KR20080028942A

KR20080028942A - 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법

Info

Publication number: KR20080028942A
Application number: KR1020087001455A
Authority: KR
Inventors: 노리히또 아오야마; 가즈히꼬 사사끼; 오사무 구사다
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2008-04-02
Also published as: EP1921453A4; JPWO2007010995A1; WO2007010995A1; EP1921453A1; CN101228442A; US20090035803A1; CA2614592A1; AU2006270756A1; JP5357424B2; US8173385B2; CN101228442B

Abstract

본 발명은 생체 시료 중의 펩티드의 간편한 안정화 방법 및 안정화 시약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 펩티드를 함유하는 생체 시료의 간편한 보존 방법 및 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 정확한 측정 방법 및 측정용 시약을 제공한다. 생체 시료에 당류를 첨가함으로써 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시키는 것, 펩티드를 함유하는 생체 시료를 펩티드를 안정화시킨 상태로 보존하는 것을 제공하며, 생체 시료 중의 펩티드를 정확하게 측정할 수 있다. 본 발명에 의해 임상 검사에서 채취되는 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시킬 수 있기 때문에, 임상 검사에 있어서 생체 시료 중의 마커가 되는 펩티드를 정확하게 측정할 수 있다.

생체 시료, 펩티드 안정화, 당류, 서브스턴스 P

Description

생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법 {METHOD OF STABILIZING PEPTIDE CONTAINED IN BIOSAMPLE}

본 발명은 생체 시료 중의 펩티드의 간편한 안정화 방법 및 안정화 시약, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 간편한 보존 방법 및 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 정확한 측정 방법 및 측정용 시약에 관한 것이다.

용액 중의 펩티드의 안정화법으로서, 펩티드를 에틸렌디아민사아세트산을 포함하는 용액 중에서 정치하여 난용성 조성물로 하는 방법(특허 문헌 1 참조), 펩티드에 혈장, γ-글로불린이나 젤라틴 등의 단백질을 공존시키는 방법(비특허 문헌 1 참조) 등이 알려져 있다.

펩티드의 동결 건조물의 안정화법으로서는, 글루콘산염을 공존시키는 방법(특허 문헌 2 참조)이 알려져 있다. 또한, 수크로스, 말토스, 락토스 등의 당류는 펩티드의 동결 건조물의 안정화제로서 알려져 있다(특허 문헌 3 및 4 참조).

또한, 면역 측정법에 있어서 고상에 고정화시키는 항원 또는 항체의 안정화 방법으로서, 트레할로스나 수크로스 등의 당류를 공존시키는 방법이 알려져 있다(특허 문헌 5 및 6 참조).

일반적으로 생체 시료 중의 펩티드는 여러 가지 요인, 예를 들면 생체 시료 중의 단백질 분해 효소에 의한 분해 등에 의해 불안정하다. 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시키는 방법으로서, 단백질 분해 효소의 저해제, 계면 활성제 또는 방부제를 첨가하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 생체 시료 중의 서브스턴스 P의 안정화 방법으로서, 단백질 분해 효소 저해제인 디이소프로필ㆍ플루오로포스페이트, 포스포라미돈 및 바시트라신을 공존시키는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌 2 참조).

생체 시료 중의 서브스턴스 P의 측정으로서는, 혈청을 산 처리한 후, 아세톤 및 에테르로 추출하고, 또한 역상 칼럼에 의한 HPLC로 정제한 서브스턴스 P를 효소 면역 측정법으로 측정하는 방법이 알려져 있지만(비특허 문헌 3 참조), 본 방법은 조작이 매우 번잡하면서 또한 화학적 처리 조건이 과혹하기 때문에 정확한 측정값을 제공하지 못하였다.

생체내의 펩티드는 각종 마커로서 중요하여, 생체 시료 중의 농도를 정확하게 측정할 필요가 있지만, 채취된 생체 시료를 측정하는 단계에서 이미 감소된 경우가 많아, 정확한 측정을 할 수 없다고 하는 문제가 있었다.

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)9-208485호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)6-321800호 공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (평)5-306235호 공보

특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)5-170664호 공보

특허 문헌 5: 일본 특허 공표 2002-508843호 공보

특허 문헌 6: 일본 특허 공개 제2003-215127호 공보

비특허 문헌 1: 엑스페리엔티아(Experientia), (스위스), 1963년, 제19권, 제2호, p.72 내지 73

비특허 문헌 2: 바이오케미칼 앤드 바이오피지컬 리서치 커뮤니케이션(Biochemical and Biophysical Research Communications), (미국), 1984년, 제125권, 제2호, p.728 내지 733

비특허 문헌 3: 클리니칼 앤드 디아그노스틱 라보라토리 이뮤놀로지(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology), (미국), 1998년, 제5권, 제3호, p.303 내지 307

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

본 발명의 목적은 생체 시료 중의 펩티드의 간편한 안정화 방법 및 안정화 시약, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 간편한 보존 방법 및 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 정확한 측정 방법 및 측정용 시약을 제공하는 것에 있다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 생체 시료 중의 펩티드의 간편한 안정화 방법을 예의 연구한 결과, 생체 시료에 당류를 첨가함으로써 펩티드를 안정화시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] 내지 [22]에 관한 것이다.

[1] 펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법.

[2] 펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하는 것을 특징으로 하는 생체 시료의 보존 방법.

[3] 펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하여 이루어지는 시료를 측정용 시료로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체 시료 중의 펩티드의 측정 방법.

[4] 생체 시료가 전혈, 혈청, 혈장, 누액, 콧물, 타액, 뇨, 변, 수액, 세포, 세포 조직액 및 세포막으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체 시료인 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[5] 당류가 단당류, 이당류 또는 다당류인 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[6] 단당류가 육탄당인 [5]에 기재된 방법.

[7] 육탄당이 만노스 또는 갈락토스인 [6]에 기재된 방법.

[8] 이당류가 환원성 이당류인 [5]에 기재된 방법.

[9] 환원성 이당류가 말토스 또는 락토스인 [8]에 기재된 방법.

[10] 다당류가 아밀로스, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분인 [5]에 기재된 방법.

[11] 펩티드가 서브스턴스 P인 [1] 내지 [10] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[12] 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 시약.

[13] 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존용 시약.

[14] 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료 중의 펩티드의 측정용 시약.

[15] 생체 시료가 전혈, 혈청, 혈장, 누액, 콧물, 타액, 뇨, 변, 수액, 세포, 세포 조직액 및 세포막으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체 시료인 [12] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 시약.

[16] 당류가 단당류, 이당류 또는 다당류인 [12] 내지 [15] 중 어느 한 항에 기재된 시약.

[17] 단당류가 육탄당인 [16]에 기재된 시약.

[18] 육탄당이 만노스 또는 갈락토스인 [16]에 기재된 시약.

[19] 이당류가 환원성 이당류인 [16]에 기재된 시약.

[20] 환원성 이당류가 말토스 또는 락토스인 [19]에 기재된 시약.

[21] 다당류가 아밀로스, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분인 [16]에 기재된 방법.

[22] 펩티드가 서브스턴스 P인 [12] 내지 [21] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

<발명의 효과>

본 발명에 의해 생체 시료 중의 펩티드의 간편한 안정화 방법 및 안정화 시약, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 간편한 보존 방법 및 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 정확한 측정 방법 및 측정용 시약이 제공된다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

(1) 펩티드

본 발명에 있어서의 펩티드는 생체내에 존재하는 것이면 어떠한 펩티드일 수도 있고, 또한 C 말단의 카르복시기가 아미드화된 것도 포함된다. 아미노산 잔기수로서는 5 내지 100개인 것이 바람직하고, 5 내지 50개인 것이 보다 바람직하고, 10 내지 30개인 것이 특히 바람직하다. 펩티드는 임상 검사의 목적으로 측정되는 펩티드가 바람직하고, 예를 들면 서브스턴스 P, 칼시토닌, 소마토스타틴, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 성장 호르몬 방출 인자, 엔도세린, 엔돌핀, 글루카곤, 글루카곤형 펩티드, 부신 피질 자극 호르몬, 코르티코트로핀 방출 인자, 바소프레신, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 가스트린, 부갑상선 호르몬, 나트륨 이뇨 펩티드, 세크레틴, 인슐린, 오스테오칼신 등을 들 수 있고, 서브스턴스 P가 바람직하다.

(2) 생체 시료

본 발명에 있어서의 생체 시료로서는, 예를 들면 전혈, 혈청, 혈장, 누액, 콧물, 타액, 뇨, 변, 수액, 세포, 세포 조직액, 세포막 등을 들 수 있고, 전혈, 혈청, 혈장, 누액, 콧물이 바람직하다.

(3) 당류

본 발명에 있어서의 당류로서는, 본 발명의 펩티드의 안정화 방법을 가능하게 하는 당류이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 단당류, 이당류, 다당류 등을 들 수 있다.

단당류로서는, 예를 들면 오탄당, 육탄당 등을 들 수 있고, 육탄당이 바람직하다. 오탄당으로서는, 예를 들면 아라비노스, 크실로스, 리보스, 릭소스, 리불로스, 크실로스 등을 들 수 있다. 육탄당으로서는, 예를 들면 갈락토스, 글루코스, 탈로스, 만노스, 소르보스, 타가토스, 프럭토스, 프시코스 등을 들 수 있고, 만노스 및 갈락토스가 바람직하다.

이당류로서는, 예를 들면 환원성 이당류나 비환원성 이당류을 들 수 있고, 환원성 이당류가 바람직하다. 환원성 이당류로서는, 예를 들면 말토스, 락토스 등을 들 수 있고, 비환원성 이당류로서는, 예를 들면 수크로스, 트레할로스 등을 들 수 있다.

다당류로서는, 예를 들면 아밀로스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분 등을 들 수 있고, 셀룰로스가 바람직하다.

(4) 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존 방법, 및 생체 시료 중의 펩티드의 측정 방법

상기 당류를 생체 시료에 첨가함으로써 상기 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시킬 수 있다. 또한, 상기 당류를 생체 시료에 첨가함으로써 상기 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시킨 상태로 상기 생체 시료를 보존할 수 있다. 또한, 생체 시료에 상기 당류를 첨가한 것을 측정 시료로서 이용함으로써 상기 측정 시료 중의 펩티드가 안정적으로 유지되기 때문에, 생체 시료 중의 펩티드를 정확하게 측정할 수 있다. 첨가되는 당류는 1종류일 수도 있고, 2종류 이상일 수도 있다. 생체 시료는 신선한 것이 바람직하고, 생체 시료의 채취 직후 또는 가능하면 신속하게 당류를 첨가하는 것이 바람직하다. 채취한 생체 시료를 넣은 용기에 미리 당류를 넣어 두는 것이 더욱 바람직하다. 당류는 고체 그대로 첨가하여 생체 시료에 용해시킬 수도 있지만, 당류의 용액을 첨가하는 방법이 바람직하다.

본 발명의 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존 방법 및 생체 시료 중의 펩티드의 측정 방법에 있어서는, 생체 시료에 첨가되는 당류는, 당류 첨가 후의 상기 생체 시료 중에, 펩티드가 안정적으로 보존될 수 있는 농도가 되도록 하는 양으로 첨가된다. 당류로서 단당류를 사용하는 경우에는, 단당류 첨가 후의 상기 생체 시료 중의 단당류의 농도는, 예를 들면 5 내지 600 mg/mL, 바람직하게는 10 내지 500 mg/mL이다. 당류로서 이당류를 사용하는 경우에는, 이당류 첨가 후의 상기 생체 시료 중의 이당류의 농도는, 예를 들면 5 내지 600 mg/mL, 바람직하게는 10 내지 500 mg/mL이다. 당류로서 다당류를 사용하는 경우에는, 다당류 첨가 후의 상기 생체 시료 중의 다당류의 농도는, 예를 들면 0.1 내지 50 mg/mL, 바람직하게는 1 내지 20 mg/mL이다.

본 발명의 펩티드의 측정 방법에 있어서 측정 시료, 즉 당류를 첨가한 생체 시료 중의 펩티드의 측정은, 예를 들면 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역학적 방법에 의해 측정할 수 있다. 면역학적 방법으로서는, 예를 들면 샌드위치법이나 경합법을 들 수 있다. 면역학적 방법을 이용한 시판되는 측정용 키트도 사용할 수 있다.

(5) 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 시약, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 측정용 시약

본 발명의 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 시약, 및 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존용 시약, 및 생체 시료 중의 펩티드의 측정용 시약은 당류를 함유한다. 본 발명의 안정화 시약, 보존용 시약 및 측정용 시약은 동결 건조품일 수도 액상품일 수도 있다. 또한, 특히 본 발명의 측정용 시약은 운반이나 보존에 적합한 형태로서 키트의 형태를 취할 수 있다. 키트로서는 2 시약계, 3 시약계 등을 들 수 있다. 당류로서는, 예를 들면 (3)에 상술한 당류을 들 수 있다. 당류는 1종류일 수도 있고, 2종류 이상일 수도 있다.

본 발명의 안정화 시약, 보존용 시약 및 측정용 시약의 이용 중 하나의 양태로서는, 예를 들면 본 발명의 안정화 시약, 보존용 시약 및 측정용 시약을 생체 시료 채취 기구 중에 미리 존재시키는 양태를 들 수 있다. 이러한 양태에 의해, 채취한 생체 시료 중의 펩티드를 즉시 안정화시킬 수 있다. 이러한 생체 시료 채취 기구로서는, 예를 들면 진공 채혈관 등을 들 수 있다. 이러한 생체 시료 채취 기구 중에 함유되는 본 발명의 측정용 시약에 생체 시료를 첨가하여 얻어지는 시료는, 그대로 또는 적절하게 완충액 등의 수성 매체로 용해시키거나, 또는 농축 또는 희석시켜 측정용 시료로서 측정에 사용된다.

본 발명의 안정화 시약, 보존용 시약 및 측정용 시약에는, 필요에 따라서 킬레이트제, 방부제, 계면 활성제, 완충제, 단백질 분해 효소 저해제, 염류 등이 함유될 수도 있다. 킬레이트제로서는 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 또는 그의 염, 디페닐디티오카르바존(DZ), 8-퀴놀리놀(OX), 6-도데실-4-(2-티아졸릴아조)레조르시놀(DTAR) 등을 들 수 있다. 에틸렌디아민사아세트산의 염으로서는 에틸렌디아민사아세트산ㆍ2나트륨(EDTAㆍ2Na) 등을 들 수 있다. 방부제로서는 아지드화나트륨, 황산 스트렙토마이신, 파라옥시벤조산에스테르류, 에틸렌글리콜 모노페닐에테르을 들 수 있다. 염류로서는 염화나트륨, 염화칼륨 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

음이온 계면 활성제로서는 알파술포지방산에스테르나트륨 등의 지방산계 음이온 계면 활성제, 알킬벤젠술폰산 나트륨 등의 알킬벤젠계 음이온 계면 활성제, 알킬황산에스테르나트륨, 알킬에테르황산에스테르 나트륨 등의 알킬황산에스테르계 음이온 계면 활성제, 알파올레핀술폰산 나트륨 등의 알파올레핀계 음이온 계면 활성제, 알킬술폰산나트륨 등의 알킬술폰산계 음이온 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온 계면 활성제로서는 소르비탄 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르 등의 지방산계 비이온 계면 활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 등의 알킬에테르계 비이온 계면 활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르 등의 알킬페놀계 비이온 계면 활성제 등을 들 수 있다.

양쪽성 계면 활성제로서는, 알킬아미노지방산나트륨 등의 아미노산계 양쪽성 계면 활성제, 알킬베타인등의 베타인계 양쪽성 계면 활성제, 알킬아민옥시드 등의 아민옥시드계 양쪽성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

양이온 계면 활성제로서는 알킬트리메틸암모늄염, 디알킬디메틸암모늄염 등의 제4급 암모늄염계 양이온 계면 활성제 등을 들 수 있다.

완충제로서는 락트산 완충제, 시트르산 완충제, 아세트산 완충제, 숙신산 완충제, 글리신 완충제, 3,3-디메틸글루타르산 완충제, 프탈산 완충제, 인산 완충제, 트리에탄올아민 완충제, 디에탄올아민 완충제, 붕산 완충제, 바르비투르 완충제, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 이미다졸-아세트산 완충제, 말산 완충제, 옥살산 완충제, 탄산 완충제, 리신 완충제, 굿드(Good) 완충제 등을 들 수 있다.

굿드 완충제로서는, 예를 들면 Tris[트리스(히드록시메틸)아미노메탄] 완충제, MES(2-모르폴리노에탄술폰산) 완충제, Bis-Tris[비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄] 완충제, ADA[N-(2-아세트아미드)이미노이아세트산] 완충제, PIPES[피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)] 완충제, ACES{2-[N-(2-아세트아미드)아미노]에탄술폰산} 완충제, MOPSO(3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산) 완충제, BES{2-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]에탄술폰산} 완충제, MOPS(3-모르폴리노프로판술폰산) 완충제, TES<2-{N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산> 완충제, HEPES[N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-술포에틸)피페라진] 완충제, DIPSO{3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산} 완충제, TAPSO<2-히드록시-3-{[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산> 완충제, POPSO[피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산)] 완충제, HEPPSO[N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진] 완충제, EPPS[N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진] 완충제, 트리신[N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신] 완충제, 비신[N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신] 완충제, TAPS{3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노프로판술폰산} 완충제, CHES[2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산] 완충제, CAPSO[3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산] 완충제, CAPS[3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산] 완충제 등을 들 수 있다.

단백질 분해 효소 저해제로서는 아프로티닌, 가벡세이트, 트라넥삼산, 디이소프로필ㆍ플루오로포스페이트, 포스포라미드, 바시트라신 등을 들 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 조금도 한정하지 않는다. 또한, 본 실시예에서는 하기 제조사의 기구 및 시약을 사용하였다.

EDTAㆍ2Na 및 아프로티닌 함유 진공 채혈관(니프로사 제조), 크실로스(특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 글루코스(특급; 간토 가가꾸사 제조), 만노스 (특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 갈락토스(특급; 나카라이 테스크사 제조), 말토스(특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 수크로스(특급; 간토 가가꾸사 제조), 락토스(특급; 나카라이 테스크사 제조), 트레할로스(닛본 쇼꾸힝 가고교사 제조), 아밀로스(와코 준야쿠 고교사 제조), 셀룰로스(나카라이 테스크사 제조), 덱스트란(특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 전분(용성; 간토 가가꾸사 제조), 에틸렌디아민사아세트산ㆍ2나트륨(EDTA2Na)(도진 가가꾸 겡뀨쇼사 제조), 글루콘산칼륨(특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 글루콘산나트륨(특급; 와코 준야쿠 고교사 제조), 글루콘산마그네슘 수화물(와코 준야쿠 고교사 제조), 포스포라미돈(SIGMA사 제조), 중성 엔도펩티다아제(NEP)(ERASTIN PRODUCTS사 제조).

실시예 1

단당류 첨가에 의한 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화

(1) 측정용 시료 및 대조 시료의 제조

EDTAㆍ2Na 및 아프로티닌 함유 진공 채혈관을 이용하여 인간으로부터 채혈한 채혈 후 3 시간 이내의 신선한 인간 혈장을 준비하였다. 이 인간 혈장 50 ㎕에, 200 mg/mL 크실로스 수용액, 200 mg/mL 글루코스 수용액, 200 mg/mL 만노스 수용액, 200 mg/mL 갈락토스 수용액을 각각 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 또한 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액(50 ㎕)을 각각의 혼합액에 첨가하여 시료 A 내지 D를 제조하였다. 단당류의 수용액은 정제수로 제조하였다. 인간 혈장 50 ㎕에, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 대조 시료로 하였다.

(2) 검량선의 제조 및 각 시료 중의 서브스턴스 P 농도의 측정

Substance P EIA Kit(Cayman사 제조)를 이용하여, 키트에 부속된 메뉴얼에 따라서 이하와 같이 하여 시료 A 내지 D 및 대조 시료 중의 서브스턴스 P를 2 연속으로 측정하였다.

본 키트는 아세틸콜린 에스테라제와 결합한 서브스턴스 P(서브스턴스 P AchE 트레이서)를 경합 물질로 한 경합법에 의한 효소 면역 측정법 키트이다. 본 키트의 측정은, 시료 중의 서브스턴스 P 및 경합 물질을 고상의 항 서브스턴스 P 항체와 경합적으로 반응시켜, 고상의 항 서브스턴스 P 항체와 결합한 경합 물질 중의 아세틸콜린 에스테라제를 엘만 시약의 발색을 흡광도 측정함으로써 행해지고, 미리 작성된 검량선을 기초로 시료 중의 서브스턴스 P 농도를 결정할 수 있다.

우선, 키트 중의 시약을 이용하여 EIA 버퍼(EIA Buffer), 세정 버퍼(Wash Buffer), 서브스턴스 P AchE 트레이서(Substance P AchE Tracer), 서브스턴스 P 항혈청(Substance P Antiserum), 엘만 시약(Ellman's Reagent), 및 서브스턴스 P의 농도가 각각 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8, 3.9 pg/mL인 표준 물질 용 액(Standard) 1 내지 8을 제조하였다. 즉, 엘만 시약의 제조는 하기 측정 방법에 있어서 하룻밤의 인큐베이션이 종료되기 직전에 행하였다. 이들 측정용 시약을 이용하여, 서브스턴스 P의 농도와 이하에 서술하는 것과 같은 흡광도로부터 구해지는 고상에 결합한 경합 물질량에 관련된 지표(％B/B₀) 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다. 동시에 시료 A 내지 D 및 대조 시료의 측정을 행하였다.

미리, 실온으로 복귀시켜 둔 96웰 ELISA 플레이트에, 이하의 (a) 내지 (f)의 반응 웰을 설정하고, 각각의 반응 웰에 기재된 용액을 각각 넣었다. (a) 블랭크(Blank): 아무것도 들어가지 않음, (b) 전활성(Total Activity): 아무것도 들어가지 않음, (c) 비특이 결합(Non-Specific Binding): EIA 버퍼 100 ㎕, 서브스턴스 P AchE 트레이서 50 ㎕, (d) 최대 결합(Maximun Binding): EIA 버퍼 50 ㎕, 서브스턴스 P AchE 트레이서 50 ㎕, 서브스턴스 P 항혈청 50 ㎕, (e) 표준 물질 용액 1 내지 8: 상기 표준 물질 용액 1 내지 8을 각각 50 ㎕, 서브스턴스 P AchE 트레이서 50 ㎕, 서브스턴스 P 항혈청 50 ㎕, (f) 시료(Sample): 측정용 시료(시료 A 내지 D 또는 대조 시료) 50 ㎕, 서브스턴스 P AchE 트레이서 50 ㎕, 서브스턴스 P 항혈청 50 ㎕.

키트 부속품의 플라스틱 필름으로 96웰 플레이트를 덮고, 4 ℃, 18 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트 워셔[모델 1575 이뮤노워시(Immuno Wash), 바이오라드(BIO-RAD)사 제조]로 1 반응 웰당 250 ㎕의 세정 버퍼로 5회 세정하였다. 반응 웰내에 세정 버퍼 잔액이 없는 것을 확인한 후, 엘만 시약 200 ㎕ 를 넣고, 전활성의 반응 웰에만 또한 서브스턴스 P AchE 트레이서 5 ㎕를 넣고, 차광하여 25 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트 리더(MTP-120 마이크로플레이트 리더, 코로나사 제조)로써 측정 파장 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

「표준 물질 용액 1 내지 8」의 각각의 반응 웰에서의 각 표준 용액에 있어서의 흡광도의 평균값을 B, 「최대 결합」의 반응 웰의 흡광도의 평균값을 B₀, 「비특이 결합」의 반응 웰의 흡광도의 평균값을 NSB라 하였을 때, 이하의 식으로 표시되는 값(％B/B₀)을 표준 용액 1 내지 8 각각에 대하여 계산하고, 서브스턴스 P의 농도와 ％B/B₀의 값을 플로팅하여 검량선을 작성하였다.

％B/B₀=[(B-NSB)/(B₀-NSB)]×100

각 시료에 대해서도, 흡광도로부터 동일하게 ％B/B₀의 값을 구하였다. 단, B는 2 연속 평균이 아니라, 웰 마다의 흡광도를 이용하였다. 상기에서 얻어진 검량선으로부터, 시료의 ％B/B₀의 값에 기초하여 산출한 서브스턴스 P의 농도를 각 시료의 측정값으로 하였다.

(3) 측정용 시료 중의 서브스턴스 P의 안정화

상기 측정용 시료의 제조에 이용한 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액과 인간 혈장 각각을 측정용 시료로 하고, 각각의 시료 중의 서브스턴스 P를 Substance P EIA Kit(Cayman사 제조)를 이용하여 상기 방법으로 측정하였다. 그 결과, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 중, 인간 혈장 중의 서브스턴스 P의 농도는 각각 226.16 pg/mL, 7.70 pg/mL로 결정되었다. 각각의 측정값으로부터 대조 시료 및 시료 A 내지 D의 서브스턴스 P의 이론값을 하기 식에 의해 계산하였다.

대조 시료 중의 서브스턴스 P 농도의 이론값

=(서브스턴스 P 수용액의 측정값×50+인간 혈장의 측정값×50)/100

시료 A 내지 D 중의 서브스턴스 P 농도의 이론값

=(서브스턴스 P 수용액의 측정값×50+인간 혈장의 측정값×50)/200

각 시료의 이론값과 측정값으로부터, 이하의 식에 의해 잔존율을 계산하여 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표로 하였다.

잔존율=(서브스턴스 P의 측정값의 평균값/서브스턴스 P의 이론값)×100

표 1에 각 시료의 이론값 및 측정값과 잔존율을 나타내었다.

200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 인간 혈장과 혼합하지 않고, 4 ℃에서 18 시간의 인큐베이션 시간을 포함하는 본 측정 조건하에서 측정한 경우, 226.16 pg/mL의 값을 얻었기 때문에, 상기 서브스턴스 P 수용액 중의 서브스턴스 P는 안정적으로 존재하는 것을 알았다. 한편, 대조구 시험으로 표시되는 형태로, 서브스턴스 P의 초기 농도가 116.93 pg/mL인 시료를, 4 ℃에서 18 시간의 인큐베이션 시간을 포함하는 본 측정 조건하에서 측정한 경우, 서브스턴스 P 농도가 평균 60.57 pg/mL로 측정되었기 때문에, 혈장와 공존시킨 서브스턴스 P는 불안정한 것을 알았다.

각 시료의 서브스턴스 P의 잔존율은, 대조 51.8 ％에 대하여 단당류를 첨가한 각각의 시료에서는, 시료 A(크실로스 첨가) 60.3 ％, 시료 B(글루코스 첨가) 68.5 ％, 시료 C(만노스 첨가) 83.9 ％, 시료 D(갈락토스 첨가) 78.2 ％이고, 혈장에 단당류를 첨가함으로써 혈장 중의 서브스턴스 P가 안정화되는 것이 개시되었다. 특히, 육탄당인 글루코스, 만노스, 갈락토스를 첨가한 시료에서, 대조와 비교하여 유의하게(P>0.05) 서브스턴스 P가 안정화되었고, 육탄당이 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화에 보다 유용하였다. 육탄당으로서는 만노스와 갈락토스에, 보다 높은 서브스턴스 P 안정화 효과가 확인되었다.

실시예 2

이당류 첨가에 의한 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 50 ㎕에, 100 mg/mL 말토스 수용액, 100 mg/mL 수크로스 수용액, 100 mg/mL 락토스 수용액, 100 mg/mL 트레할로스 수용액을 각각 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 또한 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 50 ㎕를 각각의 혼합액에 첨가하여 시료 E 내지 H를 제조하였다. 이당류의 수용액은 정제수로 제조하였다. 인간 혈장 50 ㎕에, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 대조 시료로 하였다.

제조 직후의 시료 E, 시료 F, 시료 G, 시료 H 및 대조 시료의 각각에 대하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 각각의 시료 중의 서브스턴스 P 농도를 측정하고, 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표가 되는 잔존율을 구하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

각 시료의 서브스턴스 P의 잔존율은, 대조 51.8 ％에 대하여 이당류를 첨가한 각각의 시료에서는 시료 E(말토스 첨가) 83.6 ％, 시료 F(수크로스 첨가) 73.6 ％, 시료 G(락토스 첨가) 81.4 ％, 시료 H(트레할로스 첨가) 71.6 ％였다. 이들 시료에서는, 대조 시료와 비교하여 유의하게(P>0.05) 서브스턴스 P가 안정화되었고, 혈장에 이당류를 첨가함으로써 혈장 중의 서브스턴스 P가 안정화되는 것이 개시되었다. 특히, 말토스, 락토스가 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화에 보다 유용하였다.

실시예 3

다당류 첨가에 의한 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 50 ㎕에, 10 mg/mL 아밀로스 수용액, 10 mg/mL 셀룰로스 수용액, 10 mg/mL 덱스트란 수용액, 10 mg/mL 전분 수용액을 각각 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 또한 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액(50 ㎕)을 각각의 혼합액에 첨가하여 시료 I 내지 L을 제조하였다. 다당류의 수용액은 정제수로 제조하였다. 인간 혈장 50 ㎕에, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 대조 시료로 하였다.

제조 직후의 시료 I, 시료 J, 시료 K, 시료 L 및 대조 시료의 각각에 대하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 각각의 시료 중의 서브스턴스 P를 측정하여 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표가 되는 잔존율을 구하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

각 시료의 서브스턴스 P의 잔존율은, 대조 51.8 ％에 대하여 다당류를 첨가한 각각의 시료에서는 시료 I(아밀로스 첨가) 69.3 ％, 시료 J(셀룰로스 첨가) 72.3 ％, 시료 K(덱스트란 첨가) 71.0 ％, 시료 L(전분 첨가) 60.3 ％였다. 이들 시료에서는, 대조와 비교하여 유의하게(P>0.05) 서브스턴스 P가 안정화되었고, 다당류가 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화에 유용한 것이 개시되었다.

실시예 4

당류 첨가에 의한 혈장 중의 서브스턴스 P의 4 ℃에서의 안정화

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 50 ㎕에, 정제수로 제조한 400 mg/mL 글루코스(특급; 간토 가가꾸사 제조) 수용액 100 ㎕를 첨가하여 혼합하고, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 50 ㎕를 첨가하여 제조한 시료 M을 3개 제조하였다. 인간 혈장 50 ㎕에, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 50 ㎕ 첨가한 시료도 3개 제조하여 대조 시료로 하였다.

각각의 시료, 및 시료의 제조에 이용한 인간 혈장 및 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 중의 서브스턴스 P 농도를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하고, 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표가 되는 잔존율을 구하였다. 또한, 실시예 1에서는 4 ℃에서의 인큐베이션 시간은 18 시간이지만, 본 시험에서는 각각 16 시간, 24 시간, 48 시간으로 변경하였다.

인큐베이션 시간이 16 시간, 24 시간 및 48 시간인 시료의 제조에 이용한 인간 혈장 중의 서브스턴스 P 농도는 각각 15.02 pg/mL, 4.95 pg/mL 및 5.71 pg/mL로 결정되었다. 또한, 인큐베이션 시간이 16 시간, 24 시간 및 48 시간의 시료의 제조에 이용한 서브스턴스 P 용액의 농도는 각각 211.1 pg/mL, 208.4 pg/mL 및 197.8 pg/mL로 결정되었다. 이들 측정값으로부터, 실시예 1과 동일하게 하여 시료 중의 서브스턴스 P의 농도의 이론값을 구하고, 이론값과 측정값으로부터 잔존율을 계산하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

대조 시료에서는, 시료의 4 ℃에서의 인큐베이션 시간이 16 시간에서 24 시간, 48 시간으로 길어짐에 따라서, 시료 중의 서브스턴스 P의 잔존율이 저하되는 것에 대하여, 글루코스를 첨가한 시료에서는 인큐베이션 시간이 16 시간, 24 시간, 48 시간에서 전부 100 ％ 이상이고, 잔존율의 저하는 볼 수 없었다. 따라서, 당류는 4 ℃에 있어서의 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화에 유용하였다.

실시예 5

당류 첨가에 의한 혈장 중의 서브스턴스 P의 동결시의 안정화(그의 1)

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 50 ㎕에, 정제수로 제조한 400 mg/mL 글루코스(특급; 간토 가가꾸사 제조) 수용액 100 ㎕를 첨가하여 혼합하고, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 50 ㎕를 첨가하여 제조한 시료 N을 3개 제조하고, 각각의 시료를 -80 ℃에서 동결시켰다. 시료 N에 대하여, 동결 0 일 후(제조 직후), 7 일 후, 15 일 후의 각 시료를 실온에서 융해 후, 융해된 시료 N 중의 서브스턴스 P 농도를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하고, 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표가 되는 잔존율을 구하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.

글루코스를 첨가한 시료 N에서의 서브스턴스 P의 잔존율은 조정 직후(0 일 후) 85.8 ％와 비교하여 7 일 후 85.8 ％, 15 일 후 86.4 ％이고, 잔존율의 저하는 보이지 않았다. 따라서, 당류는 동결시에 있더라도 혈장 중의 서브스턴스 P의 안정화에 유용하였다.

실시예 6

당류 첨가에 의한 혈장 중 서브스턴스 P의 동결시의 안정화(그의 2)

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 50 ㎕에 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액을 50 ㎕ 첨가하여 제조한 시료를 6개 준비하고, 상기 시료의 각각에, 400 mg/mL의 글루코스 수용액, 2.5 mg/mL의 EDTAㆍ2Na 수용액, 60 mg/mL의 글루콘산칼륨 수용액, 40 mg/mL의 글루콘산나트륨 수용액, 50 mg/mL의 글루콘산마그네슘 수용액, 10 mmol/L의 포스포라미돈 수용액을 각각 100 ㎕ 첨가 혼합하여 시료 O 내지 S를 제조하였다. 또한, EDTAㆍ2 Na는 특허 문헌 1에, 각종 글루콘산염은 특허 문헌 2에 기재된 펩티드 안정화제이다.

제조 후, 각각의 시료를 -80 ℃에서 동결시켰다. 동결 0 일 후, 3 일 후, 13 일 후의 각 시료를 실온에서 융해 후, 융해된 각 시료 중의 서브스턴스 P 농도를 Substance P EIA Kit(Cayman사 제조)를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하고, 서브스턴스 P의 혈장 중에서의 안정성의 지표가 되는 잔존율을 구하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6으로부터, 혈장 중에 존재하는 서브스턴스 P는 동결 상태에서 EDTAㆍ2 Na, 각종 글루콘산염(글루콘산칼륨, 글루콘산나트륨, 글루콘산마그네슘), 포스포라미돈을 첨가한 경우에 비교하여, 글루코스를 첨가한 경우에 유의하게 안정화되었고, 본 발명의 안정화 방법이 혈장 중에 존재하는 서브스턴스 P의 동결 상태에서의 안정화에도 유용한 방법인 것이 판명되었다.

실시예 7

중성 엔도펩티다아제(NEP)에 의한 서브스턴스 P의 분해에 미치는 당류 첨가의 영향

실시예 1과 동일하게 제조한 인간 혈장 150 ㎕, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 150 ㎕, 및 NEP가 각각 0 U/mL, 0.1 U/mL, 1.0 U/mL 및 10.0 U/mL의 농도인 효소액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 각각 제조하였다.

동일하게 하여, 인간 혈장 150 ㎕, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 150 ㎕, 400 mg/mL 글루코스 수용액을 300 ㎕, 및 NEP가 각각 0 U/mL, 0.1 U/mL, 1.0 U/mL 및 10.0 U/mL의 농도인 효소액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 각각 제조하였다.

또한, 동일하게 하여 인간 혈장 150 ㎕, 200 pg/mL의 서브스턴스 P 수용액 150 ㎕, 10 mmol/L 포스포라미돈 수용액을 300 ㎕, 및 NEP가 각각 0 U/mL, 0.1 U/mL, 1.0 U/mL 및 10.0 U/mL의 농도인 효소액을 50 ㎕ 첨가한 시료를 각각 제조하였다.

각 시료 중의 서브스턴스 P 농도를 Substance P EIA Kit(Cayman사 제조) 이용하여 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하고, 서브스턴스 P의 잔존율을 구하였다. 결과를 표 7에 나타낸다.

표 7로부터, 서브스턴스 P는 NEP에 의해 분해되고, 분해는 NEP 농도에 의존적으로 진행되지만, 글루코스 또는 포스포라미돈이 첨가된 상태에서는 서브스턴스 P의 NEP에 의한 분해는 억제되는 것이 판명되었다.

실시예 8

서브스턴스 P의 안정화 시약

인산 완충액 81.5 mmol/L

염화나트륨 80.0 g/L

염화칼륨 0.2 g/L

EDTAㆍ2Na 0.09 g/L

아지드화나트륨 1.0 g/L

글루코스 400.0 g/L

본 발명에 의해 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법이 제공된다. 상기 안정화 방법은, 예를 들면 임상 검사에서 채취되는 생체 시료 중의 펩티드를 안정화시킬 수 있기 때문에, 임상 검사에 있어서 생체 시료 중의 마커가 되는 펩티드를 정확하게 측정할 수 있다.

Claims

펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 방법.
펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하는 것을 특징으로 하는 생체 시료의 보존 방법.
펩티드를 함유하는 생체 시료에 당류를 첨가하여 이루어지는 시료를 측정용 시료로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체 시료 중의 펩티드의 측정 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 시료가 전혈, 혈청, 혈장, 누액, 콧물, 타액, 뇨, 변, 수액, 세포, 세포 조직액 및 세포막으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체 시료인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 당류가 단당류, 이당류 또는 다당류인 방법.
제5항에 있어서, 단당류가 육탄당인 방법.
제6항에 있어서, 육탄당이 만노스 또는 갈락토스인 방법.
제5항에 있어서, 이당류가 환원성 이당류인 방법.
제8항에 있어서, 환원성 이당류가 말토스 또는 락토스인 방법.
제5항에 있어서, 다당류가 아밀로스, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서브스턴스 P인 방법.
당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료 중의 펩티드의 안정화 시약.
당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료의 보존용 시약.
당류를 함유하는 것을 특징으로 하는, 펩티드를 함유하는 생체 시료 중의 펩티드의 측정용 시약.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 시료가 전혈, 혈청, 혈 장, 누액, 콧물, 타액, 뇨, 변, 수액, 세포, 세포 조직액 및 세포막으로 이루어지는 군에서 선택되는 생체 시료인 시약.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 당류가 단당류, 이당류 또는 다당류인 시약.
제16항에 있어서, 단당류가 육탄당인 시약.
제16항에 있어서, 육탄당이 만노스 또는 갈락토스인 시약.
제16항에 있어서, 이당류가 환원성 이당류인 시약.
제19항에 있어서, 환원성 이당류가 말토스 또는 락토스인 시약.
제16항에 있어서, 다당류가 아밀로스, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분인 방법.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서브스턴스 P인 방법.