DK144395B - Fremgangsmaade og proevningssaet til proevning for tilstedevaerelsen af hepatitis b overfladeantigen i menneskeblod - Google Patents
Fremgangsmaade og proevningssaet til proevning for tilstedevaerelsen af hepatitis b overfladeantigen i menneskeblod Download PDFInfo
- Publication number
- DK144395B DK144395B DK60876AA DK60876A DK144395B DK 144395 B DK144395 B DK 144395B DK 60876A A DK60876A A DK 60876AA DK 60876 A DK60876 A DK 60876A DK 144395 B DK144395 B DK 144395B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hepatitis
- antibody
- serum
- surface antigen
- human
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
- Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
(19) DANMARK
lp (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 144395B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 608/76 (51) Int.CI.3 G 01 N 33/54 (22) Indleveringsdag O· feb. 1976 (24) Løbedag 13* feb. 1976 (41) Aim. tilgængelig 20. aug. 1976 (44) Fremlagt 1 · fna*1· 19^2 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 19· feb. 1975, 5509^9, US
(71) Ansøger WARNER-LAMBERT COMPANY, Morris Plains, US.
(72) Opfinder George Edward Lowke, US: Bela Zoltan Horvath, US.
(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.
(54) Fremgangsmåde og prøvnings sæt til prøvning for tilstedevæ= reisen af hepatitis B overfla= deahtigen i menneskeblod.
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til prøvning for tilstedeværelsen af hepatitis B overfladeantigen i menneskeblod som angivet i krav 1's indledning og et prøvningssæt af den i krav 2's indledning angivne art til brug ved fremgangsmåden.
Hepatitis B overfladeantigen (Australia antigen) opdaget af tø Blumberg og medarbejdere, Bull. N.Y. Acad. Med., 40, 377 (1964) n og den efterfølgende korrelering med lang inkubationstidshepa- ^ titis har stimuleret megen aktivitet med henblik på undersøgelse it af bloddonor-populationer af hensyn til den offentlige sundhed, it [— * 3 2 144395
Anvendelsen af antistof-sensibiliserede latex-partikler, rapporteret i US patentskrifterne nr. 3 085 875 og 3 551 555, er blevet specielt tilpasset til bestemmelsen af hepatitis B overfladeantigen i blodserum som beskrevet i The Journal of Immunology, nr. 1, side 101-111, 19. januar 1972.
En følsom, men tidkrævende radioimmun-prøvning er beskrevet af ling, O.M. og Overby, I.R., The Journal of Immunology 109, nr. 4, side 834-841 (1971) (1972).
Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2 237 204 kendes en fremgangsmåde og et diagnostisk reagens til påvisning af hepatitis B overfladeantigen (Australia-antigen) eller dets antistof, hvorved blodprøver sammenblandes med en vandig suspension af fine formsto fpartikler, fortrinsvis småkugler med en diameter på 0,3-2,0 yum, som er overtrukket med det over for Australia-antigenet specifikke antistof eller med Australia-antigenet selv. Antistofferne udvindes bl.a. fra marsvineserum, som er blevet immuniseret med renset Australia-antigen fra menneskeblod.
Denne prøvning, der også er kendt som latex-prøvningen, er ganske vist relativt enkel, hurtig og billig at gennemføre, men har dog den mangel, at der finder et betydeligt antal uspecifikke latex-reaktioner sted, hvorved der som årsag til falsk-positive resultater kommer rheumafaktorer, fibrinspaltningsprodukter og fra IgM-området i betragtning. Den utilstrækkelige specifitet af latex-agglutinationen ved undersøgelse af syge personer udgør . et vist problem.
Fra US patentskrift nr. 3 088 875 er det alment kendt at anvende polystyrenlatexkugler med en diameter på 0,15-0,25^um til immunologisk diagnostik. 1 "Deutsche Medizinische Wochenschrift", 98. årgang, 1973, side 2070-2074 sammenlignes den ovenfor beskrevne latex-prøvning til påvisning af det hepatitis-forbundne antigen og påvisningen ved hjælp af modstrøms-elektrophorese, og de ovennævnte mangler ved latex-prøvningen i forhold til modstrømselektrophoresen påvises. Modstrøms-elektrophoresen har imidlertid den ulempe i forhold til latex-prøvningen, at den er mere kompliceret, langsommere og dyrere.
3 144395
Opfindelsens formål er således at angive en fremgangsmåde til påvisning af hepatitis B overfladeantigen i menneskeblod, som har fordelene ved den hidtil kendte latex-prøvning, nemlig at være enkel og hurtig at gennemføre, følsom og relativt billig, uden samtidig at have ulemperne ved de uspecifikke reaktioner eller falsk-positive resultater.
Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
Det diagnostiske middel, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er udformet til at være højfølsomt og specifikt for konstateringen af hepatitis B overfladeantigen i menneskeblod ved (a) anvendelse af formstofpartikler overtrukket med renset antistof fremstillet ud fra dyr immuniseret med renset hepatitis B overfladeantigen, (b) minimering af "falske positive" ved tilsætning af normalt serum fra den samme dyreart som den, hvorfra serumet indeholdende antistoffet blev opnået, og (c) bekræftelse af alle positive sera ved anvendelse af human-hepatitis-for-bundet antistof til antigen-neutralisering, normal human serumkontrol og et absorptionsreagens for rheumatoid-faktor.
Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav 2's kendetegnende del anførte. Fortrinsvis har polystyrenpartiklerne en diameter på omkring 0,23^um, men partikler med ensartet dimensioner på fra omkring 0,05 til omkring 2,0^um, kan være egnede.
Det for hepatitis B overfladeantigen specifikke antistof fås fra serum opnået fra marsvin, som indeholder antistoffet eller er blevet immuniseret med stærkt renset hepatitis B overfladeantigen opnået fra menneskeblod.
0,1 io natriumazid kan tilsættes som konserveringsmiddel til brug ved fremstilling af det diagnostiske reagens. Antistoffet fortyndes optimalt ved fremstilling af små charger af det diagnostiske reagens med forskellige fortyndinger af antistoffet og prøvning af disse over for en række af menneskesera, som vides at indeholde hepatitia B overfladeantigen. Den fortynding, som giver den bedste optræden over for rækken af sera, når den overtrækkes på formstofpartikler, udvælges til fremstilling af det diagnostiske reagens.
4 1U396
Det passende fortyndede antistof blandes med polystyren-latex-kugler på 0,2 um i diameter. Efter blanding i 1 - 2 timer vaskes kuglerne tre gange med glycinpufret saltvand og gensuspenderes i glycinpufret saltvand.
Den vandige suspension indeholder fortrinsvis omkring 0,5 $ vægt/vol. af formstofpartiklerne, men kan indeholde fra 0,1 til 3$ vægt/vol. af formstofpartiklerne. Til fremstillingen af det diagnostiske reagens indeholder suspensionen fortrinsvis omkring 0,05$ vægt/vol. antistof absorberet på formstofpartiklerne, men dette kan varieres i overensstemmelse med koncentrationen af partiklerne. Mængden af antistof skal være netop tilstrækkelig til at forhindre selvaggregering af formstofpartiklerne. For kugleformede polystyrenpartikler på 0,23 um i diameter er dette omkring 1/10 af partiklernes vægt.
Suspensionen indeholder fortrinsvis en stabilisator tilsat efter absorptionen af antistoffet på partiklerne, f.eks. et inert protein, såsom serumalbumin, i en koncentration på for eksempel 0,1 $ vægt/vol.
Det diagnostiske reagens indeholder også normalserum (dvs. serum, som hverken indeholder det for hepatitis B overfladeantigen specifikke antistof eller antigenet selv), opnået ud fra den samme dyreart som den, hvorfra serumet indeholdende antistoffet blev opnået. Tilstedeværelsen af sådant normalserum reducerer i væsentligt grad mængden af "falske positive", når det diagnostiske reagens anvendes til at konstatere hepatitis B overfladeantigen i blodprøver. Fortrinsvis inkluderes omkring 1 volumendel normalserum pr. 20-50 volumendele af den vandige suspension af formstof-partikler overtrukket med antistof. Hvis der ikke inkluderes normalserum fra den samme dyreart som den, hvorfra serumet indeholdende antistoffet blev opnået, i det diagnostiske reagens, vil omkring 10$ af humane sera, som ikke indeholder hepatitis B overfladeantigen, agglutinere formstofpartiklerne. Dette skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af stoffer i sådanne humane sera, som reagerer med andre materialer stammende fra det dyre-antiserum, hvorfra antistoffet for hepatitis B overfladeantigen blev opnået. Hvis imidlertid det normale dyreserum inkluderes, vil kun mellem 1 og 3 $ af humane sera agglutinere formstofpartik-leme i fravær af hepatitis B overfladeantigen i disse sera.
Dette kan skyldes komponenter i det normale dyreserum, som er i 5 144395 stand til at reagere med de stoffer i de humane sera og således forhindre dem i at frembringe agglutinering af formstofpartikler-ne.
Der tilvejebringes en normal human serumkontrol, som fremstilles ud fra ufortyndet normalt humanserum, som er påvist at være negativt for hepatitis B overfladeantigen ved hjælp af latexrea-genset og ved radioimmunoprøvning.
