CN109212180A

CN109212180A - 用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法

Info

Publication number: CN109212180A
Application number: CN201811224364.2A
Authority: CN
Inventors: 郝明; 赵存洋; 夏良雨
Original assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109212180B

Abstract

本发明涉及体外诊断领域，具体而言，涉及用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，所述保存液的溶剂为水，以所述保存液的体积计，各组分及其含量如下：缓冲盐0.02‑0.05mol/L、蛋白物质3‑30g/L、盐离子0.1‑0.4mol/L、糖类物质5‑50g/L、表面活性剂0.5‑5g/L、稳定剂50‑270g/L、防腐剂0.5‑5g/L；所述保存液的pH为7.0‑8.0。可以有效稳定甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记结合物在保存液中37℃保存7天后的活性。

Description

用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体而言，涉及用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。

背景技术

目前体外诊断领域应用常用免疫检测方法主要化学发光免疫分析(CLIA)，此方法已经广泛应用于病毒学、内分泌学、肿瘤学、生殖生理学、血液学、遗传学等医学和生物学各科的临床和科研工作中。其中酶促化学发光免疫分析中需要用到碱性磷酸酶的标记结合物，碱性磷酸酶的标记结合物的高灵敏度和良好的稳定性是高质量化学发光分析试剂的必要保证。

在化学发光试剂临床应用领域中，使用竞争法检测小分子抗原如：甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)，常需要将小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合，而小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物配制到普通的缓冲液中后很容易使其丧失活性，目前常用的酶结合物保存液不能有效地保持小分子抗原与碱性磷酸酶(ALP)结合物的活性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供的是一种涉及体外诊断试剂中用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法，特别是甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记结合物的一种保存液。用该保存液配制甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸与碱性磷酸酶标记结合物溶液，能有效的维护甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸与碱性磷酸酶标记结合物在储存和使用中的稳定性，充分满足体外诊断试剂盒的质量要求。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，所述保存液的溶剂为水，以所述保存液的体积计，各组分及其含量如下：缓冲盐0.02-0.05mol/L、蛋白物质3-30g/L、盐离子0.1-0.4mol/L、糖类物质5-50g/L、表面活性剂0.5-5g/L、稳定剂50-270g/L、防腐剂0.5-5g/L；所述保存液的pH为7.0-8.0。

甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)是由甲状腺分泌的两种含碘激素，负责调节人体物质与能量代谢，促进人体生长和发育过程。正常人血液中，T3、T4以游离型和蛋白结合型存在，两种形式呈动态平衡。血液中99.6％以上的总Τ3、总Τ4以蛋白结合型存在，仅有0.2％-0.4％的总Τ3、总Τ4作为未结合型或游离型存在于血液中。游离甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)的测定容易受到试剂缓冲液中缓冲组分、蛋白、盐离子、表面活性剂等种类及含量的影响。

本发明提供的保存液含有特定种类及含量的缓冲组分、蛋白、盐离子、表面活性剂、糖类物质、稳定剂、防腐剂等物质，各组分以以一定的比例配合，可以有效稳定甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记结合物在溶液中37℃保存7天后的活性。

其中，添加蛋白物质防止溶液中碱性磷酸酶因吸附、分子间聚合和蛋白酶水解等因素导致的变性影响。

碱性磷酸酶为一种二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶，Zn离子防止碱性磷酸酶受螯合剂影响失去锌离子失活，镁离子提高碱性磷酸酶催化水解反应效率，钠离子或钾离子提供溶液合适盐离子浓度。

增加溶剂水表面张力而导致碱性磷酸酶优先水化或者通过氢键与T4/T3和碱性磷酸酶结合物表面分子相联结，从而增加T4/T3和碱性磷酸酶结合物的稳定性。

进一步地，所述缓冲盐选自Tris、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、HEPES、MOPS、MES中的任一种。

进一步地，所述蛋白物质为选自酪蛋白、明胶、水解酪蛋白、牛血清白蛋白、羊血清、马血清中的任一种与IgG的混合物。

进一步地，所述盐离子选自氯化钠、氯化镁、氯化钾以及氯化锌中的任一种或多种。

进一步地，所述糖类物质选自海藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖中的任一种或多种。

进一步地，所述表面活性剂选自非离子性表面活性剂和阴离子性表面活性剂中的任一种或多种。

进一步地，所述稳定剂选自乙二醇、葡聚糖、聚乙二醇、甘油中的任一种或多种。

进一步地，所述防腐剂选自叠氮钠、氯霉素、庆大霉素、ProClin 300、硫酸新霉素中的任一种或多种。

优选地，在所述保存液中，所述缓冲盐的浓度为0.04-0.05mol/L。

试验发现，IgG对小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的活性保存存在很大的影响。优选地，所述蛋白物质为牛血清白蛋白与IgG的混合物。

进一步地，所述IgG为动物源性IgG。

进一步地，所述IgG包括鼠IgG、兔IgG、猴IgG、牛IgG、羊IgG中的任一种或多种，优选为鼠IgG。

优选地，在所述保存液中，所述蛋白物质的浓度为10-20g/L，所述牛血清白蛋白与鼠IgG的浓度比例为2:1。

其他动物源的IgG与鼠IgG的效果基本一致，由于鼠IgG较为生产成熟，因此优选使用。

在不同的实施例中，在保存液中，蛋白物质的浓度可以为10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L等等。

试验发现，特定的盐离子组合对小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的活性保存效果更好。优选地，所述盐离子为氯化钠、氯化镁、氯化锌的混合。

进一步地，在所述保存液中，所述氯化钠的浓度为0.1-0.26mol/L、氯化镁的浓度为0.1-5mmol/L、氯化锌的浓度为0.01-1mmol/L。

在不同的实施例中，在保存液中，氯化钠的浓度可以为0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L等等；氯化镁的浓度可以为0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L等等；氯化锌的浓度可以为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L等等。

进一步地，所述非离子性表面活性剂包括吐温20、吐温40、吐温80、曲拉通x-100、Brij 35中的任一种或多种；

所述阴离子性表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。

优选地，所述表面活性剂包括非离子性表面活性剂中的任一种或多种。

优选地，所述表面活性剂包括非离子性表面活性剂中的任两种。

优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温80中的任一种与Brij 35的组合。不同的吐温与Brij 35的组合后保存效果基本一致。

优选地，所述表面活性剂为吐温40与Brij 35的组合。

优选地，在所述保存液中，各表面活性剂的浓度相同。

优选地，在所述保存液中，所述表面活性剂的浓度为2-3g/L。

进一步地，所述葡聚糖的重均分子量为1000-200000，所述聚乙二醇的重均分子量为4000-20000。

试验发现，稳定剂为葡聚糖、聚乙二醇、甘油的组合物保存效果更好，优选地，所述稳定剂为葡聚糖、聚乙二醇、甘油的组合物。

其中，所述葡聚糖的重均分子量为150000-200000，所述聚乙二醇的重均分子量为4000-6000。

葡聚糖与聚乙二醇的重均分子量对保存效果影响较小。

优选地，在所述保存液中，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的总浓度为2-20g/L，所述甘油的浓度为50-250g/L。

如在不同的实施例中，葡聚糖和所述聚乙二醇的总浓度可以为2g/L、5g/L、8g/L、10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L等等，所述甘油的浓度可以为50g/L、80g/L、100g/L、120g/L、150g/L、180g/L、200g/L等等。

优选地，在所述保存液中，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的总浓度为15-20g/L，所述甘油的浓度为50-80g/L。

优选地，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的浓度相同。

优选地，所述防腐剂为ProClin 300或叠氮钠。不同的防腐剂，对保存液的保存效果影响很小。一般采用单一的防腐剂即可。

优选地，在所述保存液中，所述防腐剂的浓度为0.8-2g/L。如在不同的实施例中，防腐剂的浓度可以为0.8g/L、1g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L等等。

进一步地，所述小分子抗原包括甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸。

本发明还提供了上述的保存液的制备方法，包括以下步骤：

在水中加入缓冲盐，并调整溶液pH为7-8；

加入蛋白物质，搅拌，混匀；

加入盐离子，混合；

加入糖类物质，混合；

加入表面活性剂，混合；

加入稳定剂，混合；

加入防腐剂，混合，然后调整溶液pH至7.0-8.0，定容，得到所述保存液。

本发明提供的保存液的制备方法，先加缓冲盐，为其他组分的添加提供良好的溶液环境；缓冲盐添加后调整溶液的pH，主要是减少对后续添加的蛋白物质的影响；添加蛋白防止溶液中碱性磷酸酶因吸附、分子间聚合和蛋白酶水解等因素导致的变性影响；然后再一次加入盐离子，糖类物质、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，得到保存液，该保存液中各组分分散较为均一，并且其蛋白物质仍能保持很好的活性，为有效稳定甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记结合物在溶液中的活性提供良好的基础。

进一步地，调整溶液pH均采用强酸或强碱进行。

进一步地，所述强酸为HCl，所述强碱为NaOH或KOH。

进一步地，所述强酸和强碱的浓度均为0.8-2mol/L。

本发明中，保存液是作为一种广义的范围存在，如可用于短暂保存，也可以用于长久保存，也可以用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的稀释等等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中保存液含有特定种类及含量缓冲组分、蛋白、盐离子、表面活性剂、糖类物质、稳定剂、防腐剂等物质，可以有效稳定小分子抗原如甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记的结合物的保存活性。

(2)本发明提供的保存液可稳定在37℃保存小分子抗原和碱性磷酸酶标记的结合物7天后的活性。

(3)本发明提供的保存液的制备方法，制备简便易行，便于工业化生产。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，其组分为，以保存液的体积计，各组分及其含量如下：HEPES 0.05mol/L、BSA 10g/L、鼠IgG 5g/L、氯化钠9g/L、氯化镁1mmol/L、氯化锌0.1mmol/L、蔗糖10g/L、吐温40 1g/L、Brij 35 1g/L、甘油50g/L、葡聚糖200000 10g/L、聚乙二醇4000 10g/L、ProClin 300 1g/L。

制备步骤如下：

准备好洁净容器，在800ml蒸馏水中加入依次加入以下物质：

缓冲盐选择HEPES加入，搅拌使其充分混匀，使用1M HCl调整pH至7.0-7.5；

在上述溶液中加入蛋白物质BSA和鼠IgG，搅拌，使其充分混匀。

加入NaCl、MgCl₂和ZnCl₂，搅拌，使其充分混匀。

加入蔗糖，搅拌，使其充分混匀。

加入表面活性剂吐温40和Brij 35，搅拌，使其充分混匀。

加入葡聚糖2 00000和聚乙二醇4000，搅拌，使其充分混匀。

加入甘油，搅拌，使其充分混匀。

加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀。

待上述所加物质全部溶解混匀后，使用1M NaOH或1M HCl将溶液PH调整至7.0-8.0，然后使用蒸馏水将溶液定容至1L体积，最后得到甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)与碱性磷酸酶标记结合物的保存液。

实施例2

用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，其组分为，以保存液的体积计，各组分及其含量如下：HEPES 0.02mol/L、BSA 12g/L、鼠IgG 6g/L、氯化钠6g/L、氯化镁5mmol/L、氯化锌1mmol/L、蔗糖50g/L、吐温40 2.5g/L、Brij 35 2.5g/L、甘油80g/L、葡聚糖200000 1g/L、聚乙二醇4000 1g/L、ProClin 300 0.8g/L。

制备步骤如下：

准备好洁净容器，在800ml蒸馏水中加入依次加入以下物质：

加入NaCl、MgCl₂和ZnCl₂，搅拌，使其充分混匀。

加入蔗糖，搅拌，使其充分混匀。

加入表面活性剂吐温40和Brij 35，搅拌，使其充分混匀。

加入葡聚糖2 00000和聚乙二醇4000，搅拌，使其充分混匀。

加入甘油，搅拌，使其充分混匀。

加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀。

实施例3

用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，其组分为，以保存液的体积计，各组分及其含量如下：HEPES 0.05mol/L、BSA 7g/L、鼠IgG 3.5g/L、氯化钠15g/L、氯化镁0.1mmol/L、氯化锌0.01mmol/L、蔗糖5g/L、吐温40 0.25g/L、Brij 35 0.25g/L、甘油250g/L、葡聚糖2000007.5g/L、聚乙二醇4000 7.5g/L、ProClin 300 2g/L。

制备步骤如下：

准备好洁净容器，在800ml蒸馏水中加入依次加入以下物质：

加入NaCl、MgCl₂和ZnCl₂，搅拌，使其充分混匀。

加入蔗糖，搅拌，使其充分混匀。

加入表面活性剂吐温40和Brij 35，搅拌，使其充分混匀。

加入葡聚糖2 00000和聚乙二醇4000，搅拌，使其充分混匀。

加入甘油，搅拌，使其充分混匀。

加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀。

实施例4

与实施例1不同的是，缓冲盐由HEPES替换为Tris，其他均相同。

实施例5

与实施例1不同的是，盐离子中的氯化钠替换为氯化钾，其他均相同。

实施例6

与实施例1不同的是，将蔗糖替换为海藻糖，其他均相同。

实施例7

与实施例1不同的是，将吐温40替换为吐温20，其他均相同。

实施例8

与实施例1不同的是，葡聚糖替换为重均分子量为150000，聚乙二醇替换为重均分子量为6000，其他均相同。

实施例9

与实施例1不同的是，盐离子只含有氯化钠和氯化镁，其他均相同。

实施例10

与实施例1不同的是，表面活性剂只含有十二烷基硫酸钠，其在保存液中的浓度为2g/L，其他均相同。

实施例11

与实施例1不同的是，表面活性剂为十二烷基硫酸钠和吐温40，其在保存液中的浓度均为1g/L，其他均相同。

实施例12

与实施例1不同的是，稳定剂只含有甘油，其在保存液中的浓度为50g/L，其他均相同。

对比例1

与实施例1不同的是，不添加鼠IgG，其他均相同。

对比例2

按以下配方配制溶液：

缓冲盐：Tris浓度0.05mol/L；

蛋白物质：BSA浓度10g/L；

盐离子：氯化钠9g/L、氯化镁1mmol/L、氯化锌0.1mmol/L、氯化钙5mmol/L；

防腐剂：ProClin 300浓度为0.5g/L。

制备步骤如下：

准备好洁净容器，在800ml蒸馏水中加入依次加入以下物质：

缓冲盐选择Tris加入，搅拌使其充分混匀，使用1M HCl调整pH至7.0-7.5；

在上述溶液中加入蛋白物质BSA，搅拌，使其充分混匀。

加入NaCl、MgCl₂、ZnCl₂和CaCl₂，搅拌，使其充分混匀。

加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀；

用盐酸调节pH值至7.5，定容至1L体积，即可。

实验例

将甲状腺素(T4)与碱性磷酸酶标记结合物加入上述实施例制得的保存液中，得到酶标试剂。

将该试剂分成两份，一份放置与37℃恒温箱内进行加速老化实验，一份放置与2-8℃冰箱内保存。试剂放置7天后，取出平衡至室温，以2-8℃冰箱保存的酶标试剂作为对照，使用两份酶标试剂同步进行检测实验。在加有样本的反映杯中加入磁分离试剂和酶标试剂混合37℃反应20分钟，反应完成后清洗，加入发光底物检测发光值。

37℃加速7天后发光值结果如表1所示。

表1

从检测结果可以看出，在本实施例的基础上，未加鼠IgG的保存液中，FT4酶标试剂发光值降幅为14％左右；而改变配方的组分，FT4酶标试剂发光值降幅为15％-33％左右。另外，组分的配比关系以及组分种类对保存液的保存效果有一定的影响。

将表1中的甲状腺素替换为三碘甲状腺原氨酸，本发明提供的保存液进行加速7天发光值降幅检测，实施例1-8的发光值降幅均在2％以内，实施例9-12的发光值降幅均在8％以内，而对比例1和对比例2的发光值降幅均在15％以上。

说明，本发明提供的保存液，可稳定在37℃保存小分子抗原和碱性磷酸酶标记的结合物7天后的活性。

另外，需要说明的是，相对于实施例1来说，缓冲盐替换为其他种类如NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、MOPS、MES等，保存效果与实施例1没有明显差别。

相对于实施例1来说，糖类物质替换为其他种类，如果糖、葡萄糖、甘露糖，保存效果与实施例1没有明显差别。

相对于实施例1来说，葡聚糖与聚乙二醇采用不同的重均分子量，保存效果与实施例1没有明显差别。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液，其特征在于，所述保存液的溶剂为水，以所述保存液的体积计，各组分及其含量如下：缓冲盐0.02-0.05mol/L、蛋白物质3-30g/L、盐离子0.1-0.4mol/L、糖类物质5-50g/L、表面活性剂0.5-5g/L、稳定剂50-270g/L、防腐剂0.5-5g/L；所述保存液的pH为7.0-8.0。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述缓冲盐选自Tris、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、HEPES、MOPS、MES中的任一种；

进一步地，所述蛋白物质为选自酪蛋白、明胶、水解酪蛋白、牛血清白蛋白、羊血清、马血清中的任一种与IgG的混合物；

进一步地，所述盐离子选自氯化钠、氯化镁、氯化钾以及氯化锌中的任一种或多种；

进一步地，所述糖类物质选自海藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖中的任一种或多种；

进一步地，所述表面活性剂选自非离子性表面活性剂和阴离子性表面活性剂中的任一种或多种；

进一步地，所述稳定剂选自乙二醇、葡聚糖、聚乙二醇、甘油中的任一种或多种；

3.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，在所述保存液中，所述缓冲盐的浓度为0.04-0.05mol/L。

4.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述蛋白物质为牛血清白蛋白与鼠IgG的混合物；

进一步地，所述IgG为动物源性IgG；

进一步地，所述IgG包括鼠IgG、兔IgG、猴IgG、牛IgG、羊IgG中的任一种或多种，优选为鼠IgG；

5.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述盐离子为氯化钠、氯化镁、氯化锌的混合；

进一步地，在所述保存液中，所述氯化钠的浓度为0.1-0.26mol/L、氯化镁的浓度为0.1-5mmol/L、氯化锌的浓度为0.01-1mmol/L；

优选地，在所述保存液中，所述氯化钠的浓度为0.1-0.26mol/L、氯化镁的浓度为0.1-5mmol/L、氯化锌的浓度为0.01-1mmol/L。

6.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述非离子性表面活性剂包括吐温20、吐温40、吐温80、曲拉通x-100、Brij 35中的任一种或多种；

所述阴离子性表面活性剂包括十二烷基硫酸钠；

优选地，所述表面活性剂包括非离子性表面活性剂中的任一种或多种；

优选地，所述表面活性剂包括非离子性表面活性剂中的任两种；

优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温80中的任一种与Brij 35的组合；

优选地，所述表面活性剂为吐温40与Brij 35的组合；

优选地，在所述保存液中，各表面活性剂的浓度相同；

优选地，在所述保存液中，所述表面活性剂的浓度为2-3g/L。

7.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述葡聚糖的重均分子量为1000-200000，所述聚乙二醇的重均分子量为4000-20000；

优选地，所述稳定剂为葡聚糖、聚乙二醇、甘油的组合物；

优选地，所述葡聚糖的重均分子量为150000-200000，所述聚乙二醇的重均分子量为4000-6000；

优选地，在所述保存液中，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的总浓度为2-20g/L，所述甘油的浓度为50-250g/L；

优选地，在所述保存液中，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的总浓度为15-20g/L，所述甘油的浓度为50-80g/L；

优选地，所述葡聚糖和所述聚乙二醇的浓度相同。

8.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300或叠氮钠；

优选地，在所述保存液中，所述防腐剂的浓度为0.8-2g/L；

进一步地，所述保存液用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存

9.权利要求1-8任一项所述的保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在水中加入缓冲盐，并调整溶液pH为7-8；

加入蛋白物质，搅拌，混匀；

加入盐离子，混合；

加入糖类物质，混合；

加入表面活性剂，混合；

加入稳定剂，混合；

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，调整溶液pH均采用强酸或强碱进行；

进一步地，所述强酸为HCl，所述强碱为NaOH或KOH；

进一步地，所述强酸和强碱的浓度均为0.8-2mol/L。