Przedmiotem wynalazku jest preparat diagnosty¬ czny do wykrywania powierzchniowego antygenu hepatitis B we krwi ludzkiej zawierajacy wodna zawiesine zasadniczo jednorodnych kulistych cza- 25 stek syntetycznych polimeru o srednicy 0,05—2,0 mikrona, pokrytych oczyszczonym przeciwcialem specyficznym w stosunku do powierzchniowego an¬ tygenu hepatitis B, otrzymanym z osocza swinek morskich, immunizowainych oczyszczonym antyge- 30 2 nem powierzchniowym hepatitis B z krwi ludzkiej i wolnym od pozostalych przeciwcial do bialek oso¬ cza ludzkiego, przy czym przeciwcialo jest oczysz¬ czone v przez kontaktowanie roztworu kompleksu antygen-iprzeeiwcialo, otrzymanego przez kontakto¬ wanie osocza swinki morskiej, zawierajacego prze¬ ciwciala powierzchniowego antygenu hepatitis B z koncowa frakcja cieklego medium o ciaglym, wzra¬ stajacym gradiencie gestosci, poddanie cieklego medium ultrawirowaniu do osiagniecia równowa¬ gowego rozkladu skladników osocza iprzez gradient gestosci i wydzielenia frakcji zawierajacej prze¬ ciwcialo specyficzne do powierzchniowego antyge¬ nu hepatitis B oraz normalne osocze swinek mor¬ skich, nie zawierajace przeciwciala specyficznego do powierzchniowego antygenu hepatitis B.Preparat .diagnostyczny wedlug wynalazku do wykrywania powierzchniowego antygenu hepatitis B we krwi ludzkiej, zawiera wodna zawiesine roz¬ drobnionych .czastek syntetycznego polimeru o równomiernej wielkosci, pokrytych oczyszczonym przeciwcialem, specyficznym w stosunku do po¬ wierzchniowego antygenu hepatitis B. Falszywe od¬ czyty dodatnie ograniczono do minimum przez do¬ datek normalnego osocza zwierzat tego gatunku, z którego otrzymano osocze zawierajace przeciwcia¬ lo, a potwierdzenie wszystkich rzeczywiscie dodat¬ nich wyników uzyskano przez zastosowanie kon¬ trolnego, normalnego osocza ludzkiego i odczynnika absorbujacego czynnik reumatoidalny. 98 60498 604 3 Preparat diagnostyczny wedlug wynalazku jest wysoce czulym i specyficznym odczynnikiem do wykrywania powierzchniowego antygenu hepatitis B we krwi ludzkiej, dzieki (a) zastosowaniu «czastek syntetycznego polimeru pokrytych oczyszczonym przeciwcialem otrzymanym ze zwierzat immunizo- wanych oczyszczonym antygenem powierzchniowym hepatitis B i (b) ograniczeniu do minimum falszy¬ wych odczytów dodatnich przez dodanie normalne¬ go osocza zwierzat tego gatunku, z którego otrzy¬ mano osocze zawierajace przeciwcialo oraz (c) po¬ twierdzeniu wszystkich rzeczywiscie dodatnich od¬ czytów przez zastosowanie kontrolnego, normalne¬ go osocza ludzkiego i odczynnika absorbujacego ezynmik reumatoidalny.Jak wspomniano preparat diagnostyczny wedlug wynalazku zawiera wodna zawiesine rozdrobnio¬ nych czastek syntetycznego polimeru pokrytych oczyszczonym przeciwcialem, specyficznym w sto¬ sunku do powierzchniowego antygenu hepatitis B.Korzystnie sa to kuliste -czastki polistyrenu o sred¬ nicy okolo 0,23 mikrona lecz odpowiednie moga byc równiez czastki polistyrenu lub innych zywic syn¬ tetycznych, nip. zywic akrylowych o równomiernych wymiarach 0,05—2^0 mikrona.Przeciwcialo specyficzne w stosunku do powierz¬ chniowego antygenu hepatitis 'B korzystnie otrzy¬ muje sie z osocza ssaków, np. ludzi, owiec, kóz, królików, swinek morskich lub