Et positivt kontrolserum fremstilles ud fra en mængde humant serum, som vides at være positivt for hepatitis B overfladeantigen. Serumet varmebehandles ved 60°C i mindst 10 timer for at ødelægge virusets infektionsevne og dobbeltfortyndes derpå successivt i normalt humant serum. Den fortynding, som anvendes til produktet, er den, som giver en definitiv 1+ reaktion med latexreagenset.
Det diagnostiske reagenssystem består af de følgende komponenter: A. Undersøgelses-prøvningssystem 1. Hepatitis-forbundet antistof absorberet på latexkugler.
2. Positivt kontrolserum.
5. Negativt kontrolserum.
B. Bekræftende prøvningssystem 1. Hepatitis-forbundet antistof (humant).
2. Normal human serumkontrol (negativ for hepatitis B over fladeantigen) .
3. Absorptionsreagens for rheumatoid faktor.
4. Bekræftende prøvningsfortyndingsmiddel.
Det hepatitis-forbundne antistof (humant) fremstilles ud fra humant plasma, som indeholder antistoffer for hepatitis B overfladeantigen. Plasmaet modtages fra forskellige plasmaphorese-centre, titreres ved geldiffusion og omdannes til serum ved tilsætning af calciumchlorid og oksethrombin. Derpå fremstilles gamma-globulin ud fra serumet ved udfældning med 16$ natriumsulfat. Efter vaskning af bundfaldet i 14$ natriumsulfat, dialyseres det natten over imod en phosphatpuffer med lav molaritet 6 144395 og sendes igennem "DEAE"-cellulose, som i forvejen er ækvilibreret med den samme puffer. Det rensede gamma-globulin standardiseres derpå ved koncentrering og dialyseres imod phosphatpufret saltvand.
Absorptionsreagenset for rheumatoid-faktor består af latexkug-ler overtrukket med normalt humant gamma-globulin. Det fremstilles ved dannelse af en standardopløsning af renset gamma-globulin i glycinpufret saltvand, tilsætning af en suspension af polystyrenkugler på 0,2 pm og opvarmning til 5T°C i 15 minutter. Suspensionen fortyndes derpå i glycinpufret saltvand.
Det bekræftende prøvningsfortyndingsmiddel fremstilles ved fortynding af en opløsning af 30 f okse serumalbumin med phosphatpufret saltvand til 5$ proteinkoncentration.
Prøvningsmetoder A. Fremstilling af blodprøve
Serum er den foretrukne form for blodprøven. Hvis prøven er af helt blod, må den først behandles til lysering af cellerne og forhindring af koagulering. Til dette formål kan den behandles med et vandigt fortyndingsmiddel indeholdende et ikke-ionisk overfladeaktivt middel af polyoxyethyleret-alkylphenol-typen, f.eks. isooctylphenoxy-polyoxyethyl-ethanol("Tritoil%-100") og natriumcitrat.
Hvis prøven er af blodplasma, må den indeholde en antikoagulant, f.eks. enhver af standard-antikoagulanteme, såsom natriumcitrat.
Den behandles med fordel også med det samme vandige fortyndingsmiddel indeholdende et ikke-ionisk overfladeaktivt middel som for helt blod for at lysere eventuelle resterende celler deri.
B. Reagenser 1. Datexreagens (a) Specificitet 1. Bestemt ved prøvning af reagenset med en række af positive 7 144395 og negative sera leveret af the Bureau of Biologies såvel som en række af 100 negative sera opsamlet fra normale frivillige.
(h) Reaktivitet 1. Reagenset gensuspenderes ved kraftig omrøring.
2. I en af fordybningerne på plastprøvepladerne hældes tre dråber positivt kontrolserum. I det andet nabohul hældes tre dråber negativt kontrolserum.
3. Til hver prøve hældes en dråbe reagens.
4. Rer blandes fuldstændigt under anvendelse af en separat blander for hvert hul.
5. Pladen roteres på en mekanisk rotator i 10 minutter ved 150 omdr./min.
6. Blandingerne undersøges over en indirekte belyst lys-kasse.
7. En klart positiv svag (1+) reaktion skal iagttages med den positive kontrolserumprøve. Ingen reaktion skal iagttages med den negative kontrolserumprøve.
2. Positivt kontrolserum (a) Reaktivitet 1. Ret positive kontrolserum prøves med latexreagenset for at sikre en reaktivitet på 1+.
3. Negativt kontrolserum (a) Reaktivitet 1. Ret negative kontrolserum prøves med latexreagenset for at sikre en negativ reaktion.
8 U4398 4. Normal human serumkontrol (a) Specifitet 1. Der udføres en bekræftende prøvning for at sikre, at den ikke reagerer med latexreagenset, og at den ikke inhi-berer sera, som er positive for hepatitis B overfladeantigen.
