CN117567597A - 一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒,涉及医药生物领域。本发明的抗凝血酶Ⅲ基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种抗Xa活性检测试剂盒,含有如前所述的抗凝血酶Ⅲ。本发明突变后的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难,而在肝素存在下,则更容易与Xa结合,不与凝血酶结合,从而在实现抑制Xa活性的同时不会抑制凝血酶的活性;突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性;检测试剂盒的灵敏度得到了提升。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域,具体涉及一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒。
背景技术
抗凝血酶(antithrombin,AT)曾称为抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),是由肝细胞和血管内皮细胞分泌的一种相对分子质量约58.2kD的糖蛋白,是一种丝氨酸蛋白酶的抑制物,属于α2球蛋白,其生理半衰期为17.5~26.5小时,它是血浆中重要的生理性抗凝因子,其作用约占抗凝系统总活性的70%~80%。抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT Ⅲ)。AT Ⅲ是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。肝素与抗凝血酶Ⅲ结合以后可以使抗凝血酶Ⅲ的构型发生改变,抗凝血酶Ⅲ的活性部位就会被充分的暴露,暴露以后能够更好的跟凝血因子相结合,从而抑制凝血因子肝素可诱导抗凝血酶发生构象改变,使其更易与凝血酶结合,大大提升抗凝血酶Ⅲ的抗凝作用。肝素与AT结合后,使AT与凝血酶迅速且稳定结合。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合,形成抗凝血酶Ⅲ-凝血酶复合物而使凝血酶灭活,肝素可使这一反应加速千倍以上。
现有检测肝素浓度的试剂盒,大致可分为两种:一种是试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ,另一种是抗凝血酶Ⅲ作为一个单独组份存在。前者由于试剂中不含含抗凝血酶Ⅲ,利用样本中的抗凝血酶Ⅲ来抑制Xa的活性,达到检测肝素浓度的目的。如果样本中抗凝血酶Ⅲ含量偏低,导致对肝素的检测结果不准确。后者试剂盒若存放时间过长,可能存在试剂盒灵敏度降低的问题,这样导致一般检测中,还需要和抗凝血酶Ⅲ活性一起检测,增加了实验和患者的检测成本。而后者则增加了操作步骤,操作过程繁琐。
发明内容
为解决上述问题,本发明目的在于提供一种重组的抗凝血酶Ⅲ,该重组的抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变,384位的脯氨酸变成组氨酸,237位的谷氨酸变成苯丙氨酸,146位的赖氨酸变成精氨酸。通过这三个氨基酸的突变,让抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难,而在肝素存在下,抗凝血酶Ⅲ更容易与Xa结合,而不与凝血酶结合,而从而在实现抑制Xa的活性同时而不会抑制凝血酶的活性(小分子肝素本来就不让抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性)。本发明还提供了一种抗Xa活性检测试剂盒,该试剂盒直接将抗凝血酶Ⅲ置于试剂盒的试剂中,相对于现有测定盒来说,具有较高的灵敏度、操作简易性,此外还降低了成本花费。
本发明通过下述技术方案实现:
一种抗凝血酶Ⅲ,其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
一种抗Xa活性检测试剂盒,含有如前所述的抗凝血酶Ⅲ。
如前所述的试剂盒,抗凝血酶Ⅲ添加在检测试剂中。
人抗凝血酶Ⅲ全长氨基酸序列
本发明就是通过重组方法改变抗凝血酶Ⅲ的的某些氨基酸进行定点突变。如上述序列所示,该抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变,384位的脯氨酸变成组氨酸,237位的谷氨酸变成苯丙氨酸,146位的赖氨酸变成精氨酸。突变后的抗凝血酶Ⅲ相对于突变前具有两个不同点:
1、突变后的抗凝血酶Ⅲ在没有肝素情况下,不与Xa或凝血酶或其它凝血因子结合,而突变前的抗凝血酶Ⅲ是能够与Xa或凝血酶或其它凝血因子结合的,虽然结合比较缓慢,但是在长时间后,抗凝血酶Ⅲ还是可以抑制Xa或凝血酶的活性。
2、在肝素存在下,肝素与突变后的抗凝血酶Ⅲ结合后,能够迅速与Xa结合,抑制Xa的活性,而与凝血酶结合缓慢。
本发明的试剂盒是将氨基酸突变后的抗凝血酶Ⅲ加入到肝素浓度检测的试剂中(抗Xa活性检测)具有明显的优势:
1、突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性。现有检测肝素浓度的试剂盒中,要么试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ,要么抗凝血酶Ⅲ作为一个单独的组份。试剂中不含有抗凝血酶Ⅲ,利用的是样本中的抗凝血酶Ⅲ来抑制Xa的活性,当样本中抗凝血酶Ⅲ缺乏时,导致不能准确测量肝素的浓度。一般需要和抗凝血酶Ⅲ活性一起检测,这样增加了实验和患者的检测成本。而将抗凝血酶Ⅲ作为一个单独的组份,增加了操作步骤。
2、突变后的抗凝血酶Ⅲ在试剂盒中,由于在肝素存在下,突变后的抗凝血酶Ⅲ不与凝血酶反应,抑制凝血酶的活性。因此,在肝素浓度较低的情况下,突变后的抗凝血酶Ⅲ尽可能与Xa作用,这样就提高了检测的灵敏度。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
1、本发明突变后的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶在没有肝素存在下结合更加困难,而在肝素存在下,则更容易与Xa结合,而不与凝血酶结合,而从而在实现抑制Xa的活性同时而不会抑制凝血酶的活性。