ptaków, jak kur¬ czeta lub indyki, które zawieraja te przeciwciala lub takich, które zostaly immunizowane w wysokim stopniu oczyszczonym powierzchniowym antygenem hepatitis B otrzymanym z krwi ludzkiej.Swinki morskie i zwierzeta innych gatunków, jak króliki, kozy itp. immunizuje sie antygenem po¬ wierzchniowym hepatitis B, oczyszczonym sposo¬ bem opisanym w opisie patentowym Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr 3 838 144. Po wstepnej im- ' munizacji antygenem w kompletnym adjuwancie Freundsa w konczyne, powtarza sie inokulacje kil¬ kakrotnie dootrzewnowa, domiesniowo, podskórnie lub dozylnie antygenem bez adjuwantu lub z adju- wantem. Po polaczeniu osoczy pobranych z immu- nizowanych zwierzat usuwa sie szczatkowe przeciw¬ cialo ibialek osocza ludzkiego, jezeli jest ono obec¬ ne, przez kontaktowanie przeciwosocza z normal¬ nym osoczem ludzkim. Gamma globuline mozna nastepnie oddzielic przez wytracenie 14% wodnym roztworem siarczanu sodu, dializowac wobec solan¬ ki buforowanej wodnym roztworem fosforanu i ko¬ rzystnie ogrzewac w temperaturze 56°C w ciagu okolo 30 minut w celu zniszczenia komplementu.Przeciwcialo oczyszcza sie dalej zwyklymi spo¬ sobami opisanymi w The Journal of Immunolo- gy, tom 106, nr 3, marzec 1971 i Biochemistry, tom 6, nr 5, maj 1967. Specyficzne powierzchniowe przeciwcialo hepatitis B oczyszcza sie z zaabsorbo¬ wanego osocza zwierzecego, korzystnie osocza swin¬ ki morskiej przez mieszanie osocza w optymalnych proporcjach z osoczem ludzkimi zawierajacym [po¬ wierzchniowy antygen hepatitis B, inkubacje w temperaturze 37°C w ciagu godziny, a nastepnie w ciagu nocy w temperaturze 4°C. Takpowstaly osad antygen-fcrzeciwcialo przemywa sie dwukrotnie w zimnej solance buforowanej fosforanem w celu u- 4 suniecia wiekszosci niespecyficznych bialek. Osad antygen-przeciwoialo rozpuszcza sie nastepnie w - zimnym roztworze 0,2 m kwas octowy 2°/o sacha¬ roza o wartosci pH 2,3 lub w roztworach chaotro- powych jonów o róznej molarnosci, np. w 2,0 m roztworze rodanku sodu o wartosci pH 6,6.Dla fachowców jest oczywiste, ze w celu zdyso- cjowania kompleksu antygen-przeciwcialo mozna zastosowac równiez inne odpowiednie bufory. Zdy- socjowane antygeny i przeciwciala oddziela sie przez wirowania z szybkoscia 25000—£8000 obrotów na minute, w ciagu 12—15 godzin lub 30000 obro¬ tów na minute w ciagu 4 godzin, stosujac 10—14°/o roztwór sacharozy o gradiencie ciaglym w roztwo¬ rze strefowym Beckman TI-15. Rotor rozladowuje sie przez wpompowanie 50°/o roztworu sacharozy, w celu wyparcia gradientu, a 20 ml frakcje bada sie na absorpcje w nadfiolecie przy 280 nm w ku¬ wetach 1 cm, a frakcje pikowe laczy sie otrzymujac oczyszczone frakcje specyficznego przeciwciala i oczyszczone frakcje antygenu. Obie frakcje zobo¬ jetnia sie 0,1 n roztworem NaOH. Frakcje prze¬ ciwciala zateza sie do poczatkowej objetosci oso¬ cza i dializuje w ciagu nocy wobec solanki bufo¬ rowanej glicyna. Oczyszczone przeciwcialo nastep¬ nie mianuje sie i standaryzuje.Jako srodek konserwujacy mozna do preparatów diagnostycznych dodac azydek sodu w ilosci 0,1%.Przeciwcialo najlepiej jest rozcienczac przez spo¬ rzadzenie malych porcji odczynnika diagnostyczne¬ go z róznymi rozcienczeniami