CN101228442A - 生物样品中肽的稳定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生物样品中肽的简便稳定方法及稳定试剂、含肽生物样品的简便保存方法及保存用试剂、以及生物样品中肽的正确测定方法及测定用试剂。通过向生物样品中添加糖类，可以稳定生物样品中的肽、在稳定肽的状态下保存含肽生物样品、正确地测定生物样品中的肽。根据本发明，可以稳定在临床检查中采集的生物样品中的肽，因此在临床检查中可以正确地测定作为生物样品中标记物的肽。

Description

生物样品中肽的稳定方法
技术领域
本发明涉及生物样品中肽的简便稳定方法及稳定试剂、含肽生物样品的简便保存方法及保存用试剂、以及生物样品中肽的正确测定方法及测定用试剂。
背景技术
作为溶液中肽的稳定方法，已知将肽在含有乙二胺四乙酸的溶液中静置，得到难溶性组合物的方法(参照专利文献1)，使血浆、γ-球蛋白或明胶等蛋白质共存于肽中的方法(参照非专利文献1)。
作为肽的冷冻干燥物的稳定方法，已知使葡萄糖酸盐共存的方法(参照专利文献2)。另外，已知蔗糖、麦芽糖、乳糖等糖类作为肽的冷冻干燥物的稳定剂(参照专利文献3和4)。
另外，在免疫测定法中，作为固定在固相中的抗原或抗体的稳定方法，已知使海藻糖或蔗糖等糖类共存的方法(参照专利文献5和6)。
一般而言，生物样品中的肽由于各种因素，例如生物样品中蛋白质分解酶导致的分解等，因此不稳定。作为使生物样品中的肽稳定的方法，已知添加蛋白质分解酶的抑制剂、表面活性剂或者防腐剂的方法。例如，作为生物样品中物质P的稳定方法，已知使作为蛋白质分解酶抑制剂的氟磷酸二异丙酯、磷酸阿米酮(phosphoramidon)以及杆菌肽共存的方法(参照非专利文献2)。
作为生物样品中物质P的测定，已知对血清进行酸处理后，用丙酮和乙醚萃取，并且通过酶免疫测定法测定利用反相色谱柱的HPLC纯化后的物质P的方法(参照非专利文献3)，但是该方法操作非常复杂，并且化学处理条件过于苛刻，因此不能提供正确的测定值。
生物体内的肽作为各种标记非常重要，因此需要正确地测定生物样品中的浓度，但是大多在测定所收集的生物样品的阶段已经减少，存在不能正确地测定的问题。
专利文献1：日本特开平9-208485号公报
专利文献2：日本特开平6-321800号公报
专利文献3：日本特开平5-306235号公报
专利文献4：日本特开平5-170664号公报
专利文献5：日本特表2002-508843号公报
专利文献6：日本特开2003-215127号公报
非专利文献1：Experientia，(瑞士)，1963年，第19卷，第2号，p.72-73
非专利文献2：Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，(美国)，1984年，第125卷，第2期，p.728-733
非专利文献3：Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，(美国)，1998年，第5卷，第3期，p.303-307
发明内容
本发明的目的在于提供生物样品中肽的简便稳定方法及稳定试剂、含肽生物样品的简便保存方法及保存用试剂、以及生物样品中肽的正确测定方法及测定用试剂。
本发明人对生物样品中肽的简便稳定方法进行了潜心研究，结果发现通过在生物样品中添加糖类，可以使肽稳定，由此完成了本发明。即，本发明涉及以下[1]～[22]。
[1]一种生物样品中肽的稳定方法，其中，向含肽生物样品中添加糖类。
[2]一种生物样品的保存方法，其中，向含肽生物样品中添加糖类。
[3]一种生物样品中肽的测定方法，其中，使用向含肽生物样品中添加糖类而得到的样品作为测定用样品。
[4][1]～[3]中任一项所述的方法，其中，生物样品为选自由全血、血清、血浆、泪液、鼻涕、唾液、尿、大便、脊髓液、细胞、细胞组织液和细胞膜组成的组中的生物样品。
[5][1]～[4]中任一项所述的方法，其中，糖类为单糖类、二糖类或多糖类。
[6][5]所述的方法，其中，单糖类为六碳糖。
[7][6]所述的方法，其中，六碳糖为甘露糖或半乳糖。
[8][5]所述的方法，其中，二糖类为还原性的二糖类。
[9][8]所述的方法，其中，还原性的二糖类为麦芽糖或乳糖。
[10][5]所述的方法，其中，多糖类为直链淀粉、纤维素、葡聚糖或淀粉。
[11][1]～[10]中任一项所述的方法，其中，肽为物质P。