2、突变后的抗凝血酶Ⅲ可以直接加入到含有Xa的试剂中而不影响Xa的活性。
3、检测试剂盒的灵敏度得到了提升。
实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1 突变后的抗凝血酶Ⅲ的制备
本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术:
天然抗凝血酶Ⅲ mRNA序列
通过PCR引入碱基突变
436-438 aaa突变成aga,709-711 gaa突变成ttt,1273-1275由cca突变成cac。
其中,正向引物序列:atgtattcca atgtgatagg;
突变引物序列1:ctgagagaac atctgatcag;
突变引物序列2:ttccctcgtt tgccatcaatg ag;
突变引物序列3:aagtccaaac tccacggtat tg;
反向引物序列:aacccttgtg ttaagtaa。
突变后的抗凝血酶Ⅲ核酸全长序列为:
将突变后的核酸序列构建到表达载体pcDNA™3.1 (+)上,通过细胞系CHO进行表达,即可得到突变后的抗凝血酶Ⅲ蛋白,再经过亲和纯化得到纯度95%以上的重组抗凝血酶Ⅲ蛋白。该抗凝血酶Ⅲ对天然抗凝血酶Ⅲ做了3个位点的氨基酸突变,384位的脯氨酸变成组氨酸,237位的谷氨酸变成苯丙氨酸,146位的赖氨酸变成精氨酸。
实施例2
实验1、突变后的抗凝血酶Ⅲ 对凝血酶抑制检测
实验设计:试剂1为分别添加不同浓度的突变后的抗凝血酶Ⅲ和没有突变的抗凝血酶Ⅲ到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2% PEG8000,凝血酶500u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.1%的凝血酶底物S-2238。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应60min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应2min,检测读数,得到吸光度。结果如表1所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ没有抑制凝血酶活性。
实验2:在试剂中添加普通肝素,检测抗凝血酶Ⅲ对凝血酶的抑制
实验设计:
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2%PEG8000,凝血酶500u/ml。
试剂2为 50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的凝血酶底物S-2238。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应60min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应2min,检测读数,得到吸光度。结果如表2所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下没有抑制凝血酶活性,而天然人抗凝血酶Ⅲ在肝素存在下明显凝血酶活性。
实验3、突变后的抗凝血酶Ⅲ 对Xa活性抑制检测
实验设计:试剂1为分别添加不同浓度的突变后的抗凝血酶Ⅲ和没有突变的抗凝血酶Ⅲ到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2% PEG8000,Xa5000u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应60min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应2min,检测读数,得到吸光度。结果如表3所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ没有抑制Xa活性。
实验4:在试剂中添加普通肝素,检测抗凝血酶Ⅲ对Xa的抑制及线性比较
实验设计:
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2%PEG8000,Xa 5000u/ml,500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应5min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应1min,检测读数,得到吸光度。结果如表4所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下都可抑制Xa活性,且没有明显差异,且线性都为0.99。
实验5:在试剂中添加小分子肝素,检测抗凝血酶Ⅲ对Xa的抑制及线性比较
实验设计:
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的小分子肝素到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2%PEG8000,Xa 5000u/ml,500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应5min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应1min,检测读数,得到吸光度。结果如表5所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在不同浓度的肝素存在下都可抑制Xa活性,且没有明显差异,且线性都为0.99。
实验6:突变人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ在凝血酶存在下检测不同肝素的浓度的对比
实验设计:
试剂1为分别添加不同浓度的突变后的普通肝素到50mM的TRIS缓冲液系列,该系列缓冲液还含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2%PEG8000,Xa 5000u/ml,500ng/ml抗凝血酶Ⅲ,凝血酶500u/ml。
