DE2604844A1

DE2604844A1 - Diagnostisches mittel zur feststellung von hepatitis b-oberflaechenantigen in menschlichem blut

Info

Publication number: DE2604844A1
Application number: DE19762604844
Authority: DE
Inventors: Bela Zoltan Horvath; George Edward Lowke
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1975-02-19
Filing date: 1976-02-07
Publication date: 1976-09-02
Also published as: ES451061A1; US3992517A; DK144395B; SE429481B; FR2301825B1; MX4962E; SU1091844A3; FI760326A; NL7601441A; DE2604844C3; BR7600906A; IL48927A0; CH613048A5; IE42031B1; LU74348A1; EG12696A; JPS51106723A; RO71615A; DD124128A5; CS188129B2

Description

RECHTSANWÄLTE 9 6 O 4 8 4 4

DR. JUR. DIPUCHPM. WALTER BEÄ

ALFRED HObPPENSR nc _Fol

DR. JUi?. DiPL-CHEM. H.-J. WOU=P ^UÖ° Γ θ 0.

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AD&ONSWASSfc»

unsere Nummer 20 350

Pfizer Iac. New York, IT.Y. Y.St.A.

Diagnostisches Mittel zur Feststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem Blut

Die Erfindung bezieht sich auf die Peststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen durch latexagglutination.

Das Hepatitis B-Oberflächenantigen (Australia-Antigen), welches von Blumberg und Mitarbeitern entdeckt und in Bull. IT.Y. Acad. Med., 40, 377 (1964) beschrieben worden ist,sowie der Zusammenhang mit der eine lange Inkubationszeit aufweisenden Hepatitis hat die Aktivität verstärkt, Blutspender im Interesse der öffentlichen Gesundheit zu testen und zu untersuchen.

Die Verwendung von Antikörper-sensibilisierten Latexteilchen, die in den US-PS 3 085 875 und 3 551 555 beschrieben worden ist, ist spezifisch der Peststellung von Hepatitis-B-Oberflächenantigen in Blutserum angepaßt worden, was in !The Journal of

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Immunology, ITr. 1, Seiten 108-111, 19.Januar 1972 "beschrieben worden ist.

Eine empfindliche, jedoch zeitraubende radioimmunologische Prüfung ist von CM. Ling und l.R. Overby in The Journal of Immunology 109, ITr. 4·, Seiten 854-841 (1971) (1972) beschrieben worden.

Es besteht infolgedessen ein Bedarf für eine verbesserte diagnostische Methode, die schnell durchführbar, empfindlich und - als v/ichtigstes - verläßlich (minimale "falsch-positive" Anzeigen) ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft infolgedessen ein diagnostisches Mittel zur Peststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem Blut, welches aus einer wässrigen Suspension sehr feiner synthetischer Harzteilchen von im wesentlichen gleicher Größe, die mit einem gereinigten, Hepatitis B-Oberflächenantigen-spezifischen Antikörper überzogen sind, besteht. Der verwendete Antikörper ist hochgereinigt und spezifisch gegenüber Hepatitis B-Oberflächenantigen, welches aus hochgereinigtem, aus menschlichem Blut erhaltenen Hepatitis-B-Oberflächenantigen hergestellt worden ist.Auf diese Weise erreicht man eine größere Spezifität und eine größere Empfindlichkeit. "Falsch-positive"Anzeigen werden durch die Zugabe von normalem Serum von derselben !Eierart, von der auch das den Antikörper enthaltende Serum erhalten worden ist, Bestätigung aller positiven Seren, die HaA (der Hepatitis bei Menschen assoziierte Antikörper) verwenden, Kontrolle mit normalem menschlichem Blutserum und ein Rheumatoidfaktor-Absorptionsreagens verringert. Alle positiven Werte werden in einem Eontroll- bzw. Bestätigungsversuch erneut geprüft, um "falschpositive" Werte auszuscheiden. Dies wird erreicht, indem (a) alle positiven Testproben des Blutes durch Mischen mit HaA neutralisiert v/erden, (b) der Rheumatoidfaktor in den Testproben

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von Schritt (a), die diesen enthalten, durch Mischen mit latexkügelchen, die mit menschlichem GaEanaglobulin überzogen sind, absorbiert wird und (c) die positiven !Testproben erneut mit dem diagnostischen Mittel gemäß vorliegender Erfindung vermischt v/erden.

Das diagnostische Mittel gemäß vorliegender Erfindung ist so entwickelt worden, daß es hochempfindlich und spezifisch geeignet zur Feststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem Blut ist, indem (a) Harzteilchen, die mit gereinigtem, aus Tieren, die mit gereinigtem Hepatitis B-Oberflächenantigen immunisiert worden sind, gewonnenem Antikörper beschichtet sind, verwendet werden, (b) "falsch-positive" Anzeigen durch Zugabe von normalem Serum derselben Tierart, von der auch das Antikörper enthaltende Serum gewonnen worden ist, verringert werden und (c) alle positiven, HaA zur Antigenneutralisation verwendende Seren bestätigt und eine normale menschliche Serumkontrolle und ein Rheumatoidfaktor-Absorptionsreagens angewandt werden.

