DE3322643C2 - Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder HumanhämoglobinvariantenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder aus anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1. aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit Ammoniumsulfat ausfällt und abzentrifugiert, 2. die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium, in diesem bis zur Sulfatfreiheit dialysiert, 3. die dialysierte Antikörper (bzw. Antikörperfragment-)fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und 4. vorzugsweise bei einer Temperatur von 0°C bis 100°C stehen läßt und 5. anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven Mittel der allgemeinen Formel $F1 worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen und a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, und gegebenenfalls Polyvinylpyrrolidon. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines derart hergestellten Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten.
Description
R1 —CON
60
wobei R1 ein Wasserstoffatom, ein niederer Alkylrest
oder eine Aminogruppe bedeutet, die mit einem niederen Alkylrest substituiert sein kann und R2 und R3
jeweils ein Wasserstoffatom oder ein niederer Alkylrest ist, und Di-niederalkylsull'oxide. Als repräsentative Beispiele
für diese Verbindungen werden Harnstoff, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid
u. a. benannt. Dieses Reagenz soll einem diagnostischen Mittel, das sensibilisierte Latexteilchen enthält,
zugesetzt werden oder dem Verdünnungsmittel der Testprobe beigemischt werden. Nachteilig ist hierbei
insbesondere die noch zu geringe Testsensitivität. Ferner wird dessen Anwendung nur für Körperflüssigkeiten,
wie Urin, Serum oder Plasma, beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von einem Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz,
mit dem der Nachweis von Humanhämoglobin bzw. dessen Bestandteile oder Varianten zuverlässig
nicht nur in Körpeiflüssigkeiten sondern auch im Stuhl und m Extrakten, die aus Stoffen oder von Flächen entfernter
Materialien gewonnen wurden, ermöglicht wird.
Neben einer großen Empfindlichkeit beim Nachweis von Humanhämoglobin sollen ferner weitere Vorteile
durch das erfindungsgemäß erhaltene Latexreagenz erreicht werden, wie z. B. eine außerordentlich gute
Spezifitäi und eine einwandfreie Negativkontroiie.
Dabei sollen die genannten Vorteile auch nach einer Lagerung von vielen Monaten erhalten bleiben.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Latexreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern
oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern,
otfer aus deren Fragmenten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit
Ammoniumsulfat ausfällt und abzentrifugiert,
die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium bis zur Sulfatfreiheit dialysiert,
die dialysierte Antikörper{bzw. Antikörperfragment)-fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und
vorzugsweise bei einer Temperatur von 00C bis 1000C stehen läßt und
die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium bis zur Sulfatfreiheit dialysiert,
die dialysierte Antikörper{bzw. Antikörperfragment)-fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und
vorzugsweise bei einer Temperatur von 00C bis 1000C stehen läßt und
anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven Mittel der allgemeinen Formel
O
H2C ^CH-CH2-COOR
H2C ^CH-CH2-COOR
! I
HO(C2H4O)1-HC
CH-(OC2H4J4-OH
worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrjst
mit etwa 8 bis 22 c-Atomen und α, b und r jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei
die Summe von α, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, versetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren geht von Humanhämoglobin-Antikörpern
oder Hunianhämoglobinbestandteil-Antikörpern bzw. F(ab)'-Fragmenten dieser
Antikörper aus. Wenn auch Verfahren zur Herstellung dieser-Ausgangsmaterialien allgemein zum.Stand der
Technik .'gehören, solle die wichtigsten Gesichtspunkte
bei der Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wie sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
angewendet werden können, im folgenden kurz angegeben werden:
Antikörper gegen Humanhämoglobin können beispielsweise durch entsprechende Immunisierung von
Tieren erhalten werden. Dabei sind in der Praxis eine Vielzahl von Tieren geeignet, wie beispielsweise
Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Katzen, Hunde, Kinder, Schafe, Schweine, Pferde, Affen, Ziegen,
Enten, Hühner und auch Fische, z. B. Karpfen etc. Wegen der günstigen Haltungskosten werden dabei insbesondere
Kaninchen, Ziegen und Mäuse bevorzugt.
Geeignete Immunisieiungsverfahren mit den genannten Τϊτεη sind beispielsweise von Adams, EC,
Layman, KM: in »Imniunochemical Confirmation of ίο
Gastrointestinal bleeding: Annals of Clinical and Laboratory Science 4 (1974) 343 ff.« und von Burton, RM et
al.: in »Appearance, Properties and Origin of altered Human Hemoglobin in Feces; Laboratory Investigation
35 (1976) ff.« beschrieben worden.