5. Hepatitis-forbundet antistof (humant) (a) Reaktivitet 1. En gel-diffusionstitrering udføres ved anvendelse af et standardheptatis B overfladeantigen.
(b) Specificitet 1. Der udføres en brugsprøvning for at bestemme, om serumet specifikt vil inhibere prøver, som er positive for hepatitis B overfladeantigen, når det anvendes ved den bekræftende prøvning.
6. Absorptionsreagens (a) Reaktivitet 1. Reagenset prøves med sera indeholdende rheumatoid-faktor for at sikre, at det vil reagere med faktoren og delvis absorbere den fra sera indeholdende denne.
7. Bekræftende prøvnings-fortyndlngsmiddel (a) Specifitet 1. Den bekræftende prøvning udføres under anvendelse af fortyndingsmidlet for at sikre, at det ikke reagerer med latexreagenset, og at det ikke inhiberer sera, som er positive for hepatitis B overfladeantigen.
9 144395 C. Prøvning af serumprøver (unders øgels esprøvning) 1. Der hældes 120^ul serum i en af fordybningerne på plastpladen.
2. Tilsættes en dråbe latexreagens.
3. Blandes fuldstændigt under anvendelse af en separat blander for hver prøve.
4. Pladen roteres på en mekanisk rotator i 10 minutter ved 150 omdr./min.
5. Blandingerne undersøges over en indirekte belyst lyskasse.
6. Reaktionerne bedømmes efter en skala fra 1+ til 4+ svarende til stigende agglutineringsintensitet.
D. Bekræftende neutraliseringsprocedure 1. Prøver (a) Alle prøver identificeres som positive ved undersøgelse sprøvningen.
(b) Positivt kontrolserum inkluderet som en svagt positiv prøve.
2. Procedure (a) Et engangs 10 x 75 mm reagensglas mærkes med prøvens identifikationsnummer og "A". Et andet reagensglas mærkes med prøvens identifikationsnummer og "B".
(b) Der tilsættes to dråber (tilnærmelsesvis 80 μΐ) hepatitis-forbundet antistof (humant) til reagensglasset mærket "A".
(c) Der tilsættes to dråber af det normale humane negative kontrolserum til reagensglasset mærket "B".
10 144396 (&) Der tilsættes 240 μΐ af prøven til hvert af reagensglassene mærket "A" og "B".
(e) Glassenes indhold Blandes og inkuberes i 30 minutter ved 37°C i et vandbad.
(f) 120 μΐ fra reagensglas "A" og "B" prøves under anvendelse af undersøgelsesreagenserne og -procedurerne, kor de fleste positive prøver med relativt lav titer kan adskillelsen mellem specifikke og ikke-specifikke positive foretages uden yderligere prøvning, da prøven "A" vil være ikke-reaktiv, medens prøven "Bn forbliver positiv, hvilket tyder på specifik inhibering fra det humane antistof, kor de prøver, som er specifikke, men har højere titer, såvel som de, som er ikke-specifikke, kræves yderligere prøvning som forklaret nedenfor.
(g) kor hvert reagensglas, som kræver yderligere prøvning, mærkes yderligere seks reagensglas med fortyndinger fra 1:4 til 1:128, og prøveidentifikationen såvel som "A" eller "B" (h) Der sættes 200 jzl af det bekræftende prøvningsfortyndingsmiddel til hvert reagensglas, inklusive de glas, som indeholder patientens prøve og humant antiserum eller normalt humant serum, dvs. de originale "A" og "B" glas, idet de fortyndes tilnærmelsesvis 1:2.
(i) Der fremstilles dobbeltfortyndinger ved overføring af 200 μΐ under anvendelse af separate mikropipettespidser for hvert glas og grundig blanding før udtagning af prøverne.
(j) 120 μΐ fra hvert reagensglas prøves under anvendelse af undersøgelsesreagenseme og -procedurerne.
(k) Den titer, som opnås i række "B” (prøve og normalt humant serum),må være fire gange (to reagensglas) højere end i række "A" (prøve og neutraliserende hepatitis-for- i 11 144395 bundet antistof (humant)) for at man kan bekræfte prøven som specifikt positiv for hepatitis B overfladeantigen. I tilfælde, hvor både "A" og "B" titeren er højere end 1:128, må fortyndingen føres videre, indtil et endepunkt er bestemt.
Da et antal prøver indeholdende rheumatoid-faktor vil reagere med latexreagenset, er det nødvendigt at udskille de prøver, som indeholder både hepatitis B overfladeantigen og rheumatoid-faktor.
Tilstedeværelsen af rheumatoid-faktor kan bestemmes ved prøvning af serumet med det rheumatoid-faktor-absorberende reagens (latex overtrukket med humant gamma-globulin) ved blanding af 120 μΐ af prøven og en dråbe af det absorberende reagens på en plastplade og rotation i 5 minutter.
Hvis prøven indeholder rheumatoid-faktor, kan den fjernes ved tilsætning af 720 pi af prøven til et 10 x 75 mm reagensglas og tilsætning af 6 dråber af det absorberende reagens til glasset. Der blandes godt og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter centrifugeres ved 3000 omdr./min. i 5 minutter. Derefter udføres den bekræftende neutraliseringsprocedure på den absorberede prøve som forklaret ovenfor.
Fremstilling af renget^antistof for hepatitis B overfladeantigen
Marsvin immuniseres med hepatitis B overfladeantigen renset ved den metode, som er beskrevet i US patentskrift nr. 3 838 144.
En primær immunisering med antigen i "Freud's complete adjuvant" i marsvins trædepuder efterfølges af to intraperitoneale indpodninger af antigen uden hjælpestof. Efter sammenhældning af sera opsamlet fra immuniserede dyr, fjernes om nødvendigt resterende antistof for humane serumproteiner ved at bringe antiserumet i kontakt med normalt humant serum. Gamma-globulinet renses derpå ved udfældning med 14 i» vægt/vol. vandig natriumsulfatopløsning, dialyseres imod phosphatpufret saltvand og opvarmes fortrinsvis til 56°C i omkring 30 minutter for at ødelægge komplement.
12 144395
Det rensede serum blandes med humant serum indeholdende hepatitis B overfladeantigen, og inkuberes ved 37°C i 1 time og derpå natten over ved 4°C. Det således dannede antigen-antistof-bundfaid vaskes derpå to gange i koldt phosphatpufret saltvand for at fjerne de fleste resterende ikke-specifikke proteiner. Intigen-antistof-bundfaldet opløses derpå i kold 0,2M eddikesyre indeholdende 2$ saccharose, pH 2,3 eller chaeotrope ioner. Det dissocierede antigen og antistof adskilles ved centrifugering ved 25.000 - 28.000 omdr./min. i 12-15 minutter eller ved 30.000 omdr./min. i 4 timer på en kontinuert 10-40$ saccharose-gradient i "Beckman^I-15 zonal "-rotoren. Rotoren udelades ved indpump-ning af 50$ saccharose til forskydning af gradienten, og 20 ml fraktioner prøves for ultraviolet absorbans i en 1 cm celle ved 280 nm, og spidsfraktioner fældes sammen til opnåelse af en renset specifik antistof-fraktion, som derpå neutraliseres med 0,1N natriumhydroxidopløsning. .Antistoffraktionen koncentreres til det oprindelige serumvolumen og dialyseres natten over imod glycinpufret saltvand. Det rensede antistof titreres derpå og standardiseres.
Antistoffet fortyndes optimalt ved fremstilling af små charger af det diagnostiske reagens med forskellige fortyndinger af antistoffet og prøvning af disse over for en række af humane sera, kendt for at indeholde hepatitis B overfladeantigen. Den fortynding, som giver den bedste optræden over for de humane sera, når den overtrækkes på formstofpartikler, udvælges til fremstilling af det diagnostiske reagens.
Fremstilling_af_diagnostiske_reagenser . EKSEMPEL 1
En 30 % vægt/vol. vandig suspension af 0,23^um polystyrenkugler fortyndes til 8 % vægt/vol. med glycinpufret saltvand og dialyseres over for glycinpufret saltvand natten over. Den sættes derpå på en gang til 9 volumener renset marsvin-antiserum indeholdende antistoffet for hepatitis B overfladeantigen (fortyndet til 0,05 % vægt/vol.) og omrøres konstant i 30 minutter.
Derpå tilsættes 1 volumen okseserumalbumin (1% vægt/vol.), og til sidst natriumazid til en koncentration på 0,1 % vægt/vol. i slutproduktet.
13 144395 EKSEMPEL 2
En 30 $> vægt/vol. suspension af polystyrenkugler (0,05 - 2,0 pm) fortyndes til 8 $ med glycinpufret saltvand og steriliseres ved tilsætning af hypochloritopløsning. Den dialyseres derpå over for glycinpufret saltvand for at fjerne hypochlorittet.
Derpå sættes den til 9 volumener passende fortyndet renset mar-svinserumantistof for hepatitis B overfladeantigen. Polystyrensuspensionen tilsættes langsomt under omrøring, som fortsættes i 1 time. Polystyrenkugleme centrifugeres, vaskes to gange på centrifugen med pufret saltvand og gensuspenderes til det oprindelige volumen i pufret saltvand. Okseserumalbumin tilsættes under omrøring i 30 minutter. Der tilsættes 1/10 volumen fortyndet normalt serum fra ikke-immuniserede marsvin (fortyndet 1:3,5 med glycinpufret saltvand), og blandingen omrøres igen i 30 minutter. Endelig omrystes blandingen kraftigt for at sprede eventuelle agglomerationer af partikler. Alle anvendte opløsninger steriliseres ved filtrering og indeholder 0,1 $ vægt/vol. natriumazid som konserveringsmiddel.
EKSEMPEL 3
Et positivt kontrolserum fremstilles ud fra en mængde humant serum, kendt som positivt for hepatitis B overfladeantigen. Serumet varmebehandles ved 60°C i omkring 10 timer for at ødelægge virusets infektionsevne, og dobbeltfortyndes derpå successivt i normalt menneskeserum. Den anvendte fortynding er den, som giver en afgjort 1+ reaktion med latexreagenset fra eksempel 1 eller eksempel 2. Den sterilfiltreres derpå og fyldes i sterile beholdere.
EKSEMPEL 4
Et negativt kontrolserum fremstilles ud fra ufortyndet menneskeserum, som er vist at være negativt for hepatitis B overfladeantigen ved hjælp af latexreagenset fra eksempel 1 eller eksempel 2 og ved radioimmunoprøvning. Det sterilfiltreres og fyldes i sterile beholdere.
14 144395 EKSEMPEL 5
Humant plasma, som indeholder antistoffer for hepatitis B overfladeantigen, titreres ved geldiffusion og omdannes til serum ved tilsætning af calciumchlorid og oksethrombin. Derpå fremstilles gamma-globulin ud fra serumet ved udfældning med 16 fo vægt/vol. natriumsulfatopløsning. Efter vaskning af bundfaldet i 14 i» vægt/vol. natriumsulfatopløsning dialyseres det natten over imod en phosphatpuffer med lav molaritet og sendes igennem "DEAE"„cellulose, som i forvejen var ækvilibreret med den samme puffer. Det rensede gamma-globulin standardiseres derpå ved koncentrering og dialyseres over for phosphatpufret saltvand.
Det sterilfiltreres og fyldes i sterile beholdere.
EKSEMPEL 6
En standardopløsning af renset humant gamma-globulin i glycin-pufret saltvand sættes til en suspension af 0,2 pi polystyrenla tex og opvarmes til 57°C i 15 minutter. Suspensionen, som anvendes til at fjerne rheumatoid-faktor i prøvesera ved absorption af denne, fortyndes i glycinpufret saltvand og fyldes i sterile beholdere.
EKSEMPEL 7
Et bekræftende prøvnings-fortyndingsmiddel fremstilles ved fortynding af en 50 $ vægt/vol. opløsning af okseserumalbumin med phosphatpufret saltvand til en 5 $ vægt/vol. proteinkoncentration. Opløsningen sterilfiltreres og fyldes i sterile beholdere.
*
Claims (2)
15 144395 P_a_t_e_n_t_k_r_a_V2
1. Fremgangsmåde til prøvning for tilstedeværelsen af hepatitis B overfladeantigen i menneskeblod, hvorved prøver af det nævnte blod, frie for røde blodlegemer, blandes med et diagnostisk middel bestående af en vandig suspension af i det væsentlige ensartede kugleformede polystyrenpartikler med en diameter på 0,05-2,0^um, overtrukket med renset antistof specifikt for det nævnte hepatitis B overfladeantigen, hvilket antistof er udvundet fra serumet af marsvin, der er blevet immuniseret med renset hepatitis B overfladeantigen fra menneskeblod, og er frit for resterende antistoffer over for menneskeserumproteiner, hvorhos den vandige suspension også opløst i det vandige medium indeholder normalt marsvineserum, som ikke indeholder antistof specifikt for hepatitis B overfladeantigen, og hvilke polystyrenpartikler er overtrukket med en mængde af det nævnte antistof, som netop er tilstrækkelig til at forhindre selvaggregering af formstofpar-tiklerne, og blandingen af blodprøve og suspension undersøges for agglutinering, kendetegnet ved, (a) at antistoffet før overtrækningen af polystyrenpartiklerne er renset ved at bringe en opløsning af antigen-antistof-kom-pleks, opnået ved blanding af marsvineserum indeholdende antistof med menneskeserum indeholdende antigenholdige antistoffer mod hepatitis B overfladeantigen, i kontakt med højtæthedsenden af et væskemedium, hvori der er en tæthedsgradient, underkaste væskemediet ultracentrifugering, indtil der er nået ligevægtsfordeling af serumkomponenterne igennem tæthedsgradienten, og derpå udskille fraktionen indeholdende det for hepatitis B overfladeantigen specifikke antistof, (b) at alle blodprøver, hvori der iagttages agglutinering, neutraliseres ved blanding med menneskehepatitis-forbundet antistof, (c) at rheumatoid-faktor i prøverne fra trin (b) indeholdende denne faktor fjernes ved blanding af prøverne med latex-kugler overtrukket med menneske-^f-globulin og fraskillelse af kuglerne med absorberet rheumatoid-faktor, og (d) at de nævnte prøver, hvori der er iagttaget agglutinering, igen blandes med nævnte diagnostiske middel.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/550,949 US3992517A (en) | 1975-02-19 | 1975-02-19 | Detection of hepatitis B surface antigen by latex agglutination |