przeciwciala i spraw¬ dzenie ich wobec zestawu osoczy ludzkich o któ¬ rych wiadomo, ze zawieraja powierzchniowy an¬ tygen hepatitis B. Hozjcienczanie daje najlepsze wy¬ niki, jezeli odczynnik diagnostyczny jest sporzadzo¬ ny przez pokrycie czastek zywicy.Odpowiednio rozcienczone przeciwcialo miesza sie z czastkami lateksu polistyrenowego o srednicy 0,2 mikrona. Po mieszaniu w ciagu godziny do dwóch, zywice trzykrotnie przemywa 'se solanka buforo¬ wana glicyna i ponownie zajwiesza w solance bufo¬ rowanej glicyna.Wodna zawiesina korzystnie zawiera okolo 0,5°/o wagowych w objetosci czastek zywicy, lecz moze zawierac równiez czastki zywicy w ilosci 0,1—3°/o wagowych w objetosci. Dla sporzadzenia odczynni¬ ka diagnostycznego korzystna zawartosc przeciw¬ ciala zaabsorbowanego na czastkach zywicy wynosi okolo 0,05% wagowych w objetosci, lecz wartosc ta moze sie zmieniac w zaleznosci od stezenia czastek.Proporcja przeciwciala winna byc akurat wystarcza¬ jaca dla zapobiezenia samoagregacji czastek zywi¬ cy. W przypadku kulistych czastek polistyrenu o srednicy 0,23 mikrona jest to okolo 1/10 wagi tych czastek.Zawiesina korzystnie zawiera czynnik utrwalaja¬ cy dodawany po absorpcji przeciwciala na czast¬ kach, np. obojetne bialko, jak albumina osocza, w stezeniu przykladowo 0,l°/o wagowych w objetosci.Odczynnik diagnostyczny wedlug wynalazku za¬ wiera równiez osocze, normalne, tj. osocze które nie zawiera przeciwciala specyficznego w stosunku do powierzchniowego antygenu hepatitis B lub samego antygenu, otrzymane ze zwierzat tego samego ga- 40 45 50 55 _6098 604 tunku, z którego pochodzi osocze zawierajace prze¬ ciwcialo. Obecnosc takiego normalnego osocza zna¬ cznie zmniejsza proporcje falszywych odczytów do¬ datnich, gdy odczynnik diagnostyczny stosuje sie do wykrywania powierzchniowego antygenu hepa- titis B w próbach krwi. Korzystnie jedna czesc normalnego osocza dodaje sie do 20—50 czesci obje¬ tosciowych wodnej zawiesiny czastek zywicy.po¬ krytych przeciwcialem. Jezeli odczynnik diagno¬ styczny nie zawiera normalnego osocza ze zwie¬ rzat tego samego gatunku, z którego otrzymano o- socze zawierajace przeciwciala, to okolo 10% oso- czy ludzkich nie zawierajacych powierzchniowego antygenu hepatitis B bedzie aglutynowac czastki zywicy. Jest to prawdopodobnie spowodowane obec¬ noscia w takich osoczach ludzkich substancji rea¬ gujacych z materialami pochodzacymi z antyserum zwierzecego, z którego otrzymano przeciwcialo do powierzchniowego antygenu hepatitis B.W przypadku obecnosci normalnego osocza zwie¬ rzecego jedynie okolo 1—3% osoczy ludzkich aglu- tynuje czastki zywicy w nieobecnosci powierz¬ chniowego antygenu hepatitis B. Moze to byc spo¬ wodowane obecnoscia, w. normalnym osoczu zwie¬ rzecym skladników zdolnych do reagowania z tymi * substancjami w osoczu ludzkim i zapobiegania w ten sposób ich dzialaniu aglutynujacemu czastki zywicy.Kontrolne normalne osocze ludzkie otrzymuje sie z nierozcienczonego normalnego osocza ludzkiego, dajacego ujemny wynik próby na powierzchniowy antygen hepatitis B za^ pomoca odczynnika latek¬ sowego lub radioimmuinologicznego.Dodatnie osocze kontrolne sporzadza sie z osocza ludzkiego zawierajacego powierzchniowy antygen hepatitis B.' Osocze ogrzewa sie do temperatury 60°C w ciagu co najmniej 10 godzin, w celu zni¬ szczenia zakaznosci wirusa, a nastepnie podwójnie rozciencza seryjnie w normalnym osoczu ludzkim.Rozcienczeniem stosowanym dla produktu jest da¬ jacy wyrazna reakcje +1 z odczynnikiem latekso¬ wym.Uklad odczynnika diagnostycznego sklada sie z nastepujacych skladników: A. Uklad testu skriningowego. 1. Przeciwcialo zwiazane z hepatitis zaabsor¬ bowane na lateksie. 2. Osocze kontrolne dodatnie. 3. Osocze kontrolne ujemne.B. Uklad testu potwierdzajacego. 1. Przeciwcialo zwiazane z hepatitis (ludzkie). 2. Kontrolne normalne osocze ludzkie (ujemne ma powierzchniowy antygen hepatitis B). 3. Odczynnik absorbujacy czynnik reumato¬ idalny. 4. Rozcienczalnik testu potwierdzajacego.Przeciwcialo zwiazane z hepatitis {ludzkie) otrzy¬ muje sie z plazmy ludzkiej zawierajacej przeciw¬ ciala powierzchniowego antygenu hepatitis B. Plaz¬ ma .otrzymana z róznych osrodków plasimoforezy mianuje sie przez dyfuzje zelowa i przeprowadza w osocze dodatkiem chlorku wapniowego i trom- biny wolowej. Nastepnie otrzymuje sie z osocza gamma globuline, przez wytracenie 16% roztworem siarczanu sodu. Po przemyciu osadu w 14% roz^ tworze siarczanu sodu dializuje sie go w ciagu nocy wobec buforu fosforanowego o niskiej molar- nosci, a nastepnie przepuszcza przez celuloze DEAE, uprzednio zrównowazona z tym samym buforem.Oczyszczona gamma globuline standaryzuje sie przez zatezenie i dializuje wobec solanki zbuforo- wanej fosforanem.Odczynnik absorbujacy czynnik reumatoidalny !0 sklada sie z lateksu pokrytego normalna gamma ^ globulina ludzka, który wytwarza sie z lateksu pokrytego normalna gamma globulina ludzka. Wy¬ twarza sie go pczez sporzadzenie standardowego roztworu oczyszczonej gamma globuliny w solance buforowanej glicyna, dodanie zawiesiny czastek po¬ listyrenu o srednicy 0,2 mikrona i ogrzewanie w temperaturze 57°C w ciagu 15 minut. Zawiesine rozciencza sie nastepnie solanka buforowana gli¬ cyna. v 20 Rozcienczalnik testu potwierdzajacego sporzadza sie przez rozcienczenie 30% albuminy osocza wolo¬ wego solanka buforowana fosforanem do 5% ste¬ zenia bialka. - Stosowano nastepujace metody testowe: Próby krwi preparowano stosujac osocze jako korzystna postac próby krwi. Jezeli próba ma postac pelnej krwi, to nalezy poddac ja obróbce w celu wywola¬ nia lizy komórek i zapobiezenia koagulacji. W tym celu mozna na nie podzialac wodnym rozcienczal- nikiem zawierajacym niejonowy czynnik powierz¬ chniowo aktywny typu polihydr^oksyeftylowanego - alkilofenolu, na przyklad izooktylofenoksypolio- ksyetylo-etanol (Triton X-100, Rohm and Hass Co) .i cytryniansodu. N Jezeli próba jest osocze krwi, to musi ono za¬ wierac przeciwkoagulant, na przyklad którykolwiek ze standardowych przeciwkoagulantów, taki jfak cy¬ trynian sodu. Korzystnie jest podzialac na nie sa¬ mym wodnym rozcienczalnikiem zawierajacym nie- 40 jonowy czynnik powierzchniowo aktywny, który stosuje sie do pelnej krwi, w celu lizy pozostalych -w nim komórek.Stosuje sie nastepujace odczynniki: odczynnik la¬ teksowy, którego specyficznosc jest oznaczana przez 45 badanie odczynnika zestawem dodatnich i ujem¬ nych osoczy, dostarczanych przez Bureau of Bio- logies