Allgemein gilt, daß die Tiere durch Injektion in Kontakt
mit dem Antigen (d. h. Humanhämoglobin und Humanhämoglobinbestandteile) kommen, wobei fast
immer mehrere Injektionen benötigt werden. Die zeitlichen Abstände zwischen den einzelnen Injektionen,
zweckmäßige Antigenrfiengen, die Art der Injektion
und die gegebenenfalls zusätzliche Verwendung eines Adjuvanten kann von jedem Fachmann anhand des vorliegenden
Einzelfalles ohne weiteres bestimmt werden.
Neben dieser »in vivo-Immunisierung« sind auch
Methoden der »in vitro-Immunisierung« bekannt, wobei nicht das Tier sondern Zellen eines Tieres oder
sogar eines Menschens direkt in der Zellkultur mit dem Antigen in Kontakt gebracht werden. Bei dem letztgenannten
Verfahren entnimmt man Zellen z. B. aus nicht immunisierten Tieren und bringt sie in der Zellkultur
erstmals mit dem Antigen zusammen, so daß also die primäre Immunantwort in vitro ausgeführt wird. Derartige
Methoden wurden beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben: von Mishell, RJ, Dutton
RW in: »immunization of dissociated spleen ce!! cultures from normal mice; J. Exp. Med. 126 (1967) 423 ff.«;
von Marbrook, J: in »Primary immune response in cultures of spleen cells; Lancet II (1967), 1279 ff.« und von
Lefkovits, 1 in : »Induction of antibody forming cell clones
in microcultures; Europ. J. Immunol. 2 (1972), 360 ff«.
Bei den in diesen Literaturstellen beschriebenen Kulturmethoden werden Nährmedien benutzt, die durch
spezielle Zusatzstoffe und foetales Kälberserum (FCF) ergänzt worden sind, und man die Zellen nach Zugabe
des Antigens für einige Tage bei einer Temperatur von z. B. 37°C inkubiert, wobei sehr oft eine CO2-Begasung
durchgeführt wird. Die Zellen werden anschließend von toten Zellen und vom Antigen in an sich bekannter
Weise gereinigt. Sie können auch in geeigneten Fällen fusioniert werden, wie dieses nachfolgend noch
beschrieben wird.
Zellkulturen können aber auch zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Die
Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Humanhämoglobin und Humanhämoglobinbestandteile
ist bekannt und beispielsweise von Stamatoyannopoulos et al. in: »Mapping of antigenic sites on human
haemoglobin by means of monoclonal anitbodies and , !.haemoglobin ,variants«; Lancet II (1981) 952 ,ff.
''beschrieben. Zur Durchführung dieser Methode kann beispielsweise wie folgt Vorgegangen werden:
Zunächst werden Mätuse mit Humanhämoglobin
immunisiert. Nach erfolgreicher Immunisierung, die sich durch einen hohen Spiegel an anti-Humänhämoglobin-Antikörpern
im !!Serum anzeigt, werden die Mäuse getötet und Milz und Lymphknoten entfernt.
Die in den Geweben dieser Organe enthaltenen Zellen werden isoliert und mit einer 8-Azaguariin-resistetiten
genetisch identischen Myelomzeilinie fusioniert, in dem sie in zweckmäßigen Konzentrationen unter
Zugabe von Polyäthylenglykol zusammengegeben werden. Anschließend werden die Zellen in einem Selektivmedium
aufgenommen. Nach etwa 10 bis 14 Tagen werden die ersten Kolonien für das bloße Auge sichtbar,
und es kommt zu einer pH-Wert-Verschiebung im Nährmedium der Zellen. Man kann die Überstände der Zellkulturen
aus der Kulturplatte abnehmen und auf Antikörperaktivität
überprüfen. Wenn die Überstände die gewünschten Antikörper enthalten, werden die entsprechenden
Zellen der Kulturplatte in Platten und Kulturflaschen weiter vermehrt.
Zur Herstellung von besonders hochkonzentrierten Antikörperlösungen appliziert man die Antikörper-produzierenden
Zellen in den Bauchraum von Mäusen, wobei diesen vorzugsweise wenige Tage zuvor ein für
diesen Zweck im Handel angeboten :s Mineralöl in den Bauchraurn gespritzt worden ist. Nach einigen Wochen
entwickelt die Maus eine große Menge an Aszites (= Bauchraumflüssigkeit), Tumorzellen und oft auch
solide Tumore, an denen die Maus meistens zugrundegeht. Die Aszites-Flüssigkeit enthält die gewünschten
Antikörper in sehr hoher Konzentration.
