CN110187098A - 一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法，采用先制备PBST缓冲液，再将胰蛋白酶消化酪蛋白、PEG‑6000、青‑链霉素加入其中混匀过滤除菌制得。这种稀释稳定剂能够有效地延缓酶标抗体的生物活性降低，用于禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒中酶标抗体的稀释稳定，经稀释的酶标抗体可在2～8℃保存至少15个月而活性基本不发生改变，当禽流感病毒H7亚型阳性参考血清稀释至64倍时，仍能被检测出阳性，敏感性很强；此外，这种稀释稳定剂对一些常见的酶标抗体的生物活性也具有比较好的效果。

Description

一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于诊断生物制品技术领域，特别是涉及辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂制备方法及其在一种禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
背景技术
禽流感一直是影响我国禽业发展的疫病之一，疫苗免疫推广后就面临免疫后抗体水平的监测。常规的检测禽流感病毒抗体的方法是血凝抑制(HI)试验，但是HI试验操作过程繁琐，对结果的判定具有较强的主观性。鉴于此，研发出一种禽流感ELISA抗体检测试剂盒显得尤为重要。
酶标抗体(即辣根过氧化物酶标抗体)一般只能将其原液在-20℃甚至更低温度条件下贮藏时不经过反复冻融，其免疫活性才能在贮藏一年时间内不会大量地降低，有效地保证诊断方法结果的可靠性。因此，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这种保存方法，不仅会在冻干时影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中也颇为不便。常规的诸如PBS和Tris的缓冲液将其稀释至工作浓度时并不能长期保存，需要现配现用，这也给操作带来不便，不能保证试剂盒的稳定性。对该试剂盒的商品化而言，其关键技术难点之一，是如何将酶标抗体浓缩液稀释成可直接使用的酶标抗体后，在2～8℃甚至在室温条件(15～25℃)下进行保存及运输，还能确保试剂盒内酶标抗体活性不发生改变。
大量的研究报道表明一些保护性蛋白、稳定剂等对酶标抗体的活性具有一定的保护性。但是，每一种酶标抗体稳定剂都不是广谱的，需要调整相关的配方来验证其作用，因此探索研制一种可以有效保护禽流感病毒H7亚型单抗酶标抗体活性在2～8℃或室温条件下长期保存时不会发生改变的稀释稳定剂，以保证试剂盒稳定性、结果准确性和操作便易性，对试剂盒商品化和推广显得尤为重要。
现有技术中，例如专利号为201811068030.0的专利“一种口蹄疫O型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用”中公开了其所用的“样品稀释液为含0.5M NaCl、2.68mM KCl、2.79mM KHPO、8.1mM NaHPO、5g/L酪蛋白、0.05％Tween20和10mM PBS的混合溶液”。例如专利号为201710867274.4的专利“一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法”中，也公开了“所述试剂R1的稳定剂为牛血清蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或多种……所述试剂R2的稳定剂为牛血清蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、乙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或几种”。还例如专利号为201810743225.4的专利“一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒”中，公开了“试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二钠中的一种……所述封闭剂至少为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种”。这些现有技术，都是直接采用酪蛋白、海藻糖、蔗糖等为原料制备样品稀释液，酶标抗体被这些稀释液稀释后，酶标抗体在2～8℃下的保存时间仍可进一步延长，防止酶标抗体活性的效果也还具有较大的优化和提升空间。此外，当禽流感病毒H7亚型阳性参考血清在较大稀释度情况下，酶标抗体的检测敏感度也相对不高。
发明内容
相比于现有技术，本发明提供了一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，能够将经过稀释的酶标抗体在2～8℃下的保存时间至少延长至15个月，当禽流感病毒H7亚型阳性参考血清在64倍的稀释度下，酶标抗体仍能够检测出阳性，敏感性非常强。具体通过以下技术实现。
一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入5～10g胰蛋白酶消化酪蛋白、1～5g PEG-6000、5～10mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
优选地，步骤S2为：每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g胰蛋白酶消化酪蛋白、2.8gPEG-6000、8mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
上述辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂在制备时，使用含有保护性蛋白胰蛋白酶消化酪蛋白和PEG-6000，两者在功能上相互补充，可有效防止酶标抗体活性降低，青-链霉素作为一种广谱抗生素，代替了常规的试剂盒防腐剂，三者的共同作用，使采用上述稀释稳定剂稀释的酶标抗体可在2～8℃保存15个月以上而其活性基本不发生改变，这三种物质在试剂盒的稀释稳定剂中是首次使用，在以往的相关专利、期刊上未曾发现类似技术，是一种新型、绿色、高效的酶结合物溶液的稀释稳定剂，且易于配制，成本低，具有较大价格优势。
本发明还基于上述种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，将其用于禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒中，试剂盒包括酶标抗体、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物显色液和终止液，所述酶标抗体采用所述稀释稳定剂按1:1000的比例进行了稀释。
优选地，所述禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒的具体使用方法为：
P1、取动物全血，血液凝固后4000r/min离心10min，取上清液；
P2、将20倍浓缩的洗涤液恢复至20～25℃，并摇动使沉淀溶解，然后用蒸馏水或去离子水20倍稀释，即得洗涤液；
P3、将步骤P1所得上清液在血清稀释板中用所述样品稀释液10倍稀释混匀，得混合液；
P4、用洗涤液洗涤抗原包被板1次，将混合液、阴性对照和阳性对照各取50μl加至抗原包被板中，混合液设1个反应孔，阴性对照、阳性对照各设2个反应孔，每个孔同时加入酶标抗体50μl；轻轻振匀孔中样品，在37℃下温育45min；
P5、弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μl，重复洗涤5次，最后1次洗涤后拍干；
P6、每个反应孔加入显色液100μl，在20～25℃下避光显色15min；
P7、每个反应孔加终止液50μl，10min内测定结果。
更优选地，步骤P2为：将20倍浓缩的洗涤液恢复至20～25℃，然后在37℃水浴锅中加热5～10min并摇动使沉淀溶解，用蒸馏水或去离子水稀释20倍，即得洗涤液。
更优选地，步骤P7中，每次测定前在振荡器上震动3～5s。震动的目的是使加入的试剂混匀。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，含有保护性蛋白胰蛋白酶消化酪蛋白、PEG-6000和青-链霉素，三者相互补充，经本稀释稳定剂稀释的酶标抗体在2～8℃保存的时间延长至至少15个月。在试剂盒领域中，采用这三种物质单独使用或是三者联用的方式，填补了技术空白，在论文及现有专利技术中均未曾有过报道。
2、本发明提供稀释稳定剂稀释的酶标抗体的敏感性非常强，当禽流感病毒H7亚型阳性参考血清稀释至64倍时，仍能被检测出阳性；
3、经试验证实，本发明提供稀释稳定剂稀释的酶标抗体对常见酶标抗体(例如HRP标记羊抗鸡IgG抗体)的生物活性也具有良好的保护性。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和比较例中，所用的胰蛋白酶消化酪蛋白购自OXOID公司，PEG-6000购自BIOSHARP公司，青-链霉素购自HYCLONE公司，
以下应用例中，试剂盒的使用方法为：
P1、取动物全血，血液凝固后4000r/min离心10min，取上清液；
P2、将20倍浓缩的洗涤液恢复至20～25℃，然后在37℃水浴锅中加热5～10min并摇动使沉淀溶解，用去离子水稀释20倍，即得洗涤液；
P3、将步骤P1所得上清液在血清稀释板中用所述样品稀释液10倍稀释混匀，得混合液；
P4、用洗涤液洗涤抗原包被板1次，将混合液、阴性对照和阳性对照各取50μl加至抗原包被板中，混合液设1个反应孔，阴性对照、阳性对照各设2个反应孔，每个孔同时加入酶标抗体50μl；轻轻振匀孔中样品，在37℃下温育45min；
P5、弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μl，重复洗涤5次，最后1次洗涤后拍干；
P6、每个反应孔加入显色液100μl，在20～25℃下避光显色15min；
P7、每个反应孔加终止液50μl，10min内测定结果，且每次测定前在振荡器上震动3～5s。
实施例1
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、步骤S1为：在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g胰蛋白酶消化酪蛋白、2.8g PEG-6000、8mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
实施例2
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、步骤S1为：在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入5g胰蛋白酶消化酪蛋白、1g PEG-6000、10mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
实施例3
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、步骤S1为：在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入10g胰蛋白酶消化酪蛋白、5g PEG-6000、5mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例1
本比较例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、步骤S1为：在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入4g胰蛋白酶消化酪蛋白、0.5g PEG-6000、12mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例2
本比较例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、步骤S1为：在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入11g胰蛋白酶消化酪蛋白、6g PEG-6000、4mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例3
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入2.8g PEG-6000、青-链霉素8mL充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例4
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g胰蛋白酶消化酪蛋白、2.8g PEG-6000充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例5
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g胰蛋白酶消化酪蛋白、8mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例6
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g酪蛋白、2.8g PEG-6000、8mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
对比例7
本实施例提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂，其制备方法为：
在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液(稀释稳定剂)。
本对比例中直接采用PBST缓冲液作为稀释稳定剂。
应用例1：
利用实施例1～3和对比例1～7制备的稀释稳定剂对酶标抗体浓缩液按照1:1000进行稀释，进行37℃加速破坏试验，每天检测一次共10天。以此验实施例1～3和对比例1～7制备的稀释稳定剂对辣根过氧化物酶标抗体的保护性，具体结果如下表1所示。
表1 阳性参考血清1:64稀释时PI值
注：“-”表示试验结果不成立；PI值≥40％，判定为禽流感病毒H7亚型抗体阳性；PI值＜40％，判定为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。
通过上表1可知，采用实施例1～3制备的稀释稳定剂，在37℃加速破坏试验中对辣根过氧化物酶标记抗体的保护性，明显好于对比例1、2。采用实施例1制备的稀释稳定剂，在37℃加速破坏试验中的保护效果好于对比例6，明显好于对比例3～5，对比例7的保护效果最差。进一步可以得知，胰蛋白酶消化酪蛋白、PEG-6000、青-链霉素缺少任意一种，其对酶标抗体的保护性均不能达到最佳，三者之间具有明显的相互功能协同作用，当三者同时存在时，对酶标抗体的保护性最好；而采用胰蛋白酶消化酪蛋白，比简单采用普通酪蛋白的效果更好。
应用例2：采用稀释稳定剂稀释的酶标抗体在2～8℃下的保存期试验
选取实施例1～3和对比例3～7制备的稀释稳定剂，将酶标抗体浓缩液按照1:1000稀释成酶标抗体，经0.22μm滤膜过滤后，于2～8℃保存。
1、敏感性试验
每隔一个月取出酶标抗体，将禽流感病毒H7亚型阳性参考血清(HI＝210)2、4、8、16、32、64倍比稀释，按照既定的检测方法进行检测，共16个月。具体结果见下表2。
表2：阳性参考血清1:64稀释时PI值
注：“-”表示试验结果不成立；PI值≥40％，判定为禽流感病毒H7亚型抗体阳性；PI值＜40％，判定为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。
通过表2的数据可知，采用实施例1～3制备的稀释稳定剂稀释制成酶标抗体，即使血清稀释64倍，在第15个月时仍能被检出为阳性，而采用对比例3～7制备的稀释稳定剂，由于缺少胰蛋白酶消化酪蛋白、PEG-6000或青-链霉素，使三者无法发生协同促进作用，因此就无法持续这么长的时间，而采用普通酪蛋白，也明显没有采用胰蛋白酶消化酪蛋白的效果好。
2、特异性试验
每隔一个月取出酶标抗体，将禽流感病毒H7亚型阴性参考血清(编号1，HI＝29)，鸡传染性法氏囊病毒阳性血清(编号2，IDEXX禽法氏囊病抗体检测ELISA试剂盒检测结果为阳性)，新城疫病毒阳性血清(编号3，HI＝28)，鸡传染性支气管炎病毒阳性血清(编号4，IDEXX禽传染性支气管炎抗体检测ELISA试剂盒检测结果为阳性)，禽流感病毒H5亚型阳性血清(编号5，HI＝27)，禽流感病毒H9亚型阳性血清共6份特异性血清(编号6，HI＝28)，按照既定方法进行检测，共16个月。
上述6份血清在用实施例1制备的稀释稳定剂进行稀释制成酶标抗体进行检测时，均检测为禽流感病毒H7亚型抗体阴性，说明对禽流感病毒H7亚型抗体具有非常高的特异性。
3、物理性状试验
(1)将采用实施例1制备的稀释稳定剂进行稀释制成的酶标抗体于2～8℃保存。每隔一个月检测一次共16个月，观察其是否为澄清溶液。结果如下表3。
表3 物理性状(澄清度)试验结果
保存时间(月) 物理性状
0 澄清溶液
3 澄清溶液
6 澄清溶液
9 澄清溶液
12 澄清溶液
15 澄清溶液
16 澄清溶液
(2)无菌检验：将采用实施例1制备的稀释稳定剂进行稀释制成的酶标抗体于2～8℃保存。每隔一个月取样接种于TG小管两支，每支0.2mL，一支置于23～25℃中培养，1支置于35～37℃培养。另取0.2mL接种于一支TSB小管置于23～25℃中培养，均培养观察7天，共计检验16个月。结果如下表4。
表4 物理性状(无菌程度)试验结果
保存时间(月) 无菌检验
0 无菌
3 无菌
6 无菌
9 无菌
12 无菌
15 无菌
16 无菌
通过上述表3、4可知，采用实施例1制备的稀释稳定剂进行稀释制成的酶标抗体，在2～8℃保存，至少在16个月内均能保持良好的物理性状。
应用例3：经稀释稳定剂稀释的酶标抗体在2～8℃下保存16个月对常见酶标抗体生物活性保护性的试验
以KPL公司的HRP标记羊抗鸡IgG抗体为例，采用抗原抗体直接反应法进行酶标抗体稀释稳定剂效果的评估。用饱和硫酸铵沉淀法纯化一批鸡的IgG抗体，作为酶标板包被抗原，用实施例1制备的稀释稳定剂将其稀释至工作浓度。将稀释后的酶标抗体在2～8℃进行保存，并分别于不同时间抽样进行检测。具体步骤为：
Q1、酶标板的包被：将稀释后的鸡IgG抗原按100μl/孔的量加至酶标板，4℃包被过夜；
Q2、酶标板的封闭：弃去孔中液体，拍干，按200μl/孔加入PBS稀释的0.5％BSA，37℃封闭2h；
Q3、弃去孔中液体PBST洗板一次，将不同时间抽样的酶标羊抗鸡IgG加至酶标板中，置37℃反应30min；
Q4、显色：弃去液体后洗涤4次，加入TMB底物显色液，室温避光显色10min；
Q5、终止及读数：加入终止液终止显色，并于酶标仪读取OD450nm值。
检测结果如下表5。
表5 生物活性检测
保存时间(月) 0 3 6 9 12 15 16
OD450nm 1.932 1.879 1.832 1.783 1.721 1.432 1.056
根据上表可知，经过表5可知，实施例1制备的稀释稳定剂对HRP标记羊抗鸡IgG抗体的生物活性也具有良好的保护性。

Claims (6)

1.一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
S1、在800ml的去离子水中加入8g NaCl、1.42g Na2HPO4、0.2g KCl、0.27g KH2PO4，充分溶解后，加入0.5mL Tween20，继续加去离子水定容至1000ml，再在121℃下灭菌20min，即得PBST缓冲液；
S2、每1000ml的PBST缓冲溶液中加入5～10g胰蛋白酶消化酪蛋白、1～5g PEG-6000、5～10mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
2.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法，其特征在于，步骤S2为：每1000ml的PBST缓冲溶液中加入7g胰蛋白酶消化酪蛋白、2.8g PEG-6000、8mL青-链霉素充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到稀释稳定剂。
3.一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的应用，其特征在于，所述稀释稳定剂用于禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒中，试剂盒包括酶标抗体、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物显色液和终止液，所述酶标抗体采用所述稀释稳定剂按1:1000的比例进行了稀释。
4.根据权利要求3所述的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的应用，其特征在于，所述禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒的具体使用方法为：
P1、取动物全血，血液凝固后4000r/min离心10min，取上清液；
P2、将20倍浓缩的洗涤液恢复至20～25℃，并摇动使沉淀溶解，然后用蒸馏水或去离子水20倍稀释，即得洗涤液；
P3、将步骤P1所得上清液在血清稀释板中用所述样品稀释液10倍稀释混匀，得混合液；
P4、用洗涤液洗涤抗原包被板1次，将混合液、阴性对照和阳性对照各取50μl加至抗原包被板中，混合液设1个反应孔，阴性对照、阳性对照各设2个反应孔，每个孔同时加入酶标抗体50μl；轻轻振匀孔中样品，在37℃下温育45min；
P5、弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μl，重复洗涤5次，最后1次洗涤后拍干；
P6、每个反应孔加入显色液100μl，在20～25℃下避光显色15min；
P7、每个反应孔加终止液50μl，10min内测定结果。
5.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的应用，其特征在于，步骤P2为：将20倍浓缩的洗涤液恢复至20～25℃，然后在37℃水浴锅中加热5～10min并摇动使沉淀溶解，用蒸馏水或去离子水稀释20倍，即得洗涤液。
6.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的应用，其特征在于，步骤P7中，每次测定前在振荡器上震动3～5s。
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