DE60034227T2 - Stabilisiertes denaturiertes lipoprotein und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Vorliegende Erfindung betrifft ein stabilisiertes, denaturiertes Lipoprotein und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Insbesondere betrifft vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines denaturierten Lipoproteins, das die Stufen des Einfrierens einer Lösung mit einem Gehalt an Lipoprotein zur Bildung einer gefrorenen Lösung und das Schmelzen der gefrorenen Lösung zur Herstellung einer Lösung mit einem Gehalt an denaturiertem Lipoprotein umfasst.
  • Insbesondere betrifft vorliegendes Verfahren ein Verfahren zur Herstellung eines denaturierten Lipoproteins, wie weiter oben beschrieben, das ferner ein Gefriertrocknen der Lösung mit einem Gehalt an denaturiertem Lipoprotein umfasst.
  • Das denaturierte Lipoprotein legt in hohem Maße seine Assoziation mit verschiedenen Erkrankungen des Kreislaufsystems einschließlich solcher Erkrankungen des koronaren Arteriensystems nahe, wie ein Herzinfarkt und eine Stenokardie, welche Erkrankungen der cerebralen Arterien wie ein Celebralinfarkt und einer cereprovaskularen Demenz, solche Erkrankungen der renalen Arterien wie eine Nephropathie und diabetische Nephropathie sowie solche Erkrankungen des peripheren Arteriensystems wie eine Behinderung peripherer Arterien. Die Standardsubstanzen für die Bestimmung der Masse denaturierten Lipoproteins, und die verschiedenen experimentellen Reagenzien für die Erforschung der physiologischen Rolle und physiologischen Aktivität des denaturierten Liproproteins bilden deshalb selbst so wichtige Substanzen, welche die Ergebnisse der Forschungsanstrengungen beeinflussen. Das denaturierte Lipoprotein, welches auf die zuvor beschriebene Weise stabilisiert wurde, ist deshalb als Standardsubstanz bei der Bestimmungsmethode des Gehalts denaturierten Lipoproteins in einer Blutkomponente brauchbar, wie z. B. durch Bewirken, dass das denaturierte Lipoprotein in Kontakt mit einem Antikörper kommt, der der Erkennung des denaturierten Lipoproteins fähig ist und durch Bestimmung der Reaktivität des Antikörpers mit einer Probe und einem wechselnden experimentellen Reagenz zur Untersuchung der physiologischen Rolle und physiologischen Aktivität des denaturierten Lipoproteins.
  • STAND DER TECHNIK
  • Bei verschiedenen Erkrankungen des Kreislaufsystems einschließlich solcher Erkrankungen des koronaren Arteriensystems wie Herzinfarkt und Stenokardie, solcher Erkrankungen der Cerebralarterien wie bei einem Cerebralzinfarkt und einer cerebrovaskularen Demenz, solchen Erkrankungen der renalen Arterien wie Nephrophathie und diabetische Nephrophathie und solchen Erkrankungen des peripheren Arteriensystems wie einer Behinderung der peripheren Arterien ist es in hohem Maße naheliegend, dass das Lipid im Blutserum eine wichtige Rolle spielt. Heutzutage werden sehr hohe Ausgaben vom öffentlichen Gesundheitssystem für medizinische Behandlungen unter Verwendung von Serumlipid senkenden Mitteln, insbesondere Cholesterin senkende Mittel, bezahlt. Jüngere Untersuchungen lieferten einen Bericht, indem ein Vergleich zwischen einer Gruppe von Patienten mit derartigen Erkrankungen und einer Gruppe von gesunden Personen keinen merklichen Unterschied in der absoluten Menge des Serumlipids zwischen den beiden Gruppen enthüllte, und dass eher die Menge oxidierten LDL, ein denaturiertes Produkt des Lipoproteins niederer Dichte (LDL = low density lipoprotein), das im Blutserum vorliegt, zwischen den beiden Gruppen sich deutlich unterscheidet (Toshima, S. u. a. (1996) Circulation, 94, Suppl. I: 1288). Die Beziehung zwischen dem oxidierten Lipoprotein als eines der denaturierten Lipoproteine und dem Fortschreiten einer Arteriosklerose wurde z. B. von Steinberg u.a. (Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, T. E., Khoo, J. C. und Witztum, J. L., (1989) N. Engl. J. Med., 320: 915) hervorgehoben. In jüngeren Jahren wurden deshalb verschiedene Bestimmungsmethoden unter Verwendung von denaturiertem Lipoprotein entwickelt (Patentveröffentlichung JP-A-08-304.395 und JP-A-09-288.106 beispielsweise) und der Test zur Erforschung der physiologischen Rolle des denaturierten Lipoproteins gewann an Bedeutung.
  • Jedoch komplizierte die Tatsache die Situation, dass es schwierig ist, die für die bei derartigen Versuchen für die Bestimmungen erforderlichen Standardsubstanzen zu erhalten. Zur Erforschung der physiologischen Rolle des denaturierten Lipoproteins wird es notwendig, eine große Anzahl von Blutproben denaturierten Lipoproteins aus einer Vielzahl von Installationen zu sammeln und sie zu vergleichen. Zum Vergleich ist es wesentlich, dass die erhaltenen Messungen in den einzelnen Tests schwankungsfrei sind. Es kann unter diesen Messungen keine Reproduzierbarkeit gewährleistet werden, wenn nicht eine Standardsubstanz, die eine stabile und hervorragende Reproduzierbarkeit während einer Dauer zur Verfügung steht, die für eine Reihe einschlägiger Tests erforderlich ist. Wenn die Testergebnisse zwischen unterschiedlichen Personen, welche messen, infolge der Verwendung verschiedener Standardsubstanzen beträchtlich schwanken, ist die Interpretation der physiologischen Rolle eines gegebenen denaturierten Lipoproteins so kompliziert, dass es unmöglich wird, eine feste Folgerung zu erhalten. Diese Unfähigkeit, eine Standardsubstanz zu erhalten, die für eine stabile Konservierung geeignet ist, verschloss den Weg der Anwendung der Bestimmung der Menge denaturierten, z. B. in einer gegebenen Probe vorliegenden Lipoproteins als Mittel zur exakten Beurteilung der Krankheit, trotz öffentlicher Anerkennung der physiologischen Bedeutung dieser Bestimmung.
  • In der Regel wird derzeit bei der Bestimmung der Proteinmasse, die z. B. im Blutserum enthalten ist, die Praxis einer Stablisierung nach dem einen oder anderen Verfahren, das was ein Standardblutserum oder eine Zielverbindung in einem isolierten Zustand genannt werden kann unter Verwendung des Produkts dieser Stabilisierung als Standardsubstanz durchgeführt. Hinsichtlich des Lipoproteins im allgemeinen wurde über ein Verfahren zur Herstellung von Standardblutplasma oder Standardblutserum, die während einer ausgedehnten Konservierung stabil sind, durch wahlweises Mischen von Lipoprotein enthaltendem Blutplasma oder Blutserum mit einem solchen nicht-reduzierenden Zucker wie Saccharose und durch Gefriertrocknen des erhaltenen Gemischs, bis der Wassergehalt ein Niveau im Bereich von 1–10 Massen-% erreicht (Patentveröffentlichung EP-A-617289) sowie ein Verfahren zur kommerziellen Herstellung eines stabilen gefriergetrockneten Produkts unter Erhalt eines rekonstruktiven Lipoproteins aus einem Apolipoprotein und Lipid und durch Gefriertrocknen und Stabilisieren des rekonstruktiven Lipoproteins in Gegenwart eines Stabilisators, wie z. B. Saccharose oder Mannit (Patentveröffentlichung U.S.-A-5.652.399) berichtet. Die in den Amtsblättern veröffentlichten Patente versuchen lediglich, Lipoprotein als Mittel zur Stabilisierung des Lipoproteins ohne dessen Denaturierung nach sich zu ziehen und offenbaren nicht das stabilisierte denaturierte Lipoprotein und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Es wurde ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen denaturierten Lipoproteins wie eines oxidierten Lipoproteins, acetylierten Lipoproteins oder Malondialdehyd-konjugierten Lipoproteins durch Isolierung und Reinigung von Lipoprotein nach einem bislang gut bekannten Verfahren, beispielsweise durch Ultrazentrifugieren und anschließendes Oxidieren des gereinigten Lipoproteins mit einem solchen Metallion wie einem Kupferion, dessen Acetylierung durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid oder Umsetzung mit Malondialdehyd bekannt. Die durch dieses Verfahren hergestellten denaturierten Lipoproteine sind jedoch instabiler als das nicht-denaturierte Lipoprotein und in ihrem denaturierten Zustand unfähig, eine dauerhafte Konservierung zu ermöglichen.
  • Im Hinblick auf diesen Sachverhalt offenbarte die Patent-Veröffentlichung JP-A-09-288 ein Verfahren zur Bestimmung menschlichen oxidierten Lipoproteins unter Verwendung dessen als Standard, was durch Einarbeitung in Blutplasma-Lipoprotein des Oxids eines Phospholipids, erhalten durch eine künstliche Oxidation eines Phospholipids, hergestellt wird. Die Standardsubstanz, welche bei dem zuvor beschriebenen Verfahren benutzt wird, ist jedoch hinsichtlich der Konservierungs stablität so mangelhaft, dass ihre Einzelherstellung vor jedem Gebrauch erforderlich ist und ein kompliziertes Verfahren nach sich zieht.
  • Im Hinblick auf derartige verschiedene Sachverhalte bestand ein Bedürfnis zur Entwicklung von denaturiertem Lipoprotein, das während einer langen Zeit stabil gelagert werden kann sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben. Deshalb sind Ziele vorliegender Erfindung die Bereitstellung denaturierten Lipoproteins, das sich durch Stabilität einer verlängerten Konservierung auszeichnet, nämlich das Lipoprotein bewirkt keine erkennbare Veränderung bei den Bestimmungen während der Konservierungsdauer, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben, bei dem das Lipoprotein als eine Standardsubstanz für die Bestimmung der Masse denaturierten Lipoproteins, enthalten in einer gegebenen Blutkomponente, oder als wechselndes Versuchsreagenz für die Untersuchung der physiologischen Rolle denaturierten Lipoproteins angewandt wird.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten Aspekt stellt vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung denaturierten Lipoproteins zur Verfügung, umfassend die Stufen des: Gefrierens einer Lösung mit einem Gehalt an Lipoprotein zur Herstellung einer gefrorenen Lösung, und das Schmelzen der gefrorenen Lösung zur Herstellung einer Lösung mit einem Gehalt an denaturiertem Lipoprotein.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein stabilisiertes denaturiertes Lipoprotein bereit, hergestellt nach dem Verfahren des ersten Aspekts.
  • In einem dritten Aspekt stellt vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins in einer Probe bereit, umfassend folgende Stufen: die Auswahl eines stabilisierten, denaturierten Lipoproteins gemäß dem zweiten Aspekt als Standardsubstanz; die Bildung einer Eichkurve unter Verwendung vor geschriebener Konzentrationen der Standardsubstanz; Umsetzung der Probe mit einem Antikörper, der sich mit dem denaturierten Lipoprotein verbindet; und das Messen der Reaktivität des Antikörpers mit der Probe.
  • In einem vierten Aspekt stellt vorliegende Erfindung ein Reagenz-Kit zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins zur Verfügung, das stabilisiertes denaturiertes Lipoprotein gemäß dem zweiten Aspekt als Standardsubstanz umfasst. Das Reagenz-Kit kann eine Verdünnungsflüssigkeit für eine Probe, eine feste Phase, gebildet durch Immobilisieren eines Antikörpers, einen Reaktionspuffer, eine Waschlösung, einen markieren zweiten Antikörper, ein Nachweisreagenz und das ganze stabilisierte, denaturierte Lipoprotein oder einen Teil desselben gemäß dem zweiten Aspekt als Standardsubstanz als Komponentenelemente umfassen.
  • Besondere Ausführungsformen eines jeden Aspekts vorliegender Erfindung sind in den Patentansprüchen dargelegt.
  • Vorliegende Erfinder fanden nach der Durchführung sorgfältiger Untersuchungen im Hinblick auf das Erreichen des weiter oben erwähnten Ziels, dass durch Durchführung eines Verfahrens, das mindestens ein Gefrierarbeitsgang des Gefrierens einer Lipoprotein enthaltenden Lösung, wobei das in der Lösung enthaltene Lipoprotein denaturiert wird, es ermöglicht wird, eine Standardsubstanz, die für die Bestimmung eines Gehalts an denaturiertem Protein in einer gegebenen Blutprobe vorhanden ist, oder ein wechselndes Versuchsreagenz zu erhalten, das für die Untersuchung der physiologischen Rolle oder physiologischen Aktivität des denaturierten Proteins brauchbar ist. Sie fanden ferner, dass durch Gefriertrocknen des wie zuvor beschrieben erhaltenen denaturierten Lipoproteins es möglich wird, die Stabilität einer ausgedehnten Konservierung des denaturierten Lipoproteins in trockenem Zustand und die Stabilität der Konservierung des denaturierten Lipoproteins im trockenen Zustand, nachdem es in einer Lösung aufgelöst wurde, hervorragend zu verbessern. Vorliegende Erfinder fanden weiter, dass es durch Ermöglichung der Anwesenheit von Saccharose, Lactose, Trehalose, Rinderblutserumalbumin (BSA) oder menschlichem Blutserumalbumin (HSA) usw. als Stabilisator während des Verlaufs des Gefriertrocknens es möglich wird, das denaturierte Lipoprotein hinsichtlich der Stabilität einer ausgedehnten Konservierung in stärkerem Ausmaß zu verbessern und zu einer besseren Lösung des zuvor erwähnten Problems zu gelangen.
  • Vorliegende Erfindung wurde auf Basis einer solchen Erkenntnis, wie zuvor erwähnt, abgeschlossen.
  • Das weiter oben erwähnte Ziel wird durch ein Verfahren zur Herstellung denaturierten Lipoproteins erreicht, indem man ein Verfahren durchführt, das mindestens einen Gefrierarbeitsgang mit einer Lipoprotein enthaltenden Lösung durchführt, wodurch das in der Lösung enthaltene Lipoprotein denaturiert wird.