Bei der Kombination von der »in vivoTmmunisierung«
mit der »in vitro-Immunisierung« wird das Tier in oben beschriebener Weise immunisiert, und anschließend
werden die Zellen von Milz und Lymphknoten zusätzlich in der Zellkultur mit dem Antigen inkubiert.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte tierische Serum, der Zellkulturüberstand oder die
Aszites-Flüssigkeit enthalten neben den Antikörpern bzw. Antikörperfragmenten weitere Proteine, so daß es
zweckmäßig ist, eine mit Antikörpern angereicherte Fraktion auszufällen. Diese Ausfällung kann erfindungsgemäß
mit festem Ammoniumsulfat vorgenommen werden. Nach einer speziellen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt man zu diesem Z- /eck in der Kälte bei etwa 0° bis 4°C dieses Salz hinzu,
bis eine zweckmäßige Konzentration erreicht ist. Es ist aber auch möglich, eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung
in Wasser tropfenweise zuzugeben. Gute Ergebnisse werden mit einer Konzentration zwischen 106 bis
291 g, insbesondere etwa 187 g Ammoniumsulfat pro Liter Antikörper-haltiger Flüssigkeit erhalten. Diese
Werte entsprechen etwa einer Endkonzentration von 20% bis 50%, insbesondere von 33% Sättigung.
Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig in Lösung gegangen ist, ist es vorteilhaft, die Flüssigkeit
für weitere 0,5 bis 2Λ Stunden, vorzugsweise 1 bis
2 Ständen zu rühren. Die Temperatur, bei der die Ausfällung
mit Ammoniumsulfat vorgenommen wird, ist nicht entscheidend und kann über einen weiten Bereich
variieren. Einerseits wird in der Wanne eine größeie
Proteinmenge ausgefällt als in der Kälte, andererseits wird bei einem Arbeiten in der Kälte die enzymatisch
Aktivität von gegebenenfalls anwesenden ProJeinasen verringert. Anschließend wird der Antikörper-haltige
Niederschlag zweckmäßig hochtpurig abzenirifugiert
und der Überstand dekantiert und verworfen.
Dei; Niederschlag wird zweckmäßig in einem Bruchteil
des Volumens der Ausgangsflüssigkeit (beispielsweise ein Fünftel) in einem wäßrigen Medium im einfachsten
Fall in Aquä dest. gelöst. Dieses kann vorzugsweise an sich bekannte Puffer, Salze bzw. Serurm-Albumin,
'Casein oder Gelantine enthalten und einen pH-
Wert von 5 bis 10, vorzugsweise von 7,2 ± 0,8 aufweisen, wobei die Molarität zweckmäßig höchstens 2 Mol/Liter
beträgt. In an sich bekannter Weise wird dieses wäßrige Medium bis zur Sulfatfreiheit gegen ein wäßriges
Medium dialysiert. Es wird bevorzugt, daß dieses wäßrige Medium Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer nach
Sörensen enthält und einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise 7,2 ±0,8 und eine Salzkonzentration von
maximall Mol/Liter,vorzugsweiseunterö,l Mol/Liter
aufweist. Die Zusammensetzung der zu dialysierenden Lösung und der wäßrigen Lösung gegen die die Dialyse
erfolgt, kann dabei identisch sein.
Durch die Maßnahme der Stufe 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt es zu einer unspezifischen
Anlagerung von den anwesenden Proteinen an der Oberfläche von den anwesenden Polystyrol-Latexteilchen.
Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt, die Latexteilchen in Form einer wäßrigen Suspension zu
verwenden, wie sie im Handel ist.
Nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt im fertigen Latextestreagenz
eine Polystyrolsuspension vor, welche etwa 0,1 bis 12 Gew.-% Feststoffteilchen enthält. So gibt es handelsübliche
Polystyrolsuspensionen mit 10% Festbestandteilen,
weäche ggf. auch kleine Mengen an Hilfsstoffen, wie beispielsweise Stabilisatoren, Antioxidationsmittel
usw. enthalten können, und diese können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unverändert
eingesetzt werden.
Die zweckmäßige Menge an Latexteilchen im JO gebrauchsfertigen Testreagenz hängt davon ab, daß es
im allgemeinen vorteilhaft ist, daß eine Agglutination, welche bei der bestimmungsmäßigen Verwendung des
Reagenz Humanhämoglobin bzw. Humanhämoglobinbestandteile anzeigt, mit dem bloßen Auge festgestellt
werden kann.
Die Teiichendufchmessef des PoiysiyroHatex variieren
über einen sehr weiten Bereich. So können entsprechende Latexpartikel mit einem Durchmesser von
0,0018 bis zu einem Durchmesser von 100 Mikrometer verwendet werden, wobei ein Latexteilchen-Durchmesser
von 0,005 bis 5 (insbesondere bis 1) Mikrometer bevorzugt wird. Auch in dieser Hinsicht ist es zweckmäßig,
auf einen Durchmesserbereich der Latexteilchen zurückzugreifen, welcher in leicht verfügbaren Handelspräparaten
gegeben ist.