Das diagnostische Mittel gemäß vorliegender Erfindung besteht aus einer wässrigen Suspension kleinster synthetischer Harzteilchen, die mit einem hochgereinigten, gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen Antikörper beschichtet sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Teilchen um Polystyrol- kügelchen mit einem Durchmesser von etwa 0,23/um, jedoch können auch Teilchen aus anderen synthetischen Harzen, z.B. Acrylharzen, mit gleichmäßigen Abmessungen von 0,05 bis 2,0 /um verwendet v/erden.

Der gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifische Antikörper wird vorzugsweise aus Serum von Säugetieren wie Menschen, Schafen, Ziegen, Kaninchen oder Heerscb.weincb.en oder Geflügel wie Hühner oder Truthähne, die den Antikörper enthalten oder die mit hochgereinigtem, aus menschlichem Blut gewonnenem.Hepatitis

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B-Oberflächenantigen immunisiert worden sind, gewonnen.

Meerschweinchen oder andere Tiere wie Kaninchen, Ziegen usw. werden mit Hepatitis B-Oberflächenantigen, welches nach der in der US-PS 3 83S 144 "beschriebenen Methode gereinigt worden ist, immunisiert. Einer ersten Immunisierung mit Antigen in "Freund's vollständigem Präparat" in die Fußbällen folgen wiederholt intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Impfungen mit Antigen mit oder ohne Zusatzmittel. Hach dem Sammeln der aus immunisierten !Eieren gewonnenen Seren werden restliche Antikörper gegen menschliche Serumproteine, falls vorhanden, durch Zugabe von normalem menschlichen "Serum zu dem Antiserum entfernt. Das Gammaglobulin kann dann durch Ausfällen mit 14/^igem wässrigem !Natriumsulfat isoliert, gegen wässrige, mit Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert und vorzugsweise etwa 30 Minuten auf 56⁰C erhitzt werden, um den Komplementärfaktor zu zerstören.

Der Antikörper wird dann mit Hilfe der allgemeinen Methoden, die in !Ehe Journal of Immunology", Band 106, Ur. 5, Seiten 589-597, März 1971 und «Biochemistry», Band 6, Kr. 5, Seiten 1460-1466, Mai 1967 beschrieben sind, weiter gereinigt. Der spezifische Hepatitis B-Oberflächenantikörper wird von den absorbierten Tierseren (vorzugsweise Meerschweinchenserum) gereinigt, indem man das betreffende Serum in optimalen Mengenverhältnissen mit menschlichem Serum, welches Hepatitis B-Oberflächenantigen enthält, vermischt und bei 37⁰C eine Stunde und dann über Nacht bei 4⁰C bebrütet. Der Antigen-Antikörper-Uiederschlag, der sich auf diese ¥eise bildet, wird zweimal mit kalter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen, um die Hauptmenge der restlichen nicht-spezifischen Proteine zu entfernen. Danach wird der Antigen-Antikörper-Medersehlag in kalter 0,2 m Essigsäure-2^ Sucrose-Mischung, pH 2,5» oder in verschieden molaren chaotropen Ionen (z.B. 2,0 m Batriumthiocyanat, pH 6,6) gelöst. Es ist für den !Fachmann, ohne weiteres

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verstandIich, daß weitere geeignete Puffermittel zur Dissoziierung des Antigen-Antikörper-Komplexes zur Verfugung stellen und verwendet v/erden können. Die dissoziierten Antigene und Antikörper werden durch Zentrifugieren mit 25 000 bis 28 000 Umdrehungen pro Minute in 12 Ms 15 Stunden oder mit 30 000 Umdrehungen pro Minute in 4 Stunden an einem kontinuierlichen 1o bis 4-ofo Sucrosegradienten im Beckman TI-15 Zonenrotor getrennt. Der Rotor wird entleert, indem man 50$ige Sucrose einpumpt, um den Gradienten zu ersetzen; 20 ml-Praktionen werden in einer 1 cm-Zelle bei 280 nm auf Ultraviolett-Absorptionsvermögen geprüft. Die Peak-3?raktionen werden gesammelt und ergeben eine gereinigte spezifische Antikörperfraktion und eine gereinigte Antigenfraktion. Beide Fraktionen werden dann mit 1,0 η HaOH neutralisiert. Die Antikörperfraktion wird auf das ursprüngliche Serumvolumen konzentriert und über Hacht gegen eine mit Glycin gepufferte Salzlösung dialysiert. Der gereinigte Antikörper wird dann titriert und standardisiert.