[12]一种含肽生物样品中肽的稳定试剂，其中，含有糖类。
[13]一种含肽生物样品的保存用试剂，其中，含有糖类。
[14]一种含肽生物样品中肽的测定用试剂，其中，含有糖类。
[15][12]～[14]中任一项所述的试剂，其中，生物样品为选自由全血、血清、血浆、泪液、鼻涕、唾液、尿、大便、脊髓液、细胞、细胞组织液和细胞膜组成的组中的生物样品。
[16][12]～[15]中任一项所述的试剂，其中，糖类为单糖类、二糖类或多糖类。
[17][16]所述的试剂，其中，单糖类为六碳糖。
[18][17]所述的试剂，其中，六碳糖为甘露糖或半乳糖。
[19][16]所述的试剂，其中，二糖类为还原性的二糖类。
[20][19]所述的试剂，其中，还原性的二糖类为麦芽糖或乳糖。
[21][16]所述的试剂，其中，多糖类为直链淀粉、纤维素、葡聚糖或淀粉。
[22][12]～[21]中任一项所述的试剂，其中，肽为物质P。根据本发明，提供生物样品中肽的简便稳定方法及稳定试剂、含肽生物样品的简便保存方法及保存用试剂、以及生物样品中肽的正确测定方法及测定用试剂。
具体实施方式
(1)肽
本发明中的肽，如果是存在于生物体内的肽，则可以是任何的肽，另外也包含C末端的羧基酰胺化的物质。作为氨基酸残基数，优选5～100个，更优选5～50个，特别优选10～30个。肽优选按照临床检查目的而测定的肽，例如，可以列举物质P、降钙素、生长抑素、降钙素基因相关肽、生长激素释放因子、内皮素、内啡肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放因子、加压素、黄体生成素释放激素、胃泌素、甲状旁腺激素、利钠肽、胰泌素、胰岛素、骨钙素等，优选物质P。
(2)生物样品
作为本发明中的生物样品，可以列举例如：全血、血清、血浆、泪液、鼻涕、唾液、尿、大便、脊髓液、细胞、细胞组织液和细胞膜等，优选全血、血清、血浆、泪液、鼻涕。
(3)糖类
作为本发明中的糖类，如果是可以实现本发明的肽稳定方法的糖类则没有特别限制，可以列举单糖类、二糖类、多糖类等。
作为单糖类，可以列举例如：五碳糖、六碳糖等，优选六碳糖。作为五碳糖，可以列举例如：阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖等。作为六碳糖，可以列举例如：半乳糖、葡萄糖、塔罗糖、甘露糖、山梨糖、塔格糖、果糖、阿洛酮糖等，优选甘露糖和半乳糖。
作为二糖类，可以列举例如：还原性的二糖类及非还原性的二糖类，优选还原性的二糖类。作为还原性的二糖类，可以列举例如：麦芽糖、乳糖等，作为非还原性的二糖类，可以列举例如：蔗糖、海藻糖等。
作为多糖类，可以列举例如：直链淀粉、纤维素、葡聚糖、淀粉等，优选纤维素。
(4)生物样品中肽的稳定方法、含肽生物样品的保存方法、以及生物样品中肽的测定方法
通过将上述糖类添加到生物样品中，可以稳定该生物样品中的肽。另外，在通过向生物样品中添加上述糖类而使该生物样品中的肽稳定的状态下，可以保护该生物样品。另外，通过使用添加有上述糖类的生物样品作为测定样品，该测定样品中的肽被稳定地保存，因此可以正确地测定生物样品中的肽。添加的糖类可以是一种也可以是两种以上。生物样品优选新鲜的生物样品，优选在生物样品采集后立即或者尽早添加糖类。进一步优选将要放入所采集的生物样品的容器预先放入糖类。糖类可以以固体的状态直接添加并使其溶解于生物样品中，但是优选添加糖类溶液的方法。
本发明的生物样品中肽的稳定方法、含肽生物样品的保存方法以及生物样品中肽的测定方法中，向生物样品中添加的糖类，以在糖类添加后的生物样品中糖类的浓度使肽能够稳定保存的量添加。使用单糖类作为糖类时，单糖类添加后的该生物样品中的单糖类的浓度为例如5至600mg/mL，优选10至500mg/mL。使用二糖类作为糖类时，二糖类添加后的该生物样品中二糖类的浓度为例如5至600mg/mL，优选10至500mg/mL。使用多糖类作为糖类时，多糖类添加后该生物样品中的多糖类的浓度为例如0.1至50mg/mL，优选1至20mg/mL。
本发明的肽测定方法中，测定样品即添加了糖类的生物样品中的肽的测定，可以通过例如使用了与肽特异性结合的抗体的免疫学方法进行测定。作为免疫法方法，可以列举例如：夹心法或竞争法。也可以使用利用免疫学方法的市售测定用试剂盒。
(5)生物样品中肽的稳定试剂、含肽生物样品的保存用试剂、以及生物样品中肽的测定用试剂
