CN103993056A - 抗凝血酶iii组合物的制造方法 - Google Patents

抗凝血酶iii组合物的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103993056A
CN103993056A CN201410016193.XA CN201410016193A CN103993056A CN 103993056 A CN103993056 A CN 103993056A CN 201410016193 A CN201410016193 A CN 201410016193A CN 103993056 A CN103993056 A CN 103993056A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antithrombin iii
dna
cell
seq
sugar chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410016193.XA
Other languages
English (en)
Inventor
山田刚士
佐藤光男
神田丰
山野和也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of CN103993056A publication Critical patent/CN103993056A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8128—Antithrombin III
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01068—Glycoprotein 6-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.68), i.e. FUT8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01047—GDP-mannose 4,6-dehydratase (4.2.1.47), i.e. GMD
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03018—GDP-mannose 3,5-epimerase (5.1.3.18)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及抗凝血酶III组合物的制造方法。具体而言，本发明提供一种含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的结构。

Description

抗凝血酶III组合物的制造方法
本申请是申请日为2004年10月8日、中国国家申请号为200480035813.9、发明名称为“抗凝血酶III组合物的制造方法”申请的分案申请。 
技术领域
本发明涉及含有具有复合体型N-糖苷连接的糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。 
背景技术
血栓的形成会带来血流中断的危险。由于血栓形成引起的血流中断成为一种致命因素，活体可以通过几种机制来控制和调节血液凝固。即，通过丝氨酸蛋白酶直接灭活活化的凝血因子[The Thrombin,Volume I（Machovich R.主编），pp.1-21,CRC Press,Boca Raton（1982）]，基于通过活化蛋白C来降解凝血因子V和凝血因子VIII的调控机制[Progress in Hemostasis and Thrombosis,Volume7（Spaet T.H.主编），pp.25-54,Grune&Stratton,New York（1984）]，以及通过血液中的多种丝氨酸蛋白酶抑制剂对活化凝血因子的抑制机制。另外，还发现了以依赖活化X因子的方式存在的抑制VII因子活化的组织因子抑制剂[Journal of Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis,2,550（1991）]。其中最重要的机制是血液中多种丝氨酸蛋白酶抑制剂对活化凝血因子的抑制机制。 
血液中存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其含量达到总血浆蛋白的10%。已知这些抑制剂中的4种抑制剂，即抗凝血酶III、α1蛋白酶抑 制剂、α2巨球蛋白和肝素辅助因子II对于调节血液凝固是非常重要的。在这些因子中，抗凝血酶III尤其重要，占血浆抗凝血酶活性的70%。 
抗凝血酶III是含有432个氨基酸的糖蛋白，其分子量大约为59,000至65,000，并且其分子中有3个二硫键，Cys8-Cys128、Cys21-Cys95和Cys247-Cys430[Proc.Natl.Acad.Sci,USA,80,1845（1983）]。通过这些键，在C端形成一个大的环状结构，在这个环状结构中存在有作为活性中心的Arg393-Ser394键（图1）。人抗凝血酶III的等电点为5.11。N糖苷连接糖链结合在抗凝血酶III的4个位点上，即从N端数第96个、第135个、第155个和第192个天冬酰胺残基（下文中分别称为Asn96、Asn135、Asn155和Asn192）上。抗凝血酶III在人血浆中以两种异构形式存在，α型具有4个N糖苷连接的糖链，β型仅有3个N糖苷连接的糖链，却没有Asn135上的糖链[Pathophysiol.Haemost.Thromb.,32,143（2002）]，人血浆中的抗凝血酶III中，90-95%是α型，其余5-10%是β型。 
结合在抗凝血酶III上的复合体型N-糖苷连接的糖链由N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖和甘露糖构成（图2）。人血浆中分布的抗凝血酶III的特性之一是它的糖链结构未经岩藻糖修饰。 
抗凝血酶III已经被开发为一种血液凝固抑制剂，在全球广泛用于治疗先天性抗凝血酶III缺陷引起的血栓形成和伴有抗凝血酶III减少的多发性血管内血液凝固综合征。 
诸如抗凝血酶III的血液制品使用混合的人血浆样品作为原料而生产。在日本，混合血浆在日本红十字会血浆分离中心制备，在进行6个月的储存后将大约5,000至10,000名志愿者的血浆样品混合而提供。事实上，为生产一批血液制品如Cross Eight M（日本红十字会）的干燥浓缩人血液凝血因子VIII制品，需要几批从上述混合血浆中获得的冷冻沉淀物，使用大约80,000名志愿者的血浆样品[Japanese Journal of  Transfusion Medicine,48,27（2002）]。 
混合血浆是使用献血者提供的血液样品作为原料生产的，已有报道日本献血者中人细小病毒B19阳性的比例估计为0.6-0.8%[Journal of Japan Society of Blood Transfusion,42,231（1996）]。因此，可以计算出与上述Cross Eight M等量的一份制品要被相当于大概480至640名献血者的人细小病毒B19阳性血液样品污染。人细小病毒B19是一种直径为18至26nm、没有被膜的小病毒，其即使在60℃进行热处理30分钟、在大约pH3下的酸处理、氯仿处理、表面活性剂处理和类似处理后仍保持其抗性[Science,262,114（1993）]，使得它不能被一般的病毒清除方法清除。因此，清除人细小病毒B19需要有通过清除被膜病毒专用的膜的过滤步骤，所述膜的孔径为几纳米至几十纳米。但是，人们认为使用孔径这样小的过滤步骤，即纳米过滤步骤很难被许多血浆分离制品的制造方法所采用[Japanese Journal of Transfusion Medicine,48,27（2002）]。人们认为人细小病毒B19是传染性红斑的病因，在没有抗-B19抗体的健康人群中一般仅显示短暂的类似感冒的症状，但是在一些病例中引发慢性溶血性贫血。而且，据说在免疫缺陷患者中有时也可诱发严重的急性单纯红细胞发育不全。另外，有报道称没有抗-B19抗体的孕妇有时引起流产或导致未出生的婴儿水肿，15%的子宫内胎儿死亡B19 DNA检查的结果呈阳性[Lancet,357,1494（2001）]。在Cross Eight M（日本红十字会）的干燥浓缩人凝血因子VIII制品中，1997年9月报道了一例怀疑由于给予这种制品而暂时感染人细小病毒B19的病例[Journal of Japanese Society of Child Hematology,11,289（1997）]。 
乙型肝炎阴性、丙型肝炎阴性和人免疫缺陷病毒I和II阴性的混合血浆被用作抗凝血酶III血液制品如Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）和Anthrobin P（Aventis Boehring制造）的制造原料，但是在原料中并未确认是否存在人细小病毒B19。 
尽管抗凝血酶III血液制品的生产过程中要在60℃进行病毒灭活处理10小时，即巴氏灭菌，仍然有许多问题还不能完全解决，如蛋白抗凝血酶III被变性，以及AIDS病毒、人细小病毒和可引起突变型克雅氏病的朊病毒（prion）。 
如上所述，使用血液制品的缺点在于有病毒感染的危险，这种危险性采用现有技术不能完全排除。因此，抗凝血酶III制剂的安全性需要提高。 
因此，为了不使用人体血浆作为原料提供人抗凝血酶III，已经考虑使用重组体作为其替代品。但是，采用基因重组技术制备的重组抗凝血酶III在活性上次于从天然原料如血浆中获得的抗凝血酶III。其原因考虑是因为结合在重组体上的糖链结构与从血浆中制备的抗凝血酶III不同，具体地说，推测由于岩藻糖结合在待与重组抗凝血酶III结合的复合体型N-糖苷连接的糖链上，其与肝素的亲和性变低，因此便不能获得足够的抗血液凝固活性[Journal of Biological Chemistry,268,17588（1993）；Biochemistry,35,8881（1996）]。迄今，有报道通过自幼年仓鼠肾得到的BHK细胞[Journal of Biological Chemistry,268,17588（1993）；Biochemistry,35,8881（1996）]、自中国仓鼠（Chinese hamster）卵巢得到的CHO细胞（WO02/02793）或转基因山羊（US2003096974）生产的重组抗凝血酶III，但是在每一个这些例子中，岩藻糖结合在与重组抗凝血酶III结合的复合体型N-糖苷连接的糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上。在产生的重组抗凝血酶III中，结合有岩藻糖的复合体型N-糖苷连接的糖链与全部复合体型N-糖苷连接的糖链的比例取决于宿主细胞而变化，但是估计其范围为39-95%。已经采取了许多努力通过多种装置如改善培养方法来减少糖链中结合有岩藻糖的复合体型N-糖苷连接的糖链的比例，但是仍然不能成功地制造糖链结构与天然抗凝血酶III相同的重组抗凝血酶III。 
发明内容
本发明涉及下列（1）至（24）的内容： 
（1）一种抗凝血酶III组合物的制造方法，其包括：在培养基中培养通过将编码抗凝血酶III的DNA导入经基因重组修饰的宿主细胞中获得的转化体，在培养物中形成并积累含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构；和从培养物中回收抗凝血酶III组合物。 
（2）根据（1）的方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未结合岩藻糖1-位的结构。 
（3）根据（1）或（2）的方法，其中所述的宿主细胞中的基因组被修饰成：与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失。 
（4）根据（1）至（3）中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞中编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组中的所有等位基因已经被敲除。 
（5）根据（3）或（4）的方法，其中所述与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶选自GDP-甘露糖4,6-脱水酶（GMD）和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶（Fx）。 
（6）根据（5）的方法，其中所述的GDP-甘露糖4,6-脱水酶是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）与由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白的DNA。 
（7）根据（5）的方法，其中所述的GDP-甘露糖4,6-脱水酶是选自（a）、（b）和（c）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的蛋白； 
（b）由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白； 
（c）由与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白。 
（8）根据（5）的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）与由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。 
（9）根据（5）的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶是选自（a）、（b）和（c）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的蛋白； 
（b）由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白； 
（c）由与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白。 
（10）根据（3）或（4）的方法，其中所述与所述复合体型N-糖 苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶是α1,6-岩藻糖基转移酶。 
（11）根据（10）的方法，其中所述的α1,6-岩藻糖基转移酶是由选自下列（a）至（d）的DNA编码的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）含有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的DNA； 
（c）与由SEQ ID NO:11所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA； 
（d）与由SEQ ID NO:12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。 
（12）根据（10）的方法，其中所述的α1,6-岩藻糖基转移酶是选自下列（a）至（f）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的蛋白； 
（b）含有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的蛋白； 
（c）由SEQ ID NO:13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（d）由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（e）由与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（f）由与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。 
（13）根据（1）至至（4）中任意一项的方法，其中所述的转化体为FERM BP-08472、FERM BP-10083、FERM BP-10084、FERM BP-10088或FERM BP-10089。 
（14）根据（1）至（12）中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞是选自下列（a）至（j）的细胞： 
（a）来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞； 
（b）大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞； 
（c）小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞； 
（d）小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞； 
（e）来源于叙利亚仓鼠（Syrian hamster）肾组织的BHK细胞； 
（f）人白血病细胞系Namalwa细胞； 
（g）胚胎干细胞； 
（h）受精卵细胞； 
（i）植物细胞； 
（j）酵母。 
（15）根据（1）至（14）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III组合物具有复合体型N-糖苷连接的糖链，所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。 
（16）根据（1）至（15）中任意一项的方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未结合岩藻糖1-位的结构。 
（17）根据（1）至（16）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。 
（18）根据（1）至（17）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。 
（19）根据（1）至（18）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。 
（20）根据（1）至（19）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的多肽： 
（a）含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）与由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。 
（21）根据（1）至（20）中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III来自哺乳动物。 
（22）通过根据（1）至（21）中任意一项的方法获得的抗凝血酶III组合物。 
（23）含有根据（22）的抗凝血酶III组合物作为活性成分的药物。 
（24）根据（23）的药物，其为诊断、预防或治疗伴有血液凝固的疾病的药剂。 
下面将详细描述本发明。本申请要求2003年10月9日提交的日本申请No.2003-350164的优先权，在此引入该专利申请的说明书和/或附图的全部内容。 
本发明涉及含有具有复合体型N-糖苷连接的糖链的基因重组抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法以及含有所述抗凝血酶III组合物的药物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。 
在本发明中，抗凝血酶III包括由下列（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）或（f）中的DNA编码的蛋白，下列（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（l）、（m）、（n）或（o）中的蛋白，和类似蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的DNA； 
（b）含有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA； 
（c）含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA； 
（d）与由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA； 
（e）与由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA； 
（f）与由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA； 
（g）含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白； 
（h）含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白； 
（i）含有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的蛋白； 
（j）由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白； 
（k）由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白； 
（l）由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白； 
（m）由与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白； 
（n）由与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白； 
（o）由与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的同源性为80%或更高 的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白。 
编码抗凝血酶III氨基酸序列的DNA还包括含有SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列的DNA，与由SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。 
在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是指使用例如含有SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列的DNA或其片段作为探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交、DNA杂交或类似方法获得的DNA。这些DNA的一个具体例子是可以通过在存在0.7至1.0M氯化钠的情况下在65℃下进行杂交而鉴定的DNA，其使用其上固定有来自集落或噬菌斑的DNA的滤膜，然后在65℃下用0.1至2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液：150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠）洗涤滤膜。可以根据下列文献所述的方法进行杂交：Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）（下文中称为Molecular Cloning,第二版）；Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons（1987-1997）（下文中称为Current Protocols in Molecular Biology）；DNA Cloning1:Core Techniques,A Practical Approach,第二版，Oxford University（1995）等。具体地说，能够在严格条件下杂交的DNA包括与SEQ ID NO:1、2或3所示核苷酸序列的同源性为至少60%或更高，优选70%或更高，更优选80%或更高，进一步优选90%或更高，尤其优选95%或更高，最优选98%或更高的DNA。 
在本发明中，由SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有基本类似于肝素结合活性的活性的蛋白是可以通过下列方法获得的蛋白：例如，通过位点定点诱变将位点定点突变引入编码由SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA中，其描述见Molecular  Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology,Nucleic Acids Research,10,6487（1982）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409（1982）；Gene,34,315（1985）；Nucleic Acids Research,13,4431（1985）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488（1985）等。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸残基的数目是一个或多个，不进行具体限定，但在其在通过一直方法如上述位点定向诱变可能实现的缺失、取代或添加的范围内。适当的数目为1至数打，优选1至20，更优选1至10，进一步优选1至5。 
由与SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有基本类似于肝素结合活性的活性的蛋白包括与由SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列组成的蛋白的同源性为至少80%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、进一步优选为95%或更高、特别优选为97%或更高、最优选为99%或更高的蛋白，其分别使用分析软件如BLAST[J.Mol.Biol.,215.403（1990）]或FASTA[Methods in Enzymology,183,63（1990）]进行计算。 
在本发明中，本文所使用的其中在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖并未结合岩藻糖的糖链是指该糖链中，在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖基本没有结合岩藻糖，优选在糖链中，在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-糖苷连接糖链上结合的岩藻糖的含量比为0%。本发明的抗凝血酶III组合物具体是指当进行下文4中所述的糖链分析时，基本上检测不到其中岩藻糖的组合物，岩藻糖的含量基本上检测不到是指岩藻糖的含量低于检出限。 
已知与糖蛋白如抗凝血酶III结合的N-糖苷连接糖链具有多种结构，但是具有如下列结构式（I）所示的共有核心结构： 
在结构式（I）中，与天冬酰胺结合的糖链末端称为还原末端，而另一端则称为非还原末端。 
N-糖苷连接的糖链包括：高甘露糖型，其中仅有甘露糖结合在核心结构的非还原末端上；复合体型，其中核心结构的非还原末端具有一个或多个半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖（下文中称为Gal-GlcNAc）平行支链，Gal-GlcNAc的非还原末端具有唾液酸结构，截开了N-乙酰氨基葡萄糖或类似物；混杂型，其中核心结构的非还原末端包含高甘露糖型和复合体型的两种支链；和类似物。 
抗凝血酶III分子中，从N-端开始在96、135、155和192处有四个天冬酰胺残基作为与N-糖苷连接糖链结合的氨基酸残基。例子包括抗凝血酶III（α型），其中N-糖苷连接糖链与全部天冬酰胺残基结合，和抗凝血酶III（β型），其中N-糖苷连接糖链在96、155和192处与天冬酰胺残基结合。 
结合抗凝血酶III的N-糖苷连接糖链包括上述的复合体型N-糖苷连接糖链。 
就结合抗凝血酶III分子的复合体型N-糖苷连接糖链而言，其包括核心结构如上述结构式（I）所示的任意糖链。因此，结合抗凝血酶III的三个或四个N-糖苷连接糖链的组合的数目非常庞大。 
因此，通过本发明的方法获得的抗凝血酶III组合物可以是含有具有相同糖链结构的抗凝血酶III分子的组合物，或者是含有具有不同糖 链结构的抗凝血酶III分子的组合物，只要该组合物的生物活性与天然抗凝血酶III的活性定性地相似。天然抗凝血酶III是指从天然原料如血浆中获得的抗凝血酶III。 
这种抗凝血酶III组合物包括含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物，其中所述复合体型N-糖苷连接糖链的结构中，在糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖。 
其中在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的糖链可以是任意糖链，只要该糖链具有复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未通过α键与岩藻糖1-位结合的结构。非还原末端的糖链结构可以是各种各样的。 
含有具有复合体型N-糖苷链接糖链的抗凝血酶III分子的组合物的糖链结构可以通过以下方法加以确定：用已知的方法如肼解作用和酶解作用从抗凝血酶III分子中释放出糖链[Seibutsukagaku Jikkenho(Biochemical Experimentation Methods)23-Totanpakushitsu Tosa Kenkyuho(Methods of Studies on Glycoprotein Sugar chains),Gakkai Shuppan Center,Reiko Takahashi主编（1989）]，用荧光物质或放射性同位素对释放出的糖链进行标记，通过色谱分离出标记的糖链。另外任选地，释放的糖链可通过HPAED-PAD法[J.Liq.Chromatogr.,6,1577（1983）]进行分析确定。 
在本发明的方法中，可以使用基因重组修饰的宿主细胞。 
基因重组修饰的宿主细胞是指细胞的特性已经通过人工基因重组操作被改变。人工基因重组操作包括靶向基因的基因破坏，导入编码酶的基因的显性失活突变体，将突变导入进酶中，以及抑制编码酶的基因的转录和翻译。而且，人工基因重组操作也包括人工选择基因重 组细胞的方法。 
本发明中的宿主细胞包括酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞以及类似物。细胞的例子包括下列2中所描述的细胞。具体地说，动物细胞中优选的是来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞、大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20、小鼠骨髓瘤细胞系NS0、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4、来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞、产生抗体的杂交瘤细胞、人白血病细胞系Namalwa、胚胎干细胞和受精卵细胞。 
宿主细胞的例子包括具有下列（a）或（b）性质的宿主细胞： 
（a）其中的基因组修饰成与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失的细胞； 
（b）其中的基因组修饰成与在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合岩藻糖1-位的糖链修饰相关的酶活性缺失的细胞。 
与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶的例子包括GDP-甘露糖4,6-脱水酶（GMD）和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶（Fx）。 
在本发明中，GDP-甘露糖4,6-脱水酶的例子包括由下列（a）或（b）的DNA编码的蛋白，和下列（c）、（d）或（e）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）与由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白的DNA； 
（c）含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的蛋白； 
（b）由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白； 
（c）由与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白。 
在本发明中，GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶的例子包括由下列（a）或（b）的DNA编码的蛋白，和下列（c）、（d）或（e）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）与由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白的DNA； 
（c）含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的蛋白； 
（d）由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白； 
（e）由与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白。 
与在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键结合岩藻糖1-位的糖链修饰相关的酶的例子是α1,6-岩藻糖基转移酶。 
在本发明中，α1,6-岩藻糖基转移酶的例子包括由下列（a）、（b）、（c）或（d）的DNA编码的蛋白，和下列（e）、（f）、（g）、（h）、（i）或（j）的蛋白： 
（a）含有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的DNA； 
（b）含有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的DNA； 
（c）与由SEQ ID NO:11所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA； 
（d）与由SEQ ID NO:12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条 件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA； 
（e）含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的蛋白； 
（f）含有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的蛋白； 
（g）由SEQ ID NO:13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（h）由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（i）由与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； 
（j）由与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。 
编码GDP-甘露糖4,6-脱水酶氨基酸序列的DNA包括含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，和与由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交并且编码具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白的DNA。 
编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶氨基酸序列的DNA包括含有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的DNA，和与由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交并且编码具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。 
编码α1,6-岩藻糖基转移酶氨基酸序列的DNA包括含有SEQ ID NO:11或12所示核苷酸序列的DNA，和与由SEQ ID NO:11或12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交并且编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。 
在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是指使用例如由SEQ ID  NO:7、9、11或12所示核苷酸序列组成的DNA或其片段作为探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交、DNA杂交或类似方法获得的DNA。这些DNA的一个具体例子是可以通过在存在0.7至1.0M氯化钠的情况下在65℃下进行杂交而鉴定的DNA，其使用其上固定有来自集落或噬菌斑的DNA的滤膜，然后在65℃下用0.1至2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液：150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠）洗涤滤膜。可以根据下列文献所述的方法进行杂交：Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology；DNA Cloning1:Core Techniques,A Practical Approach,第二版，Oxford University（1995）等。具体地说，能够在严格条件下杂交的DNA包括与SEQ ID NO:7、9、11或12所示核苷酸序列的同源性为至少60%或更高，优选70%或更高，更优选80%或更高，进一步优选90%或更高，尤其优选95%或更高，最优选98%或更高的DNA。 
在本发明中，由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白，由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白，以及由SEQ ID NO:13或14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白可以通过下列方法获得：例如，通过位点定点诱变将位点定点突变引入具有SEQ ID NO:8、10、13或14所示核苷酸序列的DNA中，其描述见Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology,Nucleic Acids Research,10,6487（1982）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409（1982）；Gene,34,315（1985）；Nucleic Acids Research,13,4431（1985）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488（1985）等。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸残基的数目是一个或多个，不进行具体限定，但在其在通过已知方法如上述位点定向诱变可能实现的缺失、取代或添加的范围内。适当的数目为1至数打，优选1至 20，更优选1至10，进一步优选1至5。 
另外，由与SEQ ID NO:8、10、13或14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性、GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性或α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白包括与SEQ ID NO:8、10、13或14所示氨基酸序列的同源性为至少80%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、进一步优选为95%或更高、特别优选为97%或更高、最优选为99%或更高的蛋白，其分别使用分析软件如BLAST[J.Mol.Biol.,215.403（1990）]或FASTA[Methods in Enzymology,183,63（1990）]进行计算。 
另外，能够产生本发明抗凝血酶III组合物的转化体也可以通过将编码抗凝血酶III分子的DNA导入进宿主细胞而获得，其中宿主细胞中的基因组修饰成与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失。 
基因组修饰成与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失是指：将突变导入到基因的表达调控区使得酶的表达缺失，或者将突变导入到基因的氨基酸序列中使得酶的功能被删除。“导入突变”是指在基因组中进行核苷酸序列的修饰，例如核苷酸序列的缺失、取代、插入和/或添加。对由此修饰的基因组基因进行表达或功能的完全抑制是指“基因组基因的敲除”。敲除基因组基因的例子包括从基因组中去掉所有或部分的靶基因。可以通过从染色体中删除含有靶基因起始密码子的外显子基因组区而获得敲除条件。 
就获得这种细胞的方法而言，可以使用任何技术，只要可以对目 标基因组进行修饰。例如，可以使用下列使上述酶活性缺失的技术： 
（a）靶向编码酶的基因的基因破坏； 
（b）导入编码酶的基因的显性失活突变体； 
（c）将突变导入进酶中； 
（d）抑制编码酶的基因的转录或翻译； 
（e）选择耐受凝集素的细胞系，所述的凝集素可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链。 
可以使用任何凝集素作为可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖在6-位上未通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链的凝集素，只要其能够识别该糖链结构。具体的例子包括扁豆凝集素LCA（源自兵豆（Lens culinaris）的扁豆凝集素）、豌豆凝集素PSA（源自豌豆（Pisum sativum）的豌豆凝集素）、蚕豆凝集素VFA（源自蚕豆（Vicia faba）的凝集素）和橙黄网胞盘菌（Aleuria aurantia）凝集素AAL（源自橙黄网胞盘菌的凝集素）。 
“细胞耐受凝集素”是指在有效浓度的凝集素的存在下细胞生长不受抑制。“有效浓度”是比使基因组修饰前的细胞（下文中亦称之为亲代细胞系）不能正常生长的浓度高的浓度，其优选为与使基因组修饰前的细胞不能正常生长的浓度相等，更优选为使基因组基因修饰前的细胞不能正常生长的浓度的2至5倍，进一步优选为10倍，最优选为20倍或更多倍。 
在本发明中，不抑制生长的凝集素有效浓度可以根据每种细胞系而适当确定。其通常为10μg/ml至10mg/ml，优选为0.5mg/ml至2.0mg/ml。 
基因组基因修饰前的细胞，即亲代细胞，包括应用基因组基因修饰技术对编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶或者与所 述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组基因进行修饰之前的细胞。基因组基因修饰前的细胞并没有特别限制，其包括下列作为优选实施例的细胞。 
基因组基因修饰前的NS0细胞的亲代细胞包括文献例如BIO/TECHNOLOGY,10,169（1992）和Biotechnol.Bioeng.,73,261（2001）所述的NS0细胞。而且，其包括登记于RIKEN Cell Bank,The Institute of Physical and Chemical Research的NS0细胞系（RCB0213）、将这些细胞系移入各种无血清培养基得到的亚细胞系以及类似物。 
基因组基因修饰前的SP2/0-Ag14细胞的亲代细胞包括文献例如J.Immunol.,126,317（1981）；Nature,276,269（1978）和Human Antibodies and Hybridomas,3,129（1992）所述的SP2/0-Ag14细胞。而且，其包括登记于美国标准菌库（American Type Culture Collection，下文中亦称之为ATCC）的SP2/0-Agl4细胞（ATCC CRL-1581）、将这些细胞系移入各种无血清培养基得到的亚细胞系（ATCC CRL-1581.1）以及类似物。 
基因组基因修饰前的源自中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞的亲代细胞包括文献例如Journal of Experimental Medicine,108,945（1958）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275（1968）；Genetics,55,513（1968）；Chromosoma,41,129（1973）；Methods in Cell Science,18,115（1996）、Radiation Research,148,260（1997）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216（1980）；Proc.Natl.Acad Sci.USA,60,1275（1968）；Cell,6,121（1975）；Molecular Cell Genetics，附录I,II（第883-900页）和Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555（1986）所述的CHO细胞。而且，其包括登记于ATCC的细胞系CHO-K1（ATCC CCL-61）、细胞系CHO/dhfr-（ATCC CRL-9096）和细胞系Pro-5（ATCC CRL-1781）、将这些细胞系移入各种无血清培养基得到的亚细胞系以及类似物。 
基因组基因修饰前的源自叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞的亲代细胞包括文献例如Proc R Soc Med,56,1062（1963）和Nature,203,1355（1964）所述的BHK细胞。而且，其包括登记于ATCC的细胞系BHK-21（ATCC CCL-10）、市售的细胞系CHO-S（Life Technologies的Cat#11619）、将这些细胞系移入无血清培养基得到的细胞系以及类似物。 
基因组基因修饰前的大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞的亲代细胞包括从Y3/Agl.2.3细胞建立的细胞系（ATCC CRL-1631）。具体的例子包括文献例如J.Cell Biol.,93,576（1982）和Methods Enzymol.,73B,1（1981）所述的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞。而且，其包括登记于ATCC的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞（ATCC CRL-1662）、将这些细胞系移入无血清培养基得到的亚细胞系以及类似物。 
产生本发明的抗凝血酶III的细胞包括细胞系MS705 pKAN-ATIII27，其为一种转化体，其中编码抗凝血酶III的基因被导入到编码α1,6-岩藻糖基转移酶的基因被敲除的CHO细胞中；通过将转化体移入无血清培养基中得到的细胞系pKAN-ATIII AFMS705，所述的转化体中编码抗凝血酶III的基因被导入到编码α1,6-岩藻糖基转移酶的基因被敲除的CHO细胞中；通过将转化体移入无血清培养基中得到的细胞系pKAN-ATIII GMDKO，所述的转化体中编码抗凝血酶III的基因被导入到编码GDP-甘露糖4,6-脱水酶的基因被敲除的CHO细胞中；以及类似物。 
细胞系MS705pKAN-ATIII27于2003年9月9日、细胞系pKAN-ATIII AFMS705和细胞系pKAN-ATIII GMDKO于2004年8月10日保藏在专利生物保藏中心（International Patent Organism Depositary），独立行政法人产业技术综合研究所（National Institute of Advanced Industrial Science and Technology），Central6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi，茨城，日本，其保藏号分别为FERM BP-08472、FERM BP-10088和FERM BP-10083。 
另外，能够产生变异体的细胞——这种变异体中SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中135位点的天冬酰胺被谷氨酰胺取代，并具有类似于本发明的天然抗凝血酶III组合物的生物活性（下文中称之为抗凝血酶III变异体）——包括通过将转化体移入无血清培养基中得到的细胞系pKAN-ATIIIN135Q AFMS705，所述的转化体中编码SEQ ID NO:40所示抗凝血酶III变异体的基因被导入到编码α1,6-岩藻糖基转移酶的基因被敲除的CHO细胞中；以及通过将转化体移入无血清培养基中得到的细胞系pKAN-ATIII N135Q GMDKO，所述的转化体中编码SEQ ID NO:40所示抗凝血酶III变异体的基因被导入到编码GDP-甘露糖4,6-脱水酶的基因被敲除的CHO细胞中。 
细胞系pKAN-ATIIIN135Q AFMS705和细胞系pKAN-ATIII N135Q GMDKO于2004年8月10日保藏在专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi，茨城，日本，其保藏号分别为FERM BP-10089和FERM BP-10084。 
具有类似于天然抗凝血酶III的生物活性的抗凝血酶III组合物可以采用上述的转化体产生。 
抗凝血酶III组合物中复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖并未结合岩藻糖是指当进行下述的糖链分析时，基本上检测不到岩藻糖。岩藻糖的含量基本上检测不到是指岩藻糖的含量低于检出限。 
抗凝血酶III的生物活性包括肝素结合活性、抗血液凝固活性以及 类似活性。 
抗凝血酶III组合物的肝素结合活性和抗血液凝固活性可以通过体外实验测量，如已知的抗凝血酶活性测定法或肝素辅助因子活性测定法，可以使用弥漫性血管内凝血综合症动物模型通过体内实验测定，或通过类似实验测定（The Second Series of Pharmaceutical Research and Development,Volume20,Blood Product,Ikuo Suzuki主编，Hirokawa Publishing Company,Tokyo,Japan（1992）；The Course of Medicine(Igaku no Ayumi),120,1147（1982）；Japanese Pharmacology and Therapeutics,17,5843（1989）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu), 62,3573（1985）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3688,1985；Parmacometrics,30,589（1985）。 
下面详细描述本发明抗凝血酶III组合物的方法。 
1.制备产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
可以通过以下方法制备用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞。 
（1）靶向编码酶的基因的基因破坏 
用于制备抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过基因破坏技术来制备，该技术靶向编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶，或与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶（下文中称为岩藻糖修饰相关酶）的基因。与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶的例子包括GDP-甘露糖4,6-脱水酶（下文中称为GMD）和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶（下文中称为Fx）。与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的例子包括α1,6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。 
在此使用的基因包括DNA和RNA。 
基因破坏的方法可以是任何能够破坏编码酶的靶基因的方法。可以使用的方法包括反义法、核酶法、同源重组法、RNA-DNA寡核苷酸法（下文中称为RDO法）、RNA干扰法（下文中称为RNAi法）、使用逆转录病毒的方法和使用转座子的方法。下面对这些方法进行具体描述。 
（a）通过反义法或核酶法制备产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
用于制备抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以靶向编码岩藻糖修饰相关酶的基因，通过Cell Technology,12,239（1993）；BIO/TECHNOLOGY,17,1097（1999）；Hum.Mol Genet.,5,1083（1995）；Cell Technology,13,255（1994）；Proc.Natl Acad,Sci.U.S.A.,96,1886（1999）等文献中所述的反义法或核酶法制备，例如，以下列方式制备。 
制备编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA或基因组DNA。 
测定制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。 
基于测定的DNA序列，设计反义基因或长度合适的核酶，其含有编码岩藻糖修饰相关酶的DNA片段、非翻译区和内含子。 
为了在细胞中表达反义基因或核酶，通过将制得DNA的片段或全长插入到适当的表达载体启动子下游的位点来制备重组载体。 
将重组载体导入到适用于表达载体的宿主细胞中，获得转化体。 
用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过采用岩 藻糖修饰相关酶的活性作为标记对转化体进行选择而获得。用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞也可以通过采用细胞膜上糖蛋白的糖链结构或者生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记对转化体进行选择而获得。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞，只要它含有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。 
可以使用的表达载体是能够自主复制或整合到上述宿主细胞内的染色体中、并在适于所设计的反义基因或核酶转录的位置处包含启动子的载体。表达载体的例子包括下文2中所述的那些载体。 
将基因导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入进各种宿主细胞中的方法来进行。 
使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记对转化体进行选择可以通过诸如下列方法进行。 
转化体的选择方法
与岩藻糖修饰相关酶的合成相关的酶活性缺失的细胞可以通过使用下列文献所述的生物化学方法或基因工程技术测定岩藻糖修饰相关酶的活性来进行选择：Shin Seikagaku Jikken Koza(New Lectures on Experiments in Biochemistry)3-Saccharides I,Glycoprotein（Tokyo Kagaku Dojin），Japanese Biochemical Society主编（1988）；Cell Technology,Extra Edition,Experimental Protocol Series,Glycobiology Experimental Protocol,Glycoprotein,Glycolipid and Proteoglycan(Shujunsha),Naoyuki Taniguchi,Akemi Suzuki,Kiyoshi Furukawa和Kazuyuki Sugawara主编（1996）；Molecular Cloning第二版；Current  Protocols in Molecular Biology；及类似文献。生物化学方法的例子为使用酶特异性底物评价酶活性的方法。基因工程技术的例子包括Northern分析和RT-PCR，其中对编码酶的基因的mRNA量进行测定。 
使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记对转化体进行选择可以通过诸如下文1（5）中所述的方法进行。使用所产生糖蛋白分子的糖链结构作为标记对转化体进行选择可以通过诸如下文4和5中所述的方法进行。 
制备编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA可以通过诸如下列方法进行。 
cDNA的制备
从多种宿主细胞组织或细胞中制备全RNA或mRNA。 
从全RNA或mRNA制备cDNA库。 
基于岩藻糖修饰相关酶的氨基酸序列制备简并引物，使用制备的cDNA库作为模板进行PCR，获得编码岩藻糖修饰相关酶的基因片段。 
编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA可以使用所得到的基因片段作为探针对cDNA库进行筛选而获得。 
可以使用市售的mRNA（如Clontech制造）作为人或非人动物组织或细胞的mRNA，或者其可以用下列方式从人或非人动物组织或细胞中制备。 
从人或非人动物组织或细胞中制备全RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology,154,3（1987）]、酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿（AGPC）法[Analytical Biochemistry,162,156（1987）； Experimental Medicine,9,1937（1991）]和类似方法。 
从全RNA制备poly(A)+RNA的mRNA的方法包括oligo（dT）固定纤维素柱法（Molecular Cloning,第二版）。 
也可以使用市售的试剂盒制备mRNA，如Fast Track mRNA分离试剂盒（Invitrogen制造）或Quick Prep mRNA纯化试剂盒（Pharmacia制造）。 
从所得的人或非人动物组织或细胞的mRNA制备cDNA库。制备cDNA库的方法包括Molecular Cloning，第二版；Current Protocols in Molecular Biology;A Laboratory Manual，第二版（1989）等文献中所述的方法，以及使用市售试剂盒的方法，如cDNA合成和质粒克隆用的Superscript Plasmid System（Life Technologies制造）和ZAP-cDNA合成试剂盒（STRATAGENE制造）。 
可以使用任何载体作为制备cDNA库的克隆载体，如噬菌体载体和质粒载体，只要它们可以在大肠杆菌（Escherichia coli）K12中进行自主复制。合适的载体的例子包括ZAP Express[STRATAGENE制造；Strategies,5,58（1992）]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17,9494（1989）]、λZAP II（STRATAGENE制造）、λgt10、λgtll[DNA Cloning,A Practical Approach,1,49（1985）]、λTriplEx（Clontech制造）、λExCell（Pharmacia制造）、pT7T318U（Pharmacia制造）、pcD2[Mol Cell Biol,3,280（1983）]和pUC18[Gene,33,103（1985）]。 
可以使用任何微生物作为制备cDNA库用的宿主微生物，但是优选使用大肠杆菌。合适的宿主微生物的例子是大肠杆菌XLl-Blue MRF'[STRATAGENE制造；Strategies,5,81（1992）]、大肠杆菌C600[Genetics, 39,440（1954）]、大肠杆菌Y1088[Science,222,778（1983）]、大肠杆菌Y1090[Science,222,778（1983）]、大肠杆菌NM522[J.Mol.Biol., 166,1（1983）]、大肠杆菌K802[J.Mol.Biol,16,118（1966）]和大肠杆菌JM105[Gene,38,275（1985）]。 
cDNA库还可以用于下列分析。另外任选地，为了通过降低不完整cDNA的比例而有效地获得全长cDNA，下列分析中可以使用采用Sugano等人发展的oligo-cap法制备的cDNA库[Gene,138,171（1994）；Gene,200,149（1997）；Protein,Nucleic Acid and Enzyme,41,603（1996）；Experimental Medicine,11,2491（1993）；cDNA Cloning（Yodosha）（1996）；Methods for Preparing Gene Libraries（Yodosha）（1994）]。 
编码岩藻糖修饰相关酶的基因片段可以通过下列方法获得：制备对被认为编码岩藻糖修饰相关酶氨基酸序列的5’-末端和3’-末端核苷酸序列有特异性的简并引物，并使用所制备的cDNA库作为模板通过PCR对DNA进行扩增[PCR Protocols,Academic Press（1990）]。 
通过通常采用的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463（1977）]，或者使用例如ABI PRISM377DNA测序仪（Applied Biosystems制造）的核苷酸测序仪对核苷酸序列进行分析，可以确认所得到的基因片段是编码岩藻糖修饰相关酶的DNA。 
编码岩藻糖修饰相关酶的DNA可从cDNA或cDNA库获得，所述cDNA或cDNA库是使用上述基因片段作为探针通过集落杂交或噬菌斑杂交从人或非人动物组织或细胞所含的mRNA合成的（Molecular Cloning，第二版）。 
还可以用从人或非人动物组织或细胞中所含mRNA合成的cDNA或cDNA库作为模板，使用获得编码岩藻糖修饰相关酶的基因片段用的引物，通过PCR扩增来获得编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA。 
所得到的编码岩藻糖修饰相关酶的DNA的核苷酸序列可以通过通常采用的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74,5463（1977）]，或者使用例如ABI PRISM377DNA测序仪（Applied Biosystems制造）的核苷酸测序仪进行测定。 
使用同源性搜索程序如BLAST，根据测出的cDNA核苷酸序列对核苷酸序列数据库如GenBank、EMBL或DDBJ进行搜索，可以确认所得到的DNA是核苷酸序列数据库的基因当中的编码岩藻糖修饰相关酶的基因。 
通过上述方法得到的编码细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的基因的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:7和9所示的核苷酸序列。 
通过上述方法得到的编码与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:11和12所示的核苷酸序列。 
还可以根据测出的DNA序列，采用phosphoamidite法用392型DNA合成仪（Perkin Elmer制造）通过化学合成来得到编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA。 
例如，可以通过下列方法制备编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA。 
基因组DNA的制备方法
基因组DNA可通过Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology等文献所述的已知方法来制备。另外，编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA可以使用试剂盒得到，如Genomic DNA  Library Screening System（Genome Systems制造）或Universal GenomeWalkerTM试剂盒（CLONTECH制造）。 
所得到的编码岩藻糖修饰相关酶的DNA的核苷酸序列可以通过通常采用的方法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 74,5463（1977）]，或者使用例如ABI PRISM377DNA测序仪（Applied Biosystems制造）的核苷酸测序仪进行测定。 