Es liegt in der Natur der Sache, daß die für die Ablagerung der Proteine verfügbare Oberfläche der suspendierten
Polystyrolteilchen von deren Teilchengrößenbereich abhängt Je kleiner die Größe der Polystyrolteilchen
ist, desto mehr Oberfläche der Teilchen steht zur Verfügung. Für einen Fachmann ist es dabei ohne weiteres
möglich, für einen gegebenen Teilchengrößenbereich durch einfache Vorversuche eine für die
gewünschte Anlagerung der Proteine ausreichende Menge der Polystyrolteiichen zu bestimmen. Wird beispielsweise
ein Polystyrollatex mit Teilchengrößen von 0,305 Mikrometern oder 0,312 Mikrometern (wie sie
bei bestimmten Handelspräparaten) gegeben sind) eingesetzt, so werden mit 5 ecm Suspension mit einem
Gehalt von 2 Gew.-% Feststoffteilchen für 0,5 ecm einer Antikörperfraktion mit etwa 10-20 mg Proteingehalt
außerordentlich gute Ergebnisse erhalten. Es können zum Beispiel bei den oben angegebenen Teilchengrö-Sen
der Polystyrolteiichen auch etwa 10 can der Suspension mit 1% des Teilchengehalis verwendet werden,
um beispielsweise 33 mg Protein in 1 ecm Antikör-Derfraktion
zu binden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Polystyrollatex-Suspension mit einer
geeigneten Pufferlösung verdünnt oder das Suspensionsmedium durch diese vollständig ersetzt. Als
Lösungs- oder Verdünnungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren werden in der Regel blutisotone
Systeme verwendet. Als einfachstes Lösungs- bzw. Verdünnungsmittel ist 0,9%ige Kochsalzlösung zu nennen,
weiche gegebenenfalls einen geeigneten Puffer, wie Phosphatsalz oder Glycin oder Tris-HCl enthält.
Vorzugsweise werden an dieser Stelle des erfindungsgemäßen Verfahrens Glycin-gepufferte Kochsalzlösungen
eingesetzt, wobei die pH-Werte von 5 bis 10 besonders bevorzugt werden. Die Pufferlösungen können
zweckmäßig Salze, Albumin und/oder Gelatine bzw. Casein enthalten. Niedermolare Tris-HCI-Puffer oder
Phosphatpuffer, welche bereits bekannt sind, können erfindungsgemäß ebenfalls angewendet werden.
So kann zur Verdünnung der Polystyrolsuspension beispielsweise eine Glycin-gepufferte Kochsalzlösung
verwendet werden, welche eine Molarität von 0,001 bis 2 Mol/Liter, vorzugsweise von 0,01 bis 1,5 Mol/Liter
Glycin und NaCl, insbesondere von 0,1 bis 0,9 MoI/ Liter Glycin und von 0,1 ±0,05 Mol/Liter NaCl aufweist.
Wie bereits oben angegeben, können als Polystyrollatices handelsübliche Präparate verwendet werden. Insbesondere
sokne mit einem Anteil an Festbestandteilen von 10% sind erfindungsgemäß außerordentlich gut
geeignet. Unter dem Begriff »Polystyrol« sollen sowohl Homo- als auch Mischpolymerisate von Polystyrol und
Polystyrolderivaten verstanden werden. So sind beispielsweise Lactices aus Mischpolymeren von Styrol
und Butadien, insbesondere in einem Verhältnis von etwa 95 : 5 bis 60 : 40 Gew.-%, aus t.-Butylstyrol und
Vinyltoluol, und aus Styrol und Divinylbenzol (beispielsweise in einem Verhältnis von 95 : 5 Gew.-%)
erfindungsgemäß sehr gut verwendbar.
Die dialysierte Antikörper- bzw. Antikörperfragmentfraktion enthält normalerweise einen beträchtlichen
Anteil an Begleitproteinen, wie beispielsweise Globuline und Albumine. Sofem das nicht der Fall ist, ist es
zweckmäßig, der für die Beschichtung verwendeten Antikörperfraktion bzw. Antikörperfragmentfraktion
geeignete Proteine hinzuzugeben, wofür beispielsweise ein Rinderserumalbuminzusatz vorteilhaft ist. Der
Anteil der Begleitproteine, bezogen auf die Antikörperfraktionen, kann über 20%, beispielsweise etwa 20-30%
betragen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die mit der Polystyroisuspension
versetzte Antikörperfraktion zunächst 30 Minuten bis etwa 24 Stunden (beispielsweise
II ±3 Stunden) bei Zimmertemperatur belassen, wobei es zweckmäßig ist, zumindest während eines Teiles
dieser Zeit mechanische Maßnahmen, wie Rütteln, Schütteln oder Schwenken vorzusehen. Danach ist es
zweckmäßig, die Mischung unter Abkühlung beispielsweise auf 4°C für wenigstens 8 Stunden stehen zu lassen.