本发明的生物样品中肽的稳定试剂、以及含肽生物样品的保存用试剂、以及生物样品中肽的测定用试剂，含有糖类。本发明的稳定试剂、保存用试剂、以及测定用试剂，可以是冷冻干燥品也可以是液状品。另外，特别地，本发明的测定用试剂，作为适合运送或保存的方式，可以采用试剂盒的方式。作为试剂盒，可以列举：二试剂型、三试剂型等。作为糖类，可以列举例如(3)中所述的糖类。糖类可以是一种也可以是两种以上。
作为本发明的稳定试剂、保存用试剂以及测定用试剂的一种利用形式，可以列举例如：使本发明的稳定试剂、保存用试剂以及测定用试剂预先保存在生物样品采集器具中的形式。通过该形式，可以即刻稳定所采集的生物样品中的肽。作为这样的生物样品采集器具，可以列举例如：真空采血管等。在该生物样品采集器具中所含的本发明的测定用试剂中添加生物样品得到的样品，可以直接、或者用缓冲液等水性介质适当溶解或者浓缩或稀释后作为测定样品用于测定。
本发明的稳定试剂、保存用试剂以及测定用试剂中，根据需要可以含有螯合剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲剂、蛋白质分解酶抑制剂、盐类等。作为螯合剂，可以列举乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐、二苯基二硫卡巴腙(DZ)、8-喹啉醇(OX)、6-十二烷基-4-(2-噻唑基偶氮)间苯二酚(DTAR)等。作为乙二胺四乙酸的盐，可以列举乙二胺四乙酸.二钠(EDTA.2Na)等。作为防腐剂，可以列举叠氮化钠、硫酸链霉素、对羟基苯甲酸酯类、乙二醇单苯醚。作为盐类，可以列举氯化钠、氯化钾等。
作为表面活性剂，可以列举阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳离子表面活性剂等。
作为阴离子表面活性剂，可以列举α-磺基脂肪酸酯钠等脂肪酸类阴离子表面活性剂、烷基苯磺酸钠等烷基苯类阴离子表面活性剂、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸酯钠等烷基硫酸酯类阴离子表面活性剂、α-烯烃磺酸钠等α-烯烃类阴离子表面活性剂、烷基磺酸钠等烷基磺酸类阴离子表面活性剂等。
作为非离子表面活性剂，可以列举失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯等脂肪酸类非离子表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚等烷基醚类非离子表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚等烷基苯酚类非离子表面活性剂等。
作为两性表面活性剂，可以列举烷基氨基脂肪酸钠等氨基酸类两性表面活性剂、烷基甜菜碱等甜菜碱类两性表面活性剂、烷基氧化胺等氧化胺类两性表面活性剂等。
作为阳离子表面活性剂，可以列举烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐等季铵类阳离子表面活性剂等。
作为缓冲剂，可以列举乳酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、3，3-二甲基戊二酸缓冲剂、邻苯二甲酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、二乙醇胺缓冲剂、硼酸缓冲剂、巴比妥酸盐缓冲剂、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、吲唑-醋酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、草酸缓冲剂、碳酸缓冲剂、赖氨酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。