oraz zestawem 100 osoczy pobranych od nor¬ malnych ochotników, a reaktywnosc przez przepro¬ wadzenie odczynnika ponownie w zawiesine przez 50 energiczne mieszanie i wprowadzenie do jednego ( z wglebien na plastikowej plytce testowej 3 kropli dodatniego osocza kontrolnego. Do drugiego, przy¬ leglego wglebienia wprowadza sie 3 krople ujem¬ nego osocza kontrolnego. Da kazdej próby dodaje 55 sie 1 krople odczynnika i miesza sie calkowicie, stosujac 4o kazdego wglebienia osobna paleczke, a nastepnie obraca sie plytke na wirówce mecha¬ nicznej w ciagu 10 minut z szybkoscia 150 obrotów na minute, po czyim oglada ¦ sie mieszanine nad 60 pudlem obserwacyjnym oswietlonym swiatlem pos¬ rednim. W przypadku próby z dodatnim osoczem kontrolnym winna wystapic wyraznie dodatnia, sla¬ ba reakcja (1+}. Z ujemnym osoczem kontrolnym reakcja nie powinna wystepowac. r 65 Dodatnie osocze kontrolne ocenia sie badajac je-7 go reaktywnosc. W celu sprawdzenia reaktywnosci (1+) dodatnie osocze (kontrolne sprawdza sie od¬ czynnikiem lateksowym.;W ujemnym osoczu kontrolnym ocenia sie reak¬ tywnosc w ten sposób, ze w celu sprawdzenia :u- jemnej reakcji, ujemne osocze kontrolne sprawdza sie odczynnikiem lateksowym.Kontrolne normalne osocze ludzlkie ocenia sie badajac jego specyficznosc. Test potwierdzajacy przeprowadza sie w celu uzyskania pewnosci, ze nie reaguje ono z odczynnikiem lateksowym i, ze nie inhibituje osocza dodatniego na powierzchniowy antygen hepatitis B.Przeciwcialo zwiazane z hepatitis (ludzkie) bada sie pod katem reaktywnosci. Ustala sie miano dy¬ fuzji zelowej stosujac standard powierzchniowego antygenu hepatitis B, a specyficznosc przez prze¬ prowadzenie testu uzycia, dla stwierdzenia czy o- socze specyficznie inhibituje próby dodatnie na po¬ wierzchniowy antygen hepatitis B przy zastosowa¬ niu w tescie potwierdzajacym.Odczynnik absorbujacy bada sie pod katem reak¬ tywnosci w ten .sposób, ze stosuje sie osocze za¬ wierajace czynnik reumatoidalny dla upewnienia sie, ze bedzie on reagowac z tym czynnikiem i czesciowo absorbowac go z osocza.Rozcienczalnik testu potwierdzajacego bada sie na specyficznosc przeprowadzajac test potwierdza¬ jacy z zastosowaniem rozcienczalnika dla upewnie¬ nia sie, ze nie reaguje on z odczynnikiem latekso¬ wym i nie inhibituje osocza dodatniego na powierz¬ chniowy antygen hepatitis B.Badanie prób osocza (test skriningowy) wykonu¬ je sie przez wprowadzenie do wglebienia na plasti¬ kowej plytce 120^1 osocza, dodanie jednej kropli odczynnika lateksowego calkowite wymieszanie przy uzyciu do kazdej próbki osobnej paleczki.Plytke obraca sie nastepnie na wirówce mechanicz¬ nej w ciagu 10 minut z,szybkoscia 150 obrotów na minute. Oglada sie 'mieszanine nad pudlem obser¬ wacyjnym oswietlonym swiatlem posrednim. Reak¬ cje ocenia sie wedlug skali 1+ do 4+, odpowiada¬ jacej wzrastajacej intensywnosci aglutynacji.Procedura potwierdzajacej neutralizacji polega na przeprowadzeniu szeregu prób. Do badania bierze sie wszystkie próby zidentyfikowane jako dodatnie w tescie skriningowym. Dodatnie osocze kontrolne, wlaczono jako próba slabo dodatnia.Procedura polega na tym, ze oznacza sie próbke testowa jednorazowego uzycia numerem identyfi¬ kacyjnym próby, i symbolem „A", a druga pro¬ bówke oznacza sie numerem identyfikacyjnym próby i symbolem „B". (Wymiary probówek 10X75 mm). Do probówki „A" dodaje sie 2 krople (okolo 8 /al przeciwciala zwiazanego z hepatitis (ludzkiego)/ Do probówki oznaczonej „B" dodaje sie 2 krople normalnego ujemnego kontrolnego osocza ludzkie¬ go. Do probówek „A" i „B" dodaje sie po 240 /al próby testowanej. Miesza sie zawartosc probówek i inkubuje w ciagu 30 minut w temperaturze 37°C w lazni wodnej.Testuje sie 120 /al z probówek „A" i „B", stosu¬ jac odczynniki i procedure skriningu. W przypadku wiekszosci dodatnich prób o stosunkowo niskim mianie rozróznienia miedzy specyficznym a niespe- 604 8 cyficznym odczynem dodatnim mozna przeprowa¬ dzic bez dalszych prób, poniewaz próba „A" jest niereaktywna, natomiast próba „B" pozostaje do¬ datnia, wykazujac specyficzne inhibitowanie przez przeciwciala ludzlkie. W przypadku prób specyficz¬ nych lecz o wyzszym mianie oraz prób niespecy¬ ficznych, wymagane jest dalsze testowanie jak nizej.Dla kazdej probówki wymagajacej dalszego tes¬ towania oznacza sie dodatkowo 6 probówek odpo¬ wiadajacych rozcienczeniom od 1:4 do 1:128 nume¬ rem identyfikacyjnym i symbolami „A" i „B". Do kazdej probówki dodaje sie po 200 /A rozcienczal¬ nika testu powierdzajacego, równiez do probówek zawierajacych próbke pacjenta i przeciwosocze ludzkie lub normalne osocze ludzkie, to jest pro¬ bówek „A"' i ,,B', doprowadzajac do rozcienczenia okolo 1:2.Sporzadza sie dwukrotnie rozcienczenie, przeno¬ szac 200 /A za pomoca osobowych mikropipet dla kazdej probówki i dobrze mieszajac przed pobraniem próbki. Testuje sie 120 fn z kazdej probówki, sto¬ sujac odczynniki i procedure skriningowa. Miano uzyskano w szeregu „B" {próba i normalne osacze ludzfkie) winno byc czterokrotnie (dwie probówki) wyzsze niz w szeregu „A" (próba i przeciwcialo neutralizujace zwiazane z hepatitis ludzkim) dla uznania próby za dodatnia specyficznie wobec po- ' wierzchniowego antygenu hepatitis B. W przypad¬ kach, gdy zarówno „A" jak „B" maja miano wyz- sze niz 1:128 rozcienczenie nalezy prowadzic dalej do oznaczenia punktu koncowego.Poniewaz pewna liczba prób zawierajacych czyn¬ nik reumatoidalny reaguje z odczynnikiem latek¬ sowym, konieczne jest rozróznienie prób zawiera- 00 jacych zarówno antygen powierzchniowy hepatitis B jak i czynnik reumatoidalny.Obecnosc czynnika reumatoidalnego mozna stwierdzic przez testowanie osocza odczynnikiem absorbujacym czynnik reumatoidalny (lateks po- 40 kryty gamma globulina ludzka), mieszajac 120 ul próby z jedna kropla odczynnika absorbujac go na plastikowej plytce i obracajac ja w ciagu 5 minut.Jezeli próbka zawiera czynnik reumatoidalny, to mozna go wydzielic w drodze absorpcji, dodajac 720 jul próby do probówki testowej a nastepnie wkraplajac do niej 6 kropel odczynnika absorbu¬ jacego. Próbke dokladnie miesza sie i inkubuje w temperaturze pokojowej w ciagu 15 minut. Wiruje sie w ciagu 5 minut z szybkoscia 3000 obrotów na minute. Przeprowadza sie procedure potwierdzajaca neutralizacje na absorbowanej próbie, jak wyzej opisano. Otrzymanie oczyszczonego przeciwciala do powierzchniowego antygenu hepatitis B.Swinki morskie immunizuje sie powierzchniowym antygenem hepatitis