CN111856040A - 定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，包括人缪勒氏管激素AMH标准品，包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体，生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体，链霉亲和素标记的酶底物以及相应的酶促发光底物。以及制备方法：(1)包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体的制备；(2)生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体工作液的制备；(3)链霉亲和素标记的酶底物工作液的制备；(4)标准品的制备；(5)洗涤液的制备。具有操作简便、操作灵敏度高、特异性好、检测成本低、样本使用量少，对于设备的要求低等的优点。
Description
技术领域
本发明本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒及制备方法。
背景技术
多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，PCOS)是导致育龄期妇女排卵障碍性不孕最常见的重要内分泌疾病之一。PCOS发病率为5％-10％，发病机制不清。1947年Jost发现抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone，AMH)表达于睾丸支持细胞，20世纪克隆AMH后，其功能逐渐被认识。
AMH又称缪勒氏管抑制素(mullerian-inhibiting substance，MIS)，属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员，由二硫键连接的多肽激素。在男性，AMH由睾丸Sertoli细胞分泌，抑制缪勒氏管的发育，参与睾丸的分化和发育。在女性出生后由卵巢颗粒细胞极少量分泌，分泌高峰在青春期和育龄期，其表达高峰在直径<4mm的窦状卵泡，在直径4-8mm的窦状卵泡AMH表达逐渐消失，始基卵泡和衰萎卵泡不分泌AMH。但也有报道，AMH最早在妊娠36周胎儿始基卵泡的颗粒细胞中测出，抑制始基卵泡募集和生长。
卵巢功能早衰(prem ature ovarian failure，POF)为妇科内分泌疾病的常见多发病之一，近年来随着肿瘤病人存活率的提高，卵巢早衰患者的发病有增高趋势。目前大多数肿瘤患者是正处于生育年龄的妇女，这些妇女由于40岁以前就绝经，给她们的生活、工作带来种种不便，并随之产生一系列相应的并发症，例如:骨质疏松、心脏病等。但对于卵巢功能早衰病人，目前尚缺乏实用的早期诊断手段，病人一旦得到诊断多已闭经，在临床上难以治疗。
抗缪勒氏管激素(AMH)主要在男性性分化方面发挥作用，也参与女性卵巢功能调节。因它对卵泡生长起一定的作用，可以作为不排卵妇女卵巢功能异常类型和程度的标记物。卵巢颗粒细胞释放的AMH在血清中可检测到，它的水平与发育的卵泡数成一定的比例。人类的卵泡数随着年龄增长而减少，因此AMH也可以作为评估卵巢年龄的标记物。
AMH检测始于上个世纪九十年代，经过近三十年的实践，已经由手工酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法发展到了全自动化学发光免疫检测。临床实践发现，最初采用ELISA检测方法的检测受样本不稳定及补体因素干扰，室间差异显着。而不稳定的检测结果对指导IVF临床实践亦会造成一定的影响。
为了弥补手工检测法相对的不足，并进一步提高AMH检测的自动化程度，AMH全自动电化学发光免疫检测试剂盒于2014年上市，AMH电化学发光免疫检测试剂盒消除了补体干扰，且不受样本类型，储存温度及储存时间的影响。以罗氏诊断试剂盒为代表的全自动电化学发光法AMH检测已经开始广泛地应用于临床，其在全球范围内的重复性和一致性均得到了广泛认可。
但是目前的AMH化学发光法检测试剂盒仍存在不少问题，如样本使用量较多，对设备要求较高等。罗氏采用的电化学发光设备由于使用磁珠，需要在检测过程依靠大型封闭系统设备给反应系统供电，且磁珠在手工操作时候容易因为洗涤吸附丢失。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种对设备要求低、检测成本低的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒及制备方法。
本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一种定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，包括人缪勒氏管激素AMH标准品，包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体，生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体，链霉亲和素标记的酶底物以及相应的酶促发光底物。
进一步地：
所述固相载体为白色不透明96孔板。所述96孔板为聚丙乙烯材质。
所述酶底物包括辣根过氧化氢酶、碱性磷酸酶。
所述包被有人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体，其中人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.5-5ug/ml。
