CN103575876B - 一种甲状腺素标记辣根过氧化物酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲状腺素标记辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：（1）将T4与HRP分别溶于二甲基亚砜溶液和碳酸盐缓冲液中，分别制备A溶液和B溶液，然后在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持续搅拌一定时间，得溶液C，溶液C再加入氯甲酸异丁酯溶液，室温搅拌一定时间后，得溶液D，将B溶液加入溶液D进行偶联反应，得到反应混合液E。（2）反应混合液E通过透析处理除去反应混合物中未参与偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物。本发明的优点是提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于甲状腺素免疫学检测的甲状腺素标记辣根过氧化物酶。

Description

一种甲状腺素标记辣根过氧化物酶的制备方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体的是一种T4-HRP的制备方法。
背景技术
甲状腺素即3，5，3'，5'-四碘甲状腺原氨酸，简称T4(Thyroxine，T4)，是由甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌的甲状腺激素。甲状腺素的基本结构是由一个酪氨酸残基和一个酚环构成。正常人平均每日的T4分泌量为（90±9）μg，约为甲状腺内贮存量的1%。T4进入血液循环后约99.96%与结合蛋白结合，其中约60%与甲状腺素结合球蛋白（TBG）结合，30%与甲状腺素结合前白蛋白（TBPA）结合，其余与白蛋白结合。
T4具有生物活性，促进糖，脂肪，蛋白质代谢，产生能量和热，促进生长发育。甲状腺机能亢进时，甲状腺合成和分泌T4增多，血清T4增高。亚急性甲状腺炎，慢性淋巴细胞性甲状腺炎的早期，因甲状腺滤泡受破坏，T4溢出，使血中T4升高产生暂时性的轻度甲亢。甲状腺机能减退时，无论是原发，继发或其它原因，T4均减低，甲状腺缺乏或先天性发育不良，及甲状腺全切除后，血清T4降低。
临床上血清T4的检测主要采用免疫法，而且固相包被T4抗体是T4检测试剂盒的常用方式，这就需要对T4抗原进行标记以达到检测血清T4的目的。而目前市场上的T4标记抗原多要先偶联一个载体蛋白才能有效进行标记，此种方法在空间上对针对T4的抗原抗体反应必然会产生较大影响，从而导致检测结果出现偏差。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于T4免疫学检测的T4-HRP。
技术方案包括下述步骤：
一种甲状腺素标记辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将T4与HRP分别溶于二甲基亚砜溶液和碳酸盐缓冲液中，分别制备A溶液和B溶液，然后在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持续搅拌一定时间，得溶液C，溶液C再加入氯甲酸异丁酯溶液，室温搅拌一定时间后，得溶液D，将B溶液加入溶液D进行偶联反应，得到反应混合液E。
（2）反应混合液E通过透析处理除去反应混合物中未参与偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物，未偶联的小分子物质包括T4及DMSO、正三丁胺、氯甲酸异丁酯等。
进一步，步骤（1）中制备的A溶液和B溶液的浓度分别为1mg/ml和5mg/ml。
进一步，所述溶液C中T4与HRP摩尔比5-10:1。
进一步，步骤（1）中正三丁胺加入T4溶液需冰浴。
进一步，氯甲酸异丁酯加入量大于T4的物质的量。
进一步，步骤（1）中B溶液缓慢滴加到溶液D中，边滴边震荡，滴加完成后4℃持续震荡，反应20小时以上，得到反应混合液E。
偶联完成的检测采用如下方法：
按照上述步骤（1）和步骤（2）的方法，反应体系缺失T4，维持其他各反应条件不变，制备实验对照组样品。
采用紫外分光光度计对T4、T4-HRP、实验对照在200-400nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在T4-HRP、实验对照和T4对照浓度相同的情况下，如果T4-HRP的特征峰与T4特征峰及实验对照组特征峰相比多出特征吸收峰，说明偶联成功。
本发明的优点是提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于去甲肾上腺素抗体制备和免疫学检测的完全抗原，直接应用于免疫检测。
附图说明：
图1是偶联物通过分光光度计扫描鉴定图
具体实施方式：
实施例1：T4标记HRP
（1）T4（甲状腺素）5mg溶于1mlDMSO中得A溶液，HRP5mg溶于1mlpH9.6碳酸盐缓冲液中得B溶液；
（2）将体积为5ul的正三丁胺滴入A溶液中，冰浴震荡反应20分钟，得溶液C。
（3）将体积为5ul的氯甲酸异丁酯滴入溶液C中，室温震荡反应30分钟，得溶液D。
（4）将溶液D缓慢滴入B溶液中，4℃震荡反应24小时以上，得反应混合物E。
（5）反应混合物E通过透析处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用PH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物F。
（6）按照步骤（1）（2）（3）（4）（5）的方法，反应体系缺失T4，维持其他各反应条件不变，制备实验对照样品。
（7）采用紫外分光光度计对载体、小分子、偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体对照浓度相同的情况下，如果偶联物的特征峰与载体特征峰及实验对照组特征峰相比发生明显偏移，说明偶联成功。

Claims (1)

1.一种甲状腺素标记辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)T45mg溶于1mlDMSO中得A溶液，HRP 5mg溶于1mlpH9.6碳酸盐缓冲液中得B溶液；
(2)将体积为5ul的正三丁胺滴入A溶液中，冰浴震荡反应20分钟，得溶液C；
(3)将体积为5ul的氯甲酸异丁酯滴入溶液C中，室温震荡反应30分钟，得溶液D；
(4)将溶液D缓慢滴入B溶液中，4℃震荡反应24小时以上，得反应混合物E；
(5)反应混合物E通过透析处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用PH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物F；
(6)按照步骤(1)(2)(3)(4)(5)的方法，反应体系缺失T4，维持其他各反应条件不变，制备实验对照样品；
(7)采用紫外分光光度计对T4、T4-HRP、实验对照在200-400nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在T4-HRP、实验对照和T4对照浓度相同的情况下，如果T4-HRP的特征峰与T4特征峰及实验对照组特征峰相比多出特征吸收峰，说明偶联成功。
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