  • Das Ziel wird ferner durch ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, denaturierten Lipoproteins erreicht, das die Durchführung eines Verfahrens, das mindestens einen Arbeitsgang des Gefrierens einer Lipoprotein enthaltenden Lösung umfasst, wodurch das in der Lösung enthaltene Lipoprotein denaturiert und denaturiertes Lipoprotein erhalten wird, und ferner ein Gefriertrocknen des denaturierten Lipoproteins umfasst, wodurch das denaturierte Lipoprotein stabilisiert wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Schaubild, das die mit dem oxidierten LDL gebildete Eichkurve zeigt, das im Vergleichsbeispiel 1 vorliegender Erfindung als Probe erhalten wurde, wobei das oxidierte LDL durch Gefriertrocknen des mit Kupfer oxidierten LDLs und anschließendem Auflösen des trockenen LDLs nach einem vorgeschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
  • 2 ist ein Schaubild, das die aus der durch Konservierung des im Vergleichsbeispiel 1 vorliegender Erfindung bei 4°C hergestellten LDLs, wobei das oxi dierte LDL durch Gefriertrocknen des mit Kupfer oxidierten LDLs („standardoxidiertes LDL") und Auflösen des LDLs bei der angegebenen Dauer nach einem vorgeschriebenen Verfahren hergestellt ist, mit den Bestimmungen bei der angegebenen Dauer vergleicht, welche aus der durch Konservierung der mit Kupfer oxidierten LDL bei 4°C hergestellten Probe erhalten wurden, ohne dass dieses gefriergetrocknet wurde („oxidiertes LDL zum Vergleich").
  • 3 ist ein Schaubild, das die Eichkurve, gebildet mit dem oxidierten HDL, das im Vergleichsbeispiel 2 vorliegender Erfindung als Probe erhalten wurde, zeigt, wobei das oxidierte HDL durch Gefriertrocknen des mit Kupfer oxidierten HDLs hergestellt ist, und das getrocknete HDL danach nach einem vorgeschriebenen Verfahren aufgelöst ist.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Bestimmungen, erhalten von der durch Konservierung im Vergleichsbeispiel 2 vorliegender Erfindung bei 4°C erhaltenen Probe, wobei die oxidierte HDL durch Gefriertrocknen der mit Kupfer oxidierten HDL („standardoxidiertes HDL") und Auflösen der HDL bei der angegebenen Dauer nach einem vorgeschriebenen Verfahren erhalten wird, mit den Bestimmungen bei der angegebenen Dauer, welche aus dem durch Konservierung der mit Kupfer oxidierten HDL bei 4°C ohne Gefriertrocknung („oxidierte HDL zum Vergleich") hergestellt wurde, verglichen wird.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Eichkurve zeigt, gebildet mit dem oxidierten Lipoprotein a [Lp(a)], erhalten im Vergleichsbeispiel 3 vorliegender Erfindung als Probe, wobei das oxidierte Lp(a) durch Gefriertrocknen der mit Kupfer oxidierten LDL und anschließendes Lösen des getrockneten Lp(a) nach einem vorgeschriebenen Verfahren gelöst wird.
  • 6 ist ein Schaubild, das die Bestimmungen, erhalten aus der durch Konservieren des oxidierten, im Vergleichsbeispiel 3 vorliegender Erfindung bei 4°C erhaltenen oxidierten Lp(a), bei dem das oxidierte Lp(a) durch Gefriertrocknen des Lp(a) mit Kupfer oxidierten Lp(a) („standardoxidiertes Lp(a)") und Auflösen des Lp (a) bei der angegebenen Dauer nach einem vorgeschriebenen Verfahren hergestellt wird, mit den Bestimmungen bei der angegebenen Dauer, welche aus der durch Konservieren des mit Kupfer oxidierten Lp(a) bei 4°C, ohne dass es gefriergetrocknet wurde („oxidiertes Lp(a) zum Vergleich") hergestellt wurde, vergleicht.
  • 7 ist ein Schaubild, das die Herstellung denaturierten Lipoproteins durch Durchführung eines Verfahrens einschließlich einer Stufe des Gefrierens von Blutplasma, wie im Beispiel 1 gezeigt, veranschaulicht.
  • 8 ist ein Diagramm zum Vergleich der Bestimmungen (dekadische Extinktion), erhalten im Vergleichsbeispiel 4 der jeweiligen Proben von gefriergetrocknetem Standard-Blutserum, hergestellt im Vergleichsbeispiel 4 (2), mit den im Vergleichsbeispiel 1 (3) hergestellten Proben von standardoxidiertem LDL, nachdem die Proben gelöst und bezüglich ihrer Stabilität der Konservierung gemäß dem ELISA-Verfahren bewertet wurden.
  • 9 ist ein Schaubild, das die Herstellung von denaturiertem Lipoprotein durch Durchführung eines Verfahrens, einschließlich einer Gefrierstufe mit menschlichem LDL im Beispiel 2 veranschaulicht.
  • 10 ist ein Schaubild zum Vergleich der Bestimmungen (dekadische Extinktion) erhalten im Beispiel 2, mit dem Beispiel 2 (2) erhaltenen jeweiligen Proben von gefrorenem denaturierten Standard-LDL mit den Proben von standardoxidiertem LDL, hergestellt im Vergleichsbeispiel 1 (3) („standardoxidiertes LDL"), nachdem die Proben gelöst und bezüglich ihrer Stabilität der Konservierung gemäß dem ELISA-Verfahren bewertet wurden.
  • Im Folgenden wird nunmehr vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Der erste Aspekt vorliegender Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung stabilisierten, denaturierten Lipoproteins, das folgende Stufen umfasst: das Gefrieren einer Lösung mit einem Gehalt an Lipoprotein zur Herstellung einer gefrorenen Lösung und das Schmelzen der gefrorenen Lösung zur Herstellung einer Lösung mit einem Gehalt an denaturiertem Lipoprotein.
  • Der Begriff „denaturiertes Lipoprotein", wie er in vorliegender Beschreibung benutzt wird, bedeutet sowohl das denaturierte Lipoprotein, das einer chemischen Veränderung unterzogen wurde, wie oxidiertes Lipoprotein, acetyliertes Lipoprotein und Malondialdehyd-konjugiertes Lipoprotein, erhalten durch Einwirkung von Malondialdehyd usw., als auch das denaturierte Lipoprotein, welches einer derartigen Strukkturveränderung wie einer Koagulation oder Veränderung der dreidimensionalen Struktur unterzogen wurde, und umfasst auch solche Arten denaturierten Lipoproteins wie sie sich durch Veränderung der elektrischen Ladung, Veränderung des Molekulargewichts, Veränderung der Affinität für einen in-vivo-Rezeptor und eine Veränderung der Fähigkeit, mit einem für denaturiertes Lipoprotein spezifischen Antikörper eine Bindung zu bilden, identifiziert wird (J. Biol. Chem. 1994, 269: 15274–15279 und Patentveröffentlichung JP-A-07-238.098), repräsentiert durch den von FOH1a/DLH3 (Depot-Nr.: FERM 6P-7171) gelieferten Antikörper, im Vergleich zu einem nicht-denaturierten Lipoprotein. Der Ausdruck „Veränderung der Fähigkeit, eine Bindung mit einem für denaturiertes Lipoprotein spezifischen Antikörper, repräsentiert durch den von FOH1a/DLH3" wie zuvor erwähnt, gelieferten Antikörper zu bilden, bezieht sich auf den Unterschied zwischen dem Ausmaß des von einem nicht-denaturierten Lipoprotein-Antigen erhaltenen Signals und dem Ausmaß eines von einem denaturierten Lipoprotein-Antigen bei einem Arbeitsgang erhaltenen Signalausmaßes, der durchgeführt wird, durch Transformierung des nicht-denaturierten Lipoproteins und des denaturierten Lipoproteins in Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung jeweils als ein Antigen in eine unsolubilisierte Festphase, Umsetzung eines relevanten Antikörpers mit dem verfestigten Antigen und Bestimmung der Menge des hierbei an das verfestigte Antigen gebundenen Anti körpers, umgerechnet in den Enzymgehalt unter Verwendung eines enzymstandardisierten Antikörpers der gegenüber dem Antikörper Spezifität besitzt.
  • Das bei vorliegender Erfindung zu verwendende Lipoprotein kann seinen Ursprung in irgend einem lebenden Organismus haben. Als konkrete Beispiele für das Lipoprotein können angegeben werden: die Lipoproteine, welche von solchen Säugetieren stammen wie Mensch, Kuh, Pferd, Ziege, Schaf, Kaninchen, Hund und Meerschweinchen; solchen Vögeln wie Huhn und Wachtel, solchen Fischen wie Lachs und Hering und solchen Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen. Ferner können als konkrete Beispiele für das bei vorliegender Erfindung zu verwendende Lipoprotein genannt werden: Strukturelle Lipoproteine, welche in solchen Biomembranen wie der Zellmembran, einer mitochondrialen Zelle, einer Membran myelinischer Struktur und bakteriellen Zellmembran; lösliche Lipoproteine, welche im Blutplasma, Eigelb und Milch auftreten; und solche Lipoproteinfraktionen, welche durch Fraktionieren dieser zuvor genannten Lipoproteine durch das Ultrazentrifugenverfahren bis zum Chylomikron erhalten werden, wie z. B. Lipoprotein sehr geringer Dichte (VLDL), Lipoprotein niederer Dichte (LDL), Lipoprotein X, Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL), Lipoprotein a [Lp(a)], Lipoproteine hoher Dichte (HDL) wie HDL2 und HDL3 sowie Lipoprotein sehr hoher Dichte (VHDL). Diese Lipoproteine können entweder allein oder in Form einer Kombination von zwei oder mehreren erhalten werden. Von diesen Lipoproteinen werden diejenigen menschlichen Ursprungs bevorzugt verwendet, bevorzugter Chylomikron, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 oder HDL3, welche vom menschlichen Blutplasma und Blutserum stammen und deren Gemische, und LDLs, die vom menschlichen Blutplasma und Blutserum stammen, werden am meisten bevorzugt, benutzt.
  • Das menschliche Lipoprotein, das bei vorliegender Erfindung typischerweise verwendet wird, wird durch Trennen einer Fraktion mit einem vorgeschriebenen spezifischen Gewicht aus menschlichem Blutserum durch ein solches allgemein bekanntes Verfahren wie ein zentrifugales Absetzen oder ein Ultrazentrifugieren und Reinigen dieser Fraktion durch ein bislang bekanntes Verfahren wie Dialyse oder Entsalzung hergestellt. Als konkrete Beispiele für das Verfahren zur Gewinnung von Lipoprotein niederer Dichte (LDL) können folgende Verfahren (1) bis (3) angegeben werden:
    • (1) 20–30 ml normales menschliches Blutserum wird mit Ethylendiamin-Natriumtetraacetat (EDTA-2Na) bis zu einer Endkonzentration von 1 mMol/Liter versetzt. Das erhaltene Gemisch wird zur Einstellung auf ein spezifisches Gewicht von 1,000 mit NaBr versetzt. Das hergestellte Gemisch wird in Zentrifugenrohre abgefüllt, wodurch die Portionen des Gemischs in den jeweiligen Rohren erhalten werden. Pufferlösungen werden mit NaBr auf verschiedene Niveaus eines spezifischen Gewichts von 1,15, 1,063, 1,019 und 1,006 eingestellt und jeweils auf die Portionen des Gemischs nacheinander geschichtet. Sodann werden die Rohre, welche die Gemische und die Puffer enthielten, zusammen bei 4°C 24 Stunden zentrifugiert (120.000 × g). Die hierbei gebildeten Fraktionen wurden nacheinander von der oberen zur unteren getrennt und mit einem Refraktometer auf ihr spezifisches Gewicht gemessen, um Fraktionen mit einem spezifischen Gewicht im Bereich von 1,019 bis 1,063 als LDL-Fraktionen zu sammeln. Die LDL-Fraktionen, welche wie zuvor beschrieben erhalten wurden, werden unmittelbar nach ihrem Sammeln mit PBS [Phosphatpuffer aus 10 mMol/Liter und NaCl (pH-Wert 7,4) von 140 mMol/Liter] einschließlich 0,25 mMol/Liter EDTA (Patentveröffentlichung JP-A-07-238.098, § Nr. 0040) dialysiert.
    • (2) Zum heparinisierten menschlichem Blutplasma wird EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mMol/Liter zugegeben. Das so hergestellte Blutplasma wird in einer Volumeneinheit von 0,75 ml in Zentrifugierungsrohre (1–4 ml) abgefüllt. Die Portionen des Blutplasmas in den jeweiligen Rohren und 0,15 ml/Liter NaCl, 250 μl mit einem Gehalt an 0,3 mMol/Liter EDTA wurden in einer Volumeneinheit von 250 μl, aufgebracht auf die Portionen, zusammen bei 185.000 × g und 10°C während 2,5 Stunden zentrifugiert. 150 μl der oberen Schicht werden verworfen. 750 ml der unteren Schicht werden entnommen und danach mit 150 ml KBr-Lösung (50 Gew./Vol.-%) bis zu einem spezifischen Gewicht von 1,063 versetzt. Die Blut plasmagroben mit dem eingestellten spezifischen Gewicht werden auf die Böden der Zentrifugierröhren (1–4 ml) bewegt und bei 244.000 × g und 10°C 16 Stunden zentrifugiert. Das orangefarbene Band in der oberen Schicht (etwa 100–150 μl) wird sorgfältig gesammelt und gegen PBS mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA bei 4°C 6 Stunden dialysiert (3 Liter PBS wurden in zweistündigem Abstand zweimal ersetzt) (Patentveröffentlichung JP-A-08-304.395, § Nr. 0050); oder
    • (3) aus dem mit EDTA als Antikoagulationsmittel erhaltenem menschlichem Blutplasma während der Teil mit einem spezifischen Gewicht von 1,019–1,063 nach einem Zentrifugierungsverfahren als LDL-Fraktion gesammelt wird. Die LDL-Fraktion wird, nachdem ihre Reinheit durch die Bildung einer einzigen scharfen Bande bei der Analyse durch Agarose-Elektrophorese bestätigt war sorgfältig gegen eine PBS-Lösung (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA sorgfältig dialysiert (Patentveröffentlichung JP-A-09-288.106, § Nr. 0062).
  • Sodann kann als ein konkretes Beispiel für das Verfahren zur Gewinnung von Lipoprotein a [Lp(a)] beispielsweise folgendes Verfahren angegeben werden: zu dem heparinisierten menschlichen Blutplasma wird EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mMol/Liter zugegeben. Die derart erhaltene Blutplasmaprobe und 250 μl 0,15 mMol/Liter NaCl mit einem Gehalt an 0,3 mMol/Liter EDTA, aufgebracht auf die Probe wurden zusammen bei 105.000 × g und 8°C 20 Stunden zentrifugiert. Die obere Schicht wurde verworfen. In der unteren Schicht wird in einem Mörser pulverisiertes KBr vorab bis zu einem spezifischen Endgewicht von 1,125 gelöst, wobei die Bildung von Blasen vermieden wird. Die erhaltene Lösung wird bei 105.000 × g bei 8°C 20 Stunden zentrifugiert. Das Orangefarbene in der oberen Schicht wird sorgfältig gesammelt und sodann einer Gelfiltration mit Biogel a-5m (Bio-rad Corp.) mit 1 Mol/Liter NaCl, 2 mMol/Liter EDTA und 10 mMol/Liter Phosphatpuffer als Entwicklungslösungsmittel unterzogen. Die hierbei erhaltenen Fraktionen werden mit einem Lp(a)-Messkit (hergestellt von Thermo K.K.) getestet, um die Lp(a-Fraktion) zu sammeln. Diese Fraktion wird mit Lysinsepharose 4B (Farmacia Corp.) behandelt. Die hieran adsorbierte Fraktion wird mit einem Puffer, der 0,2 Mol/Liter ε-Aminocapronsäure enthält, eluiert und gegen PBS mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA dialysiert (Patentveröffentlichung JP-A-08-304.395, § Nr. 0052).
  • Als bekannte konkretes Beispiele für das Verfahren der Denaturierung menschlichen Lipoproteins, das nicht in den Umfang vorliegender Erfindung fällt, können beispielsweise angegeben werden: ein Verfahren, das in der Oxidierung des menschlichen Lipoproteins in Gegenwart eines Metallions besteht, ein Verfahren, das im Acetylieren des menschlichen Lipoproteins besteht, ein Verfahren, das in einer Einarbeitung eines Aldehyds in das menschliche Lipoprotein unter Verwendung von Malondialdehyd besteht, und ein Verfahren, das in der Zugabe einer Lösung, in der eine Verbindung gelöst ist, erhalten durch künstliche Oxidation eines solchen Lipoproteins wie 1-Palmitoyl-2-(9-oxononanoyl)-glycerin-3-phosphocholin und 1-Palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-glycerin-3-phosphocholin in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMSO zu dem menschlichen Lipoprotein besteht, genannt werden. Bei den zuvor aufgezählten Verfahren werden das Verfahren, welches in der Oxidation menschlichen Lipoproteins in Gegenwart eines Metallions besteht, das Verfahren, welches im Acetylieren des menschlichen Lipoproteins besteht, sowie das Verfahren günstig angewandt, welches unter Verwendung von Malondialdehyd ein Aldehyd in das menschliche Lipoprotein eingearbeitet wird. Im Folgenden werden nun die drei zuvor erwähnten bevorzugten Verfahren in größeren Einzelheiten beschrieben.
  • Zuerst wird die Art und Weise der Oxidation des menschlichen Lipoproteins in Gegenwart eines Metallions nachfolgend im Detail beschrieben. Ein Beispiel für die zuvor erwähnte Art wird weiter unten beschrieben: Das menschliche Lipoprotein (Fraktion), das wie zuvor beschrieben hergestellt wurde, wird durch Dialyse gegen einen Puffer, der kein EDTA enthält [z. B. PBS (pH-Wert 7,4)] von EDTA befreit und auf einen vorgeschriebenen Proteingehalt (50–2.000 μg/ml, vorzugsweise 100–500 μg/ml) eingestellt. Es wird Kupfersulfat (CuSO4) bis zu einer vorgeschriebenen Konzentration zugegeben und sodann damit bei einer Temperatur im Näherungsbereich von 36°–38°C umsetzen gelassen.
  • Als konkrete Beispiele für das zu verwendende Metallion in der zuvor erwähnten Art können angegeben werden: Kupferionen, die von Kupfer(II)fluoriddihydrat, Kupfer(II)bromid, Kupfer(II)oxid, Kupfer(II)hydroxid, Kupfer(II)sulfat, Kupfer(II)sulfatpentahydrat, Kupfer(I)selenid, Kupfer(II)selenid, Kupfer(II)selenidpentahydrat, Kupfer(II)hexafluorsilicattetrahydrat, Kupfer(II)acetatmonohydrat, Kupfer(II)tetraaminsulfatmonohydrat und Kupfer(II)bis(ethylendiamin)sulfatdihydrat; Eisenionen, die von Eisen(II)chlorid, Eisen(II)bromidhexahydrat, Eisen(II)nitrathexahydrat, Eisen(II)thiocyanattrihydrat, Eisen(II)acetattetrahydrat, Eisen(III)oxalatpentahydrat, Eisen(II)ammoniumsulfathexahydrat, Eisen(III)kaliumsulfatdodecahydrat, Eisen(II)ammoniumsulfatdodecathydrat und Eisensulfat abstammen sowie Metallionen von Hämoglobin (Hb), Transferin (Tf) und Laktoferin (Lf) sowie deren Gemische genannt werden. Unter anderen zuvor erwähnten Metallionen, die aufgezählt wurden, werden vorzugsweise die Kupferionen, welche von Kupfer(II)sulfat und Kupfer(II)sulfatpentahydrat stammen und deren Gemische benutzt. Diese Metallionen können entweder allein oder in Form einer Kombination von zwei oder mehreren Verbindungen verwendet werden. Die Menge des bei der zuvor beschriebenen Art und Weise zu verwendenden Metallions braucht nicht besonders unterschieden werden; es ist lediglich erforderlich, dass sie eine sorgfältige Oxidation des menschlichen Lipoproteins erlaubt. Sie kann derart sein, dass die Konzentration des Metallions im Bereich von 10–200 μMol/Liter, vorzugsweise im Bereich von 25–100 μMol/Liter, bezogen auf 1 g des zu oxidierenden menschlichen Lipoproteins liegt.
  • Bei der zuvor beschriebenen Art und Weise führt, wenn die Reaktionszeit übermäßig kurz ist, eine kürzere Reaktionszeit zu dem Nachteil, dass verhindert wird, dass die Denaturierung (Oxidation des Lipoproteins) ausreichend bewirkt wird. Umgekehrt führt, wenn die Reaktionszeit übermäßig lang ist, dies zu dem Nachteil, dass das Lipoprotein selbst sich übermäßig zersetzt und z. B. nicht zum Verlust der antigenen Eigenschaft des Apoproteins führt. Obgleich die Reaktionszeit nicht allgemein definiert werden kann, weil sie je nach Menge des restlichen EDTA und der Gesamtmenge der Lösung schwankt, liegt sie im Falle des nach der zuvor beschriebenen Art der Herstellung des Lipoproteins (Fraktion) im Bereich von 1–24 Stunden, vorzugsweise 2–4 Stunden, bei Temperaturen von etwa 36°–38°C. Zweitens wird die Art und Weise einer Acetylierung des menschlichen Lipoproteins nachfolgend im Detail beschrieben. Ein Beispiel für diese Art wird nachfolgend beschrieben: Die Lösung des menschlichen Lipoproteins (Fraktion), hergestellt in einer vorgeschriebenen Proteinkonzentration (etwa 500–2.000 μg/ml, vorzugsweise 500–1.000 μg/ml) wie zuvor beschrieben und hinzugefügtes gesättigtes Natriumacetat usw. in einem Volumen, das dieser gleich ist, werden zusammen bei 0°–4°C 1–2 Stunden gerührt. Das erhaltene Gemisch und hinzugegebenes Essigsäureanhydrid in einem Volumen im Bereich von 0,25–4 μl (nämlich 0,5–2 μl/mg, bezogen auf die Menge des menschlichen Lipoproteins), vorzugsweise im Bereich von 0,4–2,4 μl (nämlich 0,8–1,2 μl/mg, bezogen auf die Menge des menschlichen Lipoproteins) werden zusammen bei 0°–4°C 60–120 Minuten gerührt. Das erhaltene Gemisch wird sodann sorgfältig gegen PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA mit einem Volumen, welches das 500–1.000-fache des Volumens des hergestellten Gemischs beträgt, bei 2°–8°C zwei- oder dreimal während nicht weniger als jeweils 2 Stunden dialysiert.
  • Drittens wird nachfolgend die Art und Weise der Einarbeitung eines Aldehyds in das menschliche Lipoprotein unter Verwendung von Malondialdehyd im Detail beschrieben. Ein Beispiel für die zuvor erwähnte Art wird nachfolgend beschrieben: Die Lösung des menschlichen, wie zuvor beschrieben hergestellten Lipoproteins (Fraktion) in einer vorgeschriebenen Proteinkonzentration (etwa 0,25–1 mg/ml, vorzugsweise 0,25–0,5 mg/ml) in einem 0,1 Mol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) und eine Malondialdehydlösung (erhalten durch thermische Hydrolysierung von 1 Mol/Liter Malondialdehyd bis Dimethylacetal bei 100°C während 5 Minuten in Anwesenheit von 0,1 Mol/Liter Salzsäure), zugegeben in einem Volumen im Bereich von 0,625–10 μl (nämlich 2,5–10 μl/mg, bezogen auf die Menge des menschlichen Lipoproteins), vorzugsweise im Bereich von 1–6 μl (nämlich 4–6 μl/mg, bezogen auf die Menge des menschlichen Lipoproteins) werden bei 30°–40°C 2–4 Stunden miteinander umsetzen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wird sorgfältig gegen PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA mit einem 500–1.000-fach so großen Volumen wie dasjenige des hergestellten Gemischs bei 2°–8°C zwei- bis dreimal während nicht weniger als jeweils 2 Stunden dialysiert.
  • Das durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogene Verfahren kann ferner eine Stufe zum Gefriertrocknen des wie zuvor beschrieben erhaltenen denaturierten Lipoproteins zwecks Stabilisierung des Produkts umfassen. In vorliegender Beschreibung wird der Begriff „Gefriertrocknen" in der Bedeutung verwendet, wie sie auf dem einschlägigen Gebiet benutzt wird. Im Speziellen bedeutet er, eine gegebene Probe zu gefrieren, die in gefrorenem Zustand gehaltene Probe zu dekomprimieren und sie bis zu ihrer Trocknung von Wasser und einer sublimierenden Komponente zu befreien. Die Bedingungen für das Gefriertrocknen bei vorliegender Erfindung braucht nicht besonders unterschieden werden; es ist lediglich erforderlich, dass sie in der Lage sind, das denaturierte Lipoprotein zu stabilisieren. Das Gefriertrocknen wird in der Regel bei einer Temperatur im Bereich von –80°–20°C, vorzugsweise im Bereich von –80°–15°C, unter einem Druck im Bereich von 0,667–13,33 Pa, vorzugsweise im Bereich von 0,667–1,333 Pa während eines Zeitraums im Bereich von 12–72 Stunden, vorzugsweise im Bereich von 24–72 Stunden, erreicht. Durch diese Stufe des Gefriertrocknens wird der Wassergehalt im gefriergetrockneten Produkt, der im denaturierten Lipoprotein enthalten ist, in der Regel auf nicht mehr als 10 Massen-%, vorzugsweise nicht mehr als 1 Massen-%, herabgesetzt.
  • Bei vorliegender Erfindung wird bevorzugt, dass die Stufe des Gefriertrocknens in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels verläuft. Das bei der zuvor beschriebenen Ausführungsart zu verwendende Stabilisierungsmittel ist das gleiche Stabilisierungsmittel, wie ein solches, das allgemein auf dem einschlägigen Gebiet benutzt wird. Als konkrete Beispiele für das Stabilisierungsmittel können Saccharide wie Saccharose, Lactose und Trehalose sowie Proteine wie Rinderblut-Serumalbumin (BSA) und Menschenblut-Serumalbumin (HSA) genannt werden. Unter diesen Substanzen werden Saccharose, Lactose, Trehalose, Rinderblut-Serumalbumin (BSA) und Menschenblut-Serumalbumin (HSA) vorzugsweise als Stabilisierungsmittel verwendet. Übrigens können die zuvor aufgezählten Stabilisierungsmittel entweder allein oder in Form eines Gemischs von zwei oder mehreren Verbindungen benutzt werden. Obgleich die zu verwendende Menge des Stabilisierungsmittels nicht besonders beschränkt werden braucht, ist es jedoch erforderlich, dass es der Stabilisierung des denaturierten Lipoproteins fähig ist; in der Regel liegt sie im Bereich von 1–20 Massen-%, vorzugsweise 2–5 Massen-%.
  • Bei vorliegender Erfindung braucht die zeitliche Abstimmung der Zugabe eines Stabilisierungsmittels während des Verlauf des Gefriertrocknens, das erwartungsgemäß in Anwesenheit des Stabilisierungsmittels abläuft, nicht besonders beschränkt werden. Die Zugabe des Stabilisierungsmittels geht vorzugsweise der Stufe des Gefriertrocknens voraus, und erfolgt besonders bevorzugt zwischen der Stufe des Denaturierens und der Stufe des Gefriertrocknens. Ferner braucht die Stufe des Gefriertrocknens nicht besonders durch irgendeine Stufe zur Befreiung des gefrorenen Lipoproteins vom Stabilisierungsmittel gefolgt sein. In Anbetracht der Stabilität der Konservierung des denaturierten Lipoproteins erwies sich die fortgesetzte Anwesenheit des Stabilisierungsmittels während der Beibehaltung des gefriergetrockneten Zustands bevorzugter als wenn dies nicht der Fall ist.
  • Vorliegende Erfindung fand heraus, dass das denaturierte Lipoprotein, erhalten durch Unterwerfen der Lösung mit einem Gehalt an Lipoprotein einem Verfahren, das mindestens einen Arbeitsgang des Gefrierens umfasst, wodurch das in der Lösung enthaltene Lipoprotein auch als Standardsubstanz zur Bestimmung der Masse denaturierten Lipoproteins im Blut und als Reagenz zur Erforschung der physiologischen Rolle und physiologischen Aktivität des denaturierten Lipoproteins brauchbar ist, und dass, wenn das wie zuvor beschriebene denaturierte Lipoprotein ferner gefriergetrocknet wird, sich das denaturierte Lipoprotein durch Stabilität einer ausgedehnten Konservierung im getrockneten Zustand auszeichnet, und das denaturierte Lipoprotein im getrockneten Zustand, wenn es in einer Lösung gelöst ist, sich einer Stabilität der Konservierung erfreut. Auf Grundlage dieser Erkenntnis wurden die Verfahren des zuvor erwähnten Aspekts begriffen.
  • Das Verfahren des ersten Aspekts vorliegender Erfindung erfordert im wesentlichen die Einbeziehung der Stufe des Gefrierens der Lipoprotein enthaltenden Lösung. Als konkrete Beispiele für die Lipoprotein enthaltende Lösung können genannt werden: Blutserum, Blutplasma und Chylomikronen sowie solche Lipoproteinfraktionen wie Lipoprotein sehr niederer Dichte (VLDL), Lipoprotein niederer Dichte (LDL), Lipoprotein X, Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL), Lipoprotein a [Lp(a)], Lipoprotein hoher Dichte (HDL) wie HDL2 und HDL3 und Lipoprotein sehr hoher Dichte (VHDL). Als Lipoprotein enthaltende Lösungen werden am bevorzugtesten unter den zuvor aufgezählten Lösungen Blutserum, Blutplasma, Chylomikronen, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2, HDL3 und deren Gemische vorzugsweise verwendet; und menschliches Blutplasma, menschliches Blutserum und LSLs, das von menschlichem Blutplasma und menschlichem Blutserum abstammt, werden am meisten bevorzugt als Lipoprotein enthaltende Lösungen benutzt.
  • Das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt vorliegender Erfindung erfordert im wesentlichen die Lipoprotein enthaltende Lösung einem Verfahren zu unterziehen, das eine Gefrierstufe umfasst. In vorliegender Beschreibung bedeutet der Begriff „zumindest einen Arbeitsgang des Gefrierens umfassend" ein Verfahren, welches mindestens eine Stufe des Gefrierens eines Teils oder der ganzen Wasserkomponente im in der Lösung enthaltenden Lipoproteins oder in der Umgebung, welche im wesentlichen das Lipoprotein umgibt. Das denaturierte Lipoprotein, welches bei Durchführung des die Gefrierstufe umfassenden Verfahrens, wie es durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogen wird, kann irgendeines der zuvor aufgezählten denaturierten Lipoproteine sein. Das denaturierte Lipoprotein, welches durch Durchführung des die Gefrierstufe umfassenden Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung erhalten wird, kann oxidiertes Lipoprotein, durch Einarbeitung eines Aldehyds erhaltenes Lipoprotein oder ein Lipoprotein sein, welches sich mit dem durch eine Hybridoma-Zeillinie FOH1a/DLH3 (Depot Nr.: FERM 6P-7171) (gelegentlich einfach als „DLH3-Antikörper" bezeichnet), umsetzt. Die Hybridoma-Zelllinie FOH1a/DLH3, welche bei dem zuvor beschriebenen Verfahren benutzt wird, wurde am 17.02.1994 unter der Depot-Nr. FERM P-14153 im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry, Anschrift: 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter der Bezeichnung „Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3" hinterlegt, welches Depot am 26.05.2000 auf die Hinterlegung auf Basis des Budapester Vertrags umgestellt und bei dem Institut unter der Depot-Nr. FERM 6P-7171 gelagert wurde.
  • Die Bedingungen für das die Gefrierstufe umfassende Verfahren, das mit der Lipoprotein enthaltenden Lösung im Hinblick auf eine Denaturierung des Lipoproteins bei vorliegender Erfindung durchgeführt wird, braucht nicht besonders beschränkt werden; es ist lediglich erforderlich, dass sie in der Lage sind, das in der Lösung enthaltene Lipoprotein zu denaturieren. Ferner kann das die Gefrierstufe umfassende Verfahren nicht allgemein beschränkt werden, weil die Wirkung des Gefrierens durch die Umgebung, welche im wesentlichen das Lipoprotein während des Verlauf des Gefrierens umgibt, stark schwankt. Die Bedingungen für das Gefrieren beim die Gefrierstufe umfassenden Verfahren erlauben beispielsweise erwartungsgemäß ein Verfahren, das eine Temperaturherabsetzung bei einer Temperaturabsenkungs-Geschwindigkeit im Bereich von 0,01°–10°C/Min., vorzugsweise eine solche, die im Bereich von 0,01°–1°C/Min. liegt, bis sie ein Niveau im Bereich von 0° bis –196°C, vorzugsweise im Bereich von –5° bis –85°C, erreicht und gefriert, wonach eine vorgeschriebene Temperatur während eines Zeitraums im Bereich von 0–36 Stunden, vorzugsweise im Bereich von 0–16 Stunden, beibehalten wird. In einer Ausführungsform ist es erforderlich dass das die Gefrierstufe umfassende Verfahren zwecks Denaturierung von Lipoprotein zumindest einmal durchgeführt wird und erforderlichenfalls wiederholt werden kann. Wenn das die Gefrierstufe umfassende Verfahren wiederholt wird, liegt die Anzahl von Wiederholungen zweckmäßigerweise im Bereich von 1–10, vorzugsweise im Bereich von 1–4. Bei vorliegender Erfindung können die Gehalte der sich wiederholenden Verfahren die gleich oder bei jeder Gefrierstufe verschieden sein. Die Bedingungen für die Gefrierstufe bei jedem der Verfahren können gleich oder verschieden sein. Wenn die Anzahl von Wiederholungen der Gefriertrocknungsstufe 10 überschreitet, führt der Überschuss zu einem wirtschaftlichen Nachteil, indem eine Schwächung der Denaturierungswirkung des Lipoproteins bewirkt wird.
  • Das die Gefrierstufe umfassende Verfahren, welches darauf abzielt, das Lipoprotein zu denaturieren, bezieht in den ersten Aspekt der zuvor beschriebenen Erfindung eine Stufe zum Schmelzen nach der ersten Gefrierstufe ein. Die Bedingungen für das Gefrieren brauchen nicht besonders beschränkt werden. Das Schmelzen wird durch Erhöhung der Temperatur bei einer Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit im Bereich von 0,01°–10°C/Min., vorzugsweise im Bereich von 0,1°–10°C/Min. erreicht, bis sie ein Niveau im Bereich von 0°–42°C, vorzugsweise im Bereich von 0°–37°C erreicht. Das die Gefrierstufe umfassende Verfahren zwecks Denaturierung von Lipoprotein gemäß dem ersten Aspekt der zuvor beschriebenen Erfindung kann eine solche Verfahrensart sein, die eine Stufe des Trocknens im Verlauf des Verfahrens umfasst. Die Bedingungen für das Verfahren einschließlich der Stufe des Trocknens nach der Gefrierstufe braucht nicht besonders beschränkt werden. Das Trocknen wird beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von –80°–20°C, vorzugsweise im Bereich von –80°–15°C, unter einem Druck im Bereich von 0,6–13 Pa, vorzugsweise im Bereich von 0,6–1,3 Pa, während eines Zeitraums im Bereich von 12–72 Stunden, vorzugsweise im Bereich von 24–72 Stunden, durchgeführt.
  • Ein Verfahren, das die Gefrierstufe zwecks Denaturierung von Lipoprotein umfasst, kann von einer solchen Verfahrensart sein, die ein Gefriertrocknen einer Lösung mit einem Gehalt an dem Lipoprotein, das Auflösen der erhaltenen getrockneten Lösung in einem Lösungsmittel und das anschließende abermalige Gefriertrocknen der hergestellten Lösung umfasst. Ein derartiges Verfahren ist nicht in den Umfang vorliegender Erfindung einbezogen. Die Stufe des Gefriertrocknens, die in diesen Fall einbezogen ist, hat die gleiche Definition wie weiter oben definiert. Das Lösungsmittel zum Auflösen des in der ersten Gefriertrocknungsstufe erhaltenen Produkts braucht nicht besonders beschränkt werden; es ist lediglich erforderlich, dass es der Auflösung des getrockneten Produkts fähig ist. Als konkrete Beispiele für das Lösungsmittel können Wasser, entionisiertes Wasser und destilliertes Wasser genannt werden.
  • Das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt vorliegender Erfindung kann ferner ein Gefriertrocknen der nach dem weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren des ersten Aspekts erhaltenen denaturierten Lipoproteins und eine kontinuierliche Stabilisierung des denaturierten Lipoproteins umfassen. Die Stufe der Gefriertrocknung gemäß dem ersten zuvor beschriebenen Aspekt hat die gleiche Definition wie im ersten Aspekt mit der Ausnahme der zeitlichen Abstimmung der Zugabe des Stabilisierungsmittels. Um genauer zu sein: Das Stabilisierungsmittel schwankt in seiner Art je nach den Gehalten des Verfahrens, einschließlich der Gefrierstufe im ersten Aspekt. Wenn das die Gefrierstufe umfassende Verfahren mit der Lösung durchgeführt wird, welche z.B. denaturiertes Lipoprotein enthält, kann die Zugabe des Stabilisierungsmittels dem die Gefrierstufe umfassenden Verfahren vorausgehen oder zwischen der Gefrierstufe, die zum Denaturieren des Lipoproteins beabsichtigt ist, und der Stufe des Gefriertrocknens, welche zur Stabilisierung des denaturierten Lipoproteins beabsichtigt ist, vorausgehen kann. Wenn die das denaturierte Lipoprotein enthaltende Lösung zu gefrieren ist, wird bevorzugt, dass das Stabilisierungsmittel vor dem die Gefrierstufe umfassenden Verfahren zugegeben wird.
  • Der zweite Aspekt vorliegender Erfindung besteht in der Bereitstellung eines stabilisierten denaturierten Lipoproteins, das nach dem ersten zuvor beschriebenen Aspekt der Erfindung hergestellt ist.
  • Das denaturierte Lipoprotein und das stabilisierte denaturierte Lipoprotein, welche auf diese Weise hergestellt sind, zeichnen sich durch ihre Stabilität einer verlängerten Konservierung aus und erweisen sich deshalb als eine Standardsubstanz brauchbar, die bei einem Bestimmungsverfahren von denaturiertem Lipoprotein, das in einer Blutkomponente enthalten ist, verwendet wird, indem man eine gegebene Probe mit einem Antikörper in Berührung bringt, der fähig ist, denaturiertes Lipoprotein zu erkennen, und die Reaktivität des Antikörpers mit der Probe misst, oder als ein variierendes experimentelles Reagenz für die Untersuchung der physiologischen Rolle oder physiologischen Aktivität denaturierten Lipoproteins.
  • Der dritte Aspekt vorliegender Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins in einer Probe zur Verfügung, das folgende Stufen umfasst: Auswahl eines stabilisierten, denaturierten Lipoproteins gemäß dem zweiten Aspekt als Standardsubstanz; Bildung einer Eichkurve unter Verwendung vorgeschriebener Konzentrationen der Standardsubstanz; Umsetzung der Probe mit einem Antikörper, der sich an das denaturierte Lipoprotein bindet und Messung der Reaktivität des Antikörpers mit der Probe.
  • Der vierte Aspekt vorliegender Erfindung umfasst die Bereitstellung eines Reagenz-Kits zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins, umfassend ein stabilisiertes, denaturiertes Lipoprotein gemäß dem zweiten, zuvor beschriebenen Aspekt als Standardsubstanz.
  • Das Verfahren zur Bestimmung des denaturierten Lipoproteins im dritten, zuvor beschriebenen Aspekt kann unter den Verfahren ausgewählt werden, welche bislang als brauchbar für diesen Zweck bekannt wurden. Als konkrete Beispiele für das Verfahren können folgende Verfahren genannt werden: Radioimmunassay (RIA), Enzymimmunoassay (ELISA), Fluorimmunoassay (FIA), Luminescenzimmunoassay, Agglutinationsimmunoassay, Immunonephelometrie und nephelometrischer Immunoassay, welche immunologische Bestimmungen denaturierten Lipoproteins sind, die in einer Blutkomponente enthalten sind, indem man das Lipoprotein in einer gegebenen Probe mit einem Antikörper in Berührung bringt, der fähig ist, das denaturierte Lipoprotein zu erkennen, und die Reaktivität des Antikörpers mit der Probe misst. Als Messmethode können ein kompetitiver Test und ein Sandwich-Verfahren genannt werden. Unter den weiter oben aufgezählten Verfahren erlauben eine Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay, Fluorescenzimmonuassay und Luminescenzimmunoassay, welche eine immunologische Bestimmung bewirken, eine besonders günstige Anwendung des stabilisierten, denaturierten Lipoproteins gemäß vorliegender Erfindung als Standardsubstanz.
  • Im zuvor erwähnten vierten Aspekt vorliegender Erfindung braucht das Reagenz-Kit zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins nicht besonders beschränkt werden; es ist lediglich erforderlich, dass es stabilisiertes, denaturiertes Lipoprotein gemäß vorliegender Erfindung als Standardsubstanz enthält. Dieses Reagenz-Kit hat die gleiche Struktur wie das bekannte Kit, mit der Ausnahme, dass es stabilisiertes, denaturiertes Lipoprotein gemäß vorliegender Erfindung als Standardsubstanz enthält. Wenn das stabilisierte, denaturierte Lipoprotein, das durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogen wird, als Standardsubstanz beispielsweise bei dem ELISA-Verfahren benutzt wird, umfasst dieses Reagenz-Kit zum Beispiel eine verdünnende Flüssigkeit für eine Probe, eine Festphase, gebildet durch Immobilisieren eines Antikörpers, einen Reaktionspuffer, eine Waschlösung, einen markierten zweiten Antikörper (vorzugsweise einen mit einem Enzym markierten zweiten Antikörper), ein Nachweis-Reagenz (beispielsweise ein färbendes Fluid) und das ganze stabilisierte, denaturierte Lipoprotein gemäß der Erfindung oder ein Teil desselben als Standardsubstanz. Die Art der gerade beschriebenen Ausführungsform ist auch vom Konzept vorliegender Erfindung umfasst.
  • Der vierte Aspekt vorliegender Erfindung stellt somit auch ein Reagenz-Kit zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins zur Verfügung, welches eine Verdünnungsflüssigkeit für eine Probe, eine Festphase, gebildet durch Immobilisierung eines Antikörpers, einen Reaktionspuffer, eine Waschlösung, einen markierten zweiten Antikörper, ein Nachweis-Reagenz und das gesamte stabilisierte denaturierte Lipoprotein gemäß dem zweiten Aspekt oder einen Teil desselben, hergestellt als Standardsubstanz, als Komponentenelemente umfasst.
  • Im zuvor beschriebenen vierten Aspekt vorliegender Erfindung sollte die erfindungsgemäße Standardsubstanz, wenn sie im Reagenz-Kit nicht enthalten ist, sondern noch unter der Voraussetzung zurückgehalten wird, dass sie im wesentlichen in einem Kit verwendet wird, die Standardsubstanz gemäß vorliegender Erfindung als Komponentenelement für das Reagenz-Kit anerkannt wird.
  • Im Folgenden werden das Verfahren zur Herstellung des denaturierten Lipoproteins gemäß vorliegender Erfindung und seine Wirkung nachfolgend genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Ausführungsbeispiele, welche von dem ELISA-Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit des denaturierten Lipoproteins Gebrauch machen, genauer beschrieben. Selbstverständlich braucht vorliegende Erfindung nicht auf nachfolgende Ausführungsbeispiele begrenzt werden.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • (1) Herstellung von LDL
  • Von menschlichem Blutplasma, erhalten unter Verwendung von EDTA als Antikoagulanz wurde ein Teil mit einem spezifischen Gewicht im Bereich von 1,019–1,063 als LDL-Fraktion durch Ultrazentrifugation gesammelt (durch Einstellen einer gegebenen Probe auf ein spezifisches Gewicht von 1,019 bei 10°C, Zentrifugieren der Probe bei 120.000 × g während 20 Stunden, Sammeln des so gebildeten Überstands, Einstellen des Überstands auf ein spezifisches Gewicht von 1,063 und weiteres Zentrifugieren desselben bei 120.000 × g während 24 Stunden) gesammelt. In diesem Fall wurde die Reinheit des LDL durch die Tatsache bestätigt, dass die Probe eine einzige scharfe Bande bildete, wenn sie durch Agarose-Elektrophorese getestet wurde.
  • Sodann wurde diese LDL-Fraktion durch sorgfältige 16-stündige Dialyse über Nacht gegen PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA gereinigt. Das wie zuvor beschrieben gereinigte LDL wurde in PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA gereinigt, bis die LDL-Proteinkonzentration 1 mg/ml erreichte, und im gelösten Zustand bei 4°C konserviert, bis es in Gebrauch genommen wurde. Im vorliegenden Beispiel wurde die Proteinmasse nach dem modifizierten Lowry-Verfahren bestimmt. Um genauer zu sein: Diese Bestimmung wurde bewirkt, indem man ein Reagenz durch Vermischen einer Lösung mit einem Gehalt an 2% (Gewicht/Volumen) Natriumcarbonat, 0,4% (Gewicht/Volumen) Natriumhydroxid, 0,16% (Gewicht/Volumen) Weinsäure, 1% (Gewicht/Volumen) SDS und eine Lösung mit einem Gehalt an 4% (Gewicht/Volumen) Kupfersulfat in einem Verhältnis von 100:1 herstellte, dieses Reagenz mit jeweils 1,5 ml gegebener Proben oder einer Standardsubstanz (BSA) mit einem Volumen von 0,5 ml vermischte, die jeweiligen Komponenten bei Raumtemperatur 20 Minuten umsetzen ließ, die erhaltene Reaktionslösung unmittelbar mit 0,15 ml Phenolreagenz vermischte und diese bei Raumtemperatur 45 Minuten umsetzen ließ und das Reaktionsprodukt auf sein Absorptionsvermögen bei 660 nm maß.
  • (2) Oxidation von LDL
  • Das in (1) hergestellte LDL wurde von EDTA befreit, indem man nicht weniger als das dreifache (für nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000-fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4), das kein EDTA enthielt, dialysierte und sodann in PBS (pH-Wert 7,4) das kein EDTA enthielt, löste, bis die Konzentration an LDL 200 μg/ml erreichte. Sodann wurden 10 ml der erhaltenen LDL-Losung und Kupfersulfat (CuSO4), zugegeben bis die Endkonzentration 5 μMol/Liter erreichte, 3 Stunden bei 37°C inkubieren gelassen, um eine Oxidation des LDL zu bewirken. Die Oxidation wurde durch Zugabe von EDTA zur Lösung, bis die Endkonzentration an EDTA 1 mMol/Liter erreichte, abgebrochen. Durch nicht weniger als dreimaliges Dialysieren (während nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000-fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1 mMol/Liter EDTA wurde die Lösung von CuSO4 befreit. Das derart hergestellte oxidierte LDL wurde bei 4°C konserviert.
  • Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde der Ausdruck der Menge des oxidierten LDL durch die Proteinmasse des LDLs als Ausgangsmaterial definiert.
  • (3) Herstellung eines gefriergetrockneten Produkts von oxidiertem LDL
  • Das in (2) hergestellte oxidierte LDL wurde mit PBS (pH-Wert 7,4) verdünnt, bis die Proteinkonzentration 6,25 ng/ml in einer Portion (bezeichnet als „Typ L") und 12,5 ng/ml in einer anderen Portion (als „Typ H" bezeichnet) erreichte. Die zwei Typen wurden jeweils gut mit zugefügten BSA vermischt, bis die Endkonzentration 2% (Gewicht/Volumen) erreichte und Saccharose wurde zugegeben, bis die Endkonzentration jeweils 5% (Gewicht/Volumen) erreichte. Die hergestellten gemischten Lösungen wurden sodann jeweils in eine Volumeneinheit von 1 ml in Glasröhrchen abgefüllt, unter Verwendung eines Vakuum-Gefriertrockners (Kyowa Drier RL-201 BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) bei –50°C 16 gefroren, bei 20°C unter vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, danach verschlossen und bei 4°C konserviert. Zu dieser Zeit betrug der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte 0,8 Massen%.
  • (4) Bildung der Eichkurve mit einem gefriergetrockneten Produkt oxidierten LDLs als Standardsubstanz
  • a. Herstellung von Peroxidase-markiertem Antikörper
  • 1 ml gereinigter Anti-menschl.-apo-B-Antikörper (Ziege, Nippon Chemie-con Corp.)-Lösung (Konzentration von 5 mg/ml in 0,1 Mol/Liter Boratpuffer vom pH-Wert von 8,0) und 50 μl 2-Iminothiolan-Salzsäurelösung (Konzentration 60 mMol/Liter in 0,1 Mol/Liter Boratpuffer vom pH-Wert 8,0), die zugegeben wurde, ließ man bei 30°C 30 Minuten sich miteinander umsetzen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einer Sephadex g-25 Säule (1 cm × 30 cm) (Pharamacia Corp.) mit 0,1 Mol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) mit einem Gehalt an 5 mMol/Liter EDTA ins Gleichgewicht gebracht. Die aus der Säule eluierte Antikörperfraktion wurde gesammelt. 1 ml Meerrettich-Peroxidase (im folgenden abgekürzt als „HRP", Toyobo K.K.)-Lösung (Konzentration 10 mg/ml in 0,1 Mol/Liter Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0) und zugegebene 50 μl einer EMCS-Lösung (50 mMol/Liter einer DMSO-Lösung, Dojin Kagakusha K.K.) ließ man bei 30°C 30 Minuten miteinander umsetzen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einer Säule Sephadex G-25 (1 cm × 30 cm) (Pharmacia Corp.), mit 0,1 Mol/Liter Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 ins Gleichgewicht gebracht, behandelt. Die aus der Kolonne eluierte HRP-Fraktion wurde gesammelt. Die Antikörper-Fraktion und miteinander bei 30°C 30 Minuten umsetzen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einer Säule Sephadex G-200 (1 cm × 100 cm) (Pharmacia Corp.) behandelt, mit 0,1 Mol/Liter Phosphatpuffer (beim pH-Wert 7,0) ins Gleichgewicht gebracht. Die aus der Kolonne eluierten Antikörper-HRP-Konjugatfraktionen wurden vermischt und gesammelt. Die so gesammelte Masse wurde als „Peroxidase-markierter antimenschl. Apo-B-Antikörper" bezeichnet.
  • Die gesammelte Fraktion wurde unverzüglich mit BSA verdünnt, bis die Endkonzentration 1% (Gewicht/Volumen) erreichte und im gelösten Zustand bei –50°C bis zur Verwendung konserviert.
  • b. Herstellung von DLH3-Antikörper
  • Nicht weniger als 8 Wochen alte männliche Balb/c-Mäuse wurden nach Verabreichung von Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) durch intraabdominale Injektion mit einer Dosis von 0,5 ml/pro Maus jeweils 2 Wochen gezüchtet. Den Mäusen wurde sodann intraabdominal jeweils eine Hybridoma-Zelllinie FOH1a/DLH3, eine der Lieferung eines erforderlichen monoklonalen Antikörpers (Depot Nr. FERM 6P-7171; J. Biol. Chem. 1994, 269: 15274–15279; und Patentveröffentlichung JP-A-07-238.098) in einer Dosis von 1 × 106 [sic!]/Maus verabreicht. 7–14 Tage später wurden, die Mäuse jeweils Flüssigkeitsansammlungen im intraperitonealen Bauchbereich reichlich Flüssigkeiten (ascites) angesammelt hatten, wurden diese aus dem Bauch unter Verwendung einer Spritze 18G gesammelt und bei 3.000 UpM während 10 Minuten zentrifugiert. Der hierbei gebildete Überstand wurde gesammelt. Dieser Überstand wurde mit einer gleichen Menge PBS (pH-Wert 7,4) versetzt. Zu dem gebildeten Gemisch wurde eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung in gleicher Menge zu dem Gemisch tropfenweise innerhalb von 1 Stunde unter sorgfältigem Rühren zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde kontinuierlich weiter 1 Stunde gerührt und sodann bei 3.000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu verwerfen und den Niederschlag zu sammeln. Ferner wurde der Niederschlag in PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,5 Mol/Liter NaCl gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit einer Säule Sephacryl S-300 (2,5 cm × 100 cm) (Pharmacia Corp.) behandelt, mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,5 Mol/Liter NaCl ins Gleichgewicht gebracht, um eine IgM-Fraktion zu sammeln, welche als „DLH3-Antikörper" bezeichnet wurde. Die Konzentration des DLH3-Antikörpers (mg/ml) wurde bestimmt, indem man eine gegebene Probe auf ihr Absorptionsvermögen bei 280 nm in einer 1 cm langen Lichtbahn maß und den erhaltenen Absorptionswert durch 1,3 dividierte.
  • c. Sandwich-ELISA-Analyse
  • Das gefriergetrocknete Produkt des in (3) hergestellten oxidierten LDLs wurde in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst und sodann mit PBS mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) PSA bis zu den angegebenen wechselnden Konzentrationen (0 ng/ml, 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml, 12,5 ng/ml und 25 ng/ml) verdünnt.
  • Der in Kapitel b, oben, hergestellte DLH3-Antikörper in den einzelnen Vertiefungen (wells) einer 96F-Mikroplatte (NALGE NUNC International K.K.), verdünnt mit Tris-HCl (pH-Wert 8,0) auf 10 μg/ml wurden in einer Mengeneinheit von 1 μg/Vertiefung dispensiert und bei 4°C 16 Stunden inkubiert. Die in den Vertiefungen gebildete Antikörperlösung wurde verworfen. Der Rest in jeder Vertiefung wurde durch Inkubieren zusammen mit 350 μl/Tris-HCl (pH-Wert 8,0) mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA bei Raumtemperatur während 2 Stunden blockiert. Die blockierte Antikörperlösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen.
  • Die das gefriergetrocknete Produkt, von oxidiertem LDL einer vorgeschriebenen Konzentration enthaltende verdünnte Lösung, hergestellt wie zuvor beschrieben, wurde in einer Volumeneinheit von 100 μl auf die einzelnen Vertiefungen verteilt, bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und sodann viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen. 100 μl der durch Verdünnen der des mit Peroxidase markierten Antimenschl.-Apo-B-Antikörpers, hergestellt im Kapitel a., oben, mit PBS (ph-Wert 7,4) mit einem Erhalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA auf ein Volumen, das das 1.000-Fache des ursprünglichen Volumens betrug, wurde in die einzelnen Vertiefungen platziert und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen und sodann 30 Minuten mit 100 μl einer 0,03%igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Wasserstoffperoxidlösung, die 3 mg/ml o-Phenylendiamin (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) enthielt, angefärbt. Die sich in der Lösung fortsetzende Umsetzung wurde durch Zugabe von 50 μl einer 1 molaren/Liter Schwefelsäure abgebrochen. Sodann wurde das Absorptionsvermögen der Lösung bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Durch Verwendung des gefriergetrockneten Produkts des oxidierten LDL vorliegender Erfindung konnte, wie in 1 veranschaulicht, eine hervorragende Eichkurve gebildet werden.
