CN107576804A - 一种抗凝血酶iii的新用途及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗凝血酶III的新用途及试剂盒，用于检测抗凝血酶III的物质可以用于评估TBI患者伤情或用于检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的严重程度，该方法在用于TBI患者伤情严重程度评估或检测时，具有特异性好、敏感度高、重现性好及患者依从性好等优点。并且经过试验证明抗凝血酶III可以作为TBI患者伤情严重程度评估的标志物，ATⅢ可用于TBI患者伤情严重程度评估，且结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。

Description

一种抗凝血酶III的新用途及试剂盒

技术领域

本发明属于抗凝血酶III应用领域，特别涉及一种抗凝血酶III的新用途及试剂盒。

背景技术

创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury，TBI)是世界上影响人类健康的一个重要因素。由于其可发生于交通意外，工作以及运动等与人类生活密切的场合，因此其具有极高的发生率。最近统计显示在美国每年有200万TBI发生，其中43％的TBI患者会遗留残疾。据统计在中国每年有100万TBI发生，而中国头部外伤数据显示(Chinese Head TraumaData Bank，CHTDB)，TBI患者的死亡率可以达到21.8％。

根据损伤程度，TBI可以分为轻度、中度和重度TBI。其划分方法主要依据格拉斯哥昏迷评分(Glasgow Coma Scale，GCS)，即在TBI中，GCS评分在3到8之间的患者为重度TBI，GCS评分在9到12之间的患者为中度TBI，GCS评分在13到15之间的患者为轻度TBI。其中GCS评分主要通过睁眼反应、语言反应和运动反应对TBI患者伤情进行评估。由于主治医生的经验等原因，评估结果往往具有一定的主观性。而且TBI往往伴随着多发伤，导致与TBI可能无关的睁眼、语言和运动障碍，导致对TBI病情的误判。此外，不同国家、不同地域的语言也可能存在一定的交流障碍。因此TBI患者病情准确客观的评估对其精准合理治疗，防止治疗过度和治疗不足具有重要的指导意义。

抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT Ⅲ)。AT Ⅲ是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合。形成AT Ⅲ凝血酶复合物而使酶灭活，肝素可加速这一反应达千倍以上。目前国内外对该酶的研究甚少，限制了其在临床上的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明在对抗凝血酶III进行研究过程中，发现了抗凝血酶III的新用途。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种抗凝血酶III的新用途，具体为抗凝血酶III用于制备评估TBI患者伤情严重程度的标记物的应用。

本发明还提供用于检测抗凝血酶III的物质在制备用于评估TBI患者伤情、或检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的产品中的应用。

通过检测TBI患者脑脊液中抗凝血酶III的含量，可以用于评估TBI患者伤情严重程度，该评估手段具有特异性好、敏感性高、重现性好和患者依从性好等特点。

本发明通过大量实验证明，当抗凝血酶III含量≤37.4ng/ml，判断为轻度TBI患者；当37.4ng/ml<抗凝血酶III含量≤149.8ng/ml，判断为中度TBI患者；当抗凝血酶III含量＞149.8ng/ml，判断为重度TBI患者。通过对抗凝血酶III含量进行筛选和确定，使得评估TBI患者伤情严重程度的灵敏度大于99.9％，特异性大于99.9％。

本发明提供的抗凝血酶III(AT Ⅲ)具有如下序列：MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICTAKPRDIPMNPMCIYRSPEKKATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAINKWVSNKTEGRITDVIPSEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSKLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK。(如SEQ ID No.1所示)

本发明所指的用于检测抗凝血酶III的物质具体为抗凝血酶III的抗体，如兔抗ATⅢ抗体，具体可为abcam公司的兔抗AT Ⅲ抗体。

本发明另一方面还提供一种检测或评估TBI患者伤情的试剂盒，该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质，该用于检测抗凝血酶III的物质为抗凝血酶III的抗体，例如可以为兔抗AT Ⅲ抗体，具体可为abcam公司的兔抗AT Ⅲ抗体。

进一步的改进，用于检测抗凝血酶III的物质为酶标抗凝血酶III抗体，可以用生物素、免疫荧光标记物等对抗凝血酶III抗体进行标记。

进一步的改进，抗凝血酶III具有如SEQ ID No.1所示的序列，且抗凝血酶III的抗体为兔抗AT Ⅲ抗体。

进一步的改进，本发明提供的试剂盒还包括酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液。

进一步的改进，所述酶标抗凝血酶III抗体稀释液为含有质量分数为0.75％的氯化钠、2％的聚乙二醇400的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。该稀释液可以使得保存的酶标抗凝血酶III抗体具有很高的活性和特异性。

进一步的改进，所述洗涤液为含有质量分数为3％的壳聚糖、0.5％的绿原酸单甘油酯的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L。该洗涤液可以保证酶标抗凝血酶III抗体具有很高的活性。

进一步的改进，终止液为0.1mol/L的硫酸水溶液。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种抗凝血酶III的新用途及试剂盒，用于检测抗凝血酶III的物质可以用于评估TBI患者伤情或用于检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的严重程度，该方法在用于TBI患者伤情严重程度评估或检测时，具有特异性好、敏感度高、重现性好及患者依从性好等优点。并且经过试验证明抗凝血酶III(AT Ⅲ)可以作为TBI患者伤情严重程度评估的标志物，AT Ⅲ可用于TBI患者伤情严重程度评估，且结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为试验例的结果，a表示兔抗AT Ⅲ抗体免疫荧光分析图，b表示用DAPI复染色图；c中merged表示a、b融合图；

图2为试验例2的兔抗AT Ⅲ检测结果；

图3为试验例2的鼠抗AT Ⅲ检测结果；

图4为试验例2的羊抗AT Ⅲ检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度100％。

实施例1一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记兔抗凝血酶III抗体。

实施例2一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记抗凝血酶III的抗体；

其中，所述酶标抗凝血酶III抗体稀释液为含有质量分数为0.75％的氯化钠、2％的聚乙二醇400的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。

对照例1

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记鼠抗凝血酶III抗体。

对照例2

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记羊抗凝血酶III抗体。

对照例3

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记抗凝血酶III的抗体；

其中，所述酶标抗凝血酶III抗体稀释液为含有质量分数为2％的聚乙二醇400的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。

对照例4

该试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质、酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液；该用于检测抗凝血酶III的物质为酶标记抗凝血酶III的抗体；

其中，所述酶标抗凝血酶III抗体稀释液为含有质量分数为0.75％的氯化钠、2％的聚乙二醇6000的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。

试验例1抗凝血酶III作为TBI患者伤情严重程度的标记物试验

配对样本：6只TBI SD大鼠，以及假手术SD大鼠。

通过iTRAQ对TBI大鼠脑组织损伤区以及假手术组大鼠对应部位蛋白进行标记，采用定量蛋白组学UPLC-LTQ Orbitrap-Velos超高压液相与质谱分析TBI后大鼠损伤区脑组织蛋白表达变化；MaxQuant(版本1.5.3.28)搜索Swiss-Prot(版本release 2015_08,7928query number)数据库。经典卡值：蛋白质丰度增加1.0倍或者蛋白质丰度减少1.0倍。

具体的实验方法如下：分别取各个样本，进行免疫组织化学检测。采用一抗为兔抗AT Ⅲ抗体(Abcam,货号：ab154560)，二抗为羊抗兔荧光二抗(Abcam，货号：ab150077)，检测结果见图1。

从图1中可以看出，通过免疫荧光技术证实AT Ⅲ基因在TBI组中表达量显著上调。

试验例2抗凝血酶III(AT Ⅲ)在TBI患者脑脊液中的水平差异

检测样本：178例TBI患者的脑脊液(55例轻度TBI，61例中度TBI，62例重度TBI)；各个患者均为知情同意的志愿者。

基于如下标准评判：对于某个待测患者而言，当AT Ⅲ含量≤37.4ng/ml，判断为轻度TBI患者；当37.4ng/ml<AT Ⅲ含量≤149.8ng/ml，判断为中度TBI患者；当AT Ⅲ含量＞149.8ng/ml，判断为重度TBI患者。

分别取各个样本，进行酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)检测。分别采用实施例1试剂盒、对照例1和对照例2的试剂盒进行检测。178例TBI患者脑脊液兔抗AT Ⅲ检测结果见图2，鼠抗AT Ⅲ检测结果见图3，羊抗AT Ⅲ检测结果见图4(每个点代表1个样本)。

从图2中可以看出，在55例轻度TBI患者中，检测出有55例TBI患者的AT Ⅲ含量在15.7ng/ml±4.6ng/ml范围内，在61例中度TBI患者中，检测出有61例TBI患者的AT Ⅲ含量在63.4ng/ml±5.5ng/ml范围内，在62例TBI患者中，检测出有62例TBI患者的AT Ⅲ含量在263ng/ml±7.2ng/ml范围内，由此得出，采用实施例1试剂盒在55例轻度TBI患者、61例中度TBI患者和62例重度TBI患者中，检测出轻度TBI患者的例数为55例，中度TBI患者的例数为61例，重度TBI患者的例数为62例。该试剂盒检测的灵敏度大于99.9％，特异性大于99.9％。

从图3中可以看出，在55例轻度TBI患者中，检测出有51例患者AT Ⅲ含量在20.5ng/ml±10.3ng/ml范围内，其余4例患者的AT Ⅲ含量分别为62ng/ml、159ng/ml、65.47ng/ml和98.7ng/ml，在61例中度TBI患者中，检测出有56例患者AT Ⅲ含量在80.2ng/ml±15.8ng/ml范围内，其余5例患者的AT Ⅲ含量分别为268.9ng/ml、194.73ng/ml、16.9ng/ml、23.4ng/ml和35.7，在62例重度TBI患者中，检测出有58例患者AT Ⅲ含量在268ng/ml±20.5ng/ml范围内，其余4例患者的AT Ⅲ含量分别为123.4ng/ml、13.6ng/ml、95.3ng/ml、65.4ng/ml，由此得出，采用对照例1试剂盒，在55例轻度TBI患者，检测出有51例轻度患者，3例中度患者，1例重度患者，在61例中度TBI患者中，检测出56例中度患者，3例轻度患者和2例重度患者，在62例重度TBI患者中，检测出58例重度患者，1例轻度患者和3例中度患者，该试剂盒检测的灵敏度和特异性均大大小于实施例1的试剂盒。

从图4中可以看出，在55例轻度TBI患者中，检测出有52例患者AT Ⅲ含量在18.9ng/ml±12.4ng/ml范围内，其余3例患者的AT Ⅲ含量分别为65.4ng/ml、167.5ng/ml、92.3ng/ml，在61例中度TBI患者中，检测出有58例患者AT Ⅲ含量在85.3ng/ml±12.1ng/ml范围内，其余3例患者的AT Ⅲ含量分别为18.9ng/ml、189.7ng/ml、169.2ng/ml、在62例重度TBI患者中，检测出有60例患者AT Ⅲ含量在285ng/ml±12.4ng/ml范围内，其余2例患者的AT Ⅲ含量分别为134.5ng/ml、57.8ng/ml，由此得出，采用对照例1试剂盒，在55例轻度TBI患者，检测出有52例轻度患者，2例中度患者，1例重度患者，在61例中度TBI患者中，检测出58例中度患者，1例轻度患者和2例重度患者，在62例重度TBI患者中，检测出60例重度患者，1例轻度患者和1例中度患者，该试剂盒检测的灵敏度和特异性均大大小于实施例1的试剂盒。

结论：用兔抗凝血酶III抗体可以用于评估TBI患者伤情严重程度，灵敏度大于99.9％，特异性大于99.9％。

试验例3酶标抗凝血酶III抗体保存试验

于0℃下保存一个月，分别检测实施例4、对照例3和对照例4的试剂盒中酶标抗凝血酶III抗体活性和特异性，得出实施例4的试剂盒中保存的酶标抗凝血酶III抗体的活性和特异性均保持在95.6％以上，而对照例3的试剂盒中保存的酶标抗凝血酶III抗体的活性降低至56.2％，特异性降低至41.3％，而对照例4的试剂盒中保存的酶标抗凝血酶III抗体的活性降低至67.8％，特异性降低至63.5％。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京臻惠康生物科技有限公司

<120> 一种抗凝血酶III的新用途及试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 464

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

mysnvigtvt sgkrkvylls llligfwdcv tchgspvdic takprdipmn pmciyrspek 60

katedegseq kipeatnrrv welskansrf attfyqhlad skndndnifl splsistafa 120

mtklgacndt lqqlmevfkf dtisektsdq ihfffaklnc rlyrkankss klvsanrlfg 180

dksltfnety qdiselvyga klqpldfken aeqsraaink wvsnktegri tdvipseain 240

eltvlvlvnt iyfkglwksk fspentrkel fykadgescs asmmyqegkf ryrrvaegtq 300

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viagrslnpn rvtfkanrpf lvfirevpln tiifmgrvan pcvk 464

Claims (10)

1.抗凝血酶III在制备用于评估TBI患者伤情严重程度的标记物的应用。

2.用于检测抗凝血酶III的物质在制备用于评估TBI患者伤情、或检测、辅助检测待评估患者TBI伤情的产品中的应用，所述产品优选为试剂盒。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当抗凝血酶III含量≤37.4ng/ml，判断为轻度TBI患者；当37.4ng/ml<抗凝血酶III含量≤149.8ng/ml，判断为中度TBI患者；当抗凝血酶III含量＞149.8ng/ml，判断为重度TBI患者。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗凝血酶III具有如SEQ ID No.1所示的序列。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于检测抗凝血酶III的物质为抗凝血酶III抗体，优选为兔抗凝血酶III抗体。

6.一种用于检测或评估TBI患者伤情的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测抗凝血酶III的物质，所述用于检测抗凝血酶III的物质为抗凝血酶III抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，用于检测抗凝血酶III的物质为酶标抗凝血酶III抗体。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗凝血酶III具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述抗凝血酶III抗体为兔抗凝血酶III抗体。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板、标准品、缓冲液、酶标抗凝血酶III抗体稀释液、洗涤液、终止液。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗凝血酶III抗体稀释液为含有质量分数为0.75％的氯化钠、2％的聚乙二醇400的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。