Bei der Herstellung des diagnostischen Reagenz kann 0,1 $ Hatriumazid als Konservierungsmittel zugefügt v/erden. Der Antikörper wird in optimaler Weise verdünnt, indem..man kleine Proben des diagnostischen Mittels mit verschiedenen Verdünnungen des Antikörpers herstellt und diese gegen eine Reihe menschlicher Seren, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis B-Oberflächenantigen enthalten, prüft. Die Verdünnung, mit der die besten Ergebnisse in der Reihe erhalten werden, wenn sie auf Harzteilchen aufgebracht ist, wird zur Herstellung des diagnostischen Mittels ausgewählt.

Der in geeigneter Weise verdünnte Antikörper wird mit Polystyrollatexkügelchen mit einem Durchmesser von 0,2 /um vermischt. Nach ein- bis zweistündigem Durchmischen werden die Kügelchen dreimal mit mit Glycin gepufferter Salzlösung gewaschen und dann in der so gepufferten Salzlösung resuspendiert«

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Die v;ässrige Suspension enthält vorzugsweise etwa 0,5 $ (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen, gegebenenfalls auch. 0,1 bis 3 io (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen. Bei der Herstellung des diagnostischen Mittels enthält die Suspension vorzugsweise etwa 0,05 io (Gewicht/Volumen) Antikörper, die an den Harzteilchen absorbiert sind; diese Menge kann sich jedoch mit der Konzentration der Teilchen ändern. Die Antikörpermenge sollte gerade so groß sein, daß eine Selbstaggregation der Harzteilchen verhindert wird. Bei Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,23 /um beträgt diese Menge etwa ein Zehntel des Gewichtes der Teilchen.

Die Suspension soll vorzugsweise auch ein Stabilisierungsmittel enthalten, welches nach der Absorption der Antikörper an den Teilchen zugesetzt wird; es kann sich dabei um ein inertes Protein, z.B. Serum-albumin handeln, dessen Konzentration beispielsweise 0,1 io (Gewicht/Volumen) beträgt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das diagnostische Mittel auch normales Serum' (d.h. ein Serum, welches weder den gegenüber Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen Antikörper noch das Antigen selbst enthält), welches von derselben Tierart gewonnen worden ist, von der auch das den Antikörper enthaltende Serum gewonnen wurde. Die Gegenwart eines solchen normalen Serums verhindert erheblich die Menge der "falsch-positiven" Anzeigen, wenn das diagnostische Mittel dazu verwendet wird, Hepatitis B-Oberflächenantigen in Blutproben festzustellen. Vorzugsv/eise wird etwa ein Teil normales Serum pro 20 bis 50 Teile (Volumenteile) der wässrigen Suspension der mit dem Antikörper beschichteten Harzteilchen zugesetzt. ¥ird ein normales Serum von derselben Tierart, von der auch das Antikörper enthaltende Serum gewonnen worden ist, dem diagnostischen Mittel nicht zugesetzt, so bringen etwa 10 ^cß> eines menschlichen Serums, welches kein Hepatitis B-Oberflächenantigen enthält, die Harzteilchen zum Agglutinieren. Dies ist

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wahrscheinlich auf die Anwesenheit "bestimmter Substanzen in solchen menschliehen Seren zurückzuführen, die mit anderen Materialien reagieren, die von dem Tier-Antiserum stammen, aus denen der gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen gerichtete Antikörper gewonnen worden ist. Wird dagegen das normale Tierserum zugesetzt, so reichen bereits 1 bis 3 $ menschliches Serum, das kein Hepatitis B-OberfIachenantigen enthält, zum Agglutinieren der Harzteilchen aus. !Dies ist auf Komponenten in dem normalen Tierserum zurückzuführen, die mit diesen Substanzen, in dem menschlichen Serum reagieren können und so eine Agglutinierung der Harzteilchen verhindern.

Eine Kontrolle des normalen menschlichen Serums, welches aus nicht verdünntem, normalem, gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen negativem menschlichem Serum hergestellt worden ist, v/ird mit dem Latexreagens und radioimmunologisch durchgeführt.

Ein positives Kontrollserum wird aus einem menschlichen Serum hergestellt, welches gegenüber Hepatitis B-Oberflächenantigen positiv ist. Dieses Serum wird bei 6O⁰G wenigstens 10 Stunden erhüzt, um die Infektionskraft des Virus zu zerstören, und dann zweimal in normalem menschlichem Serum der seriellen Verdünnung unterworfen. Die auf das Produkt angewandte Verdünnung ist die, die eine definierte 1+Reaktion mit dem Iiatexreagens ergibt.

Das diagnostische Mittel besteht aus folgenden Bestandiälen:

A. ITachweis-System

1. Hepatitis-Antikörper, absorbiert an latexkügelchen

2. Positives Kontrollserum

3. Negatives Kontrollserum

B· Kontrollsystem

1. Hepatitis-Antikörper (menschlich)

2. normales menschliches Kontrollserum (negativ gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen)

3. Rheumatoidfaktor-Absorptionsreagenz

4. Kontrolltestverdünnungsmittel

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Der Hepatitis-Antikörper wird aus menschlichem Plasma hergestellt, welches Antikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen enthält. Das Plasma wird von verschiedenen Plasmaphoresezentren erhalten, durch Geldiffusion titriert und dann durch Zugabe von Calciumchlorid und Schweinethrombin in Serum umgewandelt. Gammaglobulin wird dann aus dem Serum durch Zugabe von 16$igem Natriumsulfat hergestellt. Der niederschlag wird nach dem Waschen mit 14/^igem Natriumsulfat über Nacht gegen einen Phosphatpuffer mit niedriger Molarität dialysiert und dann durch DEAE-Cellulose geleitet, die zuvor mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das gereinigte Gammaglobulin wird dann durch Eonzentrieren standardisiert und gegen mit Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert.

Das Rheumatoidfaktor-Absorptionsreagens besteht aus latexkügelchen, die mit normalem menschlichem Gammaglobulin beschichtet sind. Es wird hergestellt, indem man eine Standardlösung aus gereinigtem Gammaglobulin in .mit Glycin gepufferter Salzlösung herstellt, eine v/eitere Suspension, aus Polystyrolkügelehen mit einer Größe von 0,2 /um zusetzt und 15 Minuten auf 57⁰C erhitzt. Die Suspension wird dann mit mit Glycin- gepufferter Salzlösung verdünnt.

Das Eontrolltestverdünnungsmittel wird hergestellt, indem man eine lösung von 30$igem Schweineserumalbumin mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung auf eine Proteinkonzentration von 5$ verdünnt.

Prüfmethoden

A. Sersteilung der Blutprobe

Serum ist die bevorzugte Form der Blutprobe. Handelt es sich bei der Blutprobe um das Gesamtblut, so muß dieses zuerst behandelt v/erden, um die darin befindlichen Zellen in Lösung zu bringen und eine Koagulation zu verhindern. Zu diesem Zweck kann man das Blut mit einem wässrigen Verdünnungsmittel behandeln^ welches

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ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel vom Typ der .polyoxyäthylierten Alkylphenole, z.B. Isooctylphenoxypolyoxyäthyläthanol ("Triton X-1OO", welches von der Firma Rohm & Haas vertrieben wird) und· Hatriumzitrat sein kann.

Besteht die zu prüfende Probe aus Blutplasma, so muß dieses ein Antikoagulans, z.B. ein beliebiges Standard-Antikoagulans wie Fatriumzitrat, enthalten. Vorzugsweise wird die Probe mit demselben wässrigen Verdünnungsmittel, welches ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel enthält, das auch für die G-esamtblutprobe verwendet wird, behandelt, um die gegebenenfalls vorhandenen restlichen Blutzellen in Lösung zu bringen.

B· Reagentien
1. Latexreagenz

a. Spezifizität

1. Diese wird bestimmt, indem man das Reagenz mit der Reihe der positiven und negativen Seren prüft, die vom Bureau of Biologies zur Verfügung gestellt wird, sowie mit einer Reihe von 100 negativen Seren, die von normalen Freiwilligen eingesammelt worden sind.

b. Reaktivität

1. Zur Bestimmung wird das Reagenz unter lebhaftem Rühren resuspendiert.

2. In eine der Vertiefungen auf einer Kunststofftestplatte werden 3 Tropfen des positiven Kontrollserums gegeben. In die zweite daneben liegende Vertiefung werden 3 Tropfen des negativen Eontrollserums gegeben.

3. In jede Probe wird ein Tropfen des Reagenz gegeben.

4. Unter Verwendung getrennter Mischvorrichtungen wird die Mischung in jeder Vertiefung vollständig durchgemischt.

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5. Danach wird die Platte in einer mechanischen Drehvorrichtung 10 Minuten mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt.

6. Die Mischungen v/erden über einer indirekt beleuchteten Betrachtungsvorrichtung geprüft.

7. An der Probe mit positivem Eontrollserum sollte eine deutlich positive, schwache (1+) Reaktion zu beobachten¹ sein. An der Probe mit'negativem Eontrollserum sollte keine Reaktion zu beobachten sein.

2. Positives Eontrollserum
a. Reaktivität

1. Das positive Eontrollserum wird mit dem latexreagenz geprüft, um eine Reaktivität von 1+ sicherzustellen.

3. Negatives Eontrollserum
a. Reaktivität

1. Das negative Eontrollserum wird mit dem Latexreagenz geprüft, um eine negative Reaktivität sicherzustä.len.

4. Formales menschliches Eontrollserum a. Spezifizität

1. Der Eontroll- bzw. Bestätigungstest wird ausgeführt, um sicherzustellen, daß das Serum nicht mit dem latexreagenz reagiert und daß es die positiven Hepatitis B-Oberflächenantigen-Seren nicht inhibiert.