Dieses Stehenlassen unter Abkühlung kann durch ein Abzentrifugieren und Abdekantieren nach der oben
angegebenen halbstündigen bis 24stündigen Handlung ersetzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nun die Mischung, weiche den Folystyrülläiex mit der Antikörperfraktion
enthält, mit einer ein oberflächenaktives Mittel der allgemeinen Formel
U2C CH-CH2-COOR
I I
HO(C2H4O)^HC
CH-(OC2H4)4-OH
woifii R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit
etwa 8 bis 22 C-Atomen und a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von α,
b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, enthaltenden Lösung
versetzt. Die Menge dieses oberflächenaktiven Mittels kann bis 1 Vol-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,2 Vol-%,
insbesondere 0,015 ± 0,1 Vol-%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung betragen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als oberflächenaktives Mittel der obengenannten
Formel ein solches verwendet, bei dem R einen Laurylrest bedeutet und die Summe der Indizes a, b und
c etwa 20 ist.
Es ist sehr vorteilhaft, wenn die oben beschriebene Lösung auch Polyvinylpyrrolidon enthält. Dieses wird
in einer Menge verwendet, daß das Polyvinylpyrrolidon in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis
5 Gew.-%, insbesondere von etwa0,1 oderO,2 Gew.-% in
dem Latexreagenz vorhanden ist.
Auch das Polyvinylpyrrolidon ist in erfindungsgemäß geeigneter Form als Handelsprodukt erhältlich. Es kommen
insbesondere Materialien mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 400 000 in Betracht. Insbesondere
können Vinylpyrrolidonpolymere mit einem /i-Wert von 10 bis 90, beispielsweise 30 bis 90 ganz speziell mit
einem K-Wert von 40 mit gutem Erfolg eingesetzt werden.
Es wurde bereits oben daraufhingewiesen, daß es vorteilhaft
ist, wenn die bei dem erfindungsgemäßen Verzugsweise Puffer enthalten. Dabei ist es vorteilhaft,
Salzmengen von 0,001 bis 1,0 Mol bezogen auf die Gesamtlösung des Polyvinylpyrrolidons zu verwenden.
Auch in diesem Falle gibt ein Phosphatpuffer, welcher -der Lösung einen pH-Wert von 5-10, vorzugsweise zwischen
6,5 und 7,6 vermittelt, sehr gute Ergebnisse.
Im übrigen gelten für den Salzzusatz und die Puffermittel
diejenigen Ausführungen, welche bereits oben für andere Behandlungslösungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens gemacht worden ist.
Die Lösung mit der Antikörperfraktion bzw. Antikör-■perfragmentfraktion,
dem oberflächenaktiven Mittel und gegebenenfalls dem Polyvinylpyrrolidon ist das
gebrauchsfertige Latexreagenz, welches die bereits oben genannten Vorteile gegenüber entsprechenden
Reagenzien nach dem Stand der Technik aufweist. Es ist über Monate bzw. sogar Jahre hinweg lagerungsfähig.
Das erfindungsgemäß hergestellte Latextestreagenz kann zum Nachweis und zur Differenzierung von
Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten in einer Vielzahl von
verschiedenen Materialien durchgeführt werden. So sind entsprechende Untersuchungen von praktisch
allen physiologischen Körperflüssigkeiten, wie z. B.
Serum, Plasma, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Magensaft, Duodenalsaft, Galle, Pankreasekret,
Schweiß, Liquor, Gelenkpunktate (Synovialsekret), Fruchtwasser, Lymphe, Ejakulat, Muttermilch und Sputum
möglich, insbesondere ist aber der zuverlässige Nachweis von Blut im Stuhl zur medizinischen Diagnose
außerordentlich wichtig. Mit gutem Erfolg ist auch die gewünschte Bestimmung in allen Körperspülflüssigkeiten,
svie Bronchiallavage-Flüssigkeit, Magenspülflüssigkeit, Drainageflüssigkeit, aber auch in pathologischen
Körperflüssigkeiten, wie Eiter, seröse Wund-S sekrete, Aszites, Perikard und sonstige Ergüsse, Abszess-
und sonstige Punktate von Zysten, Erbrochenes, Inhalt von blasenartigen Hauterkrankungen, inklusive
eier Schleimhaut, möglich. Schließlich kann der Nachweis und Differenzierung von Hämoglobin und den
!'oben genannten Hämoglobin-artigen Stoffen auch in angefertigten Extrakten, welche z. B. in der Gerichtsmedizikn
aus Stoffen oder von Flächen entfernten Materialien gewonnen werden, mit dem erfindungsgemäß
hergestellten Latextestreagenz vorgenommen werden.
Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß mit dem erfindungsgemäß hergestellten Latextestreagenz die
Anzahl falscher Ergebnisse, d. h. fehlende Anzeige von Hämoglobin, sowohl dieses im zu uniersuchenden
Material vorhanden ist oder das Auftreten von Agglutination trotz fehlendem Hämoglobin oder Hämoglobinartigen Stoffen, beträchtlich reduziert werden kann.
Diese volle Spezifität und einwandfreie Negativkontrolle bleibt auch nach einer Lagerung von vielen Monaten
erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:
Aus dem Serum des Blutes einer gegen Humanhämoglobin immunisierten Ziege wurden die Antikörper in
folgender Weise aufbereitet:
Die Antikörper wurden durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Serum bis zu einer Endkonzentration
von 33% der Sättigung ausgefällt und abzentrifugiert.
a-rtv UUi>QVlUllk\f lllltlnwipviliunliw·. ..üsvv »«.-iuv-i iLL
52 mM einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 aufgelöst und gegen denselben Puffer bis
zur Sulfatfreiheit dialysiert.
Eine handelsübliche Polystyrol-Latexsuspension, bei der der Durchmesser der Latexteilchen etwa 0,305 μιη
betrug, wurde in einem Volumensverhältnis von 1 (Latexsuspension) zu 4 (gepufferte Kochsalzlösung) mit
einer Glyzin-gepufferten Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75 gut vermischt. Diese Glyzin-gepufferte-Kochsalzlösung
war vorher hergestellt worden, indem 467 ecm einer 2 m Glyzinlösung in Wasser
zunächst mit 100 ecm einer 1 m Natriumlauge vermischt wurden. Diese Mischung wurde dann im VoIumenverhältnis
von 1 : 1 mit 0,9%iger Kochsalzlösung gemischt.
Zu 5 ecm der verdünnten Polystyrollatex-Suspension wurden nun 0,5 ecm der oben erhaltenen Lösung der
Antikörperfraktion zugegeben, wobei in dieser 16,5 mg Protein in den verwendeten 0.5 ecm der Lösung enthalten
waren. Es wurde wiederum gut gemischt.
Die so erhaltene Mischung wurde zunächst 12 Stunden bei Raumtemperatur und danach weitere 12 Stunden
bei 4°C stehengelassen.
Danach wurden die 5,5 ecm der beschichteten Latexsuspension
mit der gleichen Volumenmenge einer GIyzin-gepufferten-Kochsalzlösung
verdünnt, die sowohl Polyvinylpyrrolidon als auch ein bestimmtes oberflächenaktives
Mittel enthielt.
Diese Lösung war dadurch erhalten worden, daß man zu der bereits oben beschriebenen Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung
0,1 Vol/Vol.-% eines oberflächenakti-
11
ven Mittel der obenstehenden Formel I, bei dem R einen Laurylrest bedeutet und die Summe der Indizes
o, b und c etwa 20 ist, zugab. Des weiteren wurde zu der
Pufferlösung auch noch 0,2 Gew./Vol.-% an Polyvinylpyrrolidon mit einem /c-Wert von 40 zugefügt.
Die so erhaltene Lösung ist ein Latextestreagenz, welches zum Nachweis und zur Differen2ierung von
Humanhämoglobin, Humanhämoglobin-Bestandteilen oder Humanhämoglobin-Varianten mit großem Erfolg
verwendet werden kann.
Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch ein Polystyroüatex verwendet wurde, bei dem
der Durchmesser der Polystyrollatexteilchen 0,312 μΐη
μ betrug.
~ Beispiel 3
20
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Glyzin-gepufferte-Kochsalzlösung
eine solche mit einem pH-Wert von 8,2 verwendet, welche 7,505 g Glyzin; Ig NaN3; 5,846 g NaCl auf
2 Liter Wasser enthielt. Die Konzentration des Kochsalz war also 0,1 molar.
Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch betrug die Konzentration an Polyvinylpyrrolidon in der
Glyzin-gepuffertekn-Kochsalzlösung 0,1 Gew./Vol.-%.
35
Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde 1 ecm dsr PciystyroHateX'Suspension rr.it
9 ecm der 0,1 m Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung vermischt. Dazu wurden dann 1 ecm Antikörperfraktion
gegeben, welche also 33 mg Protein enthielten.
(Nachweis von Humanhämoglobin im Stuhl)
45
1 ecm der in Beispiel 1 verwendeten Glyzin-gepufferten
Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75, ·■· welche 0,005% des in Beispiel 1 genannten oberflächenaktiven
Mittels enthielt, wurden zu 0,1 bis 0,2 g Stuhl ■hinzugefügt. Nach gründlichem Vermischen wurde zen-'trifugiert
und der Überstand nochmals durch ein Filter mit 0,45 μηι Porenweite filtriert. Das Filter war vorher
mit Glyzin-gepufferter-Kochsalzlösung, welche einen Zusatz von 1% Albumin enthielt, vorgespült worden.