试剂2为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,37℃反应5min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应1min,检测读数,得到吸光度。结果如表6所示。
结果分析:突变后的人抗凝血酶Ⅲ和天然人抗凝血酶Ⅲ检测不同浓度的肝素,突变后的人抗凝血酶Ⅲ灵敏度明显比天然人抗凝血酶Ⅲ要高。
实验7:突变后的人抗凝血酶Ⅲ37℃加速破坏稳定性研究
实验设计:
试剂1为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2% PEG8000,Xa 5000u/ml。
试剂2为 50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300, 0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
将试剂1和试剂2分成两部分,一部分放置2-8℃冰箱,一部分放置37℃恒温箱。37℃放置1天,3天,5天,7天,9天,12天,14天,15天待检测。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,分别加入肝素浓度位0.1IU/ml或1IU/ml的样本,37℃反应5min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应1min,检测读数,得到吸光度。结果如表7所示。
实验结果分析:从实验结果可以看出,突变后的抗凝血酶Ⅲ比天然的抗凝血酶Ⅲ在37℃加速破坏条件下更稳定。突变后的抗凝血酶Ⅲ在37℃放置15天,抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性下降幅度低于15%,而天然抗凝血酶Ⅲ下降幅度超过20%。
实验8:突变后的人抗凝血酶Ⅲ2-8℃放置条件下稳定性研究
实验设计:
试剂1为50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.2% PEG8000,Xa 5000u/ml,500ng/ml抗凝血酶Ⅲ。
试剂2为 50mM的TRIS缓冲液,该缓冲液含0.5%的BSA,0.1%tween20,1%的甘氨酸,0.2%PC300,0.5%的蔗糖,0.1%的Xa底物S-2765。
将试剂1和试剂2放置2-8℃冰箱。放置时间为3个月,6个月,9个月,12个月,15个月,18个月,20个月,21个月待检测。
实验反应:取试剂1体积100ul加入到反应杯中,分别加入肝素浓度位0.5IU/ml或1IU/ml的样本,37℃反应5min,在加入试剂2体积100ul,37℃反应1min,检测读数,得到吸光度。结果如表8所示。
实验结果分析:从实验结果可以看出,突变后的抗凝血酶Ⅲ比天然的抗凝血酶Ⅲ在2-8℃实时条件下更稳定。突变后的抗凝血酶Ⅲ在2-8℃放置21个月,抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶的活性下降幅度低于15%,而天然抗凝血酶Ⅲ下降幅度超过20%。
实验9:突变后的人抗凝血酶Ⅲ与天然抗凝血酶Ⅲ检测临床结果对比
实验设计:用含有突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒(已定标)和不含抗凝血酶Ⅲ的试剂盒同时在全自动凝血分析仪上检测含普通肝素(或小分子肝素)的样本。样本中的肝素用试剂盒检测并做了确认。然后用检测的值与样本理论值进行相关性比较,来判定含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒的检测准确性。结果如表9所示。
结果分析:普通肝素标本和小分子肝素标本各检测了50份。从实验结果可以看出,含有突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果和样本理论值相关性R在0.999以上,而不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果和样本理论值相关性R在0.9366和0.9454。进一步分析数据,不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒在0.1IU/ml以下的标本检测偏高,说明灵敏度偏低。对于有些高值的标本,不含突变抗凝血酶Ⅲ的试剂盒检测结果偏低,用抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒对这些样本检测,发现这些样本都是抗凝血酶Ⅲ活性偏低,知道样本中的肝素检测值偏低。
总结:根据以上实验数据,发现在抗Xa活性检测试剂盒中试剂R1中添加了含突变氨基酸的抗凝血酶Ⅲ,不仅稳定性更好,而且灵敏度高,测试结果更准确,不需要进行抗凝血酶Ⅲ活性检测,既简化了检验实验又节约了成本。
实施例3 试剂盒的使用方法
抗Xa因子检测法
标本中的肝素与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)结合形成复合物,抑制剂试剂盒中过量添加的Xa因子。测量剩余Xa因子的活性,剩余的Xa因子可以催化发色底物,获得黄色的对硝基苯胺(pNA),在405nm波长下测定的游离pNA的OD值,与血浆中的肝素活性成反比。以此计算样本中抗凝剂肝素的浓度。
ATⅢ(过量)+肝素==>ATⅢ-肝素复合物
ATⅢ-肝素+Xa(过量)==>ATⅢ-肝素-Xa复合物+Xa(剩余)
底物-pNA+Xa(剩余)==>三肽+pNA
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗凝血酶Ⅲ,其特征在于,其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种抗Xa活性检测试剂盒,其特征在于,含有如权利要求1所述的抗凝血酶Ⅲ。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,抗凝血酶Ⅲ添加在检测试剂中。
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