5. Hepatitis-Antikörper (menschlich)
a. Reaktivität

1.Es wird eine Geldiffusionstitration durchgeführt unter Verwendung von Standard-Hepatitis B-Oberflächenantigen.

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b. Spezifizität

1. Es wird ein Gebrauchstest durchgeführt, "um zu "bestimmen, ob das Serum spezifisch die positiven Hepatitis B-Oberflächenantigen-Proben inhibiert, wenn es in dem Kontrolltestprotokoll verwendet wird.

6. Absorptionsreagenz
a. Reaktivität

1. Das Reagenz wird mit Seren geprüft, die den Rheumatoidfaktor enthalten, um sicherzustellen, daß sie mit diesem reagieren und ihn partiell aus den ihn enthaltenden Seren absorbieren.

7. Kontrolltestverdünnungsmittel
a. Spezifizität

1. Der Kontrolltest wird unter Verwendung des Verdünnungsmittels durchgeführt, um sicherzustellen, daß dieses mit dem Latexreagenz nicht reagiert und daß es die positiven Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Serumproben nicht inhibiert.

C Prüfung der Serumproben (Nachweis)

1. 120 /Ul Serum werden in die Vertiefung einer Kunststoffplatte gegeben.

2. Es wird ein Tropfen latexreagenz zugesetzt.

3. Es wird vollständig unter Verwendung getrennter Mischvorrichtungen für jede Probe durchgemischt.

4. Die Platte wird auf einem mechanischen Rotor 10 Minuten mit 150 Umdrehungen pro Minute in Umdrehung versetzt.

5· Die Mischungen werden über einem indirekt beleuchteten Betrachter geprüft.

6. Die Reaktionen werden entsprechend einer Skala von 1+ bis 4+

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aufgezeichnet, und zwar entsprechend der zunehmenden Intensität der Agglutination.

D. Kontroll-ITeutralisationsvorgang

1. Proben

a. Alle Proben, die in dem Nachweis als positiv identifiziert worden sind.

b. Positives Eontrollserum, welches als schwach-positive Probe mit umfaßt v/ird.

2. Arbeitsweise

a. Ein 10 χ 75 mm Reagenzglas wird mit der Probenbezeichnungsnummer und "A" gekennzeichnet. Ein zweites Reagenzglas wird mit der Probenbezeichnungsnummer und "B" gekennzeichnet.

b. Zwei Tropfen (etwa 80 /ul) Hepatitis-Antikörper (menschlich) v/erden in das mit "A" gekennzeichnete Reagenzglas gegeben.

c. Zwei Tropfen negatives normales menschliches Kontrollserum werden in das mit "B" gekennzeichnete Reagenzglas gegeben.

d. 240/ul der Testprobe werden in jedes der mit "A" und "B" bezeichneten Reagenzgläser gegeben.

e. Der Inhalt der Reagenzgläser wird gemischt und 30 Minuten bei 37⁰C in einem Wasserbad bebrütet.

f. Je 120 /ul aus den Reagenzgläsern ¹M" und "B" werden unter Verwendung der Hachweisreagentien und -methoden geprüft. Bei den meisten relativ schwach positiven Proben kann eine Differenzierung zwischen spezifisch und nicht-spezifisch positiv ohne weitere Prüfung erfolgen, da die "A"-Probe nicht reaktiv ist, während die "B"-Probe positiv bleibt, was eine spezifische Inhibierung durch die menschlichen Antikörper anzeigt. I¹Ur die Proben, die spezifisch, jedoch höher im Titer sind als auch für die, die nicht-spezifisch sind, ist eine weitere Prüfung erforderlich, wie im folgenden erläutert v/erden wird·

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g. Pur jedes Reagenzglas, für welches eine v/eitere Prüfung erforderlich ist, werden zusätzliche 6 Reagenzgläser mit Verdünnungen von 1:4- "bis 1:128 sowie den entsprechenden Probenbezeichnungen und den Bezeichnungen "A" oder "B" vorbereitet.

h. In jedes Reagenzglas werden 200 /ul des Kontrolltestverdünnungsmittels gegeben, und zwar auch in die Reagenzgläser, die die Probe des Patienten und menschliches Antiserum oder normales menschliches Serum enthalten, d.h. die ursprünglichen "A"- und "B"-Reagenzglaser, die auf eine etwa 1:2-Verdünnung gebracht werden.

i. Es werden zweifache Verdünnungen hergestellt, in dem 200/Ul übertragen werden, wobei getrennte Mikropipettenspitzen für jedes Reagenzglas benutzt werden; vor Entfernung der Proben wird gut gemischt.

j. 120 /ul aus jedem Reagenzglas werden geprüft, wobei die Nachweisreagentien- und Methoden angewandt werden.

k. Der in Reihe "B" erzielte Titer (Probe und normales menschliches Serum) muß viermal so hoch sein ( zwei Reagenzgläser) wie in Reihe "A" ( Probe und neutralisierender HaA, damit die Probe als ein spezifisches Hepatitis B-Oberflächenantigen positiv angesehen werden kann). In den Fällen, in denen sowohl der "A"- und der "B"-Titer höher als 1:128 ist, muß eine weitere Verdünnung durchgeführt werden, bis ein Endpunkt bestimmt werden kann.

Da eine Anzahl der Proben, die den Rheumatοid-Paktor enthalten, mit dem latexreagenz reagiert, ist es erforderlich, die Proben zu kennzeichnen, die sowohl das Hepatitis B- Oberflachenantigen

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als auch den Bheumatoid-Faktor enthalten..

Die Anwesenheit des Rheumatοid-Faktors kann bestimmt v/erden, indem man das Serum mit dem den Rheumatoid-Faktor absorbierenden Reagenz ( latex, beschichtet mit menschlichem Gammaglobulin) prüft, indem man 120 /al der Probe und einen Tropfen des absorbierenden Reagenzes auf einem Kunststoffplättchen mischt und dieses fünf Minuten rotieren läßt.

Enthält die Probe den Rheumatoid-Paktor, so kann dieser herausabsorbiert werden, indem man 720 /ul der Probe in ein 10 χ 75 mm Reagenzglas gibt und dann noch sechs Tropfen des absorbierenden Reagenzes hinzufügt. Es wird gut gemischt und fünfzehn Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Anschließend wird mit 3000 Umdrehungen pro Minute fünf Minuten lang zentrifugiert. Der Kontroll- Ueutralisationsvorgang an der absorbierten Probe wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt.

Herstellung von gereinigtem Antikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen

Meerschweinchen v/erden mit Hepatitis B-Oberflächenantigen, welches nach dem in der US-PS 3 838 144 beschriebenen Yerfahren gereinigt worden ist, immunisiert.

Einer ersten Immunisierung mit Antigen in "Freund ¹S vollständigem Zusatzmittelpräparat" in die !Fußbällen der Meerschweinchen schließen sich zwei weitere intraperitoneale Impfungen mit Antigen ohne Zusatzmittel an. Fach dem Sammeln der aus den immunisierten Tieren gewonnenen Seren werden restliche Antikörper gegen menschliche Serum-proteine, falls erforderlich, entfernt, und zwar durch Zugabe von normalem menschlichen Serum zu dem Antiserum. Das · Gamma globulin wird dann durch Ausfällung mit 14 ?£-igem (Gewicht/Volumen) wässrigem

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Fatriumsulfat gereinigt, gegen wässrige, mit Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert und vorzugsweise etwa 30 Minuten auf 56⁰C erhitzt, um den Komplementärfaktor zu zerstören.

Das gereinigte Serum wird mit menschlichem Serum, welches Hepatitis B-Oberflächenantigen enthält, vermischt und hei 37⁰C eine Stunde und dann über lacht bei 4°C bebrütet. Der Antigen- Antikörperniederschlag, der sich auf diese Weise bildet, wird zweimal mit kalter, mit Phosphat gep ufferter Salzlösung gewaschen, um die Eauptmenge der restlichen nichtspezifischen Proteine zu entfernen. Danach wird der Antigen-Antikörper-lfiederschlag in kalter 0,2 m Essigsäure-2$ Sucrosemischung, pH 2,3, oder in chaotropen Ionen gelöst. Die dissoziierten Antigene und Antikörper werden durch Zentrifugieren mit 25.000 - 28.000 Umdrehungen pro Minute in 12 - 15 Stunden oder mit 30.000 Umdrehungen pro Minute in 4 Stunden an einem kontinuierlichen 10-40 fo Sucrosegradienten im Beckman TI-I5 Zonenrotor getrennt. Der Rotor wird entleert, indem man 50 $- ige Sucrose einpumpt, um den Gradienten zu ersetzen; 20 ml-Praktionen werden in einer 1 cm-Zelle bei 280 mn auf Ultraviolett- Absorptionsvermögen geprüft; die Peak-Praktionen werden gesammelt und ergeben eine gereinigte spezifische Antikörperfraktion, die dann mit 0,1 η UaOH neutralisiert wird. Die Antikörperfraktion wird auf das ursprüngliche Serumvolumen konzentriert und über Macht gegen eine mit Glycin gepufferte Salzlösung dialysiert. Der gereinigte Antikörper wird dann titriert und standardisiert.

Der Antikörper wird in optimaler Weise verdünnt, indem man kleine Proben des diagnostischen Mittels mit verschiedenen Verdünnungen des Antikörpers herstellt und diese gegen eine Reihe menschlicher Seren, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis B-Oberflächenantigen enthalten, prüft. Die Verdünnung, mit der die besten Ergebnisse in der Reihe erhalten werden,

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v/enn sie auf Earztei.lcta.en aufgebracht .ist, wird zur Herstellung des diagnostischen Mittels ausgewählt.

Herstellung der diagnostischen Reagentien

Beispiel 1

Eine 30 $-ige ( Gewicht/Volumen) wässrige . Suspension von 0,23/um großen Polystyrolkügelchen ( hergestellt von der Firma Dow Chemical) wird mit mit Glycin gepufferter Salzlösung auf 8 fo (Gewicht /Volumen) verdünnt und gegen mit Glycin gepufferte Salzlösung über Facht dialysiert. Unmittelbar danach werden 9 Volumenteile gereinigtes Meerschweinchenantiserum, welches den Antikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen ( verdünnt auf 0,05 f» - Gewicht/Volumen) enthält, zugesetzt, worauf ohne Unterbrechung 30 Minuten gerührt wird. Dann werden ein Volumenteil Schweineserumalbumin ( 1 ^cfo-Gewichlfc / Volumen) und schließlich noch Batriumazid in einer Menge, daß sich eine Konzentration von 0,1 fo ( Gewicht/Volumen) in dem fertigen Produkt ergibt, zugesetzt.

Beispiel 2

Eine 30 $-ige Suspension ( Gewicht/Volumen) von Polystyrolkügelehen ( 0,05 - 2,0 /um) wird mit einer mit Glycin gepufferten Salzlösung auf 8 f> verdünnt und unter Zugabe von Hypchloritlösung sterilisiert. Danach wird gegen mit Glycin gepufferte Salzlösung dialysiert, um das Hypochlorit zu entfernen. Die lösung wird dann zu 9 Volumenteilen von ausreichend verdünntem, gereinigtem Meerschweinchenserum-lhtikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen gegeben. Die Zugabe der Polystyrolsuspension erfolgt langsam unter Rühren, welches dann noch eine Stunde fortgesetzt wird. Danach werden die Polystyrolkügelchen abzentrifugiert, zweimal in der Zentrifuge mit gepufferter Salzlösung gewaschen und auf die ursprüngliche Volumenmenge in gepufferter Salzlösung resuspendiert. Unter Rühren wird in 30 Minuten Schweineserumalbumin zugesetzt. Ein Zehntel des Volumens eines

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verdünnten normalen Serums von nichtimmunisierten Meerschweinchen ( verdünnt auf 1 : 3,5 mit mit Glycin gepufferter Salzlösung) v/irä zugegeben und die Mischung wird erneut 30 Minuten gerührt. Schließlich wird die Mischung kräftig geschüttelt, um alle eventuell agglomerisierten Teilchen zu dispergieren. Alle "benutzten Lösungen werden durch Filtration sterilisiert und enthalten 0,1 $ (Gewicht/Volumen) Natriumazid als Konservierungsmittel.

Beispiel 3

Ein positives Kontrollserum wird aus einer Menge menschlichen Serum hergestellt, von dem "bekannt ist, daß es gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen positiv ist. Das Serum wird in der Wärme bei 60⁰C etwa 10 Stunden behandelt, um die Infektionskraft des Yirus zu zerstören; danach wird zweifach mit normalen menschlichen Serum seriell verdünnt. Die angewandte Verdünnung ist so gewählt, daß sich eine definierte 1+ Reaktion mit dem Iatesreagenz von Beipiel 1 oder Beipiel 2 ergibt. Anschließend wird steril filtriert und in sterile Behälter abgefüllt.

Beispiel 4

Ein negatives Kontrollserum wird aus nicht verdünntem menschlichen Serum hergestellt, von dem bekannt ist, daß es gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen negativ ist, und zwar mit dem Latexreagenz von Beispiel 1 oder Beispiel 2 und durch Radioimmunologie. Die lösung wird steril filtriert und in sterile Behälter abgefüllt.

Beispiel 5

Menschliches Plasma, welches Antikörper gegen Hepatitis B-

.y/

Oberflächenantigen," wird durch Geldiffusion titriert und durch Zugabe von Kaliumchlorid und Schv/e ine thrombin in Serum umgewandelt. Aus dem Serum wird Gammaglobulin durch Ausfällung mit 16 $-igem (Gewicht/Volumen) Hatriuinsulphat hergestellt. ¥ach dem Waschen des Niederschlages in 14 fs-igein (Gewicht/Volumen)

enthält

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ETatriumsulphat wird über ITactit gegen einen Phosphatpuffer niedriger Molarität dialysiert, worauf die lösung durch. DEAE-Cellulose, die , zuvor mit demselben Paffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, geleitet wird. Das gereinigte Gammaglobulin wird durch Eonzentrieren standardisiert und gegen mit Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert. Danach wird steril filtriert und in sterile Behälter abgefüllt.