B, sposobem opisanym w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 838 144.Po wstepnej immunizacji antygenem w komrilet- 60 nym adjuwancie Freundsa w konczyne, przepro¬ wadza sie dwie innokulacje dootrzewnowe antyge¬ nem bez adjuwantu. Laczy sie osocza pobrane z i immunizowanych zwierzat i jezeli to jest koniecz¬ ne, usuwa sie pozostale przeciwcialo do bialek oso- 65 cza ludzkiego, kontaktujac przeciwosocze z normal-98 604 9 nym osoczem ludzkim. Gamma globuline oczyszcza sie nastepnie przez wytracenie 14°/o wodnym roz¬ tworem siarczanu sodu, dializuje sie wobec wod¬ nego roztworu solanki, buforowanego fosforanu i korzystnie ogrzewa sie w ciagu 30 minut w tem¬ peraturze 56^C, w celu zniszczenia komplementu.Oczyszczone osocze miesza sie z osoczem ludz¬ kim zawierajacym powierzchniowy antygen hepa- titis B, inkubuje w ciagu godziny w temperaturze 37°C i w ciagu nocy w temperaturze 4°C. Wytra¬ cony osad antygen-przeciwcialo przemywa sie dwu¬ krotnie w zimnej solance buforowanej fosforanem dla usuniecia wiekszosci niespecyficznych bialek.Osad antygen-przeciwcialo rozpuszcza sie nastep¬ nie w zimnym roztworze 0,2 n kwas octowy/ 2% sacharoza o wartosci pH 2,3 lub w roztworze jonów chaotropowych. Zdysocjowane antygeny i przeciw¬ ciala rozdziela sie przez wirowanie z szybkoscia 25000—28000 obrotów na minute w ciagu 12—«H5 go¬ dzin lub z szybkoscia 30000 obrotów na minute w ciagu 4 godzin,, stosujac 10—40% roztwór sacharozy o gradiencie ciaglym, w roztworze strefowym Beckman TI-15. Rotor rozladowuje sie przez wpom¬ powanie 50% roztworu sacharozy, w celu wyparcia gradientu, a 20 ml frakcje bada sie na absorpcje w nadfiolecie przy 200 n Frakcje pikowe laczy- sie, otrzymujac oczyszczone frakcje specyficznego przeciwciala i oczyszczone frakcje antygenu. Obie frakcje zobojetnia sie 0,1 n roztworem NaOH. Frakcje przeciwciala zateza sie do poczatkowej objetosci osocza i dializuje w ciagu nocy wobec, solanki buforowanej glicyna: Oczysz¬ czone przeciwcialo nastepnie mianuje sie i standa¬ ryzuje.Przeciwcialo optymalnie rozciencza sie przez spo¬ rzadzenie malych porcji odczynnika diagnostyczne¬ go z róznymi rozcienczeniami i badajac je wobec zestawu osoczy ludzkich, zawierajacych powierz¬ chniowy antygen hepatitis B. Do sporzadzania Od¬ czynnika diagnostycznego wybiera sie rozciencze¬ nie dajace najlepsze wyniki wobec zestawu, po na¬ niesieniu na czastki zywicy.Sporzadzanie odczynnika diagnostycznego.Przyklad I. 30% wodna zawiesine (waga w objetosci) kulek polistyrenu o srednicy 0,23 fi pro¬ dukcji Dow Chemicals rozciencza sie 8% roztwo¬ rem (waga w objetosci) solanki buforowanej gli¬ cyna i w ciagu nocy dializuje wobec solanki bufo¬ rowanej glicyna. Natychmiast dodaje sie ja do 9 objetosci oczyszczonego antyosocza swinki morskiej, zawierajacego przeciwcialo do powierzchniowego an¬ tygenu hepatitis B (w rozcienczeniu 0,05% wago¬ wych w objetosci) i miesza ze stala szybkoscia w ciagu 30 minut. Nastepnie dodaje sie kolejno albu¬ miny osocza wolowego (1% wagowy w objetosci) i azydku sodu do stezenia 0,1% wagowych w obje¬ tosci produktu koncowego.Przyklad II. 30% (waga w objetosci) zawie¬ sine kulek polistyrenu (0,05—2,0 /u) rozciencza sie do 8% roztworem solanki buforowanej glicyna i sterylizuje dodatkiem roztworu podchlorynu. Na¬ stepnie w celu usuniecia podchlorynu dializuje sie ja wobec solanki buforowanej glicyna, po czym dodaje do 9 objetosci odpowiednio rozcienczonego, oczyszczonego przeciwciala powierzchniowego anty- io genu hepatitis B ze swinki morskiej. Zawiesine po- listerynu dodaje sie powoli, mieszajac w ciagu go¬ dziny. Kuleczki polistyrenu odwirowuje sie i po¬ nownie zawiesza w buforowanej solance w poczat-' kowej objetosci. Mieszajac w ciagu 30 minut do¬ daje sie albuminy osocza wolego. Dodaje sie 1/10 objetosci normalnego osocza z nie immunizowanych swinek morskich (rozcienczonego 1:3,5 solanka bu¬ forowana glicyna) i mieszanine ponownie miesza io w ciagu 30 minut. W koncu mieszanine energicz¬ nie wstrzasa sie dla rozbicia ewentualnych aglome¬ racji czastek. Wszystkie stosowane roztwory stery¬ lizuje sie przez saczenie i konserwuje dodatkiem azydku sodu w ilosci 0,1% wagowych w objetosci.Przyklad III. Sporzadza sie dodatnie osocze kontrolne ze zlanych osoczy ludzkich, zawieraja¬ cych powierzchniowy antygen hepatitis B. Osocze poddaje sie obróbce cieplnej w temperaturze 60°C w ciagu okolo 10 godzin, w celu zniszczenia za- kaznosci wirusa, a nastepnie dwukrotnie rozcien¬ cza sie seryjnie normalnym osoczem ludzkim. Sto¬ sowanym rozcienczeniem jest rozcienczenie da¬ jace wyrazna reakcje 1+ z odczynnikiem latekso¬ wym z przykladu I lub przykladu II. Nastepnie sterylnie filtruje sie ^je i Wlewa do sterylnych po¬ jemników.Przyklad IV. Sporzadza sie ujemne osocze kontrolne z nierozcienczonego osocza ludzkiego, u- jemnego na powierzchniowy antygen hepatitis B w próbie z odczynnikiem lateksowym z przykladu I lub przykladu II i w próbie radioimmunologicz- nej. Sterylnie saczy sie je i rozlewa do sterylnych pojemników.Przyklad V. Plazme ludzka, zawierajaca przeciwciala, do powierzchniowego antygenu hepa¬ titis B mianuje sie przez dyfuzje zelowa i prze¬ prowadza w osocze, dodatkiem chlorku wapniowe¬ go i trombiny wolowej. Z osocza wydziela sie na¬ stepnie gamma globuline przez wytracenie 16% 40 roztworem (waga w objetosci) siarczanu sodu. Po przemyciu osadu 14% roztworem tosci) siarczanu sodu dializuje sie je w ciagu no¬ cy wobec buforu fosforanowego o niskiej molar- nosci i przepuszcza przez celuloze DEAE uprzednio 45 zrównowazona tym samym buforem. Oczyszczona gamma globuline nastepnie standaryzuje sie przez zageszczenie i dializuje wobec solanki buforowanej glicyna, po czym sterylnie saczy i rozlewa do ste¬ rylnych pojemników. 50 Przyklad VI. Standardowy roztwór gamma globuliny ludzkiej, oczyszczonej w solance buforo¬ wanej glicyna dodaje sie do zawiesiny lateksu po¬ listyrenowego o srednicy 0,2 fi i ogrzewa sie w temperaturze 57^ w ciagu 15 minut. Zawiesine 55 stosowana do absorbowania czynnika reumatoidal¬ nego w testowanych osoczach rozciencza sie solan¬ ka buforowana glicyna i rozlewa do sterylnych pojemników.Przyklad VII. Sporzadza sie rozcienczalnik 60 testu potwierdzajacego, przez rozcienczenie 30% roztworu (waga w objetosci) albuminy osocza wo¬ lowego solanka buforowana fosforanem do stezenia bialka 6% wagowych w objetosci. Roztwór steryl¬ nie przesacza sie i rozlewa do sterylnych pojem- 65 ników.11 PL PL PL PL PL PL PL