10 ecm Stuhl Suspension wurden danach mit 10 ecm
eins Latexreagenz nach den Beispielen 1-5 vermischt. Bei Anwesenheit von Hämoglobin war nach 1 -2 Minuten
die Agglutination mit dem bloßen Auge festzustellen.
Es ist ersichtlich, daß es vorteilhaft ist, wenn die zu untersuchenden Materialien in einer isotonen Lösung,
beispielsweise einer gepufferten Kochsalzlösung, die ein oberflächenaktives Mittel der Formel I zweckmäßig
in einer Menge bis zu 1 Vol.-%, gelöst oder suspendiert werden.
Claims (18)
1. Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern
oder aus anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern oder aus deren Fragmenten, dadurch
gekennzeichnet, daß man
aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten,
diese mit Ammoniumsulfat ausfallt und abzentrifugiert,
die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen
Medium, in diesem bis zur Sulfatfreiheit dialysiert,
die dialysierte Antikörper(bzw. Antikörperfragment)-fraktion
mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und vorzugsweise bei einer Temperatur von 00C bis
1000C stehen läßt und
anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven Mittel der allgemeinen Formel
H2C
I
HO(C2H4O)1-HC
HO(C2H4O)1-HC
O
κ \
κ \
CH-CH2-COOR
CH-COC2RO13-OH
C"H-(OC2H4)4-OH
C"H-(OC2H4)4-OH
25
30
worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 c-Atomen und a, b und c
jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und c vorzugsweise 5
bis 200 ist, versetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung zusätzlich mit Polyvinylpyrrolidon
versetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Resuspendierung der
abzentrifugierten Feststoffe in einem wäßrigen Medium erfolgt, dem gegebenenfalls an sich
bekannte Puffer, Salze bzw. Albumin oder Gelatine oder Casein beigemischt sind, und welches einen
pH-Wert von 5-10, vorzugsweise von 7,2 ± 0,8 aufweist und eine Molarität von höchstens 2 Mol/l
besitzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu dialysierende Lösung
gegen ein wäßriges Medium dialysiert wird, welches Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer (nach Sörensen),
enthält und einen pH-Wert von 5 -10, Vorzugsweise 7,2 ± 0,8, und eine Salzkonzentration von
maximal 1 Mol/Liter, vorzugsweise unter 0,1 Mol/ Liter, aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse gegen denselben
^Puffer bzw. dasselbe Salz, wie es in der zu dialysierenden Lösung anwesend ist, vorgenommen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Polystyrol-Latexteilchen mit
einem Durchmesser von 0,0018 Mikrometer bis 100 Mikrometer, vorzugsweise mit einem Durchmesser
von 0,005 bis 5 (insbesondere bis 1) Mikrometer, verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension von Polystyrol-Latexteilchen
verwendet wird, die mit einer geeigneten Pufferlösung, insbesondere mit einer Glycin-gepufferten-Kochsalzlösung, mit einem pH-Wert
von 5-10, insbesondere von 8,8 + 0,4, sowie einer Molarität von 0,001 bis 2 Mol/Liter, vorzugsweise
von 0,01 bis 1,5 Mol/Liter Glycin und NaCl und insbesondere von 0,1 bis 0,9 Mol/Liter Glycin
und von 0,1 ± 0,05 Mol/Liter NaCl, verdünnt worden ist
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen-Verhältnis zwischen
Polystyrollatex-Suspension und gepufferter Verdünnungslösung so gewählt wird, daß eine
Laiexsuspension entsteht, die 2 ± 0,5% Feststoffteilchen
enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Suspension von
Polystyrol-Latexteilchen versetzte Antikörperfraktion gegebenenfalls unter Rütteln, Schütteln bzw.
Schwenken bei Zimmertemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten bis zu 24 Stunden, vorzugsweise
für 11 ± 3 Stunden stehengelassen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Stehenlassen der Antikörperfraktion-Latexmischung
in Stufe 4 gegebenenfalls im Anschluß an die Maßnahmen von Anspruch 9 bei etwa 4°C und wenigstens für 8 Stunden erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 5 eine Polyvinylpyrrolidon
enthaltende Lösung zugegeben wird, welche eine Endkonzentration (Grammprozent) von PVP
im Latextestreagenz zwischen 0,0001 und 5%, vorzugsweise zwischen 0,001% und 1% und insbesondere
von 0,05% und 0,1%, bewirkt.