Beispiel 6

Eine Standard-Lösung von gereinigtem menschlichen Gammaglobulin in mit Glycin gepufferter Salzlösung wird zu einer Suspension von 0,2 /um großen Polystyrollatexkügelchen gegeben und 15 Minuten auf 57⁰C erhitzt. Die Suspension, die dazu verwendet wird, den Rheumatoid-Falrfcor aus den Testseren zu absorbieren, wird mit mit Glycin gepufferter Salzlösung verdünnt und in sterile Behälter abgefüllt.

Beispiel 7

Ein Kontrolltestverdünnungsmittel wird hergestellt, indem man eine lösung von 30 fo-igem (Gewicht/Tolumen) Schweineserumalbumin mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung auf eine Proteinkonzentration von 5 i° (Gewicht/Tolumen) verdünnt. Die lösung wird steril filtriert und in sterile Behälter abgefüllt.

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Claims

Patentansprüche

1 Jl Diagnostisches Mittel zur Feststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet, daß dasselbe aus einer wässrigen Suspension im wesentlichen gleichmäßiger Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von etwa 0,23 /um "besteht, in v/elcher die Polystyrolkügelchen mit einem gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen Antikörper, der aus dem Serum von mit gereinigtem Hepatitis B-Oberflächenantigen aus menschlichen Blut immunisierten Meerschweinchen gewonnen worden und frei von restlichen Antikörpern gegen menschliche Serumproteine ist, beschichtet sind und welche außerdem in dem wäßrigen Medium normales Meerschweinchenserum, welches frei von gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen Antiköpern ist, enthält.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polystyrolkügelchen mit einer Menge gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischem Antikörper beschichtet sind, die gerade ausreicht, um eine Selbstaggregation der Harzteilchen zu verhindern.
3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dasselbe auch ein Konservierungs- und/oder Stabilisierungsmittel enthält.
4. Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Suspension im wesentlichen gleichmäßiger Polystyrolteilchen mit

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einem Durchmesser von etwa 0,23 /um mit einem gegen Hepatitis B-Oberfläehenantigen spezifischen Antikörper beschichtet wird, wobei der Antikörper aus dem Serum von Meerschweinchen, die mit gereinigtem Hepatitis B-OberfIachenantigen aus menschlichem Blut immunisiert worden sind, gewonnen worden und frei von restlichen Antikörpern gegen menschliche Serumproteine ist, und wobei der Lösung der Suspension normales Meerschweinchenserum, -welches frei von gegen Hepatitis B-Oberfläehenantigen spezifischen Antikörpern ist, und gegebenenfalls auch ein Konservierungs- und/oder Stabilisierungsmittel zugesetzt werden.
5. Verfahren nach. Anspruch 4_S dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gereinigt wird, indem man das die Antikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Meerschweinchenserum mit dem Ende hoher Dichte eines flüssigen Mediums mit hohem Dichtegradienten in Berührung bringt, das flüssige Medium der Ultrazentrifugierung aussetzt, bis eine Gleichgewichtsverteilung der Serumkomponenten durch den Diehtegradienten erreicht ist, und daß man dann die fraktion, die die gegen Hepatitis B-OberfIachenantigeη spezifischen Antikörper enthält, abtrennt.
6. Verfahren zum feststellen der Anwesenheit von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man Testproben von Blut, welches frei von roten Blutzellen ist, mit dem'diagnostischen Mittel gemäß Anspruch 1-3 vermischt und danach (a) alle positiven Testproben des Blutes durch Mischen mit dem der Hepatitis beim Menschen zugehörigen Antikörper neutralisiert* (b) den Rheumatoid-3?aktor aus den denselben enthaltenden Testproben von Schritt (a) durch. Mischen mit Ijatexkügelchen, die mit menschlichem Gammaglobulin beschichtet sind, herausabsorbiert und (c) erneut die positiven Testproben mit dem diagnostischen Mittel gemäß Anspruch 1-3 vermischt.

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7. Packung zur Ausführung von Tests zur Feststellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in menschlichem, Blut, ge- ' kennzeichnet durch folgende Bestandteile:

(a) eine Reagenzampulle, die wässrige Suspension der mit gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen Antikörper "beschichteten Latexkügelchen gemäß Anspruch1,2 oder 3 enthält;

(b) eine Reagenzampulle mit positivem menschlichen Eontrollserum;

(c) Reagenzampulle mit negativem menschlichen Eontrollserum,

(d) Reagenzampulle mit einer wässrigen Lösung von der Hepatitis beim Menschen zugehörigen Antikörper;

(e) Reagenzam .pulle mit einer wässrigen Suspension von Ιοί exkügelehen, die mit menschlichem Gammaglobulin beschichtet sind;

(f) Reagenzampulle mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung von Schweineserumalbumin mit 5 36-iger Proteinkonzentration;

(g) Eunststoffplättchen zur Ausführung der Prüftests.

Für: Pfizer Inc.

Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt

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SAD ORIGINAL