CN105527444A - 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法 - Google Patents

抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105527444A
CN105527444A CN201510970809.1A CN201510970809A CN105527444A CN 105527444 A CN105527444 A CN 105527444A CN 201510970809 A CN201510970809 A CN 201510970809A CN 105527444 A CN105527444 A CN 105527444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
inhibin
enzyme
detecting kit
linked immunologic
immunologic detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510970809.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105527444B (zh
Inventor
蔡华
傅剑华
曾周祥
蔡栋
操美芳
李明磊
邹玮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Original Assignee
HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN filed Critical HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Priority to CN201510970809.1A priority Critical patent/CN105527444B/zh
Publication of CN105527444A publication Critical patent/CN105527444A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105527444B publication Critical patent/CN105527444B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒和一种检测抑制素B的方法。本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒包括包被有抗抑制素Bβ亚单位抗体的酶标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标；其中，制备所述包被有抗抑制素Bβ亚单位抗体的酶标板所用的包被原是针对抑制剂Bβ亚单位特异性抗体，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体。检测抑制素B的方法是利用本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对抑制素B进行检测。因此，本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒和检测抑制素B的方法具有高灵敏度、高特异性、省时等特点，可应用于临床医疗的抑制素B的批量检测。

Description

抑制素B的酶联免疫检测试剂盒及抑制素B测试方法
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，特别涉及一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒及抑制素B测试方法。
背景技术
抑制素B是由生殖系统细胞分泌产生，与生殖能力有密切关系，对生殖功能具有内分泌、旁分泌和自分泌的调节作用。目前已经证实抑制素B是卵巢储备功能和睾丸曲细精管功能的主要标记物，可以用于卵巢因素引起的女性不孕和曲细精管功能障碍引起的男性不育检测。
目前，抑制素B的检测采用常规酶联免疫方法(ELISA)，具体操为：首先，向样本中添加预先包被的微孔板，进行孵育后，经多次洗涤，再加入二抗酶标及显色系统，通过酶标仪读取OD值，以判定样品中抑制素B的浓度。然而采用常规的酶联免疫方法检测抑制素B，由于耗时较长、检测线性狭窄，灵敏度低、抗干扰能力弱，不利于在临床医疗机构中使用。
发明内容
本发明实施例的目的在于，提供一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒及抑制素B测试方法，以克服现有测试抑制素B方法存在的耗时较长、检测线性狭窄，灵敏度低、抗干扰能力弱等的不足。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：包括包被有抗抑制素B抗体的酶标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标；其中，制备所述包被有抗抑制素B抗体的酶标板所用的包被原是针对抑制剂Bβ亚单位特异性抗体，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体。
以及，一种检测抑制素B的方法，包括采用本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对待测样品检测的步骤。
上述本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒含有针对抑制剂Bβ亚单位特异性抗体包被原的酶标板和生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体，使得因此，本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体液中抑制素B含量，如最低检测限能达到10ng/L，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，本发明对解决大批量样品的抑制素B检测技术具有重要的现实意义。
进一步地，所述生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体中的抑制素Bα亚单位单克隆抗体通过由半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫经体内免疫反应制备获得，提高了本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体液中抑制素B含量。
上述本发明检测抑制素B的方法是直接采用上述本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒进行检测抑制素B，因此，本发明检测抑制素B的方法灵敏高，特异性和抗干扰能力强，能快速同时检测大量的样品。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明抑制素B的标准曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了具有灵敏度高、特异性强、省时的酶联免疫检测试剂盒，用于抑制素B的检测。
在一实施例中，该抑制素B的酶联免疫检测试剂盒包括包被有抗抑制素B抗体的酶标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标。
这样，本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒中的酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗体，加入待测抑制素B样品，固相包被抗体和待测抑制素B反应，所以当待测的抑制素B浓度高时，则被结合在固相抗体上抑制素B多，加入的生物素标记二抗及亲和素标记酶标与被固定抑制素B结合量多，用洗涤液洗涤后加入底物液(显色液)，显色反应深，用酶标仪检测的OD值高；反之，当待测抑制素B浓度低时，则所测的OD值低。根据用已知的抑制素B浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测抑制素B的浓度。
因此，在一实施例中，本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒中的包被有抗抑制素B抗体的酶标板的制备过程中，所用的包被原是针对抑制素Bβ亚单位单克隆抗体，所用包被液是碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含明胶的该包被液。在进一步实施例中，碳酸钠缓冲液的浓度为1％(w/v)～3％(w/v)。在另一实施例中，在该封闭液中，明胶含量为0.5％(v/v)～5％(v/v)，优选为1％。
另外，包被有抗抑制素B抗体的酶标板的制备方法可以按照常规的包被抗体的酶标板的制备方法。
在另一实施例中，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体。
在进一步实施例中，所述生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体中的抑制素Bα亚单位单克隆抗体是由半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫原，再将体内免疫反应和细胞培养、纯化获得。所述生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体由该方法获得，提高了本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒特异性强、能准确灵敏地检测体液中抑制素B含量。
在一优选实施例中，半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段是由下述方法制备获得：
步骤S01：根据抑制素B编码基因INHBA，设计优势序列，进行原核表达，PCR筛选阳性克隆；
步骤S02：将所述阳性克隆转入E.coliBL21(DE3)进行培养至OD600＝0.4-0.6，加诱导剂IPTG诱导表达处理，离心收集菌体；
步骤S03：将收集的所述菌体破碎处理，并分离纯化处理，得到所述半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段。
其中，上述步骤S01中的抑制素B编码基因INHBA是从GeneBank检索的抑制素B编码基因INHBA。该抑制素B编码基因INHBA如下SEQIDNO：1所示：
上述SEQIDNO：1所述的序列公用数据库可查，如GenBank:BT006954.1。
该步骤S01中设计优势序列如SEQIDNO：2所示：
ggccacctctgctctctctctgctgacccaccccgtcctggtgctgctgctgcgctgt
cccctctgtacctgctcagcccggcctgaggccacgcccttcctggtggcccacactcgg
accagaccacccagtggaggggagagagcccgacgctcaactcccctgatgtcctggcct
该步骤S01中的原核表达是将设计优势序列转入T载体，PET-24b原核表达。
上述步骤S02中的将所述阳性克隆转入E.coliBL21(DE3)进行培养方法是将带有正确表位的阳性克隆转入E.coliBL21(DE3)，LB培养基培养，37℃震荡(150rpm)培养至OD600＝0.4-0.6。
该步骤S02中加的诱导剂为IPTG至终浓度1mM。诱导表达处理的条件可以是在30℃诱导表达6小时。
上述步骤S03中的体破碎处理方法是将离心收集菌体用pH7.4的PB重悬菌体，超声波破碎菌体，离心分离上清。
该步骤S03中的分离纯化处理是将分离的上清液进行SDS-PAGE胶分析，收集分子量约15.5KD、14KD处的蛋白带，采用NI亲和纯化目的蛋白，即得到半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段。在一实施例中，由半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫原中的载体蛋白选用牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)中的至少一种。该些载体蛋白能有效与半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段进行偶联反应生成免疫原。另外，该半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白的偶联反应方法可以按照常规的制备免疫原的方法进行。
在一实施例中，上述抑制素B的酶联免疫检测试剂盒实施例中的生物素标记二抗即生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体中的生物素标记物选用酰-N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)、酰肼(BHZ)和肼化生物胞素(BCHZ)、3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)中的至少一种。
在另一实施例中，亲和素标记酶标中的酶标物选用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种，和/或该亲和素标记酶标中的亲和素选用链霉亲和素、亲和素中的至少一种。
在一具体实施例中，上述生物素标记二抗和亲和素标记酶标构建方法可以按照下文实施例1中生物素标记二抗和亲和素标记酶标构建方法进行。
上述实施例中的优选的该生物素标记二抗和亲和素标记酶标能有效与抗体结合，从而提高本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒的灵敏度。
由上述阐述本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒的效果和作用原理的时提到，本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒在实现检测抑制素B的时候，还必须显色液等试剂。因此，该这些必要试剂可以在具体检测时临时配用。为了进一步提高本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对抑制素B检测的效率，节省配制相关试剂的时间，在一实施例中，在上述阐述的本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒的基础上，其还包括样品处理液、浓缩洗涤液、抑制素B标准品、显色液、反应终止液。
其中，为了提高显色效果，提高灵敏度，在一实施例中，当上述的亲和素标记酶标中的酶标物选用辣根过氧化物酶时，该显色液包括显色液A和显色液B。
在进一步实施例中，所述显色液A包括如下组分：
每1000mL水中含有1g～3g过氧化脲、9～11g柠檬酸、30～36gNa2HPO4·12H2O、100～300μL吐温-20，且pH＝5-5.5。在一具体实施例中，该每1000mL水中含有1g过氧化脲、10.3g柠檬酸、35.8gNa2HPO4·12H2O、100μL吐温-20，且pH＝5。
在另一实施例中，所述显色液B包括如下组分：
每1000mL蒸馏水中含有600～700mg四甲基联苯胺、9～11g柠檬酸，pH＝2.4～2.8。在一具体实施例中，每1000mL蒸馏水中含有700mg四甲基联苯胺、10.3g柠檬酸，pH＝2.4。
另外，上文所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒中所附载的处理液、浓缩洗涤液、抑制素B标准品、显色液、反应终止液具体的组分均可参见下文中的实施例1。
为了使上述各实施例中的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对抑制素B的检测更加方便快捷，本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒还可以包括如酶标版支架等部件。
因此，上述各实施例中的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒有高灵敏度、高特异性、省时等优点，且还能同时检测大量的待测抑制素B样品。
相应地，在上文所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒的基础上，本发明实施例还提供了一种快速、准确的检测抑制素B的方法。包括采用如上文所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对待测样品检测的步骤。具体的操作方法可以按照下文实施例2中的步骤进行操作检测抑制素B。理所当然的是，采用上文所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对待测样品检测后，还包括分析检测结果的步骤。
由于本发明实施例检测抑制素B的方法是直接采用上述本发明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒进行检测抑制素B，因此，本发明检测抑制素B的方法灵敏高，特异性和抗干扰能力强，能快速同时检测大量的样品。
以下通过具体实施例来举例说明抑制素B的酶联免疫检测试剂盒和抑制素B的检测方法。
实施例1：
一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其包括如下试剂和部件：
(1)包被了抗抑制素B特异抗体的酶标板；
(2)酶标板支架；
(3)100ng/L～0ng/L系列抑制素B标准品；
(4)样本处理液；
(5)生物素标记抗抑制素B抗体；
(6)辣根过氧化物酶标记亲和素；
(7)浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL；
(8)显色液：包括显色液A液和显色液B液；其中，显色液A液配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，蒸馏水1000mL，pH＝5；显色液B液配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH＝2.4；
(9)终止液，为0.2M硫酸溶液；
其中，
1.抑制素B单克隆抗体制备方法如下：
1.1半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段的合成
从GeneBank检索抑制素B编码基因INHBA，设计优势序列，转入T载体，PET-24b原核表达，PCR筛选阳性克隆。将带有正确表位的阳性克隆转入E.coliBL21(DE3)，LB培养基培养，37℃震荡(150rpm)培养至OD600＝0.4-0.6,加诱导剂IPTG至终浓度1mM,在30℃诱导表达6小时，离心收集菌体，用pH7.4的PB重悬菌体，超声波破碎菌体，离心分离上清，SDS-PAGE胶分析可见分别在分子量约15.5KD、14KD处可见明显蛋白带。采用NI亲和纯化目的蛋白，即得到半抗原人工重组抑制素B肽段。
1.2抑制素Bα亚单位单克隆抗体的制备：
以碳化而亚胺法(EDC)将半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与牛血清白蛋白偶联，偶联后的半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽作为免疫原，将80ug所述免疫原溶于80uL无菌生理盐水中，和80uL完全弗氏佐剂混合，充分乳化后从雌性Balb/c小鼠腹部皮下多点注射，以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，免疫部位为该Balb/c雌性小鼠颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从该Balb/c雌性小鼠眼眶采血，检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免疫后一周将该免疫Balb/c雌性小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌己烯雌酚/抑制素B单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过体外培养法，收集细胞培养的上清液，经离心后去除细胞碎片，上清液-20℃保存备用。
体内诱生腹水法，挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油，按照0.5mL/只进行注射，将不完全培养液中细胞浓度调至106/mL，每只预处理后的Balb/c小鼠腹腔注射1mL阳性克隆杂交瘤细胞，待7～10天，Balb/c小鼠腹部明显增大，刺穿腹腔，采集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集中间的澄清层，-20℃保存备用。用35％的饱和硫酸铵盐析法粗提细胞培养上清和腹水，最后用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的抑制素Bα亚单位单克隆抗体。
2.生物素-亲和素放大系统的构建
生物素标记二抗的构建：用0.1MNaHCO3溶液将步骤1中纯化的抑制素Bα亚单位单克隆抗体稀释为1mg/mL的抗体溶液；将生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)用二甲基甲胺溶解，形成浓度为20mg/mL的BNHS溶液；在1mL抗体溶液中加入20uLBNHS溶液，混合均匀后置于室温中，反应2小时，然后在4℃中对PBS透析24小时，滴定至工作浓度。
亲和素标记酶标的构建：以5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL双溜水中，加入新配制的0.06mol/LNaIO4水溶液(10mL双馏水+128mgNaIO4)0.5mL，混匀，于4℃的环境中放置30min；取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液(10mLH2O+0.09mL乙二醇)0.5mL，室温放置30min；加入含5mg亲和素的水溶液1mL，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/LpH＝9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；加入NaBH4溶液(5mg/mL)0.2mL，混匀，于4℃中放置2h；然后往该溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，于4℃中静置30min，离心，去上清，沉淀用少许0.02mol/LpH＝7.4的PBS缓冲液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－亲和素(HRP－SA)结合物，以0.02mol/LpH＝7.4的PBS液加至5ml，滴定至工作浓度。
实施例2
一种检测抑制素B的方法，包括如下步骤：
将获取的待测样品采用上述实施例1中的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒进行检测，具体的，采用采用上述实施例1中的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒进行检测的操作及结果计算如下：
拆开真空包装袋并取出酶标板、在室温下平衡30分钟，备用。将1000ng/L、500ng/L、250ng/L、60ng/L、10ng/L、0ng/L抑制素B校准品以1mL纯化水溶解，加入50uL到各孔中，待检样品同样以50uL加入到各孔中；将50uL样本处理液加入到各孔中，37℃孵育120分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的浓缩洗涤液洗涤5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:300稀释好的生物素标记抗抑制素B抗体100uL，37℃孵育45分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的浓缩洗涤液洗板5次，拍干；加入按1:1000稀释好的辣根过氧化酶标记亲和素100uL，37℃孵育45分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的浓缩洗涤液洗板5次，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加100uL，在暗处显色10～15分钟，每孔加入50uL的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。
1.测试结果：测定抑制素B校准品的含量曲线如图1所示。
表1实验结果
校准液浓度 0 10 60 250 500 1000
校准液OD值 0.180 0.201 0.302 0.659 1.154 1.623
待测样品OD值 0.677 0.875 0.245 0.332 0.471 0.311
待测样品浓度 256 387 27 63 134 54
其中，表1中将校准液浓度及对应OD值取以10为底的对数，三次回归拟合Log(c)-Log(OD)或Log(OD)-Log(c)曲线，计算待检样品浓度值。
2.最低检出限试验
将实施例1提供的试剂盒中0ng/L校准液检测20次，计算20次检测OD的平均值及标准差，获得最低检出限对应OD值＝平均值+2×标准差，根据实例4中所述方法计算对于浓度为：10ng/L。
由测试的最低检出限浓度可知，本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒能准确灵敏地检测体液中抑制素B含量，其灵敏度高。
3.实施例1提供的试剂盒保存实验：
将实施例1提供的试剂盒按照表2中的时间进行保藏并测定相应的数据，测试结果如表2：
表2试剂盒保存实验结果
时间(月) 0 1 3 6 9 12
OD(450nm) 0.425 0.445 0.435 0.450 0.419 0.440
浓度(ng/L) 109 120 114 122 106 117
由表2可知，浓度变化不大，试剂盒在4℃下至少可以保存12个月以上。
4.抑制素B的酶联免疫检测试剂盒干扰实验：
选择临床常见干扰因素评价本发明实施例1提供的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒的抗干扰能力，分别以血红蛋白、甘油三酯、胆红素为干扰源加入待检样品，测试待检样品加入前后的抑制素B检测值变化。以加入浓度2倍正常生理值为限，评价临床实际应用时的抗干扰能力。
表3本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒干扰实验结果
有表3可知，本发明实施例抑制素B的酶联免疫检测试剂盒具有优异的抗干扰性能，因此，其能够准确有效的对抑制素B进行检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：包括包被有抗抑制素B抗体的酶标板、生物素标记二抗、亲和素标记酶标；
其中，制备所述包被有抗抑制素B抗体的酶标板所用的包被原是针对抑制剂Bβ亚单位特异性抗体，所述生物素标记二抗为生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记抑制素Bα亚单位单克隆抗体中的抑制素Bα亚单位单克隆抗体是由半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫原，再进行体内免疫反应和细胞培养、纯化获得。
3.根据权利要求2所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所用半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段是由下述方法制备获得：
根据抑制素B编码基因INHBA设计优势序列，进行原核表达，PCR筛选阳性克隆；
将所述阳性克隆转入E.coliBL21(DE3)进行培养至OD600＝0.4-0.6，加诱导剂IPTG诱导表达处理，离心收集菌体；
将收集的所述菌体破碎处理，并分离纯化处理，得到所述半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段。
4.根据权利要求1-3任一所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记二抗中的生物素选用酰-N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)、酰肼(BHZ)和肼化生物胞素(BCHZ)、3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)中的至少一种。
5.根据权利要求1-3任一所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述亲和素标记酶标中的酶标物选用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种；和/或
所述亲和素标记酶标中的亲和素选用链霉亲和素、亲和素中的至少一种。
6.根据权利要求1-3所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：还包括样品处理液、浓缩洗涤液、抑制素B标准品、显色液、反应终止液。
7.根据权利要求6所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述亲和素标记酶标中的酶标物选用辣根过氧化物酶，且所述显色液包括显色液A和显色液B；其中，所述显色液A包括如下组分：
每1000mL水中含有1g～3g过氧化脲、9～11g柠檬酸、30～36gNa2HPO4·12H2O、100～300μL吐温-20，且pH＝5-5.5；
所述显色液B包括如下组分：
每1000mL蒸馏水中含有600～700mg四甲基联苯胺、9～11g柠檬酸，pH＝2.4～2.8。
8.根据权利要求7所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述显色液A包括如下组分：
每1000mL水中加入1g过氧化脲、10.3g柠檬酸、35.8gNa2HPO4·12H2O、100μL吐温-20，且pH＝5；
所述显色液B包括如下组分：
每1000mL蒸馏水中加入700mg四甲基联苯胺，10.3g柠檬酸，pH＝2.4。
9.根据权利要求1-3、7、8任一所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白选用牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)中的至少一种。
10.一种检测抑制素B的方法，包括采用如权利要求1-9任一所述的抑制素B的酶联免疫检测试剂盒对待测样品检测的步骤。
CN201510970809.1A 2015-12-21 2015-12-21 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法 Active CN105527444B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510970809.1A CN105527444B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510970809.1A CN105527444B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105527444A true CN105527444A (zh) 2016-04-27
CN105527444B CN105527444B (zh) 2018-08-24

Family

ID=55769796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510970809.1A Active CN105527444B (zh) 2015-12-21 2015-12-21 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105527444B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106199012A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN107389952A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 一种抑制素b测定试剂盒及其制备方法
CN108285903A (zh) * 2018-01-29 2018-07-17 国家卫生计生委科学技术研究所 一种特异性刺激抗原的制备方法
CN108982482A (zh) * 2018-08-03 2018-12-11 迪瑞医疗科技股份有限公司 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110790836A (zh) * 2019-11-22 2020-02-14 郑州安图生物工程股份有限公司 一种人抑制素b的单克隆抗体及其应用和试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1610831A (zh) * 2001-12-29 2005-04-27 韩国生命工学研究院 通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白的糖基化变化诊断癌症的方法及使用其诊断癌症的试剂盒
CN101059511A (zh) * 2006-05-18 2007-10-24 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101846684A (zh) * 2010-02-25 2010-09-29 四川大学 检测aib1的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂盒及制备方法
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1610831A (zh) * 2001-12-29 2005-04-27 韩国生命工学研究院 通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白的糖基化变化诊断癌症的方法及使用其诊断癌症的试剂盒
CN101059511A (zh) * 2006-05-18 2007-10-24 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101846684A (zh) * 2010-02-25 2010-09-29 四川大学 检测aib1的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂盒及制备方法
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯仁丰等: "《实用医学检验学》", 31 December 1996, 上海科学技术出版社 *
夏辉明等: "抑制素α、βA、βB 亚基单克隆抗体制备及其初步应用", 《中国病理生理杂志》 *
未知: "人抑制素B（INHB）ELISA试剂盒说明书", 《HTTP://XUESHU.BAIDU.COM/S?WD=PAPERURI%3A%285233802A4E8FF015F963A788CACA1ACC%29&FI》 *
潘继承: "《生物综合实验》", 30 September 2011, 华中科技大学出版社 *
贾连群等: "《现代基础医学理论与技术进展》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106199012A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
WO2018000446A1 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN107389952A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 一种抑制素b测定试剂盒及其制备方法
CN108285903A (zh) * 2018-01-29 2018-07-17 国家卫生计生委科学技术研究所 一种特异性刺激抗原的制备方法
CN108982482A (zh) * 2018-08-03 2018-12-11 迪瑞医疗科技股份有限公司 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110790836A (zh) * 2019-11-22 2020-02-14 郑州安图生物工程股份有限公司 一种人抑制素b的单克隆抗体及其应用和试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN105527444B (zh) 2018-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105527444A (zh) 抑制素b的酶联免疫检测试剂盒及抑制素b测试方法
US4228237A (en) Methods for the detection and determination of ligands
AU2007257105B8 (en) Elisa kit for detecting Sudan red and method thereof
CN1908664B (zh) 多簇抗原及制备方法、宽谱特异性多克隆抗体及其用途
DK163838B (da) Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af to monoklonale antistoffer og et proeveudstyr til brug ved denne fremgangsmaade
WO2008098438A1 (fr) Kit d'analyse elisa de détection d'un métabolite de nitrofurazone
Fuchs et al. Immunological studies of plant hormones: detection and estimation by immunological assays
CN101113981A (zh) 磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒
CN102207504A (zh) 一种酶联检测试剂盒及其制备方法
CN101413956B (zh) 一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡及其制备方法
CN101776685A (zh) 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102967709A (zh) 检测玉米赤霉烯酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102426240B (zh) 一种酶联检测试剂盒及其制备方法
CN103045541A (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体
ZA200600150B (en) Reagents, methods and kits for detecting feed enzymes
US5501988A (en) Anti hCG-β core monoclonal antibody, its production and use
NO830712L (no) Homogen immunoproeve med merket monoklonal anti-analytt
CN102206270A (zh) 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN101782579B (zh) 检测泰妙菌素药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102435743B (zh) 一种酶联检测试剂盒及其制备方法
CN105296520B (zh) 一种人肿瘤抗原3H11Ag的制备方法及其酶联免疫检测试剂盒
CN101241133A (zh) 检测沙丁胺醇残留的酶联免疫试剂盒及其使用方法
CN101271113A (zh) 检测人b淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法
Zhou et al. Development of a novel antibody probe useful for domoic acid detection
US5112738A (en) Histamine derivatives, immunogen conjugates and antibodies raised thereto

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant