JPH079427B2 (ja) * | 1985-10-21 | 1995-02-01 | 株式会社トクヤマ | 抗原又は抗体濃度の測定方法 |
-
1987
- 1987-07-30 JP JP62190767A patent/JP2523332B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6435266A (en) | 1989-02-06 |
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