  • (5) Vergleich der Konservierungsstabilität
  • Die im Kapitel (3) hergestellten gefriergetrockneten Produkte des oxidierten LDLs [standardoxidiertes LDL (1) (Typ H), 12,5 ng, und standardoxidiertes LDL (2) (Typ L), 6,25 ng], wurden bei 4°C während angegebenen Zeiträumen (0, 1, 3 und 4 Wochen) konserviert. Das in Kapitel (2) hergestellte oxidierte LDL wurde mit PBS (pH-Wert 7,4) auf 2 Proteinkonzentrationen von 6,25 ng/ml (im folgenden als „Typ L" bezeichnet) und 12,5 ng/ml (im folgenden als „Typ H") bezeichnet, verdünnt. Die beiden Typen wurden mit BSA und Saccharose auf die Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltenen Lösungen wurden gut vermischt. Die erhaltenen gemischten Lösungen wurden durch Lagerung in der Kälte bei 4°C konserviert, ohne gefriergetrocknet zu sein [d.h., das oxidierte LDL zum Vergleich (1) (Typ H), 12,5 ng/ml, und das oxidierte LDL zum Vergleich (2) (Typ L), 6,25 ng/ml] wurden bei 4°C während den angegebenen Zeiträumen (0, 1, 3 und 4 Wochen) konserviert.
  • Nach der Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurden die standardoxidierten LDLs (1) und (2), jeweils in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst, und die oxidierten LDLs zum Vergleich (1) und (2) nach dem gleichen Verfahren wie im Kapitel (4) c, oben behandelt, und ihr Absorptionsvermögen wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
  • Wie in 2 veranschaulicht, zeigen die Messungen, erhalten von den standardoxidierten LDLs (1) und (2) praktisch keine Veränderung von denjenigen, welche unmittelbar nach Herstellung (Woche 0) erhalten wurden, während die Messungen, welche für die oxidierten Vergleich-LDLs (1) und (2) nach vierwöchiger Konservierung jeweils Absenkungen von etwa 50% und etwa 45% von den unmittelbar nach Herstellung (Woche 0) erhaltenen Messungen zeigten. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass diese den odoxidierten Vergleichs-LDLs in ihrer Konservierungsstabilität den standardoxidierten LDLs (1) und (2) ziemlich unterlegen waren.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • (1) Herstellung von HDL
  • Aus dem unter Verwendung von EDTA als Antikoagulanz erhaltenen menschlichen Blutplasma wurde LDL entfernt, und ein Teil mit einem spezifischen Gewicht im Bereich von 1,063–1,21 wurde als eine HDL-Fraktion durch Ultra zentrifugieren (mit 120.000 × g bei 10°C während 48 Stunden gesammelt). In diesem Fall wurde die Reinheit des HDL durch die Tatsache bestätigt, dass die Probe eine einzige scharfe Bande bildete, wenn sie durch Agarose-Elektrophorese getestet wurde. Diese HDL-Fraktion wurde sodann durch sorgfältige Dialyse während 16 Stunden gegen PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA gereinigt. Das wie zuvor beschrieben gereinigte HDL wurde in PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA gelöst, bis die HDL-Proteinkonzentration 1 mg/ml erreichte, und in gelöstem Zustand bei 4°C bis zu ihrer Verwendung konserviert. Im vorliegenden Beispiel wurde die Proteinmasse nach dem im Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen modifizierten Lowry-Verfahren bestimmt.
  • (2) Oxidation von HDL
  • Die in Kapitel (1) hergestellte HDL wurde von EDTA durch nicht weniger als dreimalige Dialyse (während nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000-fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4), das kein EDTA enthielt, dialysiert und sodann in PBS (pH-Wert 7,4), das kein EDTA enthielt, gelöst, dialysiert, bis die Konzentration von HDL 100 μg/ml erreichte. Sodann wurden 10 ml der erhaltenen HDL-Losung und zugegebenes Kupfersulfat (CuSO4) bis die Endkonzentration 100 μMol/Liter erreichte, 18 Stunden bei 37°C inkubieren gelassen, um die Oxidation des HDLs zu bewirken. Durch Zugabe von EDTA zur Lösung bis die Endkonzentration an EDTA 1 mMol/Liter erreichte, wurde die Oxidation abgebrochen. Die Lösung wurde von CuSO4 durch Dialysieren von nicht weniger als dem Dreifachen (während nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000 fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1 mMol/Liter EDTA befreit. Das hierbei hergestellte oxidierte HDL wurde bei 4°C konserviert.
  • Bei vorliegendem Ausführungsbeispiel wurde der Ausdruck der Menge des oxidierten HDL durch die Proteinmasse des HDL als Ausgangsmaterial definiert.
  • (3) Herstellung eines gefriergetrockneten Produkts des oxidierten HDLs
  • BSA und Saccharose wurden zum im Kapitel (2) hergestellten oxidierten HDL zugegeben, bis die Endkonzentration 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) betrug und die erhaltene Lösung wurde gut vermischt. Die erhaltene gemischte Lösung wurde sodann in einer Volumeneinheit von 1 ml in Glasröhren verteilt, unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) bei –50°C 16 Stunden gefroren, bei 20°C unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, danach verschlossen und bei 4°C konserviert. Zu dieser Zeit war der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte jeweils 0,8 Massen%.
  • (4) Bildung einer Eichkurve mit dem gefriergetrockneten Produkt oxidierten HDLs als Standardsubstanz
  • a. Einstellung der Konzentration
  • Das im Kapitel (3) hergestellte, gefriergetrocknete Produkt des HDL wurde in 1 ml zugegebenem gereinigtem Wasser gelöst und mit PBS mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA auf verschiedene angegebene Konzentrationen (0 ng/ml, 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 25 nm/ml, [sic], 50 ng/ml und 75 ng/ml) gelöst.
  • b. Sandwich-ELISA-Analyse
  • In den einzelnen Vertiefungen einer 96F Mikroplatte (NALGE NUNC international K.K.), wurde eine Lösung von einem Anti-menschl.-Apo-Al-Maus-monoklonaler Antikörper (Nippon Chemi-con Corp.), verdünnt mit einem Carbonatpuffer (pH-Wert 9,5) auf eine Konzentration von 10 μg/ml, in einer Volumeneinheit von 0,1 ml/Vertiefung verteilt und bei 4°C 16 Stunden inkubiert. Die in den Vertiefungen gebildete Antikörperlösung wurde verworfen. Der Rückstand in jeder Vertiefung wurde blockiert, indem er zusammen mit 350 μl PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert wurde. Die blockierte Antikörperlösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen.
  • Die verdünnte Lösung, welche das gefriergetrocknete Produkt von oxidiertem HDL einer vorgeschriebenen Konzentration enthielt, hergestellt wie unter „a.", oben, beschrieben, wurde in einer Volumeneinheit von 10 μl auf die einzelnen Vertiefungen verteilt, bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und sodann viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen.
  • In die einzelnen Vertiefungen wurde in einer Volumeneinheit von 100 μl ein mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA verdünnten DLH3-Antikörper verteilt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen und sodann zusammen mit 100 μl eines Peroxidase-markierten Anti-Maus-IgM-Antikörper (Zymed Laborstories Inc.), verdünnt auf das 1.000-Fache mit PBS mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltene inkubierte Lösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen und sodann mit 100 μl einer 0,03%igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Wasserstoffperoxidlösung, die 3 mg/ml o-Phenylendiamin enthielt, eingefärbt. Die sich in der Lösung noch fortsetzende Umsetzung wurde durch Zugabe von 50 μl von 1 Mol/Liter Schwefelsäure abgebrochen. Sodann wurde das Absorptionsvermögen der Lösung bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Unter Verwendung des gefriergetrockneten Produkts des oxidierten HDL gemäß vorliegender Erfindung konnte eine ausgezeichnete Eichkurve gebildet werden, wie in 3 veranschaulicht ist.
  • (5) Vergleich der Konservierungsstabilität
  • Die in Kapitel (3) hergestellten gefriergetrockneten Produkte des oxidierten HDLs [standardoxidiertes HDL (1) (Typ H), 12,5 ng, und standardoxidiertes HDL (2) (Typ L), 6,25 ng] wurden bei 4°C während den angegebenen Zeiträumen (0, 1, 2, 3 und 4 Wochen) konserviert. Das im Kapitel (2) hergestellte oxidierte HDL wurde mit PBS (pH-Wert 7,4) auf zwei Proteinkonzentrationen von 6,25 ng/ml (im folgenden als „Typ L" bezeichnet) bzw. 12,5 ng/ml (im folgenden als „Typ H" bezeichnet) verdünnt. Die zwei Typen wurden mit BSA und Saccharose auf eine Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltenen Lösungen wurden gut vermischt. Die erhaltenen gemischten Lösungen wurden bei einer 4°C kalten Lagerung konserviert, ohne gefriergetrocknet zu werden [d.h., das oxidierte Vergleichs-HDL (1) (Typ H), 12,5 ng/ml, und das oxidierte Vergleichs-HDL (2) (Typ L), 6,25 ng/ml] wurden während den angegebenen Zeiträumen (0, 1, 2, 3 und 4 Wochen) konserviert. Nach der Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurden die standardoxidierten HDLs (1) und (2), jeweils in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst, und die oxidierten Vergleichs-HDLs (1) und (2) wurden nach dem gleichen Verfahren wie im Kapitel (4) b. oben, behandelt, und das Absorptionsvermögen bei 492 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
  • Wie in 4 veranschaulicht, zeigen die aus den standardoxidierten HDLs (1) und (2) erhaltenen Messungen praktisch keine Veränderung von denjenigen, welche unmittelbar nach Herstellung (Woche 0) erhalten wurden, während die von den oxidierten Vergleichs-HDLs (1) und (2) erhaltenen Messungen nach einer Lagerung in der Kälte jeweils Absenkungen von etwa 40% und etwa 30% von den unmittelbar nach Herstellung (Woche 0) erhaltenen Messungen. Diese Ergebnisse zeigen klar an, dass diese oxidierten Vergleichs-HDLs in ihrer Konservierungsstabilität den standardoxidierten HDLs (1) und (2) ziemlich unterlegen waren.
  • Vergleichsbeispiel 3
  • (1) Herstellung von Lp(a)
  • Von dem unter Verwendung von EDTA als Antikoagulanz erhaltenen menschlichem Blutplasma wurde ein Teil mit einem spezifischen Gewicht im Bereich von 1,060–1,125 gesammelt und weiter einer Gelfiltration mit Biogel A-5m (Bio-rad Corp.) unterzogen, um eine Lp(a)-Fraktion zu sammeln. In diesem Fall wurde die Reinheit des Lp(a) durch die Tatsache bestätigt, dass die Probe eine einzige scharfe Bande bildete, wenn sie durch die Agarose-Elektrophorese getestet wurde.
  • Diese Lp(a)-Großfraktion wurde sodann durch sorgfältiges Dialysieren (während 16 Stunden) gegen PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA dialysiert. Ferner wurde das wie zuvor beschrieben gereinigte Lp(a) in PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,25 mMol/Liter EDTA gelöst, bis die Lp(a)-Proteinkonzentration 1 mg/ml erreichte, und in gelöstem Zustand bei 4°C bis zu seiner Verwendung konserviert. Im vorliegenden Beispiel wurde die Proteinmasse nach dem modifizierten Lowry-Verfahren bestimmt.
  • (2) Oxidation von Lp(a)
  • Das in Kapitel (1) hergestellte Lp(a) wurde durch nicht weniger als dreimaliges Dialysieren (während nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000-fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4) ohne einen Gehalt an EDTA dialysiert und sodann in PBS (pH-Wert 7,4) ohne einen Gehalt an EDTA gelöst, bis die Konzentration von Lp(a) 100 μg/ml erreichte. Danach wurden 10 ml der erhaltenen LDL-Losung und hinzugefügtes Kupfersulfat (CuSO4), bis die Endkonzentration 10 μMol/Liter erreichte, zusammen bei 37°C 18 Stunden inkubieren gelassen, um eine Oxidation des Lp(a) zu bewirken. Durch Zugabe von EDTA zur Lösung, bis die Endkonzentration des EDTA 1 mMol/Liter erreichte, wurde die Oxidation abgebrochen. Die Lösung wurde von CuSO4 durch 2–3-maliges Dialysieren (während jeweils nicht weniger als 2 Stunden) gegen nicht weniger als das 500–1.000-Fach so große Volumen von PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1 mMol/Liter EDTA dialysiert. Das hierbei hergestellte oxidierte Lp(a) wurde bei 4°C konserviert.
  • Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde der Ausdruck der Menge des oxidierten Lp(a) durch die Proteinmasse des Lp(a) als Ausgangsmaterial definiert.
  • (3) Herstellung des gefriergetrockneten Produkts oxidierten Lp(a)
  • BSA und Saccharose wurden zum im Kapitel (2) hergestellten oxidierten Lp(a) zugegeben, bis die Endkonzentration 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) erreichte, und die erhaltene Lösung wurde gut vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde in einer Volumeneinheit von 1 ml in Glasfläschchen verteilt, dann bei –50°C 16 Stunden unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) bei –50°C gefroren, bei 20°C unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, danach verschlossen und bei 4°C konserviert. Zu dieser Zeit betrug der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte jeweils 0,8 Massen%.
  • (4) Bildung einer Eichkurve mit dem gefriergetrockneten Produkt des oxidierten Lp(a) als Standardsubstanz
  • a. Einstellung der Konzentration
  • Das im Kapitel (3) hergestellte gefriergetrocknete Produkt des oxidierten Lp(a) wurde in 1 ml gereinigtem Wasser auf verschiedene angegebene Konzentrationen gelöst (0 ng/ml, 0,15625 ng/ml, 0,3125 ng/ml, 0,625 ng/ml, 1,25 ng/ml, 2,5 ng/ml und 5 ng/ml).
  • b. Sandwich-ELISA-Analyse
  • In die einzelnen Vertiefungen einer 96F Mikroplatte (NALGE NUNC International K.K.), wurde einer Lösung des anti-menschl. Lp(a)-monoklonalen Mausantikörpers (Nippon Chemi-con Corp.), verdünnt mit einem Carbonatpuffer (pH-Wert 9,5) auf eine Konzentration von 10 μg/ml, in einer Mengeneinheit von 1 μg/Vertiefung verteilt und bei 4°C 16 Stunden inkubiert. Die in den Vertiefungen gebildete Antikörperlösung wurde verworfen. Der Rückstand in jeder Vertiefung wurde durch Inkubieren zusammen mit 350 μl PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA bei Raumtemperatur 2 Stunden blockiert. Die blockierte Antikörperlösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen.
  • Die wässerige Lösung mit einem Gehalt an dem gefriergetrockneten Produkt des oxidierten Lp(a) einer vorgeschriebenen Konzentration, hergestellt wie im Kapitel „a.", oben beschrieben, wurde in einer Volumeneinheit von 100 μl in die einzelnen Vertiefungen verteilt, bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und sodann viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen.
  • In den einzelnen Vertiefungen wurde die verdünnte Lösung, welche durch Verdünnen des DLH3-Antikörpers, hergestellt im Kapitel (4) b. des Vergleichsbeispiels 1, auf eine Konzentration von 10 μg/ml, mit einer Lösung von 20 mMol/Liter Tris-HCl-Lösung (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA erhalten, in einer Volumeneinheit von 100 μl verteilt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Sodann wurde die inkubierte Lösung viermal mit PBS (pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen und danach zusammen mit 100 μl eines Peroxidase-markierten Anti-Maus-IgM-Antikörpers (Nippon Chemi-con Corp.), verdünnt auf das 1.000-fache mit PBS mit einem Gehalt an 1% (Gewicht/Volumen) BSA, bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die erhaltene inkubierte Lösung wurde viermal mit PBS (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,05% (Volumen/Volumen) Tween 20 gewaschen und danach mit 100 μl einer 0,03%igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Wasserstoffperoxidlösung mit einem Gehalt an 3 mg/ml O-Phenylendiamin angefärbt. Die Umsetzung, die sich in der Lösung fortsetzte, wurde durch Zugabe von 50 μl einer 1 molaren/Liter Schwefelsäure abgebrochen. Sodann wurde das Absorptionsvermögen der Lösung bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Unter Verwendung des gefriergetrockneten Produkts des oxidierten Lp(a) gemäß vorliegender Erfindung konnte eine hervorragende Eichkurve gebildet werden, wie in 5 veranschaulicht.
  • (5) Vergleich der Konservierungsstabilität
  • Die in Kapitel (3) hergestellten gefriergetrockneten Produkte des oxidierten Lp(a) [standardoxidiertes Lp(a) (1) (Typ H), 12,5 ng, und standardoxidiertes Lp(a) (2) (Typ L), 6,25 ng] wurden bei 4°C während den angegebenen Zeiträumen (0, 1, 2, 3 und 4 Wochen) konserviert. Das in Kapitel (2) hergestellte oxidierte Lp(a) wurde mit PBS (pH-Wert 7,4) auf 2 Proteinkonzentrationen von 6,25 ng/ml (im folgenden als „Typ L" bezeichnet) bzw. 12,5 ng/ml (im folgenden als „Typ H" bezeichnet) verdünnt. Die beiden Typen wurden BSA und Saccharose auf die Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltenen Lösungen wurden gut vermischt. Die erhaltenen gemischten Lösungen wurden durch Lagern in der Kälte bei 4°C ohne gefriergetrocknet zu werden, konserviert [d.h., die oxidierten Vergleichs-Lp(a)s (1) (Typ H), 12,5 ng/ml, und das oxidierte Vergleichs-Lp(a) (2) (Typ L), 6,25 ng/ml] wurden bei 4°C während der angegebenen Zeiträume (0, 1, 2, 3 und 4 Wochen konserviert).
  • Nach der Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurden die standardoxidierten Lp(a)s (1) und (2) jeweils in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst, und die oxidierten Vergleichs-Lp(a)s (1) und (2) wurden nach dem gleichen Verfahren wie im Kapitel „(4) c.", oben, behandelt, und das Absorptionsvermögen wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
  • Wie in 6 veranschaulicht, zeigten die Messungen, erhalten von den standardoxidierten Lp(a)s (1) und (2) praktisch keine Veränderung von denjenigen, erhalten unmittelbar nach Herstellung (Woche 0), während die Messungen, erhalten mit den oxidierten Vergleichs-Lp(a)s (1) und (2) nach einer vierwöchigen Lagerung in der Kälte Absenkungen von etwa 50% bzw. etwa 40% von den unmittelbar nach Herstellung (Woche 0) erhaltenen Messungen. Diese Ergebnisse geben klar an, dass diese oxidierten Vergleichs-Lp(a)s in ihrer Konservierungsstabilität den standardoxidierten Lp(a)s (1) und (2) ziemlich unterlegen waren.
  • BEISPIEL 1
  • (1) Herstellung von durch Gefrieren denaturiertem menschlichem Blutplasma
  • Blutproben wurden aus vier Personen mit Heparin als Antikoagulanz gezogen. Blutplasmaproben wurden jeweils aus den Blutproben nach dem üblichen Verfahren gesammelt und nach einem Verfahren ähnlich dem ELISA-Verfahren, das im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschrieben ist, getestet.
  • Die Blutplasmaproben wurden sodann jeweils in einer Volumeneinheit von 2 ml in Glasfläschchen verteilt, welche von Raumtemperatur (25°C) in eine Kühlvorrichtung mit einer Innentemperatur von –30°C übergeführt, hierin nicht weniger als 3 Stunden stehen gelassen, auf Raumtemperatur rückgeführt, wobei die ganzen Inhalte völlig schmolzen. Das einzelne Blutplasma, welches dem Verfahren einschließlich dem Gefrierarbeitsgang unterzogen worden war, wurde nach einem, dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren ähnlichen Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. 7 zeigt klar an, dass, wenn das Verfahren einschließlich des Gefrierarbeitsgangs mit Blutplasma durchgeführt wurde, dass das im Blutplasma enthaltene Lipoprotein signifikant denaturiert war, unter Bildung eines durch Gefrieren denaturierten Lipoproteins (oxidierten LDLs).
  • (2) Herstellung des gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmas
  • Die Blutplasmaproben, welche dem in Kapitel (1), oben beschriebenen Verfahren unterzogen worden waren, welches insgesamt einen viermaligen Gefrierarbeitsgangs umfasste, wurden in jeweils gleichen Volumina vermischt. Die denaturierte LDL-Konzentration (oxidierte LDL-Konzentration) der erhaltenen gemischten Lösung wurde aus der Eichkurve, gebildet wie im Vergleichsbeispiel 1 (4) veranschaulicht, in Übereinstimmung mit dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren berechnet.
  • Danach wurde das durch Gefrieren denaturierte menschliche Blutplasma, hergestellt im Kapitel (1), auf zwei oxidierte LDL-Konzentrationen, 6,25 ng/ml (Typ L) bzw. 12,5 ng/ml (Typ H) mit einem 10 mMol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 140 mMol/Liter NaCl, BSA einer Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen), Saccharose einer Endkonzentration von 5% (Gewicht/Volumen) und 0,25 mMol/Liter EDTA-2Na verdünnt. Die beiden Typen der verdünnten Lösung wurden in einer Volumeneinheit von 1 ml in Glasfläschchen verteilt, bei –50°C 16 Stunden unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners (Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) gefroren und sodann bei 5°C unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und abzutreiben, verschlossen und bei 4°C bis zur Verwendung konserviert. Dieses Produkt wurde als „gefriergetrocknetes Produkt eines durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmas" bezeichnet. Der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte betrug jeweils 0,8 Massen-%.
  • (3) Bestimmung der Konzentration des gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmas
  • Das gefriergetrocknete Produkt des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmas, hergestellt im Kapitel (2), wurde in 1 ml zugegebenem gereinigten Wasser gelöst. Gemäß dem Verfahren zur Bestimmung des oxidierten LDLs nach dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen Sandwich-ELISA-Verfahrens wurde das Absorptionsvermögen bei 492 nm der erhaltenen Lösung gemessen. Beim Suchen der oxidierten LDL-Konzentration der Lösung aus der im Vergleichsbeispiel 1 (4) aufgrund des bei der Messung gefundenen Absorptionsvermögens gebildeten Eichkurve zeigte die oxidierte LDL-Konzentration im gefriergetrockneten Produkt praktisch keine erkennbare Veränderung vor und nach der Stufe des Gefriertrocknens.
  • (4) Vergleich der Konservierungsstabilität
  • Die beiden Arten des gefriergetrockneten Produkts [durch Standardgefrierung denaturiertes menschliches Blutplasma (1) Typ H, 12,5 ng, und standardgefrorenes denaturiertes menschliches Blutplasma (2) (Typ L), 6,25 ng] des durch Gefrieren denaturierten menschlichem Blutplasmas, hergestellt im Kapitel (2), wurden bei 4°C während variierenden angegebenen Zeiträumen (0, 6 und 12 Monate) konserviert.
  • Sodann wurden die beiden Arten des gefriergetrockneten Produkts von oxidiertem LDL [standardoxidiertes LDL (1) (Typ H), 12,5 ng, und standardoxidiertes LDL (2) (Typ L), 6,25 ng], hergestellt im Vergleichsbeispiel 1 (3), bei 4°C während variierenden angegebenen Zeiträumen (0, 6 und 12 Monate) konserviert.
  • Nach der Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurde das durch Standardgefrieren denaturierte menschliche Blutplasma (1) und (2) und die standardoxidierten LDLs (1) und (2) jeweils in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst. Die erhaltenen Lösungen wurden nach einem Verfahren, das dem Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren ähnlich war, getestet. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00430001
  • Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass das standardoxidierte LDL sich durch Konservierungsstabilität auszeichnet, solange es eine geringe Konzentration hatte [standardoxidiertes LDL (2)]. Das durch Standardgefrieren denaturierte menschliche Blutplasma gemäß vorliegender Erfindung, welches eine Denaturierung von Lipoprotein durch Gefrieren erreichte und sodann durch Gefriertrocknen Stabilität erlangte, zeichnete sich im Vergleich zum standardoxidierten LDL hinsichtlich einer verlängerten Konservierungsstabilität signifikant aus, auch wenn es im Vergleich zum standardoxidierten LDL eine hohe Konzentration hatte [durch Standardgefrieren denaturiertes menschliches Blutplasma (1)].
  • Vergleichsbeispiel 4
  • (1) Herstellung eines durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutserums
  • Blutproben wurden von vier Personen gezogen. Die Blutserumproben wurden jeweils von den Blutproben nach dem üblichen Verfahren abgetrennt und vermischt. Das Blutserum wurde mit BSA und Saccharose auf die Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen) bzw. 5% (Gewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltenen Gemische wurden gut vermischt. Die Gemische wurden in einer Volumeneinheit von 2 ml in Glasflächen verteilt, unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners (Kyowa Drier RL-201BS, Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) bei –50°C 16 Stunden gefroren, bei 5°C unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, verschlossen und bei 4°C konserviert. Der jeweilige Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte betrug 0,8 Massen-%.
  • (2) Herstellung eines gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutserums
  • In einer Volumeneinheit von 2 ml wurde gereinigtes Wasser den Glasflächen, welche die im Kapitel (1) hergestellten, durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasma-Proben enthielten, zugegeben, wodurch sich der jeweilige Inhalt der Glasflächen völlig löste. Die oxidierten LDL-Konzentrationen der hergestellten Lösungen wurden aus der Eichkurve errechnet, welche, wie im Vergleichsbeispiel 1 (4) erläutert, gemäß dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren gebildet wurden.
  • Das im Kapitel (1) hergestellte, durch Gefrieren denaturierte menschliche Blutserum wurde auf zwei oxidierte LDL-Konzentrationen, 6,25 ng/ml (Typ L), und 12,5 ng/ml (Typ H), mit einem 10 mMol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 140 mMol/Liter NaCl, BSA einer Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen), Saccharose einer Endkonzentration von 5% (Gewicht/Volumen) und 0,25 ml/Liter EDTA-2 Na verdünnt. Die zwei Arten der verdünnten Lösung wurden in einer Volumeneinheit von 1 ml in Glasflächen verteilt, 16 Stunden unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) bei –5°C gefroren, unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden bei 5°C gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, verschlossen und bei 4°C bis zur Verwendung konserviert. Dieses Produkt wurde als „gefriergetrocknetes Produkt eines durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmas" bezeichnet. Der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte betrug jeweils 0,8 Massen-%.
  • (3) Bestimmung der Konzentration des gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutserums
  • Das gefriergetrocknete Produkt des durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutserums, hergestellt im Kapitel (2), wurde in 1 ml hinzugefügtem gereinigtem Wasser gelöst. Beim Suchen der oxidierten LDL-Konzentration der erhaltenen Lösung aus der Eichkurve, die im Vergleichsbeispiel 1 (4) nach dem Bestimmungsverfahren des oxidierten LDL gemäß dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren zeigte die oxidierte LDL-Konzentration im gefriergetrockneten Produkt praktisch keinen erkennbaren Unterschied vor und nach der Stufe des Gefriertrocknens.
  • (4) Vergleich der Konservierungsstabilität
  • Das gefriergetrocknete Produkt des durch Gefrieren denaturierten Blutserums, hergestellt im Kapitel (2), wurde mit 1 ml gereinigtem Wasser in zwei oxidierte LDL-Konzentrationen von 12,5 ng/ml bzw. 6,25 ng/ml aufgelöst, um die durch standardisiertes Gefrieren denaturierten menschlichen Blutserum-Proben (1) (Typ H) und (2) (Typ L) herzustellen. Diese beiden Probearten wurden bei 4°C während variierender angegebener Zeiträume (0, 3, 7, 10 und 14 Tage) konserviert. Sodann wurden die beiden Arten des gefriergetrockneten Produkts des oxidierten LDLs, hergestellt im Vergleichsbeispiel 1 (3), auf die gleiche Art und Weise wie weiter oben beschrieben, gelöst, um standardoxidierte LDLs mit oxidierten LDL-Konzentrationen von 12,5 ng/ml und 6,25 ng/ml, d.h. ein standardoxidiertes LDL (3) (Typ H) und ein standardoxidiertes LDL (4) (Typ L) zu erhalten. Diese Arten wurden in gelöstem Zustand bei 4°C während variierenden angegebenen Zeiträumen (0, 3, 7, 10 und 14 Tage) konserviert.
  • Nach Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurden die durch Gefrieren denaturierten menschlichen Blutplasmen (1) und (2) und die standardoxidierten LDLs (3) und (4) jeweils nach dem Verfahren zur Bestimmung von oxidiertem LDL gemäß dem Sandwich-ELISA-Verfahren getestet, welches im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 8 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00460001
  • Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, zeichnete sich das standardoxidierte LDL durch Konservierungsstabilität solange aus, wie es eine geringe Konzentration hatte [standardoxidierte LDL (4)]. Das durch Standardgefrieren denaturierte menschliche Blutserum, welches eine Denaturierung von Lipoprotein durch Gefrieren erreichte und sodann durch Gefriertrocknen Stabilität erlangte, zeichnete sich im Vergleich zum standardoxidierten LDL hinsichtlich der Stabilität einer verlängerten Konservierung signifikant aus, auch wenn es eine hohe Konzentration hatte [durch Standardgefrieren denaturiertes menschliches Blutserum (1)].
  • BEISPIEL 2
  • (1) Herstellung von durch Gefrieren denaturiertem LDL
  • Das im Vergleichsbeispiel 1 (1) hergestellte LDL wurde von EDTA befreit, indem man nicht weniger (nicht weniger als jeweils 2 Stunden) gegen nicht weniger als 500–1.000-Fache Volumen von PBS (pH-Wert 7,4) ohne einen Gehalt an EDTA, verdünnt auf eine LDL-Konzentration von 1 mg/ml, mit einem 10 mMol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 140 mMol/NaCl, BSA einer Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen), Saccharose einer Endkonzentration von 5% (Gewicht/Volumen) und 0,25 mMol/Liter EDTA-2 Na dialysierte und gut vermischte. Die gebildete verdünnte Lösung wurde in einer Volumeneinheit von 2 ml in Glasfläschchen abgefüllt, welche von Raumtemperatur und 22°C zu Kühlvorrichtungen mit einer Innentemperatur von –85°C bzw. –30°C übergeführt, hierin für nicht weniger als 1 Stunde stehen gelassen und auf Raumtemperatur rückgeführt wurden, um eine völlige Auflösung der Inhalte der Glasfläschchen zu bewirken. Das Verfahren, umfassend die Gefrierstufe und das zuvor erwähnte Auflösen, wurde bis zu insgesamt 10 Wiederholungen durchgeführt. Der jeweilige Inhalt der Glasfläschchen wurde teilweise während einiger Zwischenräume zwischen den erwähnten Verfahren, umfassend die Gefrierstufe und Schmelzstufe, gesammelt. Die derart erhaltenen Proben wurden nach dem Sandwich-ELISA-Verfahren, beschrieben im Vergleichsbeispiel 1 (4) getestet. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
  • Wie aus 9 ersichtlich, erreichte die Denaturierung von LDL nahezu einen gesättigten Zustand, wenn das die Gefrierstufe und Schmelzstufe umfassende Verfahren bis zu drei Wiederholungen durchgeführt wurde, während die Innentemperatur der Gefriervorrichtung –30°C betrug. Wenn jedoch die Innentemperatur der Gefriervorrichtung –85°C betrug, erreichte die Denaturierung von LDL keinen gesättigten Zustand, wenn das die Gefrierstufe und Schmelzstufe umfassende Verfahren nicht bis zu neun Wiederholungen durchgeführt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die herzustellende Produktmenge des denaturierten LDL mit der verringerten Temperatur schwankt.
  • (2) Herstellung eines gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten LDLs
  • Das durch Gefrieren denaturierte LDL, hergestellt durch Durchführung des die Stufen des Gefrierens bei der Innentemperatur von –30°C der Gefriervorrichtung in (1) bis zu insgesamt vier Wiederholungen umfassenden Verfahrens wurde auf oxidierte LDL-Konzentrationen, 6,25 ng/ml (Typ L) bzw. 12,5 ng/ml (Typ H) mit 10 mMol/Liter Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 140 mMol/Liter NaCl, BSA einer Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen), Saccharose einer Endkonzentration von 5% (Gewicht/Volumen) und 0,25 mMol/Liter EDTA-2 Na verdünnt. Die beiden Arten der so erhaltenen verdünnten Lösung wurden in einer Volumeneinheit von 1 ml in Glasfläschchen verteilt, bei –50°C unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) 16 Stunden gefroren, bei 5°C unter einem vermindertem Druck von 1,33 Pa 48 Stunden gefriergetrocknet, um die Wasserkomponente zu vergasen und auszutreiben, verschlossen und bei 4°C bis zur Verwendung konserviert. Dieses Produkt wurde als „gefriergetrocknetes Produkt des durch Gefrieren denaturierten LDLs" bezeichnet. Der Wassergehalt der gefriergetrockneten Produkte betrug jeweils 0,8 Massen-%.
  • (3) Bestimmung der Konzentration des gefriergetrockneten Produkts des durch Gefrieren denaturierten LDLs
  • Das gefriergetrocknete Produkt des durch Gefrieren denaturierten LDLs, hergestellt im Kapitel (2), wurde in 1 ml hinzugegebenem gereinigten Wasser gelöst. Beim Suchen der oxidierten LDL-Konzentration der erhaltenen Lösung aus der Eichkurve, gebildet im Vergleichsbeispiel 1 (4) nach dem Bestimmungsverfahren des oxidierten LDLs in Übereinstimmung mit dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen ELISA-Verfahren zeigte die oxidierte LDL-Konzentration im gefriergetrockneten Produkt praktisch keine erkennbare Veränderung vor und nach der Stufe des Gefriertrocknens.
  • (4) Vergleich der Konservierungsstabilität nach Auflösen
  • Das gefriergetrocknete Produkt des durch Gefrieren denaturierten LDLs, hergestellt im Kapitel 2 wurde mit 1 ml gereinigtem Wasser in zwei oxidierte LDL-Konzentrationen, nämlich 2,5 ng/ml und 6,25 ng/ml, zur Herstellung der durch Standardgefrieren denaturierten menschlichen LDLs (1) (Typ H) bzw. (2) (Typ L) gelöst. Diese beiden Probearten wurden bei 4°C während Variieren der angegebenen Zeiträume (0, 3, 7, 10 und 14 Tage) konserviert. Die beiden Arten des gefriergetrockneten Produkts des oxidierten LDLs, hergestellt im Vergleichsbeispiel 1 (3), wurden auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben, gelöst, um standardoxidierte LDLs mit oxidierten LDL-Konzentrationen von 12,5 ng/ml und 6,25 ng/ml zu erhalten [standardoxidiertes LDL (3) (Typ H) und standardoxidiertes LDL (4) und (Typ 1)]. Diese Arten wurden in gelöstem Zustand bei 4°C während variierender angegebener Zeiträume (0, 3, 7, 10 und 14 Tage) konserviert.
  • Nach der Konservierung während des angegebenen Zeitraums wurde das Absorptionsvermögen bei 492 nm der standardgefrorenen denaturierten LDLs (1) und (2) und der standardoxidierten LDLs (3) und (4) jeweils nach dem Verfahren zur Bestimmung von oxidiertem LDL gemäß dem im Vergleichsbeispiel 1 (4) beschriebenen Sandwich-ELISA-Verfahren gemessen. Der jeweilige oxidierte LDL-Gehalt in den Standardproben wurde aus der Eichkurve gesucht, gebildet im Vergleichsbeispiel 1 (4), auf Basis des durch die obige Messung erhaltenen Absorptionsvermögens. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 10 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00500001
  • Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, zeichnet sich das standardoxidierte LDL gemäß der Erfindung hinsichtlich seiner Konservierungsstabilität so lange aus, wie es eine niedere Konzentration hatte [standardoxidiertes LDL (4)]. Das durch Standardgefrieren denaturierte menschliche Blutserum gemäß vorliegender Erfindung, welches eine Denaturierung von Lipoprotein durch Gefrieren erreichte und sodann durch Gefriertrocknen Stabilität erlangte, zeichnet sich im Vergleich zum standardoxidierten LDL hinsichtlich der Stabilität einer anhaltenden Konservierung nach Auflösen signifikant aus, auch wenn es eine hohe Konzentration hatte (durch Standardgefrieren denaturiertes LDL (1)].
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT DER ERFINDUNG
  • Es wird in starkem Maße nahegelegt, dass das denaturierte Lipoprotein in einer engen Beziehung mit verschiedenen Erkrankungen des Kreislaufsystems einschließlich solcher Krankheiten des koronaren Arteriensystems wie Herzinfarkt und Stenocardie, solcher Erkrankungen der Cerebralarterien wie Cerebralinfarkt und cereprovaskuläre Demenz, solchen Erkrankungen der Renalarterien wie Nephrophathie und diabetischen Nephropathie und solchen Erkranken des peripheren Arteriensystems wie eine Blockierung von peripheren Arterien steht. Die Standardsubstanz zur Bestimmung denaturierten Lipoproteins im Blut, und das Reagenz für die Erforschung der physiologischen Rolle und physiologischen Aktivität von denaturierten Lipoprotein sind sehr wichtige Substanzen, welche die Wirkungen derartiger Versuche beeinflussen.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde es deshalb nun möglich, denaturiertes Lipoprotein herzustellen, das sich durch Konservierungsstabilität auszeichnet, in anderen Worten ausgedrückt, das eindeutige Abgrenzungen zeigt. Zusätzlich zum zuvor erwähnten Vorteil zeichnet sich das stabilisierte Lipoprotein, das durch Gefriertrocknen von denaturierten Lipoprotein gebildet wird, erhalten durch Durchführung eines Verfahrens des ersten Aspekts, nicht nur durch Konservierungsstabilität sondern auch durch Konservierungsstabilität nach seinem Auflösen aus. Das durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogene denaturierte Lipoprotein behält die hervorragende Stabilität sogar dann bei, wenn es in Form einer Lösung angewandt wird, d.h., den Formen seiner aktuellen Verwendung. Diese Tatsache macht dieses stabilisierte denaturierte Lipoprotein in hohem Maße für die Bestimmung denaturierten Lipoproteins vorteilhaft. Deshalb ist das stabilisierte, denaturierte Lipoprotein gemäß vorliegender Erfindung als Standardsubstanz bei einem Verfahren zur Bestimmung von denaturiertem Lipoprotein, das in einer Blutkomponente enthalten ist, brauchbar, indem man eine gegebene Probe mit einem Antikörper in Berührung bringt, der fähig ist, denaturiertes Lipoprotein zu erkennen und das Reaktionsvermögen dieses Antikörpers auf die Probe misst, sowie als variierendes Versuchsreagenz zur Erforschung der physiologischen Rolle und physiologischen Aktivität von denaturiertem Lipoprotein. Offensichtlich übt es eine sehr wichtige Wirkung auf die Kommerzialisierung diagnostischer Technologie und die Entwicklung von Reagenzien im Hinblick auf verschiedene, weiter oben erwähnte Ziele aus.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung von denaturiertem Lipoprotein, bei dem man eine Lösung, die Lipoprotein enthält, einfriert, um eine gefrorene Lösung herzustellen; und die gefrorene Lösung schmilzt, um eine Lösung herzustellen, die denaturiertes Lipoprotein enthält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte des Einfrierens und Schmelzens wiederholt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Schritte des Einfrierens und Schmelzens im Bereich von 1 bis 10mal wiederholt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Schritte des Einfrierens und Schmelzens im Bereich von 1 bis 4mal wiederholt werden.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei dieses denaturierte Lipoprotein eine Standardsubstanz zur Bestimmung von denaturiertem Lipoprotein in Blut oder ein Untersuchungsreagenz zur Ermittlung der physiologischen Funktion oder der physiologischen Aktivität von denaturiertem Lipoprotein ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei dieses denaturierte Lipoprotein in der Lage ist, mit einem DLH3-Antikörper zu reagieren, der von der Hybridomazelllinie Maus-Maus-Hybridoma FOH1a/DLD3 (Hinterlegungsnummer FERM BP-7171) gewonnen wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei dieses Lipoprotein wenigstens eines ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Chylomicronen, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 und HDL3 besteht.
  8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man ferner die Lösung, die das denaturierte Lipoprotein enthält, gefriertrocknet.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man ferner nach dem Schmelzen und vor dem Gefriertrocknen einen Stabilisator zur Lösung, die das denaturierte Lipoprotein enthält, zugibt.
  10. Stabilisiertes denaturiertes Lipoprotein, das nach einem der vorangegangenen Ansprüche hergestellt worden ist.
  11. Verfahren zur Bestimmung von denaturiertem Lipoprotein in einer Probe, bei dem man ein stabilisiertes denaturiertes Lipoprotein, wie es in Anspruch 10 dargelegt ist, als Standardsubstanz auswählt; eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von vorbestimmten Konzentrationen der Standardsubstanz erstellt; die Probe mit einem Antikörper reagieren lässt, der an das denaturierte Lipoprotein bindet; und die Reaktivität des Antikörpers mit der Probe misst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei diese Bestimmung eine immunologische Bestimmung ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei diese immunologische Bestimmung ausgewählt wird aus einem Radioimmunassay, einem Enzymimmunassay, einem Fluoroimmunassay, einem Lumineszenzimmunassay, einem Agglutinationsimmunassay, Immunnephelometrie und einem nephelometrischen Immunassay.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei dieses Verfahren zur immunologischen Bestimmung ein kompetitives Verfahren oder ein Sandwichverfahren ist.
  15. Reagenzkit zur Bestimmung von denaturiertem Lipoprotein, umfassend stabilisiertes denaturiertes Lipoprotein, wie es in Anspruch 10 dargelegt ist, als Standardsubstanz.
  16. Reagenzkit zur Bestimmung von denaturiertem Lipoprotein, umfassend als Komponentenbestandteile eine Verdünnungsflüssigkeit für eine Probe, eine feste Phase, die durch die Immobilisierung eines Antikörpers gebildet wird, ein Reaktionspuffer, eine Waschlösung, ein markierter sekundärer Antikörper, ein Detektionsreagenz und das ganze oder ein Teil des stabilisierten denaturierten Lipoproteins, wie es in Anspruch 10 dargelegt ist, als Standardsubstanz.
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