12. Verfahren nach Anspruch 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Polyvinylpyrrolidon
einen /f-Wert von K 10 bis K 90, vorzugsweise
von K 30 bis K 90, insbesondere von K 40 aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 5 das oberflächenaktive
Mittel in einer Menge bis zu 1 Vol-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,2 Vol-% und insbesondere
0,015 ±0,01 Vol-%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel
ein solches verwendet wird, bei dem der Rest R einen Laurylresl bedeutet und die Summe der Indices
a, b und c etwa 20 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyvinylpyrrolidon und
das oberflächenaktive Mittel enthaltende Lösung zusätzlich vorzugsweise 0,001 bis 1,0 Mol, insbesondere
bis 0,1 Mol eines geeigneten anorganischen Salzes, vorzugsweise einen Puffer, enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer der Lösung eine pH-Wert
von 5-10, insbesondere von 8,8 + 0,4 vermittelt.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Ammoniumsulfatkonzentration, bezogen auf das Endvolumen der Antikörper bzw.
Antikörperfragmente enthaltenden Flüssigkeit zwischen 20% und 50% Sättigung, insbesondere bei 33%
Sättigung liegt.
18. Verwendung eines nach Anspruch 1 hergestell-
ten Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen
oder Humanhämoglobinvarianten in allen physiologischen Körperflüssigkeiten
sowie insbesondere im Stuhl, sowie in allen Körperspülflüssigkeiten und pathologischen Körperflüssigkeiten
sowie Extrakten, die aus Stoffen oder von Flächen entfernten Materialien gewonnen worden sind.
10
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern
oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern oder aus deren Fragmenten, und die Verwendung von diesem zum Nachweis und zur
Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten.
Es ist bekannt, &aS der Nachweis von Humanhämoglobin
durch einen Latex-Agglutinationstest durchgeführt werden kann. Bei diesem Test geht man von entsprechenden
Antiseren oder Antikörpern aus, die durch Immunisierung von Kaninchen oder Ziegen gegen
Humanhämoglobin erhalten werden können. Bei der Herstellung eines bekannten Latexnstreagenz (E C
Adams, K M Layman, Annals of Clinical and Laboratory Science Band 4 (1974) S. 343 ff.) werden zunächst
nach einer Erhitzungsstufe des Serums der immunisierten Tiere die heterophilen Antikörper durch
Absorption an lyop:.ylisierten, formalinisierten Schafserythrozyten
entfernt, und nach der ^ugabe von Rivanol-Lösung
zu dem Antiserum-Überstand wird dieser zentrifugiert und der dabei erhaltene Überstand mehrmals
mit Aktivkohle und nachfolgendem Zentrifugie-
ii^ii via CiX uosAVli rvjal U115 uviiaiiuwi, πυιιαι,ιι vuiv i_,jo
philisation des geklärten Überstandes erfolgt. - Das Lyophilisat wird in einer neutralen Kochsalzlösung aufgelöst
und diese Lösung mit handelsüblichen Polystyrol-Latexteilchen behandelt, wobei eine Beschichtung
der Latexteilchen durch Schütteln erfolgt. Zur Herstellung eines gebrauchsfähigen Testreagenzes wird diese
Latex-Lyophilisat-Mischung mit Kochsalzlösung weiter verdünnt.
Eine praktische Anwendung dieses bereits bekannten Testreagenz hat gezeigt, daß es außerordentlich wünschenswert
ist, dessen Empfindlichkeit gegenüber dem nachzuweisenden Hämoglobin zu vergrößern.
Aus der DE-OS 30 02 973 ist bekannt, daß die Latexagglutinationsreaktion
durch Verwendung eines speziellen Reagenz verbessert werden kann, wobei dieses
Reagenz für die Latexagglutinationsreaktion und ein Verfahren zur Durchführung der genannten Reaktion
beansprucht wird. Bei diesem Reagenz handelt es sich um eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen
Formel
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19833322643 DE3322643C2 (de) | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19833322643 DE3322643C2 (de) | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3322643A1 DE3322643A1 (de) | 1985-01-03 |
DE3322643C2 true DE3322643C2 (de) | 1986-07-10 |
Family
ID=6202197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19833322643 Expired DE3322643C2 (de) | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten |
Country Status (1)
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---|---|
DE (1) | DE3322643C2 (de) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3532868A1 (de) * | 1985-09-14 | 1987-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin sowie hierzu geeignete verbindungen und verfahren zu deren herstellung |
US4847209A (en) * | 1987-11-09 | 1989-07-11 | Miles Inc. | Latex agglutination immunoassay in the presence of hemoglobin |
CA2061371A1 (en) * | 1991-03-15 | 1992-09-16 | Edna Antonian | Agglutination immunoassay |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1146852A (en) * | 1979-01-31 | 1983-05-24 | Koichi Kondo | Reagent for latex agglutination |
-
1983
- 1983-06-23 DE DE19833322643 patent/DE3322643C2/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3322643A1 (de) | 1985-01-03 |
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