JP6520948B2

JP6520948B2 - 蛋白質安定化剤及び蛋白質安定化方法

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Publication number: JP6520948B2
Application number: JP2016540732A
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Inventors: 史雄中島; 将松田; 朋澄野田; 山田　智; 智山田
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Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2015-08-06
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Description

本発明は、溶液状態の蛋白質に用いる蛋白質安定化剤に関する。

近年、臨床検査、診断薬の分野において、酵素免疫法や化学発光酵素免疫法等の免疫反応を利用した測定方法が広く用いられている。このような生化学的測定法における測定系（以後、単に測定系と称する）においては、多くの種類の生体由来の蛋白質を特異的かつ高精度に検出することが求められており、測定対象となる蛋白質が長期間安定である必要がある。しかしながら、多くの蛋白質は、種々の要因、例えば、温度、光、ｐＨ、塩濃度や酸化等によって容易に変性・失活し、生理活性を失ってしまうために、蛋白質の保存に際しては、それら外的因子から蛋白質を保護し、その生理活性を維持させることが重要である。

また、臨床診断に用いられる抗体（あるいは抗原）、または標識抗体（あるいは標識抗原）などは、溶液状態、凍結状態、及び凍結乾燥状態でその抗体活性、抗原性、酵素活性などの活性を保持するために、スクロース、サッカロース、ウシ血清アルブミン（以後、ＢＳＡと略す。）などを添加する方法が一般に知られている（非特許文献１）。また、特許文献１は、蛋白質を安定化させるために特定の合成高分子を用いる方法を開示している。

特開平１０−４５７９４号公報

石川栄治著、酵素免疫測定法、医学書院、１９８７年５月１日

しかしながら、上記非特許文献１に記載の各種添加剤を用いる方法では、まだ十分な安定化効果は得られていない。また、特許文献１に記載の方法では、高分子を添加することによって、溶液粘度が上がり、調製した試薬のハンドリング性が悪化するなどの問題がある。

そこで、本発明の課題は、測定系に影響を与えず、かつ、酵素、蛍光物質あるいは化学発光物質等の標識物質および測定対象物質に限定されることなく、蛋白質を溶液状態において長期間安定化することができる蛋白質安定化剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、式（１）で示される化合物が、水を含む溶液中において蛋白質を安定化することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、式（１）で示される化合物を有効成分として含有する蛋白質安定化剤が提供される。

［式（１）中、Ｘは水素原子またはメチル基を示す。ｎは３〜１７の整数である。］
本発明の蛋白質安定化剤は、蛋白質として、ペルオキシターゼ又はアルカリ性ホスファターゼを特に好適に安定化させることができる。

本発明の蛋白質安定化剤は、好ましくは水を含有する。

本発明の別の観点の発明によれば、蛋白質安定化のための、式（１）で示される化合物の使用が提供される。

また、さらに別の観点の発明によれば、蛋白質と式（１）で示される化合物とを、水を含む溶液中で共存させることを含む、蛋白質安定化方法が提供される。

本発明の蛋白質安定化剤の有効成分である式（１）の化合物は、水を含む溶液中に蛋白質と共に共存させるだけで、容易に蛋白質の活性を保持でき長期安定化を図ることができる。また、本発明の蛋白質安定化剤を蛋白質、例えば、血漿製剤蛋白質、標識免疫学的活性物質あるいは酵素と配合した蛋白質安定化溶液は、長期安定化が可能となり、臨床検査、診断薬の分野において、酵素免疫法や化学発光酵素免疫法等の免疫反応を利用した測定方法に広く用いることが可能である。

以下本発明を詳細に説明する。以下の説明において、蛋白質溶液とは、蛋白質のみが溶解している溶液、蛋白質安定化溶液とは、蛋白質と本発明の蛋白質安定化剤の両者が溶解している溶液、蛋白質安定化剤溶液とは、式（１）の化合物と水とを含有する溶液形態の本発明の蛋白質安定化剤を意味する。

本発明の蛋白質安定化剤の有効成分は式（１）で示される化合物である。式（１）中、Ｘは水素原子またはメチル基である。ｎは３〜１７の整数であり、蛋白質の安定化効果がより高くなる点で、７〜１１が好ましい。なお、末端のＮに結合する置換基は全てメチル基である。

式（１）の化合物は、例えば、２−メタクリロイルオキシエチル−２−トリメチルアンモニオエチルホスフェート（ＭＰＣ）と１−アルカンチオールとを、例えば、アルコール溶媒中、ジイソプロピルアミン等のアミン系触媒を用いて、室温下に１０〜５０時間反応させることによって合成することができる。１−アルカンチオールとしては、炭素数が４〜１８の１−アルカンチオールが好ましい。

本発明の蛋白質安定化剤は、好ましくは水を含有する。水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、また水を含有する各種緩衝液に式（１）で示される化合物が溶解したものであってもよい。各種緩衝液としては、蛋白質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、これらを混合して使用してもよい。このような溶液を上記の通り蛋白質安定化剤溶液と称する場合がある。

蛋白質安定化剤溶液中に含有される式（１）で示される化合物は、０．０１質量％以上であることが好ましく、０．１質量％以上がより好ましい。上限値としては、主溶媒である水に溶解する限り特に制限はないが、例えば、２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下である。これらの範囲であれば、蛋白質安定化剤溶液は有効な蛋白質安定化効果を示し、かつ、蛋白質の溶解、又は蛋白質溶液との混合を良好に実施できる。

式（１）で示される化合物としては、具体的には、２−［３−（ブチルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝３）、２−［３−（ヘキシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝５）、２−［３−（オクチルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝７）、２−［３−（デシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝９）、２−［３−（ドデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１１）、２−［３−（テトラデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１３）、２−［３−（ヘキサデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１５）、２−［３−（オクタデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１７）等を例示できる。

式（１）で示される化合物以外に、蛋白質安定化剤中に含有し得る化合物としては、蛋白質のさらなる安定化を目的として通常この分野で用いられるその他の試薬類等であって、例えば、糖類、安定化対象の蛋白質以外の蛋白質、塩類、界面活性剤等が挙げられる。糖類としては、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース等が挙げられる。蛋白質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。塩類としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。

次に、本発明の蛋白質安定化剤の使用方法について説明する。

本発明の蛋白質安定化剤が安定化する蛋白質としては、特に限定されないが、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ペニシリナーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチーム等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法にて汎用されるペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファダーゼ等が挙げられる。

このような蛋白質は、本発明による安定化の前に、溶媒に溶解して蛋白質溶液とされていてもよい。このような溶媒としては、蛋白質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、これらを混合して使用してもよい。

本発明の蛋白質安定化剤は、例えばこのような蛋白質で標識された抗体等を使用する測定系において、含有される蛋白質の安定化のために用いることができる。

本発明の蛋白質安定化剤は、蛋白質溶液に添加して用いることができる。あるいは、本発明の蛋白質安定化剤は、蛋白質安定化剤溶液として、対象の蛋白質を溶解させてもよい。またさらに、蛋白質溶液と蛋白質安定化剤溶液とを調製し、両溶液を混合してもよい。
いずれの場合も、蛋白質と蛋白質安定化剤とが共存する蛋白質安定化溶液中における式（１）の化合物の濃度を、０．０１〜１０質量％とすることが好ましく、０．０１〜０．１質量％とすることがより好ましい。０．０１質量％未満であると蛋白質の安定化効果が十分でなく、１０質量％を超えると溶液が泡立ちやすく、使用しにくくなる恐れがある。
本発明の蛋白質安定化剤によって蛋白質を安定化させるにあたって、蛋白質安定化溶液を保持する温度は、２℃〜４０℃が好ましい。２℃以下だと蛋白質安定化溶液が凍結する可能性があり、４０℃以上になると安定化できる期間が短くなるからである。

さらに、蛋白質安定化溶液中には、蛋白質のさらなる安定化を目的として通常この分野で用いられるその他の試薬類等の、その他の化合物が含有可能である。その他の化合物としては、本発明の蛋白質安定化剤中に含有できるものとして上述した化合物が挙げられる。

以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例においては、下記各合成例に示す式（１）の化合物を各蛋白質安定化剤の有効成分とした。

＜式（１）に示す化合物の合成＞
合成例１
２−メタクリロイルオキシエチル−２−トリメチルアンモニオエチルホスフェート１４．７６３５ｇ（０．０５０ｍｏｌ）、及び１−ブタンチオール４．９６０５ｇ（０．０５５ｍｏｌ）をエタノール（ＥｔＯＨ）８１．００ｇに溶解させ、触媒としてジイソプロピルアミン０．２２２６ｇ（０．００２２ｍｏｌ）を加え、室温で２４時間反応させた。反応終了後、反応液を濃縮し、酢酸エチルへの再沈殿操作により、式（１）で示される化合物（Ｘがメチル基且つｎ＝３）の白色粉末を得た。

合成例２
１−ブタンチオールの代わりに１−オクタンチオールを用い、モル比が合成例１と等しくなるよう、仕込み量を変更した以外は、合成例１と同様にして式（１）で示される化合物（２−［３−（オクチルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝７））の白色粉末を得た。

合成例３
１−ブタンチオールの代わりに１−デカンチオールを用い、モル比が合成例１と等しくなるよう、仕込み量を変更した以外は、合成例１と同様にして式（１）で示される化合物２−［３−（デシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝９）の白色粉末を得た。

合成例４
１−ブタンチオールの代わりに１−ドデカンチオールを用い、モル比が合成例１と等しくなるよう、仕込み量を変更した以外は、合成例１と同様にして式（１）で示される化合物２−［３−（ドデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１１）の白色粉末を得た。

合成例５
１−ブタンチオールの代わりに１−テトラデカンチオールを用い、モル比が合成例１と等しくなるよう、仕込み量を変更した以外は、合成例１と同様にして式（１）で示される化合物２−［３−（テトラデシルスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１３）の白色粉末を得た。

比較合成例１
ｎの値が式（１）に示す化合物の範囲外である化合物を次のようにして合成した。１−ブタンチオールの代わりに１−エイコサンチオールを用い、モル比が合成例１と等しくなるよう、仕込み量を変更した以外は、合成例１と同様にして式（１）で示される化合物２−［３−（エイコサスルファニル）−２−メチルプロピオニルオキシ］エチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスファート（式（１）のＸがメチル基且つｎ＝１９）の白色粉末を得た。

実施例１−１：実施例１−１−１、１−１−２
＜蛋白質安定化剤溶液の調製＞
合成例１で得られた化合物を、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）に溶解させ、終濃度が表１に示す１．０００質量％（実施例１−１−１）、及び０．１００質量％（実施例１−１−２）である２種類の蛋白質安定化剤溶液を調製した。

＜蛋白質安定化効果の評価＞
ペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、濃度が０．５質量％になるように、上記で調製した各蛋白質安定化剤溶液に溶解させて蛋白質安定化溶液を調製し、表１記載の日数、４℃でインキュベートした。インキュベート後、該蛋白質安定化溶液を、ポリスチレン製９６穴プレートに８μＬ／ｗｅｌｌで加え、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを含む０．０１質量％のクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、蛋白質との発色反応を５分間行った。続いて２Ｎの硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止させた。波長４５０ｎｍに対する吸光度を測定し、ペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体の安定化効果について評価をおこなった。
すなわち、蛋白質安定化溶液調製直後の吸光度と、上記インキュベートによる経日後の吸光度を、下記方法により測定して下記数式（１）により酵素活性残存率（％）を算出した。蛋白質安定化効果は、当該酵素活性残存率（％）により評価し、酵素活性残存率の値が高いほど蛋白質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表１に示す。

＜吸光度測定方法＞
各蛋白質安定化溶液の吸光度は、次に示す測定器を使用して、下記測定条件で測定した。
測定機器：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社製）
測定条件：エンドポイント波長４５０ｎｍ又は波長４０５ｎｍ

測定した吸光度から、下記数式（１）により酵素活性残存率（％）を算出した。

実施例１−２：実施例１−２−１、１−２−２
合成例１の化合物の代わりに合成例２の化合物を使用し、表１に示す各濃度とした以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化溶液を調製した。さらに、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果を評価した。結果を表１に示す。

実施例１−３：実施例１−３−１〜１−３−３
合成例１の化合物の代わりに合成例３の化合物を使用し、表１に示す各濃度とした以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化溶液を調製した。さらに、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果を評価した。結果を表１に示す。

実施例１−４：実施例１−４−１〜１−４−３
合成例１の化合物の代わりに合成例４の化合物を使用し、表１に示す各濃度とした以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化溶液を調製した。さらに、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果を評価した。結果を表１に示す。

実施例１−５：実施例１−５−１〜１−５−３
合成例１の化合物の代わりに合成例５の化合物を使用し、表１に示す各濃度とした以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化溶液を調製した。さらに、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果を評価した。結果を表１に示す。

比較例１−１
蛋白質安定化剤を用いずに、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）のみを使用した以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果の評価を行った。結果を表１に示す。

比較例１−２
蛋白質安定化剤としてモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンを使用し、終濃度が０．５質量％になるよう調製した蛋白質安定化溶液を用いた以外は、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化効果の評価を行った。結果を表１に示す。

比較例１−３
比較合成例１で得られた化合物を、実施例１−１と同様にして蛋白質安定化溶液の調製を試みたが、比較合成例１で得られた化合物はリン酸緩衝液に溶解しなかったため、蛋白質安定化効果を評価できなかった。

表１から明らかなように、実施例１−１〜１−５の本発明の実施形態に係る化合物を使用した蛋白質安定化剤は、各比較例と比較して顕著に蛋白質（ペルオキシダーゼ）を安定化していることが判る。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加している場合があるが、測定誤差であると思われる。

実施例２−１
＜蛋白質安定化剤溶液の調製＞
合成例１で得られた化合物を、トリス緩衝溶液（ｐＨ＝８．０）に溶解させ、終濃度が表２に示した濃度の２倍の蛋白質安定化剤溶液を調製した。

＜蛋白質安定化効果の評価＞
（１）調製した蛋白質安定化剤溶液と、アルカリ性ホスファターゼ、スクロース及びＭｇＣｌ_２を含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（蛋白質溶液）と、をそれぞれ等量混合し、蛋白質安定化溶液を調製した。該蛋白質溶液中のアルカリ性ホスファターゼ濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、スクロース濃度は２０質量％、及びＭｇＣｌ_２濃度は２ｍＭであった。
従って、蛋白質安定化溶液中には、アルカリ性ホスファターゼは０．１ｍｇ／ｍＬ含有され、該蛋白質安定化溶液中の合成例１の化合物の濃度は、表２に示した１．０００質量％である。
（２）蛋白質安定化溶液を、表２に記載の日数、２５℃でインキュベートした。インキュベート後、ポリスチレン製９６穴プレートに８μＬ／ｗｅｌｌで加え、１−ＳｔｅｐＰＮＰＰ（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、蛋白質との発色反応を７分間行った。続いて、２Ｎの水酸化ナトリウムを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止させた。波長４０５ｎｍに対する吸光度を測定し、アルカリ性ホスファターゼの安定化効果について評価をおこなった。吸光度は、波長が４０５ｎｍであることを除いては、上記と同様にして測定した。なお、蛋白質安定化効果は、上記数式（１）から求められる酵素活性残存率（％）により評価した。酵素活性残存率の値が高いほど蛋白質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表２に示す。

実施例２−２〜２−５
合成例１の化合物の代わりに合成例２〜５の化合物を使用し、表２に示す濃度となるように、実施例２−１と同様にして各蛋白質安定化溶液を調製した。さらに、実施例２−１と同様にして各実施例の蛋白質安定化効果を評価した。結果を表２に示す。

比較例２−１
蛋白質安定化剤溶液の代わりに、トリス緩衝液（ｐＨ＝８．０）のみを使用し、かつ蛋白質溶液中にスクロースを添加しない以外は、実施例２−１と同様にして蛋白質安定化効果の評価を行った。結果を表２に示す。

比較例２−２
蛋白質安定化剤溶液の代わりに、トリス緩衝液（ｐＨ＝８．０）のみを使用した以外は、実施例２−１と同様にして蛋白質安定化効果の評価を行った。結果を表２に示す。

表２から明らかなように、実施例２−１〜２−５の本発明の実施形態に係る化合物を使用した蛋白質安定化剤は、各比較例と比較して顕著に蛋白質（アルカリ性ホスファターゼ）を安定化していることが判る。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加している場合があるが、測定誤差であると思われる。

Claims

式(1)で示される化合物を有効成分として含有する蛋白質安定化剤。

［式（１）中、Ｘは水素原子またはメチル基を示す。ｎは３〜１７の整数である。］
水を含有する、
請求項１に記載の蛋白質安定化剤。
安定化させる蛋白質がペルオキシターゼ及びアルカリ性ホスファターゼの少なくとも一つである、
請求項１又は２に記載の蛋白質安定化剤。
蛋白質安定化のための、式（１）で示される化合物の使用。

［式（１）中、Ｘは水素原子またはメチル基を示す。ｎは３〜１７の整数である。］
蛋白質と式（１）で示される化合物とを、水を含む溶液中で共存させることを含む、蛋白質安定化方法。

［式（１）中、Ｘは水素原子またはメチル基を示す。ｎは３〜１７の整数である。］