所述化学发光试剂盒还包括用于稀释所述生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的稀释液一，所述稀释液一的配制如下：0.01M pH7.4的PB缓冲液或0.05M pH7.4的Tris缓冲液、1％酪蛋白或1％BSA、0.1％proclin300。
所述化学发光试剂盒还包括用于稀释所述链霉亲和素标记的酶底物的稀释液二，所述稀释液二的配制如下：0.1M pH7.4的TB缓冲液或0.05M pH7.4的Tris缓冲液、1％酪蛋白或1％BSA、0.1％proclin300。
所述化学发光试剂盒还包括用于稀释所述人缪勒氏管激素AMH标准品的稀释液三，所述稀释液三为含1％BSA的HEPES，或含1％BSA的PB缓冲液。
所述化学发光试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为0.01M PBST溶液。
本发明还提供了所述化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体的制备
利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-5ug/ml，按照100ul/孔加入化学发光板中，并于4℃放置16-20小时后，取出化学发光板，甩干残液进行封闭处理，干燥，冷藏保存；
(2)生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体工作液的制备
A.稀释液一的制备：
0.01M PB缓冲液pH7.4或0.05M pH7.4的Tris缓冲液，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
B.工作液的制备：
用稀释液一稀释生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体，得到生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体工作液，其稀释比例为1:500-1:5000；
(3)链霉亲和素标记的酶底物工作液的制备
A.稀释液二的制备：
0.1M TB缓冲液pH7.4或0.05M pH7.4的Tris缓冲液，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
B.工作液的制备：
用稀释液二稀释链霉亲和素标记的酶底物，其稀释比例在1:500-1:5000，得到链霉亲和素标记的酶底物工作液；
(4)标准品的制备
用于稀释人缪勒氏管激素AMH标准品的稀释液三为含1％BSA的HEPES或含1％BSA的PB缓冲液，内含0.1％proclin300，稀释浓度梯度为：0.02ng/ml、0.078ng/ml、0.313ng/ml、1.25ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml，用于制作检测标准曲线；
(5)洗涤液的制备
所述洗涤液为0.01M PBST溶液，配制1L的洗涤液：二水磷酸二氢钠9.75g、十二水磷酸氢二钠51g、氯化钠155g、Tween2010ml，内含0.1％proclin300，使用时利用超纯水20倍稀释。
本发明采用酶促化学发光法，将人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或人缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体包被于固相载体中，利用酶促催化发光底物，并利用生物素放大系统，提高了试剂盒的灵敏度和准确性；实验证明，化学发光法配合生物素放大系统是一种检测人缪勒氏管激素(AMH)的有效方法。
本发明具有如下优点：
1)化学发光法配合生物素放大系统检测系统，对样本中人缪勒氏管激素(AMH)做出很好的结果判断；
2)相比于市场上人缪勒氏管激素(AMH)酶联免疫分析法(ELISA)检测试剂盒，检测灵敏度更高，特异性更强；且因本发明试剂盒无需做血样处理，操作更为简便。与现有的全自动电化学发光法相比，对于所需设备无很高要求，可以手工操作，也可以使用各种化学发光检测设备(酶促发光设备)，实现大通量检测，免疫诊断部分可实现半自动化或全自动化批量操作。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为人缪勒氏管激素(AMH)化学发光检测试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
一、本发明试剂盒的制备
1.包被有人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体的制备
利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-5ug/ml，按照100ul/孔加入高吸附白色不透明96孔板(聚丙乙烯材质)中，并于4℃放置16-20小时后，取出化学发光板，甩干残液，利用如牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、动物或人血清等进行封闭处理，按照150ul-250ul/孔加样，37℃放置2小时或4℃放置16-20小时，甩干残液，干燥，并保存于4℃备用。
2.生物素标记的人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或人缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体的制备
利用0.1M PBS pH7.2配制10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液。按照一定比例将人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或多克隆抗体加入适量的10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液中，于室温反应1小时，利用葡聚糖凝胶分离纯化，去除游离生物素。加入0.1％BSA，放置4℃备用。
3.生物素标记的人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或人缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体工作液的制备
1)稀释液的制备：
0.01M PB缓冲液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
2)工作液的制备：
用稀释液稀释生物素标记好的人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或人缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体后得到生物素标记的人缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体或人缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体工作液，其稀释比例在1:500-1:5000，本实施案例中的稀释比例为1:1000。
4.链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶
采用戊二醇法，将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶配置成50IU/ml，取适量，加入含1.25％戊二醛的pH6.8的PBS溶液中，混匀至室温下反应过夜。收集反应液，利用PBS(pH7.2)透析4次，取适量SA溶于1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)中，与透析后的反应液混匀，于4℃反应，并加入适量0.2mol/L赖氨酸溶液。混匀，室温反应2小时，利用0.05mol/L PBS(pH7.2)透析4次。离心取上清液，至4℃备用。
购买商用链霉亲和素标记试剂盒操作也可。
5.链霉亲和素标记的辣根过氧化物没或碱性磷酸酶工作液的制备
1)稀释液的制备：
0.1M TB缓冲液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
2)工作液的制备：
用稀释液稀释链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶后得到链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液，其稀释比例在1:500-1:5000，本实验实施案例中的稀释比例为1:1000。
6.标准品的制备
人缪勒氏管激素(AMH)标准品抗原为基因重组的浓度≥95％的人人缪勒氏管激素(AMH)蛋白或国际(WHO/NIBSC)或国家中检院提供的人缪勒氏管激素(AMH)标准品物质，本发明试剂盒中涉及的人缪勒氏管激素(AMH)标准品的稀释液为含1％BSA的HEPES或含1％BSA的PB缓冲液，内含0.1％proclin300。稀释浓度梯度为：0.02ng/ml、0.078ng/ml、0.313ng/ml、1.25ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml，用于制作检测标准曲线。
7.洗涤液的制备
本发明试剂盒所述的洗涤液为0.01M PBST溶液，配制1L的洗涤液：二水磷酸二氢钠9.75g、十二水磷酸氢二钠51g、氯化钠155g、Tween2010ml，内含0.1％proclin300，使用时利用超纯水20倍稀释。
二、使用本发明试剂盒检测含人缪勒氏管激素(AMH)的方法
a.按照说明书20倍稀释浓缩洗涤液至工作浓度；
b.按照说明书稀释梯度进行标准品浓度稀释，并加入化学发光板中，50ul/孔，做好标示；
c.按照50ul/孔取标准品梯度浓度和血清/血浆样本，加入对应板孔，做好标示；
d.取生物素标记的人缪勒氏管激素(AMH)抗体工作液，按照50ul/孔加入对应板孔；
e.37℃孵育1h，取出，每孔250ul洗涤工作液，洗涤4次，拍干；
f.取链霉亲和素标记的过氧化物酶工作液或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液，按照50ul/孔加入对应反应孔；50ul/孔，放置37℃反应30min；
g.取出发光板，每孔250ul洗涤液，洗涤4次，拍干；
h.每孔加入50ul酶发光底物，读取发光值；
i.分别取标准品梯度的浓度值作为x值和发光值作为y值，制作标准曲线，获得曲线方程；将待测样本的发光值带入标准曲线，计算出待测样本的浓度值。
三、本发明试剂盒的方法学评价
3.1标准曲线
本发明试剂盒用校准品浓度(0IU/ml剔除，该值作为反应板本底考虑，不计入标准曲线范围内)作为X值，对应浓度检测的发光值RLU做Y值，以此做一元一次方程。如图1所示，所绘制的标准曲线回归方程为y＝28149x+107.2，R2＝0.9995
3.2最低检出限
本发明试剂盒在检测标准曲线的同时检测最低检出限参考品(0.05ng/ml)10次，并通过标准曲线计算最低检出限参考品的平均浓度值(x)和标准差(SD)。根据公式：检出限＝X±2SD，计算样品的最低检出限，结果如表1，本发明试剂盒对血样检测人缪勒氏管激素(AMH)的最低检出限为0.139ng/ml＜0.15IU/ml。
表1人缪勒氏管激素(AMH)化学发光检测试剂盒的最低检出限
3.3精密性
同上述3.2的检测结果，本发明试剂盒利用标准差(SD)/平均浓度值(x)所获得的比值即为精密性值，即：标准差0.003ng/ml除以平均浓度值0.062ng/ml，乘以100％，为4.838％＜15％
采用本发明试剂盒检测人缪勒氏管激素(AMH)与目前市面上所拥有的ELISA检测试剂盒相比较，具有操作简便、操作灵敏度高、特异性好(通过阴性样本和阳性样本的检测验证)、检测成本低、样本使用量少，对于设备的要求低等的优点，本发明的试剂盒可以手工操作，也可以在设备上自动化处理。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (9)
1.一种定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：包括人缪勒氏管激素AMH标准品，包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体，生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体，链霉亲和素标记的酶底物以及相应的酶促发光底物。
2.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：所述固相载体为白色不透明96孔板。
3.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：所述酶底物包括辣根过氧化氢酶、碱性磷酸酶。
4.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：所述包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体，其中人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.5-5ug/ml。
5.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：还包括用于稀释所述生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的稀释液一，所述稀释液一的配制如下：0.01M pH7.4的PB缓冲液或0.05M pH7.4的Tris缓冲液、1％酪蛋白或1％BSA、0.1％proclin300。
6.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：还包括用于稀释所述链霉亲和素标记的酶底物的稀释液二，所述稀释液二的配制如下：0.1MpH7.4的TB缓冲液或0.05M pH7.4的Tris缓冲液、1％酪蛋白或1％BSA、0.1％proclin300。
7.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：还包括用于稀释所述人缪勒氏管激素AMH标准品的稀释液三，所述稀释液三为含1％BSA的HEPES缓冲液，或含1％BSA的PB缓冲液。
8.根据权利要求1所述的定量检测人缪勒氏管激素的化学发光试剂盒，其特征在于：还包括洗涤液，所述洗涤液为0.01M PBST溶液或0.05M TBS溶液。
9.如权利要求1-8中任意一种的所述化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)包被人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体的固相载体的制备
利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-5ug/ml，按照100ul/孔加入化学发光板中，并于4℃放置16-20小时后，取出化学发光板，甩干残液进行封闭处理，干燥，冷藏保存；
(2)生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体工作液的制备
A.稀释液一的制备：
0.01M PB缓冲液pH7.4或0.05M pH7.4的Tris缓冲液，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
B.工作液的制备：
用稀释液一稀释生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体，得到生物素标记的人缪勒氏管激素AMH单克隆抗体或多克隆抗体工作液，其稀释比例为1:500-1:5000；
(3)链霉亲和素标记的酶底物工作液的制备
A.稀释液二的制备：
0.1M TB缓冲液pH7.4或0.05M pH7.4的Tris缓冲液，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；
B.工作液的制备：
用稀释液二稀释链霉亲和素标记的酶底物，其稀释比例在1:500-1:5000，得到链霉亲和素标记的酶底物工作液；
(4)标准品的制备
用于稀释人缪勒氏管激素AMH标准品的稀释液三为含1％BSA的HEPES缓冲液或含1％BSA的PB缓冲液，内含0.1％proclin300，稀释浓度梯度为：0.02ng/ml、0.078ng/ml、0.313ng/ml、1.25ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml，用于制作检测标准曲线；
(5)洗涤液的制备
所述洗涤液为0.01M PBST溶液或0.05M TBS溶液，使用时利用超纯水20倍稀释。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201030 |