| US55094975 | 1975-02-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK60876A DK60876A (da) | 1976-08-20 |
| DK144395B true DK144395B (da) | 1982-03-01 |
| DK144395C DK144395C (da) | 1982-08-02 |
Family
ID=24199232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK60876A DK144395C (da) | 1975-02-19 | 1976-02-13 | Fremgangsmaade og proevningssaet til proevning for tilstedevaerelsen af hepatitis b overfladeantigen i menneskeblod |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3992517A (da) |
| JP (1) | JPS51106723A (da) |
| AR (1) | AR210753A1 (da) |
| AT (1) | AT352290B (da) |
| BE (1) | BE838474A (da) |
| BR (1) | BR7600906A (da) |
| CH (1) | CH613048A5 (da) |
| CS (1) | CS188129B2 (da) |
| DD (1) | DD124128A5 (da) |
| DE (1) | DE2604844C3 (da) |
| DK (1) | DK144395C (da) |
| EG (1) | EG12696A (da) |
| ES (2) | ES445042A1 (da) |
| FI (1) | FI63493C (da) |
| FR (1) | FR2301825A1 (da) |
| GB (1) | GB1529891A (da) |
| IE (1) | IE42031B1 (da) |
| IL (1) | IL48927A (da) |
| IT (1) | IT1066096B (da) |
| LU (1) | LU74348A1 (da) |
| MX (1) | MX4962E (da) |
| NL (1) | NL7601441A (da) |
| NZ (1) | NZ179988A (da) |
| PL (1) | PL98604B1 (da) |
| RO (1) | RO71615A (da) |
| SE (1) | SE429481B (da) |
| SU (1) | SU1091844A3 (da) |
| ZA (1) | ZA76721B (da) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1508132A (en) * | 1974-05-20 | 1978-04-19 | Technicon Instr | Analysis of biological fluids |
| IL49752A (en) * | 1975-07-09 | 1979-07-25 | Kabi Ab | Compositions having affinity for hepatitis virus and method for hepatitis virus removal or concentration |
| US4202665A (en) * | 1978-11-06 | 1980-05-13 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University A Division Of Yeshiva University | Detection of hepatitis B surface antigen |
| US4204989A (en) * | 1978-12-13 | 1980-05-27 | Merck & Co., Inc. | Isolation of hepatitis B e antigen |
| US4310508A (en) * | 1979-06-19 | 1982-01-12 | Siber George | Diagnostic test and reagent therefor |
| US4340564A (en) * | 1980-07-21 | 1982-07-20 | Daryl Laboratories, Inc. | Immunoadsorptive surface coating for solid-phase immunosubstrate and solid-phase immunosubstrate |
| CA1172561A (en) * | 1981-01-28 | 1984-08-14 | Richard H. Decker | Igm detection method |
| US4351824A (en) * | 1981-02-05 | 1982-09-28 | Icl Scientific | Polystyrene latex reagents, methods of preparation, and use in immunological procedures |
| US4493899A (en) * | 1981-10-16 | 1985-01-15 | City Of Hope | Method of testing for particular antibodies in the serum of a patient |
| FR2531718B1 (fr) * | 1982-08-16 | 1986-11-21 | Sanofi Sa | Reactif permettant un dosage de tres haute sensibilite de l'antigene caracteristique du virus de l'hepatite b dans les liquides biologiques humains |
| US4542103A (en) * | 1982-09-13 | 1985-09-17 | Miles Laboratories Inc. | Latex agglutination determination of IgG in neonatals and in colostrum |
| JPS60256057A (ja) * | 1984-06-01 | 1985-12-17 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| US6881536B1 (en) * | 1986-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Particle based electrochemiluminescent assays |
| EP0737863A4 (en) * | 1993-12-28 | 1998-09-30 | Ss Pharmaceutical Co | METHOD FOR DETECTING BLOOD COMPONENTS AND KIT THEREFOR |
| US6159748A (en) * | 1995-03-13 | 2000-12-12 | Affinitech, Ltd | Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry |
| JP3840521B2 (ja) * | 1995-08-21 | 2006-11-01 | Ａｓｐｉｏｎ株式会社 | ウイルス検出方法およびウイルス検査用キット |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE759948A (fr) * | 1969-12-08 | 1971-06-07 | Mc Culler James F | Procede de detection de l'hepatite infectieuse et sereuse et reactifs utilises a cet effet |
| BE787014A (fr) * | 1971-07-31 | 1973-01-31 | Pfizer | Procede et reactif pour deceler la presence de l'antigene australien |
| GB1356413A (en) * | 1971-09-09 | 1974-06-12 | Pfizer Ltd | Method of obtaining purified australia antigen from blood serum |
| JPS49126818A (da) * | 1973-04-13 | 1974-12-04 |
-
1975
- 1975-02-19 US US05/550,949 patent/US3992517A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-11-07 IE IE2435/75A patent/IE42031B1/en unknown
-
1976
- 1976-01-26 SE SE7600797A patent/SE429481B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-01-28 IL IL48927A patent/IL48927A/xx unknown
- 1976-02-02 MX MX763642U patent/MX4962E/es unknown
- 1976-02-07 DE DE2604844A patent/DE2604844C3/de not_active Expired
- 1976-02-09 ZA ZA721A patent/ZA76721B/xx unknown
- 1976-02-10 AT AT91776A patent/AT352290B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-02-10 ES ES445042A patent/ES445042A1/es not_active Expired
- 1976-02-11 FI FI760326A patent/FI63493C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-02-11 RO RO7684761A patent/RO71615A/ro unknown
- 1976-02-12 IT IT48062/76A patent/IT1066096B/it active
- 1976-02-12 NL NL7601441A patent/NL7601441A/xx not_active Application Discontinuation
- 1976-02-12 NZ NZ179988A patent/NZ179988A/xx unknown
- 1976-02-12 BE BE1007197A patent/BE838474A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-02-13 DD DD191240A patent/DD124128A5/xx unknown
- 1976-02-13 FR FR7604009A patent/FR2301825A1/fr active Granted
- 1976-02-13 CH CH178076A patent/CH613048A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-02-13 AR AR262244A patent/AR210753A1/es active
- 1976-02-13 LU LU74348A patent/LU74348A1/xx unknown
- 1976-02-13 BR BR7600906A patent/BR7600906A/pt unknown
- 1976-02-13 DK DK60876A patent/DK144395C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-02-13 SU SU2322065A patent/SU1091844A3/ru active
- 1976-02-14 PL PL1976187226A patent/PL98604B1/pl unknown
- 1976-02-14 JP JP51015405A patent/JPS51106723A/ja active Pending
- 1976-02-16 CS CS76998A patent/CS188129B2/cs unknown
- 1976-02-17 EG EG90/76A patent/EG12696A/xx active
- 1976-02-18 GB GB6477/76A patent/GB1529891A/en not_active Expired
- 1976-08-27 ES ES451061A patent/ES451061A1/es not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK144395B (da) | Fremgangsmaade og proevningssaet til proevning for tilstedevaerelsen af hepatitis b overfladeantigen i menneskeblod | |
| US7943368B2 (en) | Reducing time to result for blood bank diagnostic testing | |
| TWI475229B (zh) | A reagent group for transfusion test and its test method | |
| WO2005121805A2 (fr) | Utilisation de ferrofluides pour le phenotypage sanguin et applications derivees | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| JPH0343094A (ja) | 単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キット | |
| KR100896396B1 (ko) | 점착성 미세소포의 제거 방법 | |
| US4640897A (en) | Immunoanalysis of basophil-containing blood fraction for diagnosing parasitoses and allergies | |
| EP0122620B1 (en) | Reagent and kit for determination of blood coagulation factor xiii | |
| Haberman et al. | ABO isoimmunization: the use of the specific Coombs and heat elution tests in the detection of hemolytic disease | |
| JPS6224745B2 (da) | ||
| USRE28548E (en) | Method and reagents for the diagnosis of viral diseases | |
| NO135801B (da) | ||
| JP3487642B2 (ja) | Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 | |
| US3733398A (en) | Determining and reversing anticomplementary activity in complement fixation test for australia antigen | |
| Walls et al. | Evaluation of a hemagglutination test for amebiasis, using a commercial antigen | |
| JP4694867B2 (ja) | 多孔性膜上に現れる輪を測定する試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キット | |
| JPH08193999A (ja) | 免疫測定法 | |
| DK172178B1 (da) | Fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af en deltager i en partikelforstærket, immunologisk reaktion samt middel til udførelse af fremgangsmåden | |
| JPS5999257A (ja) | 抗体検出用試薬の水性溶媒 | |
| US4092409A (en) | Method for the diagnosis of viral diseases | |
| WO1989001154A1 (en) | DETERMINATION OF IgM ANTIBODIES | |
| RU2021815C1 (ru) | Способ диагностики алеутской болезни норок | |
| JPH1090264A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| JPH1038885A (ja) | 免疫学的診断試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |