CN111896744A - 一种羊棘球蚴抗体elisa检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种羊棘球蚴抗体elisa检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、底物显色液、终止液和血清稀释板。本发明的羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，采用细粒棘球蚴EG95蛋白B细胞表位特异性多肽抗原作为包被抗原，生产方法简便、抗原纯度高。避免了大肠杆菌发酵产生的复杂纯化步骤和杂蛋白干扰，适合大量血清样品的检测，在进行动物疫病检测和流行病学调查中，具有经济方便等优点，且检查成本低，利于推广应用，在检测羊棘球蚴(包虫)EG95蛋白抗体中，具有广泛的应用前景。

Description

一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
棘球蚴病又称包虫病，主要是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)中绦期幼虫—棘球蚴感染中间宿主而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。细粒棘球绦虫寄生在犬、狐狸、狼等动物小肠，棘球蚴寄生于绵羊、山羊、牛(牦牛)、猪、骆驼等多种动物以及人的肝、肺等器官。该病严重威胁着人类健康和畜牧业发展，被世界卫生组织(WHO)列为17种被忽视的热带病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为需要报告的动物疫病，被欧盟列入严重关注的人畜共患病名单。自2005年以来，包虫病一直被纳入全国重点寄生虫病防治规划，《中华人民共和国传染病防治法》将人间包虫病列入丙类法定传染病名录，国家农业农村部将畜间包虫病列入二类动物疫病名录，是16种优先防控的动物疫病之一。长期以来，我国采取终末宿主犬驱虫和病人手术治疗的防控措施，并没有切断中间宿主这一传播环节，因此，防控效果有限。羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗经国内外实验室和临床验证预防效果很好，在我国注册为一类新兽药。自2016年始，包虫病被列入为数不多的强制免疫动物疫病之一。
EG95蛋白是细粒棘球绦虫六钩蚴的天然抗原，是最有效的疫苗分子，是羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的保护性抗原成分。该蛋白存在多个有效B细胞和T细胞表位，能刺激机体产生良好的免疫应答。其中体液免疫应答与临床保护密切相关，可用于免疫监测和效果评估。
长期以来对羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗的免疫效果评估主要采用包被重组表达抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，认为二免后2周至少80％试验羊血清ELISA抗体水平≥1.0，且二免后2周血清同一免前血清相比ELISA的P/N值均应≥2.0，为免疫有效，被检疫苗判为合格。但该方法重组抗原的制备需要经过重组工程菌发酵、细菌破碎、包涵体洗涤、包涵体变性、透析、过滤、亲和层析、凝血酶水解、聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定、抗原浓度测定等一系列繁琐操作步骤，生产工艺复杂；另外，该方法需要使用细菌培养设备、超声破碎仪、透析设备、蛋白纯化仪、蛋白电泳仪等多种设备，不利于规模化生产；该方法生产的抗原含有微量的大肠杆菌杂蛋白，包被酶标板检测时，常存在假阳性情况，导致结果判定通常存在一定的误判。国内外用囊液抗原、裂解抗原、重组抗原进行了大量检测方法研究，要么敏感性不能达到临床免疫效果评价要求，要么特异性不佳(与其他羊寄生虫病的抗体有交叉反应)，检测效果均不理想，迄今为止，国内外仍没有商品化的相关检测试剂盒可资利用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
经研究，本发明采用以下技术方案：
一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗、底物显色液、终止液和血清稀释板；所述EG95多肽抗原为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
其中，所述EG95多肽抗原来源基因序列为细粒棘球蚴EG95全序列，其基因全序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。对该序列进行基因工程原核表达及Western Blot验证，具有良好的免疫原性。进一步通过Gene bank分析其相对保守的位点，并结合蛋白序列的β转向(Beta-Turn)预测、表面可达性(Surface Accessibility)预测、柔性(Flexibility)预测、抗原性(Antigenicity)预测、亲水性(Hydrophilicity)预测等综合分析蛋白的B细胞表位(http://www.iedb.org/home_v3.php)抗原表位区(AI)。并对候选多肽通过网络资源(如https://web.expasy.org/protscale/及https://swissmodel.expasy.org/)进行疏水性及空间结构检测，得到如序列表所示的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4氨基酸序列作为EG95蛋白B细胞表位特异性多肽抗原。
优选的，EG95多肽抗原包被酶标板即为包被有合成的EG95多肽抗原的可拆聚苯乙烯酶联反应板。
优选的，所述稀释液包括体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，浓度为200μL/L的防腐剂Proclin 300，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的10×(1/15mol/L磷酸盐缓冲液)。
优选的，所述洗涤液包括0.5％(V/V)的Tween-20和pH值为7.4的10×(1/15mol/L磷酸盐缓冲液)。
优选的，所述封闭液为含2％明胶的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述阳性对照液为含有EG95抗体的羊血清；所述阴性对照液为健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清。
其中，阳性对照液具体为：以羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗免疫制备高免血清，当琼扩抗体效价达到1:3～1:4时，经颈静脉无菌采集血液，常规分离血清，进一步过滤除菌后分装，作为储备阳性对照血清。将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5ml无色透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照液在-20℃保存备用。
阴性对照液具体为：用来自非疫区的经琼脂扩散试验(AGP)检测棘球蚴(包虫)EG95抗体阴性的2～4月龄健康羔羊，经颈静脉无菌采集血液，常规分离血清，进一步过滤除菌后分装，作为储备阴性对照血清。将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照液。
优选的，所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG酶标二抗体。具体为：是以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体(购自Earthox Life Sciences公司)作为原液以1:200使用二抗保护剂稀释后制得(2支，200μL/支)。
优选的，所述底物显色液为包括溶液A和溶液B；所述溶液A包括体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述溶液B包括0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺(先溶于6ml二甲基亚砜)的混合溶液。
优选的，所述终止液为2mol/L的浓硫酸。
优选的，所述EG95多肽抗原具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2、上述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
二抗保护剂的制备：取海藻糖、PEG(聚乙二醇)4000、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)K-30、PVA(聚乙烯醇)9000-10000、D-ribose(D-核糖)、1-甲基-2-吡咯烷酮、异噻唑啉酮，加蒸馏水定容，过滤除菌，即可；
包被缓冲液制备：取碳酸钠、碳酸氢钠，加蒸馏水，充分溶解，调pH值至9.6，定容，过滤除菌，即可；
稀释液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，Proclin 300防腐剂200μL/L，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
洗涤液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的10×(1/15mol/L磷酸盐缓冲液)的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
封闭液的制备：用磷酸盐缓冲液配制含有2％明胶，Procline 300防腐剂200μL/L的混合溶液,分装30mL/瓶，即可；
阳性对照液的制备：以羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫制备的高免血清，作为储备阳性对照血清，将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照血清，于-20℃保存备用；
阴性对照液的制备：用健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清，作为储备阴性对照血清，将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照血清，于-20℃保存备用；
酶标二抗的制备：以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体作为原液，使用二抗保护剂以1:200稀释后制得，200μL/支；
底物显色液的制备：溶液A：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液，分装30mL/瓶，即可；溶液B：用蒸馏水配制含0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺(先溶于6ml二甲基亚砜)的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
终止液的制备：用蒸馏水配制含2mol/L硫酸溶液，分装15mL/瓶，即可；
EG95多肽抗原包被酶标板的制备：利用多肽合成仪合成SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，纯化后得EG95多肽抗原；用包被缓冲液将纯化后的EG95多肽抗原配制成浓度为4μg/mL，按100μL/孔，加入酶标板中，在4℃条件下，包被过夜14～18h，弃去包被缓冲液，洗涤，拍干，每孔加入200μL封闭液，在37℃条件下，封闭2h，弃去封闭液，洗涤，真空包装后置于4℃保存，即可。
优选的，所述二抗保护剂的制备具体为：称取海藻糖20mg、PEG4000 20mg、PVP K-3050mg、PVA 9000-10000 3mg、D-ribose 3mg、1-甲基-2-吡咯烷酮3mg、异噻唑啉酮1mg，加蒸馏水定容至100mL，过滤除菌，即可。
优选的，所述包被缓冲液制备具体为：称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水至800ml，充分溶解，调pH值至9.6，定容1000mL，过滤除菌，即可。
3、上述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒在检测绵羊/山羊血清中EG95抗体的应用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，采用细粒棘球蚴EG95蛋白B细胞表位特异性多肽抗原作为包被抗原，生产方法简便、抗原纯度高。在避免了大肠杆菌发酵产生的复杂纯化步骤和杂蛋白干扰的同时，也保证了批间、批内产品的重复性。人工合成的细粒棘球蚴EG95蛋白B细胞表位特异性多肽，不仅保留了完整EG95蛋白的免疫原性，去除了不必要的部分，而且具有更高的特异性和灵敏度，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高检测灵敏度，显著降低非特异性背景读值；
2)本发明的羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，易于标准化、灵敏度高、且适合大量血清样品的检测，在进行动物疫病检测和流行病学调查中，具有经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，且检查成本低，利于推广应用，在检测羊棘球蚴(包虫)EG95蛋白抗体中，具有广泛的应用前景；
3)本发明的羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，用于检测绵羊、山羊血清中EG95抗体具有灵敏性高、特异性强、操作简单和重复性好，能快速检测血清中羊棘球蚴(包虫)EG95蛋白抗体，特别适合作为羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗免疫抗体监测和免疫效果评估的工具，在我国动物包虫病防控急需的产品中，具有重要使用价值和意义。
附图说明
图1为本发明的原核表达的EG95 SDS-PAGE图；图中M:蛋白彩虹Marker；1:超声裂解后上清；2:超声裂解后沉淀；3:pET32a-EG95未诱导；4:pET32a-EG95诱导后；
图2为本发明的原核表达的EG95纯化后Western-blot鉴定图，图中，M:蛋白低分子量Marker；1:未纯化蛋白；2:纯化后蛋白；
图3为本发明实施例4中血清温育时间试验结果图；
图4为本发明实施例4中酶标二抗反应时间试验结果。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，包括：酶标板(2×96孔)，稀释液(2瓶，30mL/瓶)；洗涤液(1瓶，30mL/瓶)；封闭液(1瓶，15mL/瓶)；阳性对照血清(1支，50μL/支)；阴性对照血清(1支，50μL/支)；酶标二抗(2支，200μL/支)；底物显色液：显色液A(1瓶，30mL/瓶)，显色液B(1瓶，30mL/瓶)；终止液(1瓶，15mL/瓶)；以及血清稀释板(2块)。
抗原表位多肽来源基因序列为细粒棘球蚴EG95全序列，其基因全序列如SEQ IDNO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。对该序列进行基因工程原核表达(结果如图1所示)及Western Blot验证(结果如图2所示)，具有良好的免疫原性。进一步通过Gene bank分析其相对保守的位点，并结合蛋白序列的β转向(Beta-Turn)预测、表面可达性(SurfaceAccessibility)预测、柔性(Flexibility)预测、抗原性(Antigenicity)预测、亲水性(Hydrophilicity)预测等综合分析蛋白的B细胞表位(http://www.iedb.org/home_v3.php)抗原表位区(AI)。并对候选多肽通过网络资源(如https://web.expasy.org/protscale/及https://swissmodel.expasy.org/)进行疏水性及空间结构检测，得到如序列表所示的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4氨基酸序列作为EG95蛋白B细胞表位特异性多肽抗原。
阳性对照液的制备：以羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫制备的高免血清，作为储备阳性对照血清，将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照血清，于-20℃保存备用；
阴性对照液的制备：用健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清，作为储备阴性对照血清，将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照血清，于-20℃保存备用；
酶标二抗的制备：以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体作为原液，使用二抗保护剂以1:200稀释后制得，200μL/支；
稀释液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，Proclin 300防腐剂200μL/L，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
洗涤液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的10×(1/15mol/L磷酸盐缓冲液)的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
封闭液的制备：用磷酸盐缓冲液配制含有2％明胶，Procline 300防腐剂200μL/L的混合溶液,分装30mL/瓶，即可；
底物显色液的制备：溶液A：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液，分装30mL/瓶，即可；溶液B：用蒸馏水配制含0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺(先溶于6mL二甲基亚砜)的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
终止液的制备：用蒸馏水配制含2mol/L硫酸溶液，分装15mL/瓶，即可；
EG95多肽抗原包被酶标板的制备：利用多肽合成仪合成SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，纯化后得EG95-PT-2多肽抗原；用包被缓冲液将纯化后的EG95-PT-2多肽抗原配制成浓度为4μg/mL，按100μL/孔，加入酶标板中，在4℃条件下，包被过夜14～18h，弃去包被缓冲液，洗涤，拍干，每孔加入200μL封闭液，在37℃条件下，封闭2h，弃去封闭液，洗涤，真空包装后置于4℃保存，即制成的EG95-PT-2多肽抗原包被酶标板。
实施例2
本实施例中羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，除了将利用多肽合成仪合成SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，纯化后得EG95-PT-2多肽抗原，替换为利用多肽合成仪分别合成SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，纯化后依次得EG95-PT-1、EG95-PT-3或EG95-PT-4多肽抗原，分别制成的EG95-PT-1、EG95-PT-3或EG95-PT-4多肽抗原包被酶标板之外，其余与实施例1均相同。
实施例3
将实施例1和实施例2中羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒用于检测山羊阳性血清3份(SP1、SP2、SP3)、山羊阴性血清3份(SN1、SN2、SN3)、绵羊阳性血清2份(MP1、MP2)和绵羊阴性血清2份(MN1、MN2)中的羊棘球蚴EG95抗体。
具体操作步骤为：
1)分别取EG95-PT-1、EG95-PT-2、EG95-PT-3或EG95-PT-4多肽抗原包被酶标板，分别将稀释好的待测血清和对照各取100μL加入到抗原包被板酶标板孔中，待检血清做1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μL，轻轻振均孔中待测血清(勿溢出)，置37℃温育60分钟；
2)去掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μL，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤5次；
3)每孔加兔抗山羊IgG酶标二抗体100μL，置于37℃温育60分钟；
4)洗涤5次，方法同步骤2)，每次均需在干净吸水纸上拍干；
5)每孔先加底物显示液中的溶液A 50μL，再加底物显示液中的溶液B 50μL，室温避光显色10分钟；
6)每孔加终止液50μL，10分钟内测定结果；
7)利用酶标仪在OD450nm测定光吸收(OD)值。
计算各组的P/N值，结果如表1所示。
表1血清中OD450nm值和P/N值结果
Figure BDA0002606514620000071
Figure BDA0002606514620000081
表1中，P/N数值为阳性值与阴性值的比，阳性值高表明检测阳性信号强，阴性值低表明检测本底噪声弱，所以数值大更好，通常需大于等于2.1。从表1中分析可知，EG95-PT-2的P/N值最大，为13.701，表明该多肽的信噪比较高，检测结果可靠。
实施例4
以实施例2中的EG95-PT-2用于羊棘球蚴EG95抗体间接ELISA方法检测的建立
1)抗原包被浓度和血清稀释度的确定
具体为：按照方阵滴定法确定抗原包被浓度和血清稀释度，用包被液将EG95-PT-2抗原稀释至1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL，分别包被入5块酶标板中，制备不同抗原包被量的抗原包被板待用；将阳性对照血清及阴性对照血清利用稀释液按1:50、1:100、1:150、1:200倍进行稀释，每孔加入100μL稀释好的血清，进行ELISA检测。对检测结果统计并比较P/N值，确定抗原的包被浓度及血清的稀释度，结果如表2所示。
表2抗原包被浓度和血清稀释度的方阵滴定结果(OD450nm值)
Figure BDA0002606514620000082
Figure BDA0002606514620000091
从表2中抗原包被浓度和血清样品稀释度正交试验检测结果分析可知，包被抗原浓度为4μg/mL、血清按1:100倍稀释时，阳性对照血清OD450nm值/阴性对照血清OD450nm值，即P/N值最高，因此确定抗原包被浓度为4μg/mL，血清稀释度为1:100。
2)封闭液的确定
具体操作为：分别使用含1％BSA、0.1％BSA、1％明胶和2％明胶的磷酸盐缓冲液作为封闭液，对包被的酶标板进行封闭。使用不同封闭液的酶标板检测山羊阳性血清3份(SP1、SP2、SP3)、山羊阴性血清3份(SN1、SN2、SN3)、绵羊阳性血清2份(MP1、MP2)和绵羊阴性血清2份(MN1、MN2)，计算并比较P/N值，确定封闭液。结果如表3所示。
表3封闭液的筛选
Figure BDA0002606514620000092
Figure BDA0002606514620000101
从表3中分析可知，以2％明胶的磷酸盐缓冲液作为封闭液时，阳性对照血清OD450nm值/阴性对照血清OD450nm值，即P/N值最高，因此，以含2％明胶的磷酸盐缓冲液作为封闭液。
3)血清、酶标二抗温育时间的确定
具体操作为：以抗原确定的包被浓度及血清确定的稀释度为前提条件，分别设置不同的血清温育时间：15min、30min、45min、60min，并统计比较不同温育时间检测P/N值，确定血清温育时间。结果如图3所示。
从图3中分析可知，在包被抗原浓度为4μg/ml、血清以1:100倍稀释的条件下，血清温育30min的P/N值最高，因此确定血清的温育时间为30min。
以抗原确定包被浓度、血清确定稀释度及血清确定温育时间为前提条件，分别设置不同的酶标二抗温育时间：15min、30min、45min、60min，并对不同温育时间检测结果统计并比较P/N值，确定酶标二抗最适温育时间，结果如图4所示。
从图4中分析可知，在包被抗原浓度为4μg/ml、血清以1:100倍稀释、血清温育30min的条件下，酶标二抗温育30min的P/N值最高，因此将酶标二抗的反应时间设置为30min。
4)阴阳性判定标准的确定
具体为：应用优化的诊断方法包被5批抗原酶标板并对250份经琼扩试验验证的羊棘球蚴阴性血清(山羊血清163份、绵羊血清各87份)进行检测，分别计算山羊棘球蚴阴性血清和绵羊棘球蚴阴性血清的平均OD450nm值
Figure BDA0002606514620000102
及标准差SD，并计算其临界值
Figure BDA0002606514620000103
结果如表4所示。
表4 5批次试剂盒检测250份羊棘球蚴阴性血清临界值结果
Figure BDA0002606514620000104
从表4中分析可知，山羊棘球蚴阴性血清与绵羊棘球蚴阴性血清的平均OD450nm值和标准差无明显差异，临界值皆约为0.3，故将OD450nm值＜0.3判定为羊棘球蚴阴性血清，OD450nm≥0.3判定为羊棘球蚴阳性血清。
实施例5羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的敏感性试验
具体操作为：用3批试剂盒对172份已验证的羊阴性和阳性血清样品(包含绵羊和山羊血清)进行检测，同时随机抽取强阳性血清、弱阳性血清、棘球蚴感染血清、阴性血清各5份(皆包含绵羊和山羊血清)进行倍比稀释，得到的试剂盒检测结果与AGP的检测结果进行对比分析。结果如表5、6和7所示。
表5 3批试剂盒对强阳性血清倍比稀释ELISA检测结果
Figure BDA0002606514620000111
表6强阳性血清倍比稀释AGP检测结果
Figure BDA0002606514620000112
Figure BDA0002606514620000121
表7弱阳性、阴性、羊棘球蚴感染血清倍比稀释ELISA检测结果
Figure BDA0002606514620000122
Figure BDA0002606514620000131
Figure BDA0002606514620000141
从表5、6和7中综合对比分析可知，本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒对172份羊血清样品检测结果与AGP试验检测结果完全一致，且对山羊和绵羊血清检测结果无明显差异；强阳性血清稀释到3200倍检测全部为阳性，弱阳性血清和感染血清分别稀释到400倍检测仍为阳性，证明了本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒对强阳性血清的最低检测限为1:3200，而AGP检测强阳性血清的最高效价为1:4，显示ELISA检测的敏感性远远高于AGP。证明了本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒灵敏性高，适用于山羊和绵羊的血清样品检测。
实施例6羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的特异性试验
具体为：应用3批次的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒对经AGP试验验证的115份羊阴性血清(山羊血清72份、绵羊血清43份)和10份羊阳性血清样品(山羊与绵羊血清各5份)进行检测；并对5份细颈囊尾蚴感染血清、5份多头蚴感染血清、5份小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体阳性血清、5份口蹄疫病毒O型(FMDV-O)抗体阳性血清和5份布氏菌抗体阳性血清样品(山羊血清3份、绵羊血清2份)进行检测。结果如表8所示。
表8特异性血清检测结果
Figure BDA0002606514620000142
Figure BDA0002606514620000151
从表8中综合分析可知，本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒对羊血清中阴性检出率分别为阴性血清100％、阳性血清0％。而对细颈囊尾蚴感染血清、多头蚴感染血清、小反刍兽疫病毒抗体阳性血清、口蹄疫病毒O型抗体阳性血清及布氏菌抗体阳性血清检测结果皆为阴性。说明了本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒与临床症状相似、亲属关系相近的感染病阳性血清及强制免疫病抗体并无交叉反应，证明了本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的特异性良好。
实施例7羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的重复性和可靠性验证
具体为：采用不同批次和同批次的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒检测强阳性、弱阳性、阴性和棘球蚴感染血清。结果如表9和10所示。
表9 3批试剂盒检测各批次批内变异系数结果
Figure BDA0002606514620000152
Figure BDA0002606514620000161
表10 3批试剂盒检测批间变异系数结果
Figure BDA0002606514620000162
Figure BDA0002606514620000171
从表9和表10中综合分析可知，本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒检测山羊血清批内变异系数为2.03％～4.28％，试剂盒检测绵羊血清批内变异系数为2.08％～4.15％。本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒检测山羊血清批间变异系数为3.85％～8.44％，试剂盒检测绵羊血清批间变异系数为3.95％～9.28％。试剂盒批内变异系数为2.03％～4.28％，批间变异系数为3.85％～9.28％，说明了试剂盒检测山羊血清和绵羊血清时批内变异系数小于5％，批间变异系数小于10％。从而证明了本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的重复性、稳定性均良好。
实施例8羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的符合率验证
具体为：分别应用羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒及AGP对120份血清样品进行检测。结果如表11所示。
表11试剂盒及AGP检测结果符合率对比
Figure BDA0002606514620000172
从表11中分析可知，羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的阳性符合率100％，阴性符合率89％，总符合率为98％。其中3份血清样品的AGP检测结果为阴性，而羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒检测结果为弱阳性，经过分析比较，山羊与绵羊检测结果的符合率无明显差异。与AGP试验相比，本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的灵敏性更强，检出率更高，且适用于绵羊和山羊血清样品的检测。
实施例9羊羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的临床试验
具体为：应用4批羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒在4个可代表不同地理位置的实验室对经琼脂扩散试验(AGP)检测为阴性、弱阳性、强阳性的1104份绵羊和山羊血清进行检测。结果如表12所示。
表12 ELISA检测试剂盒和AGP方法检测1104份临床血清样品结果
Figure BDA0002606514620000181
从表12中分析可知，四个地区羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒的阳性检出率(山羊、绵羊)均高于AGP的阳性检出率(山羊、绵羊)，被检测的1104份临床血清样品阳性符合率为100.0％(山羊、绵羊)，阴性符合率(山羊、绵羊)为88.1％，总符合率(山羊、绵羊)为93.8％。当AGP检测呈阴性时，羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒可能为阳性，因此，样品阴性符合率和总符合率偏低。上述试验结果表明，本发明的羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒对检测的山羊和绵羊抗体水平不存在种间差异和地域性差异；AGP在检测低抗体滴度的样品时存在假阴性，而羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒则更灵敏，被检测的1104份临床血清样品阳性符合率为100.0％，表明羊棘球蚴抗体间接ELISA检测试剂盒进行批量检测样品时，检测结果稳定可靠、准确性较高，可用于检测绵羊、山羊血清中的EG95抗体。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆澳龙生物制品有限公司
<120> 一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用
<160> 6
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val
1 5 10 14
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr AlaLys Phe
1 5 10 15 20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser GlySer Ala
1 5 10 15 20
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ser Ala Leu Thr Ser Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser
1 5 10 12
<210> 5
<211> 468
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫EG95基因
<400> 5
ATGGCATTCC AGTTATGTCT CATTTTGTTT GCGACTTCAG TTTTGGCTCA GGAATACAAA 60
GGAATGGGCG TAGAGACAAG GACAACAGAG ACTCCGCTCC GTAAACACTT CAATTTGACT 120
CCTGTGGGTT CTCAGGGCAT TCGCTTAAGT TGGGAAGTCC AACACTTGTC TGACCTCAAA 180
GGAACAGATA TTTCTCTAAA AGCGGTGAAT CCTTCTGACC CGTTAGTCTA CAAAAGACAA 240
ACTGCAAAAT TCTCAGATGG ACAACTCACT ATCGGCGAAC TGAAGCCCTC CACATTATAC 300
AAAATGACTG TGGAAGCAGT GAAAGCGAAA AAGACCATTT TGGGATTCAC CGTAGACATT 360
GAGACACCGC GCGCTGGCAA GAAGGAAAGC ACTGTAATGA CTAGTGGATC CGCCTTAACA 420
TCCGCAATCG CTGGTTTTGT ATTCAGCTGC ATAGTGGTTG TCCTTACT 468
<210> 6
<211> 156
<212> PRT
<213> 细粒棘球绦虫EG95基因
<400> 6
Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala
1 5 10 15
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
20 25 30
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
35 40 45
Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile
50 55 60
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
65 70 75 80
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
100 105 110
Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys
115 120 125
Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala
130 135 140
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr
145 150 155 156

Claims (10)

1.一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗、底物显色液、终止液和血清稀释板；
所述EG95多肽抗原为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，浓度为200μL/L的防腐剂Proclin 300，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含2％明胶的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液为含有EG95抗体的羊血清；所述阴性对照液为健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清。
6.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG酶标二抗体。
7.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液包括溶液A和溶液B；所述溶液A包括体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述溶液B包括0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺的混合溶液。
8.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述EG95多肽抗原具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1至权利要求8任一所述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
二抗保护剂的制备：取海藻糖、PEG(聚乙二醇)4000、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)K-30、PVA(聚乙烯醇)9000-10000、D-ribose(D-核糖)、1-甲基-2-吡咯烷酮、异噻唑啉酮，加蒸馏水定容，过滤除菌，即可；
包被缓冲液制备：取碳酸钠、碳酸氢钠，加蒸馏水，充分溶解，调pH值至9.6，定容，过滤除菌，即可；
稀释液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，Proclin 300防腐剂200μL/L，二抗保护剂1ml和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
洗涤液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
封闭液的制备：用磷酸盐缓冲液配制含有2％明胶，Procline 300防腐剂200μL/L的混合溶液,分装30mL/瓶，即可；
阳性对照液的制备：以羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫制备的高免血清，作为储备阳性对照血清，将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照血清，于-20℃保存备用；
阴性对照液的制备：用健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清，作为储备阴性对照血清，将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无色透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照血清，于-20℃保存备用；
酶标二抗的制备：以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体作为原液，使用二抗保护剂以1:200稀释后制得，200μL/支；
底物显色液的制备：溶液A：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液，分装30mL/瓶，即可；溶液B：用蒸馏水配制含0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
终止液的制备：用蒸馏水配制含2mol/L硫酸溶液，分装15mL/瓶，即可；
EG95多肽抗原包被酶标板的制备：利用多肽合成仪合成SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，纯化后得EG95多肽抗原；用包被缓冲液将纯化后的EG95多肽抗原配制成浓度为4μg/mL，按100μL/孔，加入酶标板中，在4℃条件下，包被过夜14～18h，弃去包被缓冲液，洗涤，拍干，每孔加入200μL封闭液，在37℃条件下，封闭2h，弃去封闭液，洗涤，真空包装后置于4℃保存，即可。
10.如权利要求1至权利要求8任一所述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒在检测绵羊/山羊血清中EG95抗体的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817040A (zh) * 2021-09-06 2021-12-21 四川大学华西医院 一种细粒棘球蚴重组蛋白及其制备方法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1405565A (zh) * 2002-10-24 2003-03-26 肖洪武 梅毒螺旋体抗体酶诊断试剂
WO2003103636A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Agresearch Limited A novel drug dosing regimen
CN101710120A (zh) * 2009-12-14 2010-05-19 上海市农业科学院 稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用
CN103497958A (zh) * 2013-09-25 2014-01-08 浙江省农业科学院 水稻OsXrn4基因及其应用
CN103864906A (zh) * 2014-03-13 2014-06-18 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN104101716A (zh) * 2014-07-22 2014-10-15 重庆澳龙生物制品有限公司 一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒
CN105823871A (zh) * 2016-04-18 2016-08-03 苏州新赛美生物科技有限公司 一种高效稳定的单组份酶联免疫显色液及其制备方法
CN106397610A (zh) * 2016-11-30 2017-02-15 石河子大学 细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白的制备方法及其应用
CN107576804A (zh) * 2017-08-31 2018-01-12 北京臻惠康生物科技有限公司 一种抗凝血酶iii的新用途及试剂盒
CN107831319A (zh) * 2017-12-18 2018-03-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
CN108369235A (zh) * 2015-12-18 2018-08-03 丹麦科达有限公司 生色过氧化物酶底物
CN110187098A (zh) * 2019-05-27 2019-08-30 武汉科前生物股份有限公司 一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用
CN110261623A (zh) * 2019-07-30 2019-09-20 石河子大学 一种检测羊细粒棘球蚴病抗体间接elisa检测试剂盒及其应用
CN110297085A (zh) * 2019-06-13 2019-10-01 武汉博士德生物工程有限公司 一种用于增强免疫印迹检测信号的抗体稀释液
CN110531077A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 荣昌生物制药（烟台）有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003103636A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Agresearch Limited A novel drug dosing regimen
CN1405565A (zh) * 2002-10-24 2003-03-26 肖洪武 梅毒螺旋体抗体酶诊断试剂
CN101710120A (zh) * 2009-12-14 2010-05-19 上海市农业科学院 稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用
CN103497958A (zh) * 2013-09-25 2014-01-08 浙江省农业科学院 水稻OsXrn4基因及其应用
CN103864906A (zh) * 2014-03-13 2014-06-18 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN104101716A (zh) * 2014-07-22 2014-10-15 重庆澳龙生物制品有限公司 一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒
CN108369235A (zh) * 2015-12-18 2018-08-03 丹麦科达有限公司 生色过氧化物酶底物
CN105823871A (zh) * 2016-04-18 2016-08-03 苏州新赛美生物科技有限公司 一种高效稳定的单组份酶联免疫显色液及其制备方法
CN106397610A (zh) * 2016-11-30 2017-02-15 石河子大学 细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白的制备方法及其应用
CN107576804A (zh) * 2017-08-31 2018-01-12 北京臻惠康生物科技有限公司 一种抗凝血酶iii的新用途及试剂盒
CN107831319A (zh) * 2017-12-18 2018-03-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
CN110531077A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 荣昌生物制药（烟台）有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒
CN110187098A (zh) * 2019-05-27 2019-08-30 武汉科前生物股份有限公司 一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用
CN110297085A (zh) * 2019-06-13 2019-10-01 武汉博士德生物工程有限公司 一种用于增强免疫印迹检测信号的抗体稀释液
CN110261623A (zh) * 2019-07-30 2019-09-20 石河子大学 一种检测羊细粒棘球蚴病抗体间接elisa检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D.J.WOOLLARD等: "Epitope specificities and antibody responses to the EG95 hydatid vaccine", 《PARASITE IMMUNOLOGY》 *
朴英实等: "《分子病理生物学实验技术指南》", 31 May 2015, 人民军医出版社 *
江莉等: "棘球蚴AgB抗原家族基因的克隆及抗原表位的预测分析", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 *
汪多仁: "《精细化工中间体》", 31 January 2008, 海洋出版社 *
王清: "《我国优秀运动员竞技能力状态诊断和监测系统的研究与建立》", 29 February 2004, 人民体育出版社 *
罗满林: "《兽医生物制品学》", 30 April 2019, 中国农业大学出版社 *
贾红等: "羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817040A (zh) * 2021-09-06 2021-12-21 四川大学华西医院 一种细粒棘球蚴重组蛋白及其制备方法

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