作为Good’s缓冲剂，可以列举例如：Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]缓冲剂、MES(2-吗啉基乙烷磺酸)缓冲剂、Bis-Tris[双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷]缓冲剂、ADA[N-(2-乙酰胺基)亚氨基双醋酸]缓冲剂、PIPES[哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)]缓冲剂、ACES{2-[N-(2-乙酰胺基)氨基]乙磺酸}缓冲剂、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙磺酸)缓冲剂、BES{2-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸}缓冲剂、MOPS(3-吗啉基丙磺酸)缓冲剂、TES<2-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸>缓冲剂、HEPES[N-(2-羟乙基)-N’-(2-磺基乙基)哌嗪]缓冲剂、DIPSO{3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸}缓冲剂、TAPSO<2-羟基-3-{[N-三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸>缓冲剂、POPSO[哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙烷-3-磺酸)]缓冲剂、HEPPSO[N-(2-羟乙基)-N’-(2-羟基-3-磺基丙基)哌嗪]缓冲剂、EPPS[N-(2-羟乙基)-N’-(3-磺基丙基)哌嗪]缓冲剂、Tricine[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]缓冲剂、Bicine[N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸]缓冲剂、TAPS{3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸}缓冲剂、CHES[2-(N-环己基氨基)乙磺酸]缓冲剂、CAPSO[3-(N-环己基氨基)-2-羟基丙磺酸]缓冲剂、CAPS[3-(N-环己基氨基)丙磺酸]缓冲剂等。
作为蛋白质分解酶抑制剂，可以列举抑肽酶、加贝酯(Gabexate)、氨甲环酸(Tranexamic Acid)、氟磷酸二异丙酯、磷酸阿米酮、杆菌肽等。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但是本发明的范围不限于这些实施例。另外，本实施中，使用下述制造商的器具和试剂。
加有EDTA·2Na和抑肽酶的真空采血管(二プロ社制)、木糖(特级；和光纯药工业社制)、葡萄糖(特级；关东化学社制)、甘露糖(特级；和光纯药工业社制)、半乳糖(特级；ナカライテスク社制)、麦芽糖(特级；和光纯药工业社制)、蔗糖(特级；关东化学社制)、乳糖(特级；ナカライテスク社制)、海藻糖(日本食品化工业社制)、直链淀粉(和光纯药工业社制)、纤维素(ナカライテスク社制)、葡聚糖(特级；和光纯药工业社制)、淀粉(可溶性；关东化学社制)、乙二胺四乙酸·2Na(EDTA2Na)(同仁化学研究所社制)、葡萄糖酸钾(特级；和光纯药工业社制)、葡萄糖酸钠(特级；和光纯药工业社制)、葡萄糖酸镁水合物(和光纯药工业社制)、磷酸阿米酮(SIGMA社制)、中性肽链内切酶(NEP)(ERASTIN PRODUCTS社制)。
实施例1
通过添加单糖类血浆中物质P的稳定
(1)测定用样品及对照样品的制备
使用加有EDTA·2Na和抑肽酶的真空采血管，准备从人体采集的采血后3小时以内的新鲜人血浆。向该人血浆50μL中分别添加并混合200mg/mL木糖水溶液、200mg/mL葡萄糖水溶液、200mg/mL甘露糖水溶液、200mg/mL半乳糖水溶液100μL，进一步向各混合液中添加200pg/mL的物质P水溶液(50μL)，制备了样品A～D。单糖类的水溶液用纯化水制备。向人血浆50μL中添加200pg/mL物质P水溶液50μL得到的样品作为对照样品。
(2)标准曲线的制作及各样品中物质P浓度的测定
使用Substance P EIA Kit(Cayman社制)，根据试剂盒附带的手册，如下所述平行测定样品A～D及对照样品中的物质P。
本试剂盒是通过使用与乙酰基胆碱酯酶结合的物质P(物质PAchE示踪物)作为竞争物质的竞争法的酶免疫测定法试剂盒。本试剂盒的测定，通过使样品中的物质P和竞争物质与固相的抗物质P抗体进行竞争反应，并且利用吸光度测定与固相的抗物质P抗体结合的竞争物质中的乙酰基胆碱酯酶的Ellman’s试剂的显色来进行，并且基于预先制作的标准曲线，确定样品中物质P的浓度。
首先，使用试剂盒中的试剂，制备EIA缓冲剂(EIA Buffer)、洗涤缓冲剂(Wash Buffer)、物质P AchE示踪物(Substance P AchETracer)、物质P抗血清(Substance P Antiserum)、Ellman’s试剂(Ellman’sReagent)及物质P的浓度分别为500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9pg/mL的标准物质溶液(Standard)1～8。但是，Ellman’s试剂的制备是在下述测定方法中，在一夜的温育刚要结束之前进行。使用这些测定用试剂，制作表示物质P的浓度与由下述的吸光度求出的固相结合的竞争物质的量相关的指标(％B/B0)之间关系的标准曲线。同时，进行样品A～D及对照样品的测定。
向预先回到室温的96孔ELISA板中，设定以下的(a)～(f)的反应孔，向各个反应孔中分别放入所述的溶液。(a)空白(Blank)：什么也不放、(b)全活性(Total Activity)：什么也不放(c)非特异结合(Non-Specific Binding)：EIA缓冲剂100μL、物质P AchE示踪物50μL、(d)最大结合(Maximum Binding)：EIA缓冲剂50μL、物质P AchE示踪物50μL、物质P抗血清50μL、(e)标准物质溶液1～8：上述标准物质溶液1～8各自50μL、物质P AchE示踪物50μL、物质P抗血清50μL、(f)样品(Sample)：测定用样品(样品A～D或者对照样品)50μL、物质P AchE示踪物50μL、物质P抗血清50μL。
用试剂盒附带的塑料膜覆盖96孔板，在4℃温育18小时。温育后，通过洗板机[1575型ImmunoWash、BIO-RAD社制]每个反应孔用250μL的洗涤缓冲剂洗涤5次。确认反应孔内没有洗涤缓冲剂残液后，加入Ellman’s试剂200μL，仅在全活性的反应孔内进一步加入物质PAchE示踪物5μL，避光，在25℃温育2小时。温育后，通过板读数器(MTP-120 Microplate Reader，コロナ社制)测定波长405nm处的吸光度。
将各个“标准物质溶1～8”反应孔中内的各标准溶液的吸光度的平均值设为B、“最大结合”反应孔的吸光度的平均值设为B0、“非特异结合”反应孔的吸光度平均值设为NSB时，分别对标准溶液1～8计算以下式表示的值(％B/B0)，以物质P的浓度和％B/B0的值作图，制作了标准曲线。
％B/B0＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
对于各样品，从吸光度同样地求出％B/B0的值。但是，B不是平行测定的平均，而是使用各孔的吸光度。从上述得到的标准曲线，基于样品的％B/B0值计算出物质P的浓度，将其作为各样品的测定值。
(3)测定用样品中物质P的稳定
将在上述的测定用样品的制作中使用的200pg/mL的物质P水溶液和人血浆分别作为测定用样品，使用Substance P EIA Kit(Cayman社制)通过上述方法测定各样品中的物质P。结果200pg/mL的物质P水溶液中、人血浆中物质P的浓度分别为226.16pg/mL、7.70pg/mL。从各测定值，由下式计算对照样品及样品A～D的物质P的理论值。
对照样品中物质P浓度的理论值
＝(物质P水溶液的测定值×50+人血浆的测定值×50)/100
样品A～D中物质P浓度的理论值
＝(物质P水溶液的测定值×50+人血浆的测定值×50)/200
从各样品的理论值和测定值，由下式计算残存率，作为物质P在血浆中稳定性的指标。
残存率＝(物质P的测定值的平均值/物质P的理论值)×100
表1中表示了各样品的理论值和测定值以及残存率。
表1
样品 糖类              物质P浓度(pg/mL) 残存率(％)
  理论值 测定值1 测定值2 平均值
对照ABCD -木糖葡萄糖甘露糖半乳糖  116.9358.4658.4658.4658.46  59.937.139.048.143.1  61.333.341.150.048.3  60.5735.2340.0749.0745.74   51.860.368.583.978.2
200pg/mL的物质P水溶液未与人血浆混合、在包含4℃、18小时的温育时间的本测定条件下测定时，得到226.16pg/mL的值，由此可以判定该物质P水溶液中的物质P稳定存在。另一方面，如对照区的试验所示，物质P的初始浓度为116.93pg/mL的样品在包含4℃、18小时的温育时间的本测定条件下测定时，物质P浓度测定为平均60.57pg/mL，由此可以判定与血浆共存的物质P不稳定。
各样品的物质P的残存率，对照为51.8％，与此相对添加单糖类的各样品中，样品A(添加木糖)为60.3％、样品B(添加葡萄糖)为68.5％、样品C(添加甘露糖)为83.9％、样品D(添加半乳糖)为78.2％，可以看出，通过向血浆中添加单糖类，使血浆中的物质P稳定。特别是添加作为六碳糖的葡萄糖、甘露糖和半乳糖的样品，与对照相比显著地(P＜0.05)使物质P稳定，六碳糖对于血浆中物质P的稳定是有用的。作为六碳糖，甘露糖和半乳糖确认了更高的物质P稳定效果。
实施例2
通过添加二糖类血浆中的物质P的稳定
向与实施例1同样制备的人血浆50μL中，分别添加并混合100mg/mL麦芽糖水溶液、100mg/mL蔗糖水溶液、100mg/mL乳糖水溶液、100mg/mL海藻糖水溶液各100μL，进一步向各混合液中添加200pg/mL的物质P水溶液50μL，制备了样品E～H。二糖类的水溶液用纯化水制备。向人血浆50μL中添加200pg/mL物质P水溶液50μL得到的样品作为对照样品。
对于刚制备后的各个样品E、样品F、样品G、样品H和对照试样，通过与实施例1同样的方法测定各样品中物质P浓度，并求出作为物质P在血浆中稳定性指标的残存率。结果如表2所示。
表2
样品 糖类             物质P浓度(pg/mL) 残存率(％)
  理论值 测定值1 测定值2 平均值
对照EFGH -麦芽糖蔗糖乳糖海藻糖   116.9358.4658.4658.4658.46   59.947.341.151.440.2   61.350.544.943.843.5  60.5748.8843.0447.6241.84  51.883.673.681.471.6
各样品的物质P的残存率，对照为51.8％，与此相对添加二糖类的各样品中，样品E(添加麦芽糖)为83.6％、样品F(添加蔗糖)为73.6％、样品G(添加乳糖)为81.4％、样品H(添加海藻糖)为71.6％，这些样品与对照相比显著地(P＜0.05)使物质P稳定，可以看出，通过向血浆中添加二糖类使血浆中的物质P稳定。特别是麦芽糖、乳糖对于血浆中物质P的稳定是有用的。
实施例3
通过添加多糖类血浆中的物质P的稳定
向与实施例1同样制备的人血浆50μL中，分别添加并混合10mg/mL直链淀粉水溶液、10mg/mL纤维素水溶液、10mg/mL葡聚糖水溶液、10mg/mL淀粉水溶液各100μL，进一步向各混合液中添加200pg/mL的物质P水溶液(50μL)，制备了样品I～L。多糖类的水溶液用纯化水制备。向人血浆50μL中添加200pg/mL物质P水溶液50μL得到的样品作为对照样品。
对于刚制备后的各个样品I、样品J、样品K、样品L和对照试样，通过与实施例1同样的方法测定各样品中物质P浓度，并求出作为物质P在血浆中稳定性指标的残存率。结果如表3所示。
表3
样品 糖类            物质P浓度(pg/mL) 残存率(％)
  理论值 测定值1 测定值2 平均值
对照IJKL -直链淀粉纤维素葡聚糖淀粉   116.9358.4658.4658.4658.46   59.941.841.839.935.0   61.339.342.843.135.5   60.5740.5442.2941.5135.27   51.869.372.371.060.3
各样品的物质P的残存率，对照为51.8％，与此相对添加多糖类的各样品中，样品I(添加直链淀粉)为69.3％、样品J(添加纤维素)为72.3％、样品K(添加葡聚糖)为71.0％、样品L(添加淀粉)为60.3％，这些样品与对照相比显著地(P＜0.05)使物质P稳定，可以看出，多糖类对于血浆中的物质P稳定有效。
实施例4
通过添加糖类使血浆中的物质P在4℃下的稳定
向与实施例1同样制备的人血浆50μL中，添加并混合用纯化水制备的400mg/mL葡萄糖(特级；关东化学社制)水溶液100μL，并添加200pg/mL的物质P水溶液50μL得到样品M，制备了3个样品M。向人血浆50μL中添加200pg/mL物质P水溶液50μL得到的样品也制备3个，作为对照样品。
通过与实施例1同样的方法测定各样品、以及样品制备中使用的人血浆以及200pg/mL的物质P水溶液中的物质P浓度，并求出作为物质P在血浆中稳定性指标的残存率。另外，在实施例1中，4℃下的温育时间为18小时，而在本试验中，分别变更为16小时、24小时和48小时。
温育时间为16小时、24小时和48小时的样品制备中使用的人血浆中物质P浓度分别为15.02pg/mL、4.95pg/mL和5.71pg/mL。另外，温育时间为16小时、24小时和48小时的样品制备中使用的物质P溶液的浓度分别为211.1pg/mL、208.4pg/mL和197.8pg/mL。从这些测定值与实施例1同样地求出样品中物质P浓度的理论值，由理论值和测定值计算残存率。结果如表4所示。
表4
样品 葡萄糖 温育            物质P浓度(pg/mL) 残存率(％)
 理论值 测定值1 测定值2   平均值
对照对照对照MMM   ---+++   16小时24小时48小时16小时24小时48小时   108.1106.7101.754.053.350.9   86.463.660.956.055.152.2   87.564.050.957.952.554.4   86.9463.7855.9256.9553.7953.25   80.559.855.0105.4100.9104.7
对照样品中，随着样品在4℃下的温度时间从16小时延长为24小时、48小时，样品中物质P的残存率下降，与此相对，添加了葡萄糖的样品中，温育时间为16小时、24小时和48小时时全部为100％以上，没有发现残存率下降。因此，糖类对于4℃下血浆中物质P的稳定是有效的。
实施例5
通过添加糖类使血浆中物质P冻结时的稳定化(其一)
向与实施例1同样制备的人血浆50μL中，添加并混合用纯化水制备的400mg/mL葡萄糖(特级；关东化学社制)水溶液100μL，并添加200pg/mL的物质P水溶液50μL得到样品N，制备了3个样品N。将各个样品在-80℃冻结。对于样品N，将冻结0天后(刚制备后)、7天后、15天后的各样品在室温融化后，通过与实施例1同样的方法测定融化的样品N中物质P浓度，并求出作为物质P在血浆中的稳定性指标的残存率。结果如表5所示。
表5
样品 糖类         残存率(％)
0天 7天后   15天后
N 葡萄糖 85.8 85.8   86.4
添加了葡萄糖的样品N中物质P的残存率，与刚制备后(0天后)的85.8％相比，7天后为85.8％、15天后为86.4％，未观察到残存率下降。因此，糖类对于冻结时血浆中物质P的稳定也是有效的。
实施例6
通过添加糖类使血浆中物质P冻结时的稳定化(其二)
向与实施例1同样制备的人血浆50μL中，添加200pg/mL的物质P水溶液50μL制备样品，将该样品准备6个，向各样品中分别添加并混合400mg/mL的葡萄糖水溶液、2.5mg/mL的EDTA·2Na水溶液、60mg/mL的葡萄糖酸钾水溶液、40mg/mL的葡萄糖酸钠水溶液、50mg/mL的葡萄糖镁水溶液、10mmol/L的磷酸阿米酮水溶液各100μL，制备了样品O～T。另外，EDTA·2Na是专利文献1中、各种葡萄糖酸盐是专利文献2中记载的肽稳定剂。
制备后，将各样品在-80℃冻结。将冻结0天后、3天后、13天后的各样品在室温下融化后，使用Substance P EIA Kit(Cayman社制)、通过与实施例1同样的方法测定融化的各样品中物质P浓度，并求出作为物质P在血浆中的稳定性指标的残存率。结果如表6所示。
表6
样品          残存率(％)
  0天   3天后   13天后
O葡萄糖PEDTA·2NaQ葡萄糖酸钾R葡萄糖酸钠S葡萄糖酸镁T磷酸阿米酮   79.8104.480.074.382.987.6   78.526.431.432.242.629.0   72.332.630.130.340.125.6
从表6可以看出，血浆中存在的物质P在冻结状态下与添加了EDTA·2Na、各种葡萄糖酸盐(葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁)、磷酸阿米酮的情况相比，添加葡萄糖的情况下显著地稳定，本发明的稳定方法是对于血浆中存在的物质P的冻结状态下的稳定也有效的方法。
实施例7
糖类添加对于中性肽链内切酶(NEP)引起的物质P分解的影响
分别制备添加了与实施例1同样制备的人血浆150μL、200pg/mL的物质P水溶液150μL、以及NEP分别为0U/mL、0.1U/mL、1.0U/mL及10.0U/mL浓度的酶液50μL的样品。
同样地，分别制备添加了人血浆150μL、200pg/mL的物质P水溶液150μL、400mg/mL的葡萄糖水溶液300μL、以及NEP分别为0U/mL、0.1U/mL、1.0U/mL及10.0U/mL浓度的酶液50μL的样品。
另外，同样地分别制备添加了人血浆150μL、200pg/mL的物质P水溶液150μL、10mmol/L磷酸阿米酮水溶液300μL、以及NEP分别为0U/mL、0.1U/mL、1.0U/mL及10.0U/mL浓度的酶液50μL的样品。
使用Substance P EIA Kit(Cayman社制)，通过与实施例1同样的方法测定各样品中的物质P浓度，并求出物质P的残存率。结果如表7所示。
表7
    样品                     残存率(％)
                   NEP 浓度(U/mL)
    0     0.1   1.0   10.0
    物质P葡萄糖+物质P磷酸阿米酮+物质P     100.0100.0100.0     102.298.7103.9   93.395.8103.4   84.098.396.2
从表7可以看出，物质P被NEP分解，分解依赖于NEP的浓度进行，但是在添加葡萄糖或磷酸阿米酮的状态下，物质P的NEP分解受到抑制。
实施例8
物质P的稳定试剂
磷酸缓冲液    81.5mmol/L
氯化钠        80.0g/L
氯化钾        0.2g/L
EDTA·2Na     0.09g/L
叠氮化钠      1.0g/L
葡萄糖        400.0g/L
产业实用性
根据本发明，提供了生物样品中肽的稳定方法。该稳定方法例如可以稳定在临床检查中采集的生物样品中的肽，因此在临床检查中可以正确地测定作为生物样品中的标记物的肽。

Claims (22)

1.一种生物样品中肽的稳定方法，其中，向含肽生物样品中添加糖类。
2.一种生物样品的保存方法，其中，向含肽生物样品中添加糖类。
3.一种生物样品中肽的测定方法，其中，使用向含肽生物样品中添加糖类而得到的样品作为测定用样品。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，生物样品为选自由全血、血清、血浆、泪液、鼻涕、唾液、尿、大便、脊髓液、细胞、细胞组织液和细胞膜组成的组中的生物样品。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，糖类为单糖类、二糖类或多糖类。
6.权利要求5所述的方法，其中，单糖类为六碳糖。
7.权利要求6所述的方法，其中，六碳糖为甘露糖或半乳糖。
8.权利要求5所述的方法，其中，二糖类为还原性的二糖类。
9.权利要求8所述的方法，其中，还原性的二糖类为麦芽糖或乳糖。
10.权利要求5所述的方法，其中，多糖类为直链淀粉、纤维素、葡聚糖或淀粉。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，肽为物质P。
12.一种含肽生物样品中肽的稳定试剂，其中，含有糖类。
13.一种含肽生物样品的保存用试剂，其中，含有糖类。
14.一种含肽生物样品中肽的测定用试剂，其中，含有糖类。
15.权利要求12至14中任一项所述的试剂，其中，生物样品为选自由全血、血清、血浆、泪液、鼻涕、唾液、尿、大便、脊髓液、细胞、细胞组织液和细胞膜组成的组中的生物样品。
16.权利要求12至15中任一项所述的试剂，其中，糖类为单糖类、二糖类或多糖类。
17.权利要求16所述的试剂，其中，单糖类为六碳糖。
18.权利要求17所述的试剂，其中，六碳糖为甘露糖或半乳糖。
19.权利要求16所述的试剂，其中，二糖类为还原性的二糖类。
20.权利要求19所述的试剂，其中，还原性的二糖类为麦芽糖或乳糖。
21.权利要求16所述的试剂，其中，多糖类为直链淀粉、纤维素、葡聚糖或淀粉。
22.权利要求12至21中任一项所述的试剂，其中，肽为物质P。
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