使用同源性搜索程序如BLAST，根据测出的基因组DNA核苷酸序列对核苷酸序列数据库如GenBank、EMBL或DDBJ进行搜索，可以确认所得到的DNA是核苷酸序列数据库的基因当中的编码岩藻糖修饰相关酶的基因。 
还可以根据测出的DNA序列，采用phosphoamidite法用392型DNA合成仪（Perkin Elmer制造）通过化学合成来得到编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA。 
通过上述方法得到的编码细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的基因组DNA的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:15、16、17和18所示的核苷酸序列。 
通过上述方法得到的编码与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组DNA的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞也可以通过将反义寡核苷酸或核酶直接导入到宿主细胞中而不使用表达载体便得到，所述的反义寡核苷酸或核酶是根据编码岩藻糖修饰相关酶的核苷酸序列设计的。 
可以通过已知的方法或使用DNA合成仪来制备反义寡核苷酸或核酶。具体地说，根据其序列对应于编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列中的5至150个、优选5至60个、更优选10至40个核苷酸的寡核苷酸的序列信息，可以合成对应于上述寡核苷酸互补序列的寡核苷酸（反义寡核苷酸）或包括该寡核苷酸序列的核酶。 
寡核苷酸包括寡聚RNA和寡核苷酸的衍生物（下文称为寡核苷酸衍生物）。 
寡核苷酸衍生物包括寡核苷酸中磷酸二酯键转变为磷酸硫酯键（phosophorothioate bond）的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中磷酸二酯键转变为N3'-P5'磷酸酰胺键（phosphoamidate bond）的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖-磷酸二酯键转变为肽-核酸键的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5噻唑基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被吩嗪修饰的胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖被2'-O-丙基核糖取代的寡核苷酸衍生物、和寡核苷酸中核糖被2'-甲氧基乙氧基核糖取代的寡核苷酸衍生物[Cell Technology,16,1463（1997）]。 
（b）通过同源重组法制备产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过采用同源重组法对染色体上编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因进行修饰来制备。 
可以使用下列文献所述的方法对染色体上的靶基因进行修饰：Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）（下文称为Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual）；Gene Targeting,A Practical  Approach,IRL Press at Oxford University Press（1993）；Biomanual Series8,Gene Targeting,Preparation of Mutant Mice Using ES Cells,Yodosha（1995）（下文称为Preparation of Mutant Mice Using ES Cells）等，例如以下列方式进行。 
制备编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA。 
根据基因组DNA的核苷酸序列，制备用于待修饰靶基因同源重组的靶载体（如岩藻糖修饰相关酶的结构基因或启动子基因)。 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过下列方法制备：将所制备的靶载体导入到宿主细胞中，并选择其中在染色体上的靶基因和靶载体之间产生同源重组的细胞。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为宿主细胞，只要它具有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。 
编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA可以通过上文1（1）（a）中所述制备基因组DNA用的方法或类似方法制备。 
通过上述方法得到的编码细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的基因组DNA的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:15、16、17和18所示的核苷酸序列。 
通过上述方法得到的编码与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组DNA的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。 
染色体上的靶基因同源重组中使用的靶载体可以根据Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press（1993）；Biomanual Series8,Gene Targeting,Preparation of Mutant Mice Using ES Cells等文献所述的方法来制备。置换型或插入型载体均可以用作靶载体。 
将靶载体导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入到各种宿主细胞中的方法来进行。 
对同源重组体进行有效选择的方法包括Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press（1993）；Preparation of Mutant Mice Using ES Cells等文献所述的正向选择、启动子选择、负选择和polyA选择。从选出的细胞系中选择所需的同源重组体的方法包括用基因组DNA进行DNA杂交（Molecular Cloning，第二版）和PCR[PCR Protocols,Academic Press（1990）]。 
（c）通过RDO法制备产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过靶向编码岩藻糖修饰相关酶的基因的RDO法制备，例如以下列方式制备。 
编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA或基因组DNA可以通过上文1（1）（a）所述的方法制备。 
测定所制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。 
根据测出的DNA序列，设计并合成长度合适的RDO构建物，其含有编码岩藻糖修饰相关酶的DNA、非翻译区和内含子。 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过下列方法制备：将合成的RDO导入到宿主细胞中，然后选择靶酶（即岩藻糖修饰相关 酶）中发生突变的转化体。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为宿主细胞，只要它具有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。 
将RDO导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入到各种宿主细胞中的方法来进行。 
编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA可以通过上文1（1）（a）中所述制备cDNA用的方法或类似方法制备。 
编码岩藻糖修饰相关酶的基因组DNA可以通过上文1（1）（a）中所述制备基因组DNA用的方法或类似方法制备。 
用合适的限制性内切核酸酶对DNA进行切割后，可以通过下列方法测定DNA的核苷酸序列：将DNA片段亚克隆到质粒如pBluescript SK(-)（Stratagene制造）中，使克隆发生反应，该反应通常用作核苷酸序列分析法如Sanger等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）]或类似方法，然后使用自动核苷酸序列分析仪如ABI PRISM377DNA测序仪（Applied Biosystems制造）或类似物对克隆进行分析。 
RDO可以通过传统方法或使用DNA合成仪来制备。 
通过将RDO导入到宿主细胞中来选择其中编码靶酶（即岩藻糖修饰相关酶）的基因发生突变的细胞的方法包括Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology等文献中描述的检测染色体中基因突变的方法。 
对于转化体的选择，还可以使用下列方法：上文1（1）（a）中所述的使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记的；下文1（5）中所述的使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记的方法；以及如下文4和5中所述的使用产生的糖蛋白分子的糖链结构作为标记的方法。 
可以根据下列文献的描述对RDO的结构进行设计：Science,273,1386（1996）；Nature Medicine,4,285（1998）；Hepatology,25,1462（1997）；Gene Therapy,5,1960（1999）；J.Mol.Med.,75,829（1997）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,8774（1999）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96,8768（1999）；Nuc.Acids Res.,27,1323（1999）；Invest.Dermatol., 111,1172（1998）；Nature Biotech.,16,1343（1998）；Nature Biotech., 18,43（2000）；Nature Biotech.,18,555（2000）等。 
（d）通过RNAi法制备产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过靶向编码岩藻糖修饰相关酶的基因的RNAi法制备，例如，可以用下列方式制备。 
通过上文1（1）（a）中所述的方法制备编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA。 
测定制备的cDNA的核苷酸序列。 
根据测出的cDNA序列，设计长度合适RNAi基因构建物，其含有编码岩藻糖修饰相关酶的DNA、非翻译区和内含子。 
为了在细胞中表达RNAi基因，通过将所制备的cDNA的片段或全长插入到适当的表达载体启动子下游的位点来制备重组载体。 
将重组载体导入到适用于表达载体的宿主细胞中，获得转化体。 
用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过采用岩藻糖修饰相关酶的活性或者细胞膜上的糖蛋白分子或生成的糖蛋白的糖链结构作为标记对转化体进行选择而获得。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞，只要它具有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。 
可以使用能够自主复制或整合到上述宿主细胞内的染色体中、并在适于所设计的RNAi基因转录的位置处包含启动子的的表达载体。表达载体的例子包括下文2中所述的那些载体。 
将基因导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入到各种宿主细胞中的方法来进行。 
使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记选择转化体的方法包括上文1（1）（a）中所述的方法。 
使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括1（5）中所述的方法。使用生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括下文4或5中所述的方法。 
编码岩藻糖修饰相关酶的cDNA可以通过上文1（1）（a）中所述制备cDNA用的方法或类似方法制备。 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞也可以通过将根据编码岩藻糖修饰相关酶的核苷酸序列设计的siRNA（短的干扰RNA）直接导入到宿主细胞中而不使用表达载体便得到。 
siRNA可以通过已知的方法或使用DNA合成仪来制备。 
可以根据下列文献的描述对siRNA基因的结构进行设计：Nature, 391,806（1998）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,15502（1998）；Nature, 395,854（1998）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,5049（1999）；Cell,95,1017（1998）；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1451（1999）；Proc.Natl.Acad,Sci.USA,95,13959（1998）；Nature Cell BioL,2,70（2000）；或类似文献。 
（e）通过使用转座子的方法制备产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞 
用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过下列方法制备：使用Nature Genet.,25,35（2000）或类似文献中所述的转座子系统，然后采用岩藻糖修饰相关酶的活性或者细胞膜上的糖蛋白或生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记对突变体进行选择而获得。 
转座子系统是通过将外源基因随机插入到染色体中而诱导突变的系统，其中通常使用插入到转座子中的外源基因作为突变诱导载体，将基因随机插入到染色体中的转座酶表达载体被同时导入到细胞中。 
可以使用任何转座酶，只要它适用于所用的转座子序列。 
可以使用任何基因作为外源基因，只要它可以在宿主细胞的DNA中诱导突变。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞，只要它具有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。将基因导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入到各种宿主细胞中的方法来进行。 
使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记选择转化体的方法包括上文1（1）（a）中所述的方法。 
使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括1（5）中所述的方法。使用生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括下文4或5中所述的方法。 
（2）导入编码酶的基因的显性失活突变体的技术 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可使用导入靶基因（即即编码岩藻糖修饰相关酶的基因）的显性失活突变体的方法来制备。细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的例子包括GMD和Fx。与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的例子包括α1,6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。 
这些酶具有底物特异性，可以催化特定的反应。通过破环这些具有底物特异性和催化作用的酶的活性中心，可以制备它们的显性失活突变体。下文使用目标酶当中的GMD作为例子对显性失活突变体的制备进行详细描述。 
对大肠杆菌来源的GMD三级结构的分析结果显示，4个氨基酸（133位点的苏氨酸、135位点的谷氨酸、157位点的酪氨酸和161位点的赖氨酸）对酶的活性具有重要作用（Structure,8,2,2000）。即，根据三级结构，用其他的氨基酸取代上述4个氨基酸制备的突变体均显示出酶活性的显著降低。另一方面，观察到突变体结合GMD辅酶NADP或底物GDP-甘露糖结合的能力则改变很少。因此，可以通过取代决定GMD酶活性的4个氨基酸来制备显性失活突变体。根据制备大肠杆菌来源GMD的显性失活突变体的结果，可以使用氨基酸序列信息进行同源性比较和三级结构预测，制备其他的GMD的显性失活突变 体。例如，对于CHO细胞来源的GMD（SEQ ID NO:8），可以通过用其它的氨基酸取代155位点的苏氨酸、157位点的谷氨酸、179位点的酪氨酸和183位点的赖氨酸来制备显性失活突变体。制备这种已导入了氨基酸取代的基因可以通过Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology等文献所述的定点诱变来进行。 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以根据Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology,Manipulating the Mouse Embryo，第二版等文献所述的基因导入方法，使用上文制备的编码靶酶显性失活突变体的基因（下文简称为显性失活突变体基因）来制备，例如用下列方式制备。 
制备编码岩藻糖修饰相关酶的显性失活突变体的基因。 
根据制备的显性失活突变体基因的全长DNA，根据需要制备长度合适的含蛋白编码区的DNA片段。 
将DNA片段或全长DNA插入到合适的表达载体中启动子的下游位点，制备重组载体。 
将重组载体导入适用于表达载体的宿主细胞，获得转化体。 
用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过采用岩藻糖修饰相关酶的活性，或者生成的糖蛋白分子或细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记对转化体进行选择而获得。 
可以使用任何酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或类似物作为宿主细胞，只要它含有编码岩藻糖修饰相关酶的靶基因。宿主细胞的例子包括下文2中所述的那些细胞。 
可以使用能够自主复制或整合到上述宿主细胞内的染色体中、并在适于编码所需显性失活突变体的DNA转录的位置处包含启动子的表达载体。表达载体的例子包括下文2中所述的那些载体。 
将基因导入到各种宿主细胞中可以通过下文2中所述的适于将重组载体导入进各种宿主细胞中的方法来进行。 
使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记选择转化体的方法包括上文1（1）（a）中所述的方法。 
使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括下文1（5）中所述的方法。使用生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记选择转化体的方法包括下文4或5中所述的方法。 
（3）将突变导入到酶中的技术 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过下列方法制备：将将突变导入编码岩藻糖修饰相关酶的基因，然后选择所需的酶中发生突变的细胞系。 
细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的例子包括GMD和Fx。与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的例子包括α1,6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。 
将突变导入岩藻糖修饰相关酶的方法包括：1）使用岩藻糖修饰相关酶的活性作为标记，从通过对亲代细胞系进行诱变或通过自发突变得到的突变体中选择所需细胞系的方法；2）使用生成的糖蛋白分子的糖链结构作为标记，从通过对亲代细胞系进行诱变或通过自发突变得到的突变体中选择所需细胞系的方法；和3）使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为标记，从通过对亲代细胞系进行诱变或通过自发突变得到 的突变体中选择所需细胞系的方法。 
可以通过任何能够诱导亲代细胞系细胞的DNA发生点突变、缺失突变或移码突变的方法进行诱变。 
合适的方法的例子包括用乙基亚硝基脲、亚硝基胍、苯并芘或吖啶染料处理和辐射处理。可以使用多种烷化试剂和致癌物作为诱变剂。可以使用Soshiki Baiyo no Gijutsu(Tissue Culture Techniques),第三版(Asakura Shoten),The Japanese Tissue Cultrue Association主编（1996）；Nature Genet.,24,314（2000）或类似文献中所述的方法使诱变剂对细胞发生作用。 
通过自发突变产生的突变体的例子包括在通常的细胞培养条件下不进行任何特殊的诱变处理通过连续传代培养得到的自发突变体。 
测定岩藻糖修饰相关酶活性的方法包括上文1（1）（a）中所述的方法。测定生成的糖蛋白分子糖链结构的方法包括下文4和5中所述的方法。测定细胞膜上糖蛋白糖链结构的方法包括1（5）中所述的方法。 
（4）抑制编码酶的基因转录或翻译的技术 
用于产生本发明抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过使用反义RNA/DNA技术[Bioscience and Industry,50,322（1992）；Chemistry,46,681（1991）；Biotechnology,9,358（1992）；Trends in Biotechnology,10,87（1992）；Trends in Biotechnology,10,152（1992）；Cell Technology,16,1463（1997）]、三股螺旋技术[Trends in Biotechnology,10,132(1992)]或类似技术来抑制靶基因（即编码岩藻糖修饰相关酶的基因）的转录或翻译而制备。 
细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成相关酶的例子包括GMD和Fx。 与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的例子包括α1,6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶。 
（5）选择耐受凝集素的细胞系，所述的凝集素可以识别复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链结构 
用于产生抗凝血酶III组合物的宿主细胞可以通过选择耐受凝集素的细胞系来制备，所述的凝集素可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链结构。 
选择耐受凝集素的细胞系的方法可以通过例如使用Somatic Cell Mol.Genet.,12,51（1986）等文献所述的凝集素的方法来进行，所述的凝集素可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链结构。 
可以使用任何凝集素作为可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链结构的凝集素，只要其能够识别该糖链结构。具体的例子包括扁豆凝集素LCA（兵豆（Lens culinaris）来源的扁豆凝集素）、豌豆凝集素PSA（豌豆（Pisum sativum）来源的豌豆凝集素）、蚕豆凝集素VFA（蚕豆（Vicia faba）来源的凝集素）和橙黄网胞盘菌（Aleuria aurantia）凝集素AAL（自橙黄网胞盘菌得到的凝集素）。 
具体地说，可以通过下列方法选择本发明的耐受可识别在复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链结构的凝集素的细胞系：将细胞在含有浓度为1μg/ml至1mg/ml的上述凝集素的培养基中培养1天至2周，优选1天至1周，使存活的细胞传代或挑出集落，将其转移到培养容器中，随 后使用含凝集素的培养基继续培养。 
2.生产本发明抗凝血酶III组合物的方法 
本发明的抗凝血酶III组合物可以通过采用下列文献所述的方法在宿主细胞中对其进行表达而获得：Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology;Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，1988（下文中称为Antibodies）；Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第三版，Acad.Press，1993（下文中称为Monoclonal Antibodies）；Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press，1996（下文中称为Antibody Engineering）等文献中所述的方法，例如采用下列方式。 
制备编码抗凝血酶III分子的全长cDNA，制备长度合适的含有抗凝血酶III分子编码区的DNA片段。 
将DNA片段或全长cDNA插入到适当的表达载体启动子下游的位点，制备重组载体。 
将重组载体导入到适用于表达载体的宿主细胞中，获得产生抗凝血酶III分子的转化体。 
可以使用任何能够表达所需基因的酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等作为宿主细胞。 
还可以使用与抗凝血酶III分子结合N-糖苷连接糖链的修饰相关的酶即岩藻糖修饰相关酶的活性缺失的细胞，或者通过上文1中所述的各种人工技术得到的细胞。 
可以使用能够自主复制或整合到上述宿主细胞内的染色体中、并在适于编码所需抗凝血酶III分子的DNA转录的位置处包含启动子的 表达载体。 
可以根据上文1（1）（a）中所述的制备cDNA用的方法，使用诸如对所需抗凝血酶III分子有特异性的探针或引物，从人或非人动物组织或细胞中制备cDNA。 
使用酵母作为宿主细胞时，可以使用YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）或类似物作为表达载体。 
可以使用任何能够在酵母菌株中进行表达的启动子作为启动子。合适的启动子包括糖酵解途径基因启动子，如己糖激酶、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子和CUP1启动子。 
合适的宿主细胞的例子是属于酵母（Saccharomyces）属、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）属、克鲁维酵母（Kluyveromyces）属、丝孢酵母（Trichosporon）属和许旺酵母（Schwanniomyces）属的微生物，具体地说，为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、出芽丝孢酵母（Trichosporon pullulans）、alluvius许旺酵母（Schwanniomyces alluvius）和类似微生物。 
重组载体的导入可以使用任何将DNA导入酵母的方法来进行，例如，电穿孔[Methods Enzymol.,194,182（1990）]、原生质球法[Proc.Natl Acad.Sci.USA,84,1929（1978）]、乙酸锂法[J.Bacteriology,153,163（1983）]以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929（1978）所述的方法。 
当使用动物细胞作为宿主细胞时，可以使用pcDNAI、pcDM8（可购自Funakoshi Co.,Ltd.）、pAGE107[日本公开未审查专利申请第 22979/91号；Cytotechnology,3,133（1990）]、pAS3-3（日本公开未审查专利申请第227075/90号）、pCDM8[Nature,329,840（1987）]、pcDNAI/Amp（Invitrogen Corp.制造）、pREP4（Invitrogen Corp.制造）、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307（1987）]、pAGE210等作为表达载体。 
可以使用任何能够在动物细胞中进行表达的启动子作为启动子。合适的启动子包括巨细胞病毒（CMV）IE（极早期）基因的启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。人CMV的IE基因增强子可以与启动子结合使用。 
合适的宿主细胞的例子是来源于人的Namalwa细胞、来源于猴的COS细胞、来源于中国仓鼠的CHO细胞、HBT5637（日本公开未审查专利申请第299/88号）、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠骨髓瘤细胞、来源于叙利亚仓鼠肾的细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞和类似细胞。 
重组载体的导入可以使用任何将DNA导入动物细胞的方法来进行，例如，电穿孔[Cytotechnology,3,133（1990）]、磷酸钙法（日本公开未审查专利第227075/90号）、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413（1987）]、注射法（Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual）、使用微粒枪（基因枪）的方法（日本专利第2606856号和第2517813号）、DEAE-葡聚糖法[Biomanual Series4-Methods of Gene Transfer,Expression and Analysis(Yodosha),Takashi Yokota和Kenichi Arai主编（1994）]和病毒载体法（Manipulating the Mouse Embryo，第二版）。 
当使用昆虫细胞作为宿主细胞时，可以Current Protocols in Molecular Biology,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York（1992）；Bio/Technology,6,47 （1988）或类似文献中所述的方法来表达蛋白。 
即，将重组载体和杆状病毒共同转染到昆虫细胞中，在昆虫细胞的培养物上清液中得到重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞，从而可以对蛋白进行表达。 
可用于该方法的基因传递载体包括pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII（均由Invitrogen Corp.制造）。 
杆状病毒的例子是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus），其为感染夜蛾（Barathra）科昆虫的病毒。 
昆虫细胞的例子是草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞Sf9和Sf21[Current Protocols in Molecular Biology;Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York（1992）]和粉纹夜蛾（Trichoplusiani）卵巢细胞High5（Invitrogen Corp.制造）。 
制备重组病毒用的将上述重组载体和上述杆状病毒共同转染到昆虫细胞中可以通过磷酸钙法（日本公开未审查专利申请第227075/90号）、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413（1987）]和类似方法来完成。 
当使用植物细胞作为宿主细胞时，可以使用Ti质粒、烟草花叶病毒载体或类似物作为表达载体。 
可以使用任何能够在植物细胞中进行表达的启动子作为启动子。合适的启动子包括花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、水稻actin1启动子等。 
合适的宿主细胞的例子是诸如烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、紫花苜蓿、水稻、小麦、大麦、小立碗癣（Physcomitrella patens）和紫萍（Spirodela polyrhiza）的植物细胞。 
重组载体的导入可以使用任何将DNA导入植物细胞的方法来进行，例如，使用土壤杆菌（Agrobacterium）的方法(日本公开未审查专利申请第140885/84号和第70080/85号，WO94/00977)、电穿孔法（日本公开未审查专利申请第251887/85号）和使用微粒枪（基因枪）的方法（日本专利第2606856号和第2517813号）。 
抗体基因的表达不仅可以通过直接表达进行，还可以根据Molecular Cloning第二版和类似文献中所述的方法，通过分泌性生产、Fc区和其它蛋白的融合蛋白及类似物的表达来进行。 
当基因在携带被导入的糖链合成相关基因的酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中得到表达时，可以得到通过导入的基因而加上糖或糖链的抗凝血酶III分子。 
抗凝血酶III组合物可以通过下列方法产生：将上文得到的转化体在培养基中培养，使抗凝血酶III分子在培养物中形成并积累，从培养液中将其回收。在培养基中培养转化体可以通过常规的宿主细胞培养方法进行。 
对于使用真核生物如酵母作为宿主得到的转化体的培养，可以使用任何天然培养基和合成培养基，只要该培养基适于有效地培养转化体，并含有可被所使用的宿主吸收的碳源、氮源、无机盐和类似物。 
可以使用任何可被宿主吸收的碳源作为碳源。合适的碳源的例子包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖及含有它们的糖浆、淀粉和 淀粉水解产物；有机酸，如乙酸和丙酸；和醇，如乙醇和丙醇。 
可以使用氨水、有机酸或无机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵作为氮源，还可以使用其它的含氮化合物以及胨、肉汁，酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆饼、大豆饼水解产物、各种发酵微生物细胞及其消化产物。 
有机酸盐的实施例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。 
通常在通气的条件下进行培养，例如通过摇瓶培养或通风条件下的浸没旋动培养。培养温度优选为15至40℃，培养期通常为16小时至7天。培养过程中pH保持在3.0至9.0。使用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水等进行pH调节。 
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如氨苄青霉素和四环素。 
在培养用含诱导型启动子的重组载体转化的微生物时，如果需要的话，培养基中可以加入诱导物。例如，微生物用含lac启动子的重组载体转化时，培养基中可以加入异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷或类似物；微生物用含trp启动子的重组载体转化时，可以加入吲哚丙烯酸或类似物。 
对于使用动物细胞作为宿主细胞得到的转化体的培养，可以使用通常使用的培养基作为培养基，如RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519（1967）]、Eagle's MEM[Science, 122,501（1952）]、Dulbecco’s改良MEM[Virology,8,396（1959）]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1（1950）]和Whitten培养基[Developmental Engineering Experimentation  Manual-Preparation of Transgenic Mice(Kodansha)，Motoya Katsuki主编（1987）]，以及通过在这些培养基中加入胎牛血清或类似物制备的培养基。 
培养通常在pH为6.0至8.0、温度为30至40℃、存在5%CO2的条件下培养1至7天。 
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如卡那霉素和青霉素。 
对于使用昆虫细胞作为宿主细胞得到的转化体的培养，可以使用通常使用的培养基作为培养基，如TNM-FH培养基（Pharmingen,Inc.制造）、Sf-900II SFM培养基（Life Technologies,Inc.制造）、ExCell400和ExCell405（JRH Biosciences,Inc.制造）和Grace's昆虫培养基[Nature, 195,788（1962）]。 
培养通常在pH为6.0至7.0、温度为25至30℃的条件下培养1至5天。 
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如庆大霉素。 
使用植物细胞作为宿主细胞得到的转化体可以这样的细胞形式培养，也可以在分化成植物细胞或植物器官后培养。对于这种转化体的培养，可以使用通常使用的培养基作为培养基，如Murashige-Skoog（MS）培养基和White培养基，以及通过在这些培养基中加入植物激素如生长素和细胞分裂素制备的培养基等。 
培养通常在pH为5.0至9.0、温度为20至40℃的条件下培养3至60天。 
如果需要的话，在培养过程中培养基中可以加入抗生素，如卡那霉素和潮霉素。 
如上文所述，抗凝血酶III组合物可以通过下列方法产生：根据常规的培养方法培养源自微生物、动物细胞或植物细胞、并携带其中插入有编码抗凝血酶III分子的DNA的表达载体的转化体，使抗凝血酶III组合物形成并积累，并从培养物中回收抗凝血酶III组合物。 
抗凝血酶III组合物的方法包括通过宿主细胞在细胞内产生的方法、通过宿主细胞在细胞内分泌的方法和通过宿主细胞在外膜上产生的方法。可以通过改变所用宿主细胞的种类或将产生的抗凝血酶III分子的结构而采用所需的生产方法。 
当抗凝血酶III组合物在宿主细胞中或在宿主细胞的外膜上产生时，可以通过下列方法迫使抗凝血酶III组合物被分泌在宿主细胞外：Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.,264.17619（1989）]；Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227（1989）；Genes Develop.,4,1288（1990）]；日本公开未审查专利申请第336963/93号；WO94/23021中所述的方法或类似方法。 
即，可以通过下列方法迫使所需的抗凝血酶III组合物被分泌在宿主细胞外：将编码抗凝血酶III分子的DNA和编码适于抗凝血酶III分子的表达的信号肽的DNA插入到表达载体中，将表达载体导入宿主细胞，然后使用重组DNA技术表达抗凝血酶III分子。 
也可以根据日本公开未审查专利申请第227075/90号中所述的方法，使用二氢叶酸还原酶基因或类似物，采用基因扩增系统增加抗凝血酶III组合物的产生。 
此外，抗凝血酶III组合物可使用通过携带导入基因的动物或植物的再分化形成的具有导入基因的动物（非人转基因动物）或具有导入基因的植物（转基因植物）来产生。 
当转化体是动物或植物时，抗凝血酶III组合物可以通过下列方法产生：以通常的方式饲养或培育动物或植物，使抗凝血酶III组合物在其中形成并积累，从动物或植物中回收抗凝血酶III组合物。 
使用动物制备抗凝血酶III组合物的方法可以进行如下：例如，根据已知方法[American Journal of Clinical Nutrition,63,639S（1996）；American Journal of Clinical Nutrition,63,627S（1996）；Bio/Technology, 9,830（1991）]在导入基因形成的动物中产生所需的抗凝血酶III组合物。 
使用动物时，抗凝血酶III组合物可以通过下列方法产生：例如，培养携带导入的编码抗凝血酶III分子的DNA的非人转基因动物，使抗凝血酶III组合物在动物中形成并积累，从动物中回收抗凝血酶III组合物。抗凝血酶III组合物形成和积累的部位包括动物的乳汁（日本公开未审查专利申请第309192/88）、卵等。可以使用任何能够在动物中进行表达的启动子作为该方法中的启动子。优选的启动子包括乳腺细胞特异性启动子，如α-酪蛋白启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。 
使用植物制备抗凝血酶III组合物的方法可以进行如下：例如，根据已知的方法培养携带导入的编码抗凝血酶III分子的DNA的转基因植物[Soshiki Baiyo(Tissue Culture),20（1994）；Soshiki Baiyo(Tissue Culture),21（1995）；Trends in Biotechnology,15,45（1997）]，使抗凝血酶III组合物在植物中形成并积累，从植物中回收抗凝血酶III组合物。 
当携带导入的编码抗凝血酶III分子的基因的转化体产生的抗凝血酶III组合物在细胞中以可溶形式表达时，培养结束后通过离心回收细胞，并将其悬浮在含水缓冲液中，之后使用超声仪、French press、Manton Gaulin匀浆器、Dynomill或类似物进行破坏，得到无细胞提取物。可以通过下列方法得到抗凝血酶III组合物的纯化制剂：对无细胞提取物进行离心，获取上清液，然后单独使用或结合使用常规手段对上清液进行处理以分离和纯化酶，例如用溶剂提取、用硫酸铵等进行盐析、脱盐、用有机溶剂沉淀、使用树脂如二乙氨乙基（DEAE）-琼脂糖和DIAION HPA-75（Mitsubishi Chemical Corporation制造）的阴离子交换色谱、使用树脂如S-琼脂糖FF（Pharmacia制造）的阳离子交换树脂、使用树脂如丁基琼脂糖和苯基琼脂糖的疏水色谱、使用分子筛的凝胶过滤、亲合力色谱、色谱聚焦和电泳如等电聚焦。具体的例子包括使用Miller-Anderson在1974开发的固定化肝素亲和力色谱[Thromb.res.,5,439（1974）；Zoku Seikagaku Jikken Koza(A Sequel to Lectures on Experiments in Biochemistry),8,Blood,第二卷，第569-574页（Tokyo Kagaku Dojin），Tokyo Kagaku Dojin主编（1985）]。 
当抗凝血酶III组合物在细胞内表达为包涵体时，类似地回收和破坏细胞，之后进行离心，回收沉淀部分的抗凝血酶III组合物包涵体。将回收的抗凝血酶III组合物包涵体用蛋白变性剂溶解。将溶解的抗体溶液稀释或透析，从而时抗凝血酶III组合物恢复成具有正常构象。然后，可以通过与上文所述相同的分离和纯化步骤得到抗凝血酶III组合物的纯化制剂。 
当抗凝血酶III组合物被分泌在细胞外时，可以在培养物上清液中回收抗凝血酶III组合物或其衍生物。即，对培养物进行与上述相同的处理，例如进行离心，获取培养物上清液。可以通过与上文所述相同的分离和纯化方法得到抗凝血酶III组合物的纯化制剂。 
当宿主细胞已经具有表达抗凝血酶III分子的能力时，可以采用上 述1的方法制备能够表达抗凝血酶III分子的细胞，培养细胞，从培养液中提纯目标抗凝血酶III组合物，从而制备抗凝血酶III组合物。 
3.抗凝血酶III组合物的活性评价 
纯化抗凝血酶III组合物的抗凝血活性可以通过体外试验如已知的抗凝血酶活性测定法或肝素辅助因子活性测定法、使用弥漫性血管内凝血（下文中称为DIC）病态动物模型的体内试验[The Second Series of Pharmaceutical Research and Development,第20卷，Blood Product,Ikuo Suzuki，主编，Hirokawa Publishing Company,Tokyo,Japan（1992）；The Course of Medicine(Igaku no Ayumi),120,1147（1982）；Japanese Pharmacology and Therapeutics,17,5843（1989）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3573（1985）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3688（1985）；Parmacometrics,30,589（1985）]或类似方法测定。下文对具体例子进行描述。 
（1）抗凝血酶活性测定法 
将纯化的抗凝血酶III组合物和待测物质如去纤维蛋白血浆依次用含0.05M NaCl、pH8.3的0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2%人血清白蛋白稀释。 
向100μl的每份稀释样品中加入500μ17.5U/ml凝血酶溶液，反应在37℃下进行10分钟。然后加入2ml底物溶液，该底物溶液通过将附着在Berichrome抗凝血酶III（Boehring Berge制造）上的凝血酶特异性染色底物（HD-CHA-But-Arg-pNA）用稀释剂稀释至0.25M，反应在37℃下进行5分钟。之后，加入0.5ml50%乙酸使反应终止。 
测定反应溶液在405nm处的吸光度，将每个稀释步骤加入待测物质的反应溶液的吸光度减去不加入待测物质抗凝血酶III的对照反应溶液的吸光度，得到一个数值。以该数值即灭活凝血酶的量为纵坐标，以待测物质的稀释比例为横坐标，在半对数图纸上作图。通过对作图 测量的数据得到的灭活凝血酶的量和待测物质稀释比例之间的线性关系进行近似，并将其与纯化抗凝血酶III组合物和去纤维蛋白血浆的测量结果得到的近似表达式进行比较，可以计算纯化抗凝血酶III组合物与去纤维蛋白血浆的比例，并可测定其效价。 
（2）肝素辅助因子活性测定法 
将纯化的抗凝血酶III组合物和待测物质如去纤维蛋白血浆依次用含0.05M NaCl、pH8.3的0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2%人血清白蛋白稀释。 
向50μl的每份稀释样品中加入含2.5U/ml肝素的1.0m10.3单位凝血酶溶液，反应在37℃下进行5分钟。然后加入100μ1调节至2.0mM的上文3（1）中所述的底物溶液，反应在37℃下进行2分钟。之后，加入0.5ml50%乙酸使反应终止。 
反应结束后，测量反应混合物在405nm处的吸光度，然后通过与上文3（1）中所述相同的方法测定纯化抗凝血酶III组合物对去纤维蛋白血浆的效价。 
（3）使用DIC病态动物模型的体内试验 
纯化抗凝血酶III组合物的体内抗凝血活性可以使用家兔急性DIC病态动物模型[Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3573（1985）]、大鼠急性DIC病态动物模型[Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3688（1985）]、妊娠家兔急性DIC病态动物模型[Parmacometrics,30,589（1985）]或类似动物模型来测定。 
此外，抗凝血酶III组合物在人体中的安全性和治疗作用也可使用与人相近的动物种属模型如食蟹猴（Macaca fascicularis）进行评价。 
4.抗凝血酶III组合物中糖链的分析 
各种细胞中表达的抗凝血酶III分子的糖链结构可以根据糖蛋白糖链结构的常规分析方法进行分析。例如，与抗凝血酶III分子结合的糖链由中性糖如半乳糖、甘露糖和岩藻糖；氨基糖如N-乙酰氨基葡萄糖；和酸性糖如唾液酸组成，可以通过例如糖组成分析和糖链结构分析的技术，使用二维糖链作图进行分析。 
（1）中性糖和氨基糖的组成分析 
抗凝血酶III分子的糖链组成可以通过用三氟乙酸或类似物进行酸水解释放出中性糖或氨基糖并分析组成比例来进行分析。 
具体地说，可以通过使用碳水化合物分析系统（BioLC；Dionex产品）的方法进行分析。BioLC是通过HPAEC-PAD（高效阴离子交换色谱-脉冲电流检测）分析糖组成的系统[J.Liq.Chromatogr.,6,1577（1983）]。 
组成比例也可以通过使用氨基吡啶的荧光标记法进行分析。具体地说，组成比例可以用下列方法计算：根据已知方法对酸水解样品进行2-氨基吡啶化荧光标记，然后用HPLC来分析组成[Agric.Biol.Chem., 55(1)283-284（1991）]。 
（2）糖链结构分析 
抗凝血酶III分子的糖链结构可以通过二维糖链作图进行分析[Anal.Biochem.,171,73（1988）；Seibutsukagaku Jikkenho(Biochemical Experimentation Methods)23-Totanpakushitsu Tosa Kenkyuho(Methods of Studies on Glycoprotein Sugar Chains),Gakkai Shuppan Center,Reiko Takahashi主编（1989）]。二维糖链作图是一种推断糖链结构的方法，例如，以反相色谱中糖链的保留时间或洗脱位置为X轴，以正相色谱中糖链的保留时间或洗脱位置为Y轴作图，并将它们与对已知糖链的结果进行比较。 
具体地说，通过抗凝血酶III组合物的肼解从抗凝血酶III分子中释放出糖链，用2-氨基吡啶（下文称为PA）对其进行荧光标记[J.Biochem.,95,197（1984）]。通过凝胶过滤将其从过量PA处理试剂中分离后，对糖链进行反相色谱。然后，对糖链的每个峰进行正相色谱。将得到的结果在二维糖链图谱上作图，并将其与糖链标准物（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）的点或文献中的数据进行比较，可以推断糖链的结构[Anal.Biochem.,171.73（1988）]。 
通过二维糖链作图推断的结构可以通过对每个糖链进行质谱分析如MALDI-TOF-MS而确认。 
5.确定抗凝血酶III分子糖链结构的免疫测定 
抗凝血酶III组合物由糖链结构不同的抗凝血酶III分子组成。本发明的重组抗凝血酶III组合物具有很高的ADCC活性，其中结构为在还原末端N-乙酰氨基葡萄糖上结合有岩藻糖的糖链与结合在Fc区上的全部复合体型N-糖苷连接糖链的比例为0%。这种抗凝血酶III组合物可以用上文4中所述的抗凝血酶III分子的糖链结构分析方法进行鉴定。另外，还可以通过使用凝集素的免疫测定进行鉴定。 
通过使用凝集素的免疫测定区分糖链结构可以根据Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Wiley-Liss,Inc.（1995）；Enzyme Immunoassay.,第三版，Igaku Shoin（1987）；Enzyme Antibody Technique,修订版，Gakusai Kikaku（1985）等文献中所述的免疫测定进行，如蛋白质印迹法、RIA（放射免疫测定）、VIA（病毒免疫测定）、EIA（酶免疫测定）、FIA（荧光免疫测定）和MIA（金属免疫分析），例如以下列方式进行。 
对识别抗凝血酶III分子糖链结构的凝集素进行标记，使标记的凝集素与样品抗凝血酶III组合物反应，然后测定标记凝集素与抗凝血酶III分子的复合体的量。 
用于测定抗凝血酶III分子糖链结构的凝集素的例子包括WGA（来源于T.vulgaris的麦芽凝集素）、ConA（来源于矮生刀豆（C.ensiformis）的伴刀豆凝集素A）、RIC（来源于蓖麻（R.communis）的毒素）、L-PHA（来源于菜豆（P.vulgaris）的白细胞凝集素）、LCA（来源于兵豆（L.culinaris）的扁豆凝集素）、PSA（来源于豌豆（P.sativum）的豌豆凝集素）、AAL（橙黄网胞盘菌（Aleuria aurantia）凝集素）、ACL（尾穗苋（Amaranthus caudatus）凝集素）、BPL（羊蹄甲（Bauhinia purpurea）凝集素）、DSL（曼陀罗（Satura stramonium）凝集素）、DBA（双花扁豆（Dolichos biflorus）凝集素）、EBL（elderberry balk凝集素）、ECL（鸡冠刺桐（Erythrina cristagalli）凝集素）、EEL（欧洲卫矛（Euonymus europaeus）凝集素）、GNL（雪花莲（Galanthus nivalis）凝集素）、GSL（加纳谷物（Griffonia simplicifolia）凝集素）、HPA（罗马蜗牛（Helix pomatia）凝集素）、HHL（朱顶红（Hippeastrum）杂合凝集素）、榴莲凝集素、LTL（Lotus tetragonolobus凝集素）、LEL（番茄（Lycopersicon esculentum）凝集素）、MAL（Maackia amnrensis凝集素）、MPL（桑橙（Maclura pomifera）凝集素）、NPL（喇叭水仙（Narcissus pseudonarcissus）凝集素）、PNA（花生凝集素）、E-PHA（菜豆（Phaseolus vulgaris）红细胞凝集素）、PTL（四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus）凝集素）、RCA（蓖麻（Ricinus communis）凝集素）、STL（Solarium tuberosum凝集素）、SJA（堇花槐（Sophora japonica）凝集素）、SBA（大豆凝集素）、UEA（荆豆（Ulex europaeus）凝集素）、VVL（长柔毛野豌豆（Vicia villosa）凝集素）和WFA（多花紫藤（Wisteria floribunda）凝集素）。 
优选使用特异性识别其中复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖结合有岩藻糖的糖链结构的凝集素。这种凝集素的例子包括扁豆凝集素LCA（来源于兵豆（L.culinaris）的扁豆凝集素）、豌豆凝集素PSA（来源于豌豆（P.sativum）的豌豆凝集素）、蚕豆凝集素VFA（来源于蚕豆（Vicia faba）的凝集素）和橙黄网胞盘菌（Aleuria  aurantia）凝集素AAL（来源于橙黄网胞盘菌的凝集素）。 
5.抗凝血酶III组合物的应用 
由于本发明得到的抗凝血酶III组合物具有等同于天然抗凝血酶III的高肝素结合活性，其可以用来预防和治疗伴有血液凝固的疾病。 
已知在伴有血液凝固的疾病中，形成血液凝固的区域如血管内皮组织上粘附并凝固血小板，形成血栓。形成血栓的原因有许多种，如创伤、动脉硬化和血管炎症，当血栓脱落时产生栓子，栓子随血流转移，阻塞其它的血管。当动脉被血栓或栓子阻塞时，阻塞区域的下游灌流区呈缺血状态。这种由血栓引起的多种疾病状态称为血栓形成。因此，本发明的抗凝血酶III组合物也可用来预防和治疗血栓形成。 
血栓形成的实施例包括脑梗塞（脑血管意外）、心肌梗塞、四肢动脉血栓栓塞、深部静脉血栓形成（血栓性静脉炎）、DIC、抗凝血酶III缺陷性疾病、妊娠中毒和类似情况。 
脑梗塞（脑血管意外）是由颅内外主要的大脑动脉中形成动脉粥样硬化病变引起的伴有血管阻塞的疾病。由于大脑血管被血栓迅速堵塞，相对很快便会出现例如偏瘫的移动困难以及例如单侧感觉障碍、视野障碍、失语和发音困难的神经症状。脑梗塞的种类包括：腔隙性脑梗塞，它是由从主要大脑动脉分支的微动脉阻塞产生的相对较小的大脑动脉的血栓形成；心原性脑梗塞，它的发作是当心脏疾病（包括心肌梗塞、心脏瓣膜病如二尖瓣狭窄、关节纤维性颤动（articular fibrillation）和类似疾病）导致在心脏中形成血栓时血栓脱落使动脉血管阻塞引起的。 
心肌梗塞是由于冠状动脉阻塞引起灌注区心肌血流障碍引起的心肌细胞坏死的结果。尽管有患者在疾病发作前具有心绞痛征兆，如胸痛和压迫性胸痛，但是多数情况下没有前驱症状便突然发作。 
四肢动脉血栓栓塞的例子包括：闭塞性动脉硬化(ASO)，它是由腿部动脉硬化引起的阻塞性病变；未知原因的伴有血管炎症的血栓闭塞性脉管炎（TAO,伯格氏病），它导致了肢体动脉和静脉中血栓阻塞。 
深部静脉血栓形成（血栓性静脉炎）是由于外科手术、长期卧床、感染、妊娠、创伤或类似情况造成的血流停滞、或静脉损伤而产生的血栓形成。这种疾病好发于左腿，其主要症状是肿胀，但是也可能发生例如皮肤发红、静脉过度肿胀和疼痛等。这种疾病还好发于远程飞行中，这种情况专门称为经济舱综合症。 
DIC是由于微血管内广泛微血栓形成引起的缺血性器官障碍而发作的疾病，其原因可以是活体中凝血系统的过度活化，其基础疾病包括急性白血病、癌症、感染性疾病、产科疾病、暴发性肝炎、主动脉瘤、心动脉瘤、巨大血管瘤、糖尿病昏迷、血管内溶血、手术、创伤、烧伤创面、整形手术和类似情况。由于其疾病状态在很大程度上取决于基础疾病而变化，因此必须与基础疾病的治疗一起进行抗凝血治疗。 
抗凝血酶III缺陷性疾病是伴有抗凝血酶III数量减少或功能异常的疾病。抗凝血酶III的数量减少或功能异常造成对活化的凝血因子IX和X、凝血酶和类似物的抑制力降低，并成为血栓形成发生的原因。抗凝血酶III缺陷性疾病于1965年在频繁发生血栓的挪威家族中被发现为先天性遗传疾病。百分之几的具有多发性或复发性血栓形成的患者中发现有抗凝血酶III缺陷性疾病。在抗凝血酶III缺陷性疾病患者中，发作频率随年龄增加，而且这种疾病在许多情况下是通过妊娠、感染、外科手术、创伤、服用口服避孕药和类似情况作为起始而发生的。由于在许多病例中血栓形成于腿的深静脉，因此肺栓塞区域、肠系膜静脉、颅内动静脉和类似部位中也观察到其发生。 
妊娠中毒是一种在妊娠过程中发生的疾病，其主要症状为高血压、 蛋白尿和水肿。分娩后仍可观察到相似症状的疾病称为妊娠中毒的继发疾病，从广义上说包括在妊娠中毒中。凝血纤溶系统异常与妊娠中毒的起因有关。 
也可以在疾病发病之前用抗凝血酶III组合物为患者给药，以预防血栓的形成。这些病人的具体例子包括可能引起下列疾病危险的患者：如PTCA后血管再狭窄、不稳定型心绞痛、外周动脉阻塞、暂时性脑缺血发作、急性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、DIC、肝素血小板减少引起的血栓形成并发症、急性肺血栓栓塞、深静脉血栓形成、症状性肺栓塞和抗凝血酶III缺陷疾病。 
可以将含有本发明抗凝血酶III组合物的药物组合物可作为治疗剂单独给药。但是，优选地，将其与一种或多种药学可接受载体混合，提供通过制药技术领域公知的任意方法制造的药物制剂。 
需要通过对治疗最有效的途径用药物组合物给药。合适的给药途径包括口服给药和经胃肠外给药，如口内给药、气管内给药、直肠内给药、皮下给药、肌肉内给药和静脉内给药。对于抗凝血酶III制剂，优选静脉内给药。 
药物组合物的形式可以是喷雾剂、胶囊、片剂、颗粒剂、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、药膏、胶带和类似形式。 
适于口服给药的药物制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉剂和颗粒剂。 
液体制剂如乳剂和糖浆可以使用水；糖类如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇如聚乙二醇和丙二醇；油类如芝麻油、橄榄油和豆油；防腐剂如对羟基苯甲酸；香料如草莓香料、薄荷油和类似物作为添加剂而制备。 
胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或类似物可以使用赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇；崩解剂如淀粉和藻酸钠；润滑剂如硬脂酸镁和滑石；粘合剂如聚乙稀醇、羟丙基纤维素和明胶；表面活性剂如脂肪酸酯；增塑剂如甘油和类似物作为添加剂而制备。 
适于胃肠外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂和喷雾剂。 
注射剂可以使用含盐溶液、葡萄糖溶液或其混合物或类似物的载体而制备。还可以通过根据常规方法冻干抗凝血酶III组合物并向其中加入氯化钠而制成粉末注射剂。 
栓剂可以使用载体如可可脂、氢化油脂和羧酸而制备。 
抗凝血酶III组合物还可以以喷雾剂的形式给药，但是应当使用不刺激接受者口腔或气道粘膜并且可以将抗凝血酶III组合物分散成很细的微粒以促进吸收的载体来制备喷雾剂。 
合适的载体包括乳糖和甘油。也可以根据根据抗凝血酶III组合物和所用载体的性质制备气雾剂、干粉或类似物。制备胃肠外制剂时，也可加入上述的口服制剂添加剂。 
剂量和给药频率根据所需的治疗效果、给药途径、治疗周期、患者的年龄、体重或类似情况而改变。但是，适用于成人的活性成分日剂量通常为10μg/kg至20mg/kg。 
另外，抗凝血酶III组合物的抗凝血活性可以通过体外实验测量，如抗凝血酶活性测定法或肝素辅助因子活性测定法，使用DIC病态动物模型使用例如家兔的实验动物通过体内实验测定，或通过类似方法测定。 
测定抗凝血酶活性的方法、测量肝素辅助因子活性的方法和DIC病态动物模型试验通过下列文献所述的方法进行：The Second Series of Pharmaceutical Research and Development,Volume20,Blood Product,Ikuo Suzuki主编，Hirokawa Publishing Company,Tokyo,Japan（1992）；The Course of Medicine(Igaku no Ayumi),120,1147（1982）；Japanese Pharmacology and Therapeutics,17,5843（1989）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3573（1985）；Clinic and Research(Rinsyo to Kenkyu),62,3688,1985；Parmacometrics,30,589（1985）或者类似文献。 
以下基于实施例对本发明进行更详细的描述；但是这些实施例仅仅用来进行描述，本发明的范围不限于此。 
附图说明
图1用示意图显示了人抗凝血酶III的结构。 
图2用示意图显示了加在来源于人血浆的抗凝血酶III上的复合体型N-糖苷连接糖链。 
图3显示了质粒pKOFUT8Neo的构建步骤。 
图4显示了质粒pBS-ATIII的构建步骤。 
图5显示了质粒pKAN-ATIII的构建步骤。 
图6显示了质粒pKAN-ATIIIN135Q的构建步骤。 
图7显示了抗凝血酶III的肝素亲合色谱洗脱图。 
图8显示了抗凝血酶III的肝素辅助因子活性。 
具体实施方式
实施例1 
构建CHO/DG44细胞系，其中基因组中α1,6-岩藻糖基转移酶的两条等位基因（FUT8）均已被破坏 
根据下列步骤构建α1,6-岩藻糖基转移酶包含翻译起始密码子的 两条等位基因（下文中称为FUT8）的基因组区域缺失的CHO/DG44细胞系。 
1.构建靶向包含外显子2的中国仓鼠FUT8基因的载体质粒pKOFUT8Neo 
使用通过WO02/31140实施例13-1中所述的方法构建的靶向中国仓鼠FUT8基因外显子2的载体质粒pKOFUT8Puro和质粒pKOSelectNeo（Lexicon制造），以下列方式构建质粒pKOFUT8Neo。 
使用16单位限制性内切核酸酶AscI（New England Biolabs），使1.0μg质粒pKOSelectNeo（Lexicon制造）在37℃下反应2小时。对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒（QIAGEN制造）回收含有新霉素抗性基因表达单位的约1.6Kb AscI片段。 
接下来，使用16单位限制性内切核酸酶AscI（New England Biolabs制造）使1.0μg质粒pKOFUT8Puro在37℃下反应2小时。消化反应之后，根据所附的说明书用来源于大肠杆菌C15（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）的碱性磷酸酶使DNA片段的末端发生去磷酸化。反应之后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA片段。 
在存在Ligation High（Toyobo Co.,Ltd.制造）的情况下，将上文得到的0.1μg来源于质粒pKOSelectNeo的AscI片段（大约1.6Kb）和0.1μg来源于质粒pKOFUT8Puro的AscI片段（大约10.1Kb）连接，根据Cohen等人[Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.,69,2110（1972）]的方法使用生成的重组质粒DNA来转化大肠杆菌DH5α（Toyobo Co.,Ltd.制造）。从各转化体制备质粒DNA，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0和DNA测序仪ABI PRISM377（Applied Biosystems制造）对各个核苷酸序列进行分析。得到图3所示的具有目标核苷酸序列的质粒pKOFUT8Neo，并将其用作制备CHO 细胞的FUT8基因敲除细胞用的靶载体。 
2.制备基因组中FUT8基因的一个拷贝已经被破坏的CHO细胞 
（1）获取已经导入靶载体pKOFUT8Neo的细胞系 
将实施例1-1中构建的靶向中国仓鼠FUT8基因组区的载体pKOFUT8Neo用下列方式导入来源于中国仓鼠卵巢的二氢叶酸还原酶基因（dhfr）基因缺陷的CHO/DG44细胞[Somataic Cell and Molecular Genetics,12,555（1986）]。 
加入400单位限制性内切核酸酶SalI（New England Biolabs制造）使280μg质粒pKOFUT8Neo在37℃下反应5小时进行线性化后，通过电穿孔将4μg线性化pKOFUT8Neo导入1.6×106CHO/DG44细胞[Cytotechnology,3,133（1990）]。将得到的细胞悬浮在含10%透析FBS（Invitrogen）和1倍浓度HT添加物（Invitrogen制造）的IMDM-dFBS(10)-HT(1)IMDM培养基（Invitrogen制造）中，然后将其接种在贴壁细胞培养用的10-cm皿中（Falcon制造）。在37℃下在5%CO2培养箱中培养24小时后，将培养基用10ml含600μg/ml G418（Nacalai Tesque,Inc.制造）的IMDM-dFBS(10)（含10%透析FBS的IMDM培养基）替换。在37℃下在5%CO2培养箱中培养15天，其间每3至4天重复一次上述的培养基更换，得到G418-耐受性克隆。 
（2）通过基因组PCR确认同源重组 
通过基因组PCR以下列方式进行上文（1）中得到的G418-耐受性克隆中同源重组的确认。 
在96孔板中对G418-耐受性克隆进行胰蛋白酶消化，每孔加入2倍体积的冷冻培养基（20%DMSO、40%胎牛血清和40%IMDM）使细胞悬浮。将每孔内细胞悬液的一半接种在贴壁细胞用的平底96孔板（Asahi Techno Glass制造）中制备复制平板，将另一半作为主平板冷冻保存。 
将复制平板上的新霉素耐受性克隆用含600μg/ml G418的IMDM-dFBS（10）培养1周，然后回收细胞。根据已知方法从回收的细胞中制备每个克隆的基因组DNA[Analytical Biochemistry,201,331（1992）]，然后将其在30μl TE-RNase缓冲液（pH8.0）（10mmol/1Tris-HCl、1mmol/1EDTA、200μg/ml RNase A）中溶解过夜。 
基因组PCR中使用的引物设计如下。制备与越过靶向载体同源区（SEQ ID NO:20或21）的部分的序列结合的引物，和与通过WO03/31140实施例12中所述的方法获得的FUT8基因组区（SEQ ID NO:13）中的载体（SEQ ID NO:22或23）内的序列结合的引物。下面的聚合酶链式反应（PCR）使用这些引物进行。具体地说，制备含10μl上文制备的每种基因组DNA溶液的反应混合物[25μl；DNA聚合酶ExTaq（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、ExTaq缓冲液（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、0.2mmol/1dNTPs、0.5μmol/1每种上述的基因特异性引物（正向引物：SEQ ID NO:20或21；反向引物：SEQ ID NO:22或23）]，在94℃下加热3分钟后，进行PCR循环，每次循环由在94℃下反应1分钟、在60℃下反应1分钟和在72℃下反应2分钟组成。 
PCR之后，对反应混合物进行0.8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，观察到含有CHO细胞基因组区边界部分和靶载体同源区的特异性扩增（约1.7Kb）的细胞系被确定为阳性克隆。 
（3）通过基因组DNA印迹法确认同源重组 
以下列方式通过DNA印迹法对上文（2）中获得的阳性克隆中的同源重组进行确认。 
从上文（2）中通过冷冻保存的主平板中，选择含有（2）中发现的阳性克隆的96孔板。将培养板在5%CO2和37℃下保持10分钟后，将孔中对应于阳性克隆的细胞接种到贴壁细胞用的平底24孔板 （Greiner制造）中。用含600μg/ml浓度的IMDM-dFBS（10）培养1周后，将细胞接种到贴壁细胞用的平底6孔板（Greiner）中。根据已知方法将从板中回收的细胞中制备每个克隆的基因组DNA[Nucleic Acids Research,3,2303（1976）]，然后将其在150μl TE-RNase缓冲液（pH8.0）（10mmol/1Tris-HCl、1mmol/1EDTA、200μg/ml RNaseA）中溶解过夜。 
将上文制备的基因组DNA（12μg）用25单位限制性内切核酸酶BamHI（New England Biolabs制造）在37℃下消化过夜。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段。将回收的片段溶解在20μl TE缓冲液（pH8.0）（10mmol/1Tris-HCl、1mmol/1EDTA）中，然后对其进行0.6%（w/v）琼脂糖凝胶电泳。电泳之后，根据已知方法将基因组DNA转移到尼龙膜上[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683（1979）]，然后在80℃下将尼龙膜热处理2小时进行固定。 
分别地，DNA印迹法中使用的探针可以用下列方式制备。首先，如下进行PCR：使用与越过通过WO02/31140实施例12中所述方法得到的FUT8基因组区（SEQ ID NO:13）中的靶向载体同源区（SEQ ID NO:24和25）的部分的序列结合的引物。即，制备20μl含4.0ng WO02/31140实施例12中所述质粒pFUT8fgE2-2的反应混合物[DNA聚合酶ExTaq（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、ExTaq缓冲液（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、0.2mmol/1dNTPs、0.5μmol/1每种上述的基因特异性引物（SEQ ID NO:24和25）]，在94℃下加热1分钟后，进行PCR，循环25次，每次循环由在94℃下反应30秒、在55℃下反应30秒和在74℃下反应1分钟组成。PCR之后，对反应混合物进行1.75%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，纯化大约230bp的探针DNA片段。然后，使用[α-32P]dCTP1.75MBq和Megaprime DNA标记系统dCTP（Amersham Pharmacia Biotech制造）对5μ1的所得探针DNA溶液进行放射性标记。 
以下列方式进行杂交。将上述尼龙膜置于滚瓶中，向其加入15ml杂交溶液[5×SSPE、50×Denhaldt's溶液、0.5%（w/v）SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA]。预杂交在65℃下进行3小时。然后，对32P-标记的探针DNA进行热变性处理，将其置于瓶中，然后在65℃下加热过夜。 
杂交之后，将尼龙膜浸在50ml2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。重复2次洗涤步骤后，将尼龙膜浸在50ml0.2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。洗涤之后，将尼龙膜在-80℃下在X-光胶片上曝光显影。 
亲代细胞系CHO/DG44和50-10-104细胞系的基因组DNA是上文（2）中得到的阳性克隆，根据本方法对其进行分析。在CHO/DG44细胞系中，仅仅检测到来源于野生型FUT8等位基因的约25.5Kb的片段。另一方面，在阳性克隆即50-10-104细胞系中，除来源于野生型FUT8等位基因的约25.5kb的片段外，还检测到经历重组的对等位基因有特异性的约20.0Kb的片段。这两种片段的数量比为1:1，从而确认50-10-104细胞系是一种半敲除克隆，其中FUT8等位基因的一个拷贝被破坏。 
3.制备基因组上的FUT8基因已经被双重敲除的CHO/DG44细胞系 
（1）获取已导入靶向载体pKOFUT8Puro的细胞系 
为了破坏实施例1-2（2）中得到的FUT8基因半敲除克隆中的另一条FUT8等位基因，将根据WO02/31140实施例13-1中所述的方法构建的中国仓鼠FUT8基因外显子2靶向载体质粒pKOFUT8Puro用下列方式导入到克隆中。 
加入800单位限制性内切核酸酶SaiI（New England Biolabs制造）使440μg质粒pKOFUT8Puro在37℃下反应5小时进行线性化后，通过电穿孔将4μg经线性化的pKOFUT8Puro导入1.6×106FUT8基因半 敲除克隆的细胞[Cytotechnology,3,133（1990）]。将得到的细胞悬浮在IMDM-dFBS(10)-HT(1)中，然后将其接种在贴壁细胞培养用的10-cm皿（Falcon制造）中。在37℃下在5%CO2培养箱中培养24小时后，将培养基用10ml含15μg/ml嘌呤霉素（SIGMA制造）的IMDM-dFBS(10)-HT(l)替换。 
在5%CO2的气氛下培养15天，其间每7天重复一次上述的培养基更换，得到嘌呤霉素-耐受性性克隆。 
（2）通过基因组DNA印迹法确认同源重组 
以下列方式通过DNA印迹法对上文（1）中获得的耐药克隆中的同源重组进行确认。 
从表达嘌呤霉素耐受性克隆的10-cm培养皿中移除培养物上清液，倒入7ml磷酸盐缓冲液，将培养皿移至立体显微镜下。接下来，挑出集落，用PIPETMAN（GILSON制造）吸出，并收集在圆底96孔板（Falcon制造）中。胰蛋白酶消化后，将每个克隆接种接种到贴壁细胞用的平底96孔板（Asahi Techno Glass制造）中，然后使用含15μg/ml嘌呤霉素（SIGMA制造）的IMDM-dFBS(10)-HT(l)培养1周。 
培养之后，对上述板中的每个克隆进行胰蛋白酶消化，将得到的细胞接种到贴壁细胞用的平底24孔板中（Greiner制造）。使用含15μg/ml嘌呤霉素（SIGMA制造）的IMDM-dFBS(10)-HT(l)培养1周后，将细胞接种到贴壁细胞用的平底6孔板（Greiner制造）中。根据已知方法从培养板中制备每个克隆的基因组DNA[Nucleic Acids Research,3,2303（1976）]，然后将其在150μl TE-RNase缓冲液（pH8.0）中溶解过夜。 
将上述制备的基因组DNA（12μg）用25单位限制性内切核酸酶BamHI（New England Biolabs制造）在37℃下进行消化反应过夜。将 通过乙醇沉淀回收的DNA片段溶解在20μl TE缓冲液（pH8.0）中，然后对其进行0.6%（w/v）琼脂糖凝胶电泳。电泳之后，根据已知方法将基因组DNA转移到尼龙膜上[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683（1979）]，然后在80℃下将尼龙膜热处理2小时。 
分别地，DNA印迹法中使用的探针可以用下列方式制备。首先，使用与越过FUT8基因组区中的靶向载体同源区的部分的序列（SEQ ID NO:26和27）结合的引物进行PCR。即，制备20μl含4.0ng通过WO02/31140实施例12中所述的方法构建的质粒pFUT8fgE2-2的反应混合物[DNA聚合酶ExTaq（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、ExTaq缓冲液（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、0.2mmol/1dNTPs、0.5μmol/1每种上述的基因特异性引物（SEQ ID NO:26和27）]，在94℃下加热1分钟后，进行PCR，循环25次，每次循环由在94℃下反应30秒、在55℃下反应30秒和在74℃下反应1分钟组成。PCR之后，对反应混合物进行1.75%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，纯化大约230bp的探针DNA片段。然后，使用[α-32P]dCTP1.75MBq和Megaprime DNA标记系统dCTP（Amersham Pharmacia Biotech制造）对5μ1的所得探针DNA溶液进行放射性标记。 
以下列方式进行杂交。将上述尼龙膜置于滚瓶中，向其加入15ml杂交溶液[5×SSPE、50×Denhaldt's溶液、0.5%（w/v）SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA]。预杂交在65℃下进行3小时。然后，对32P-标记的探针DNA进行热变性处理，将其置于瓶中，然后在65℃下加热过夜。 
杂交之后，将尼龙膜浸在50ml2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。重复2次该洗涤步骤后，将尼龙膜浸在50ml0.2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。洗涤之后，将尼龙膜在-80℃下在X-光胶片上曝光显影。 
WK704细胞系的基因组DNA是根据上文（1）中所述的方法从 50-10-104细胞系得到的嘌呤霉素耐受性克隆中的一种，根据本方法对其进行分析。在WK704细胞系中，来源于野生型FUT8等位基因的约25.5Kb的片段被去除，仅仅检测到对经历同源重组的等位基因有特异性的约20.0Kb的片段。这一结果确定，WK704细胞系是其中两条FUT8等位基因均被破坏的克隆。 
4.从FUT8基因双敲除细胞中去掉药物耐受性基因 
（1）导入Cre重组酶表达载体 
将Cre重组酶表达载体pBS185（Life Technologies制造）用下列方法导入上文实施例1的3中得到的FUT8-双敲除克隆中。 
将4μg质粒pBS185通过电穿孔[Cytotechnology,3,133（1990）]导入1.6×106细胞后，将所得细胞悬浮在10ml IMDM-dFBS(10)-HT(l)中，将悬液用相同培养基稀释20000倍。将稀释悬液接种到贴壁细胞用的10-cm培养皿（Falcon制造）中，然后在37℃下在5%CO2气氛中培养10天，形成集落。 
（2）获取已导入Cre重组酶表达载体的细胞系 
用下列方式从将基因导入上文实施例1中3制备的FUT8-双敲除克隆而得到的集落中收集任意克隆。首先，从10-cm培养皿中移除培养物上清液，倒入7ml磷酸盐缓冲液，将培养皿移至立体显微镜下。接下来，挑出集落，用PIPETMAN（GILSON制造）吸出，并收集在圆底96孔板（Falcon制造）中。胰蛋白酶消化后，将每个克隆接种到贴壁细胞用的平底96孔板（Asahi Techno Glass制造）中，然后使用IMDM-dFBS(10)-HT(l)培养1周。 
培养之后，在上述板中对每个克隆进行胰蛋白酶消化，将其与2倍体积的冷冻培养基（20%DMSO、40%胎牛血清和40%IMDM）混合。将其一半接种在贴壁细胞用的平底96孔板（Asahi Techno Glass制造）中制备复制平板，将另一半作为主平板冷冻保存。 
将复制平板用含600μg/ml G418和15μg/ml嘌呤霉素的IMDM-dFBS(10)-HT(l)培养7天。在G418和嘌呤霉素的存在下，其中loxP序列之间的两条等位基因上的耐药基因均已通过Cre重组酶表达而被去除的阳性克隆死亡。根据这种负选择方法选择阳性克隆。 
（3）通过基因组DNA印迹法确认耐药基因的去除 
上文（2）中收集的阳性克隆中耐药基因的去除可以通过基因组DNA印迹法用下列方式进行确认。 
从上文（2）中通过冷冻保存的主平板中，选择含有上述阳性克隆的96孔板。将培养板在5%CO2和37℃下保持10分钟后，将孔中对应于上述克隆的细胞接种到贴壁细胞用的平底24孔板（Greiner制造）中。用已经加入10%胎牛血清（Invitrogen制造）和1×浓度HT添加物（Invitrogen制造）的IMDM（Invitrogen制造）培养1周后，将细胞接种到贴壁细胞用的平底6孔板（Greiner）中。根据已知方法[Nucleic Acids Research,3,2303（1976）]将从培养板制备每个克隆的基因组DNA，然后将其在150μl TE-RNase缓冲液（pH8.0）中溶解过夜。 
将上文制备的基因组DNA（12μg）用20单位限制性内切核酸酶NheI（New England Biolabs制造）在37℃下消化过夜。将通过乙醇沉淀从反应混合物中回收的DNA片段溶解在20μl TE缓冲液（pH8.0）中，然后对其进行0.6%（w/v）琼脂糖凝胶电泳。电泳之后，根据已知方法将基因组DNA转移到尼龙膜上[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683（1979）]，然后在80℃下将尼龙膜热处理2小时进行固定。 
分别地，DNA印迹法中使用的探针可以用下列方式制备。接下来，使用与越过FUT8基因组区中的靶向载体同源区的部分的序列（SEQ ID NO:26和27）结合的引物进行如下PCR。即，制备含4.0ng WO02/31140实施例12中所述质粒pFUT8fgE2-2的反应混合物[20μl；DNA聚合酶 ExTaq（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、ExTaq缓冲液（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、0.2mmol/1dNTPs、0.5μmol/1每种上述的基因特异性引物（SEQ ID NO:26和27）]作为模板，在94℃下加热1分钟后，进行PCR，循环25次，每次循环由在94℃下反应30秒、在55℃下反应30秒和在74℃下反应1分钟组成。PCR之后，对反应混合物进行1.75%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，纯化大约230bp的探针DNA片段。然后，使用[α-32P]dCTP1.75MBq和Megaprime DNA标记系统dCTP（Amersham Pharmacia Biotech制造）对5μ1的所得探针DNA溶液进行放射性标记。 
以下列方式进行杂交。将上述尼龙膜置于滚瓶中，向其加入15ml杂交溶液[5×SSPE、50×Denhaldt's溶液、0.5%（w/v）SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA]。预杂交在65℃下进行3小时。然后，对32P-标记的探针DNA进行热变性处理，将其置于瓶中，然后在65℃下加热过夜。 
杂交之后，将尼龙膜浸在50ml2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。重复2次该洗涤步骤后，将尼龙膜浸在50ml0.2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。洗涤之后，将尼龙膜在-80℃下在X-光胶片上曝光显影。 
通过上文所述的使用限制性内切核酸酶NheI进行处理，从野生型FUT8等位基因得到约8.0Kb的DNA片段。另外，通过类似的限制性内切核酸酶处理，从经历靶向载体同源重组的等位基因得到约9.5Kb的DNA片段。而且，通过类似处理，当从经历同源重组的等位基因中去除新霉素耐受性基因（约1.6kb）和嘌呤霉素耐受性基因（约1.5Kb）时，得到约8.0Kb的DNA片段。 
上文第2条中所述的亲代细胞系CHO/DG44、50-10-104细胞系、上文第3条中所述的WK704细胞系和4-5-C3细胞系的基因组DNA均为根据上文（2）中所述的方法从WK704细胞系得到的药物敏感性克 隆中的一种，根据本方法对其进行分析。在CHO/DG44细胞系中，仅检测到来源于野生型FUT8等位基因的约8.0Kb的DNA片段。在50-10-104细胞系和WK704细胞系中，观察到来源于经历同源重组的等位基因的约9.5Kb的DNA片段。另一方面，在4-5-C3细胞系中，仅检测到从经历同源重组的等位基因中去除新霉素耐受性基因（约1.6Kb）和嘌呤霉素耐受性基因（约1.5Kb）而得到的约8.0Kb的DNA片段。从上述结果中，确认4-5-C3细胞系中的耐药基因已经被Cre重组酶除去。 
除4-5-C3细胞系外，还得到了多个耐药基因已经被除去的FUT8基因双敲除克隆（下文中称为FUT8基因-双敲除细胞）。 
实施例2 
通过FUT8基因-双敲除细胞表达重组抗凝血酶III： 
通过下文所示的方法制备表达重组抗凝血酶III的FUT8基因-双敲除细胞系。 
1.聚合酶链式反应（PCR） 
从人抗凝血酶III基因（UniGene:Hs.75599）序列制备两条引物（SEQ ID NO:28和29）进行如下PCR。即，制备20μl由DNA聚合酶（Takara Bio制造）、缓冲液、0.2mmol/1dNTP混合物和0.5μmol/1上述基因特异性引物（SEQ ID NO:28和29）组成、含来源于人肝脏的cDNA（Invitrogen制造）作为模板的反应混合物，在94℃下加热1分钟后，进行PCR循环30次，每次循环由在94℃下反应30秒、在55℃下反应1分钟和在74℃下反应2分钟组成。PCR之后，对反应混合物进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，以确认含有约1,400bp的人抗凝血酶III基因的DNA片段得以特异性扩增。 
2.制备质粒pBS-ATIII 
对上文1中制备的PCR产物进行苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀， 将由此回收的纯化DNA片段溶解在17μ1无菌水中。接下来，向溶液中加入10单位限制性酶EcoRI（Takara Bio制造）、10单位BamHI（Takara Bio制造）和2μl10×H缓冲液（Takara Bio制造），制成20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。接下来，将3μg质粒pBluescript II KS(+)（Stratagene制造）溶解在17.5μl无菌水中。接下来，向溶液中加入10单位EcoRI和2μl10×H缓冲液，制成20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。反应之后，进行苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀，将由此回收的质粒溶解在17.5μ1无菌水中。接下来，向溶液中加入10单位BamHI和2μl10×K缓冲液，进一步制成20μl的反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。对上文得到的含有人抗凝血酶III基因的PCR产物片段（EcoRI-BamHI）和pBluescript II KS(+)片段（EcoRI-BamHI）均进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒（QIAGEN制造）对约1.4Kb和3.0Kb的DNA片段分别进行纯化。接下来，在Ligation High（Toyobo Co.,Ltd.制造）的存在下对20ng纯化的PCR产物片段（EcoRI-BamHI）和80ng纯化的pBluescript II KS(+)片段（EcoRI-BamHI）进行连接，使用由此得到的重组质粒DNA对大肠杆菌株DH5α（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行转化。从每个转化体中制备质粒DNA，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0（Applied Biosystems制造）和DNA测序仪ABI PRISM377（Applied Biosystems制造）对其核苷酸序列进行分析。结果，得到含有人抗凝血酶III全部翻译区基因序列的质粒pBS-ATIII（图4）。 
3.制备质粒pKAN-ATIII 
将3μg上文中制备的pBS-ATIII溶解在17μl无菌水中，向其中加入10单位EcoRI（Takara Bio制造）、10单位BamHI（Takara Bio制造）和2μl10×H缓冲液，得到20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。 
接下来，将3μg质粒pKANTEX93（WO97/10354）溶解在17.5μl 无菌水中。接下来，向溶液中加入10单位EcoRI和2μl10×H缓冲液，制成20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。反应之后，进行苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀，将由此回收的质粒溶解在17.5μ1无菌水中。接下来，向溶液中加入10单位BamHI和2μl10×K缓冲液，进一步制成20μl的反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。 
对上文得到的pBS-ATIII片段（EcoRI-BamHI）和pKANTEX93片段（EcoRI-BamHI）均进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒（QIAGEN制造）对约1.4Kb和9.0Kb的DNA片段分别进行纯化。接下来，在Ligation High（Toyobo Co.,Ltd.制造）的存在下对50ng纯化的pBS-ATIII片段（EcoRI-BamHI）和30ng纯化的pKANTEX93片段（EcoRI-BamHI）进行连接，使用由此得到的重组质粒DNA对大肠杆菌株DH5α（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行转化。从每个转化体中制备质粒DNA，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0（Applied Biosystems制造）和DNA测序仪ABI PRISM377（Applied Biosystems制造）对其核苷酸序列进行分析。结果，得到含有人抗凝血酶III全部翻译区基因序列的动物细胞表达用的质粒pKAN-ATIII（图5）。 
4.将人抗凝血酶III表达质粒稳定地导入基因组FUT8基因被双敲除的CHO/DG44细胞系中 
将上一条中制备的质粒pKAN-ATIII稳定地导入实施例1中制备的FUT8基因被双敲除的CHO/DG44细胞系中，制备转化体。通过下列步骤根据电穿孔法[Cytotechnology,3,133（1990）]进行质粒pKAN-ATIII的基因导入。首先，制备600μl含60μl NEBuffer3（New England Biolabs制造）和120单位限制性内切核酸酶MluI（New England Biolabs制造）的反应混合物，在37℃下进行5小时消化反应，对100μg质粒pKAN-ATIII进行线性化。反应之后，通过苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀对反应混合物进行提纯，从而回收线性质粒。接下来，将实施例1中制备的FUT8基因被双敲除的CHO/DG44细胞系克隆当中 的一个细胞系悬浮在K-PBS缓冲液（137mmol/1KC1、2.7mmol/1NaCl、8.1mmol/1Na2HPO4、1.5mmol/1KH2PO4、4.0mmol/1MgCl2）中，制备8×107细胞/ml的悬液。将200μl细胞悬液（1.6×106细胞）与9μg上述的线性质粒混合后，将全部体积的细胞-DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette（电极间距离2mm，BIO-RAD制造）中，使用电穿孔装置Gene Pulser II（BIO-RAD制造）在350V脉冲电压和250μF电容的条件下进行基因导入。以相同的方式在4个试管中进行基因导入之后，将细胞悬液悬浮在120ml补充有10%胎牛血清（Life Technology制造）和50μg/ml庆大霉素（Nacalai Tesque制造）的IMDM培养基（Life Technology制造）中，并以100μl/孔接种到12个贴壁细胞用的96孔板（Greiner制造）中。在CO2培养箱（TABAI制造）中在5%CO2和37℃下进行培养。 
5.获取500nM MTX-耐受性细胞系 
将上一条中得到的稳定导入pKAN-ATIII的细胞培养6天，然后弃去培养物上清液，加入100μl/孔的补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和50nM氨甲喋呤（MTX）（SIGMA制造）的IMDM培养基。继续培养9天，其间每3至4天重复一次该培养基更换。接下来，继续培养18天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和200nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，将最终形成的集落接种到24孔板（SIGMA制造）中。随后，继续培养19天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，任选地扩大培养，从而得到500nM MTX耐受性转化体。 
6.选择抗凝血酶III高产细胞系 
从上一条中得到的几种500nM MTX-耐受性细胞系中每一个中收集1.5×106细胞，并将其悬浮在5ml补充有10％透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基中，然后接种到组织培养瓶(培养面积25cm2，Greiner制造)中培养。培养3天后，回收 培养物上清液，使用用抗凝血酶(ATIII)试剂盒(Affinity Biological制造)的ELISA测定上清液中所含人抗凝血酶III的量。根据试剂盒所附的说明书实施该方法，并使用市售的来源于人血浆的抗凝血酶III(SIGMA制造)作为标准制剂。在几种500nM MTX-耐受性细胞系当中，确认细胞系MS705pKAN-ATIII27的培养物上清液中人抗凝血酶III以304μg/ml的浓度得以表达。细胞系Ms705pKAN-ATIII27于2003年9月9日保藏在专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi，茨城，日本，其保藏号为FERM BP-08472。 
实施例3 
通过CHO/DG44细胞表达重组抗凝血酶III： 
1.将人抗凝血酶III表达质粒导入CHO/DG44细胞系 
首先，制备600μl含60μl NEBuffer3（New England Biolabs制造）和120单位限制性内切核酸酶MluI（New England Biolabs制造）的反应混合物，对100μg实施例2-3中制备的质粒pKAN-ATIII进行线性化，在37℃下进行5小时消化反应。反应之后，通过苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀对反应混合物进行提纯，从而回收线性质粒。 
接下来，将CHO/DG44细胞系[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216（1980）]悬浮在K-PBS缓冲液（137mmol/1KC1、2.7mmol/1NaCl、8.1mmol/1Na2HPO4、1.5mmol/1KH2PO4、4.0mmol/1MgCl2）中，达到8×107细胞/ml的密度。接下来，将200μl细胞悬液（1.6×106细胞）与9μg上述的线性质粒混合后，将全部体积的细胞-DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette（电极间距离2mm，BIO-RAD制造）中，使用电穿孔装置Gene Pulser II（BI O-RAD制造）在350V脉冲电压和250μF电容的条件下进行基因导入。根据参考文献进行电穿孔[Cytotechnology,3,133（1990）]。基因导入之后，将细胞悬液悬浮在30ml补充有10%胎牛血清（Life Technology制造）和50μg/ml庆大 霉素（Nacalai Tesque制造）的IMDM培养基（Life Technology制造）中，并以100μl/孔接种到3个贴壁细胞用的96孔板（Greiner制造）中。在5%CO2和37℃的条件下进行培养。 
2.获取MTX-耐受性细胞系 
将上文中得到的导入pKAN-ATIII的细胞培养6天，然后弃去培养物上清液，以100μl/孔分配补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和50nM氨甲喋呤（MTX）（SIGMA制造）的IMDM培养基。继续培养9天，其间每3至4天重复一次该培养基更换。接下来，继续培养18天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和200nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，将最终形成的集落接种到24孔板（SIGMA制造）中。随后，继续培养19天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，任选地扩大培养，从而得到500nM MTX耐受性转化体。 
3.选择抗凝血酶III高产细胞系 
从上一条中得到的几种500nM MTX-耐受性细胞系中的每一个中收集1.0×106细胞，并将其悬浮在5ml补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基中，然后接种到组织培养瓶中培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用抗凝血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA测定上清液中所含人抗凝血酶III的量。根据ELISA试剂盒所附的说明书实施该方法，并使用来源于人血浆的制剂Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）作为标准制剂。在其培养物上清液中发现有重组人抗凝血酶III积累的转化体被命名为pKAN-ATIII DG44。 
实施例4 
重组抗凝血酶III的纯化和糖链结构分析： 
1.自然化至无血清培养基 
将实施例2和3中制备的表达重组抗凝血酶III的FUT8基因双敲除细胞系和表达重组抗凝血酶III的CHO/DG44细胞系通过下列方法自然化至无血清培养基。将每个细胞系悬浮在15ml补充有4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen制造)、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的EX-CELL302培养基(JRH制造)(下文中称为无血清培养基)中，达到5×105细胞/ml的密度，并将其接种到125ml圆锥瓶中进行分批培养。在35℃下进行培养，旋转速度为90至100rpm，当进行传代时，通过将含5％CO2的空气吹至培养基的表面来更换锥形瓶中的空气，吹入空气的体积为培养容器体积的4倍或更多。三天之后，更换培养基，在第6天用5×105细胞/ml进行传代。之后的2周，每隔3至4天重复一次传代，将细胞自然化至无血清培养基中。通过这种培养，得到来源于FUT8基因双敲除细胞系、并能够在无血清培养基中生长的转化体pKAN-ATIII AFMS705和来源于CHO/DG44细胞系、并能够在无血清培养基中生长的转化体pKAN-ATIII AFDG44。将由此获得的每个细胞系悬浮在15ml无血清培养基中，达到3.0×105细胞/ml的密度，将其接种到125ml培养瓶中进行培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用抗凝血酶(ATIII)试剂盒(Affinity Biological制造)的ELISA测定上清液中所含重组抗凝血酶III的量，确认重组抗凝血酶III被两种转化体以几乎相同的浓度表达，即，pKAN-ATIII AFMS705的培养物上清液中为18μg/ml，pKAN-ATIII AFDG44的培养物上清液中为28μg/ml。在这一方面下，细胞系pKAN-ATIII AFMS705细胞系以细胞系名称pKAN-ATIII AFMS705于2004年8月10日保藏在专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi，茨城，日本，其保藏号为FERM BP-10088。 
2.获取含重组抗凝血酶III的培养物上清液 
将上文得到的每个细胞系pKAN-ATIII AFMS705和pKAN-ATIII AFDG44作为两种无血清自然化的细胞系悬浮在450ml无血清培养基 中，达到3×l05细胞/ml的密度，并将其接种到2升容积的转瓶（Becton Dickinson制造）中，通过将含5%CO2的空气吹至培养基的表面来更换锥形瓶中的空气，吹入空气的体积为培养容器体积的4倍或更多。在35℃下进行培养，旋转速度为5至10rpm，在培养的第5天，为了补充被消耗的营养物质如氨基酸，向其中加入37.5ml饲养培养基和1.8ml50%葡萄糖溶液。饲养培养基是含有氨基酸（L-丙氨酸0.22g/1、L-精氨酸盐酸盐0.74g/1、L-天冬酰胺一水合物0.22g/1、L-天冬氨酸0.26g/1、L-胱氨酸二盐酸盐0.80g/1、L-谷氨酸0.66g/1、L-谷氨酰胺7.3g/1、甘氨酸0.26g/1、L-组氨酸盐酸盐二水合物0.37g/1、L-异亮氨酸0.92g/1、L-亮氨酸0.92g/1、L-赖氨酸盐酸盐1.29g/1、L-蛋氨酸0.26g/1、L-苯丙氨酸0.58g/1、L-脯氨酸0.35g/1、L-丝氨酸0.37g/1、L-苏氨酸0.84g/1、L-色氨酸0.14g/1、L-酪氨酸二钠二水合物0.92g/1和L-缬氨酸0.83g/1）、维生素（d-生物素0.0001g/1、D-泛酸钙0.035g/1、氯化胆碱0.035g/1、叶酸0.035g/1、肌醇0.063g/1、烟酰胺0.035g/1、盐酸吡哆醛0.035g/1、核黄素0.0035g/1、盐酸硫胺素0.035g/1和维生素B120.0001g/1）、重组人胰岛素0.31g/1（JRH制造）、乙醇胺0.025g/1（Sigma-Aldrich制造）、2-巯基乙醇0.0098g/1（Sigma-Aldrich制造）、大豆水解物HY-SOY8g/1（Quest International制造）、亚硒酸钠16.8μg/1（Sigma-Aldrich制造）、胆固醇脂质浓缩溶液2ml/1（250×水溶液，Invitrogen制造）和乙二胺四乙酸铁二钠盐0.05g/1（Sigma-Aldrich制造）的培养基。在饲养过程中和饲养之后，每天通过通风进行换气，直至培养结束。保持80%或更高的存活比例，培养9至10天。培养结束后，使用抗凝血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA测定培养物上清液中重组人抗凝血酶的量。结果，确认pKAN-ATIII AFMS705和pKAN-ATIII AFDG44培养物上清液中所含重组抗凝血酶III的浓度分别为68μg/ml和87μg/ml。下文中，分别将pKAN-ATIII AFMS705产生的重组抗凝血酶III称为ATIII MS705，将pKAN-ATIII AFDG44产生的重组抗凝血酶III称为ATIII DG44。 
3.重组抗凝血酶III的纯化 
将上一条中得到的含有重组抗凝血酶III的培养物上清液中根据参考文献[Meth.Enzymol.,222,525,1993]中所述的方法用下列方式提纯重组抗凝血酶III。取一部分上一条中得到的含有重组抗凝血酶III的培养物上清液，其对应于大约250mg重组抗凝血酶III，将其应用于肝素柱（Heparin Sepharose6Fast Flow，250ml，Amersham Bioscience制造），该柱已经用由50mM Tris、14mM柠檬酸和0.15M NaCl组成的缓冲液（pH7.4）平衡。随后，将肝素柱用10CV平衡缓冲液冲洗，然后采用线性梯度洗脱法（12CV）来洗脱重组抗凝血酶III，直至NaCl浓度为3M。所用装置为Hiload色谱系统（Amersham Bioscience制造），流速为21ml/min，分离到50ml的重组人抗凝血酶III洗脱部分。当使用抗凝血酶（ATIII）试剂盒的ELISA（Affinity Biological制造）测定每一部分中人抗凝血酶III的量时，如图7所示，洗脱图上观察到大概分成三个峰，ATIII MS705和ATIII DG44显示出不同的洗脱图形。下文中，从最快洗脱出的部分开始，依次称之为峰（1）部分、峰（2）部分和峰（3）部分。下列文献中已经报道了通过肝素亲和色谱提纯抗凝血酶III时发现多个峰[如J.Biol.Chem.,268.17588（1993）；Biochem.J.,286,793（1992）；J.Biol.Chem.,264,21153（1989）等]。此外，当考查Neuart的洗脱图时，观察到其洗脱限于峰（2）部分。将对应于ATIII MS705峰（2）部分和峰（3）部分以及ATIII DG44峰（1）部分和峰（2）部分的每个主要峰部分用5mM磷酸钠缓冲液（pH7.4）使用Pericon XL（Millipore制造）和Biomax10（Millipore制造）通过透析过滤法脱盐。将每个脱盐的峰部分应用于DEAE Sepharose Fast Flow Column（Amersham制造，480m），吸收至其上。随后，用12CV的20mM磷酸钠缓冲液（pH7.4）对柱进行冲洗，然后以40ml/min的流速使用线性梯度洗脱法（8.6CV）来洗脱重组抗凝血酶III，直至NaCl浓度为1.0M。洗脱图通过其吸光度（A280nm）绘制。接下来，合并含有重组抗凝血酶III的洗脱部分，通过透析过滤法使用Pericon XL（Millipore制造）和Biomax10（Millipore制造）用PBS更换缓冲液，从而制备评价用的样品。测定样品的吸光度（A280nm）进行评价，根据A280nm1.0=0.64mg/ml来计算蛋白浓度。另外，还可以使用抗凝 血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA进行测定，确认吸光度法和ELISA法测得的浓度相同。另外，使用PAGEL SPG520L（Atto制造）进行还原SDS-PAGE。在电泳中，使用2μg被2-巯基乙醇还原的重组抗凝血酶III，通过CBB染色法进行染色。结果，在所有用于评价的样品中均未发现分子量约60kD的ATIII带之外的条带。 
4.重组抗凝血酶III中性糖和氨基糖的组成分析 
对实施例4-3中获得的评价用样品的中性糖和氨基糖组成进行分析。将每个重组抗凝血酶III评价样品在100℃下在4.0mo/1三氟乙酸的存在下水解2小时，从蛋白中释放出中性糖和氨基糖。将由此得到的糖使用DX-500糖分析仪（Dionex制造）根据Michael Weitzhandler等人的文献中所述的方法[Analytical Biochemistry,241,128-134(1996)]和DIONEX Application Note92（通过高效阴离子交换用脉冲电流检测测定糖蜜中的糖类（The Determination of Sugars in Molasses by High-Performance Anion Exchange with Pulsed Amperometric Detection））进行分析。已知来源于人血浆的抗凝血酶III的糖链结构是复合体型双链糖链，不含岩藻糖[Arch.Biochem.Biophys.,203,458（1980）]（图2）。在中性糖和氨基糖组成分析的结果分析中，计算每种单糖成分（岩藻糖、半乳糖和甘露糖）的组成比例，将N-乙酰氨基葡萄糖的组成比例视为4。分析的结果是，在ATIII DG44的糖链组成中检测到岩藻糖，而ATIII MS705糖链组成中岩藻糖的含量为检出限或更低，与来源于人血浆的抗凝血酶Neuart情况类似。另外，根据每种单糖组分的组成比例，可以得到所有样品的主要糖链结构不是高甘露糖型或杂交型，而是复合体型双链糖链。 
5.羟基磷灰石色谱分析 
根据Goran Karlsson和Stefan Winge的方法[Protein Expression and Purification,28,196-201（2003）]，通过羟基磷灰石色谱对实施例4-3中得到的评价用样品中α型和β型组成比例进行分析。结果，与来 源于人血浆的Neuart的情况类似，α型主要包含在ATIII MS705峰（2）部分和ATIII DG44峰（1）部分中。另外，α型和β型以几乎相同的比例包含在ATIII DG44峰（2）部分中。中性糖和氨基糖分析以及羟基磷灰石色谱分析的结果总结于表1。 
表1 
由于ATIII DG44在糖链中含有岩藻糖，其糖链结构不同于来源于人血浆的抗凝血酶III。另一个方面，已经发现ATIII MS705峰（2）部分和ATIII MS705峰（3）部分的糖链结构分别与来源于人血浆的α型和β型抗凝血酶III接近。另外，通过文献中[J.Biol.Chem.,268,17588（1993）]对来源于人血浆的抗凝血酶III的肝素亲和力辅助纯化法，能够分离出ATIII MS705III的α型和β型。但是，当进行相同的纯化时，不能分离ATIII DG44峰（2）部分。根据上文所述，表明ATIII MS705具有与来源于人血浆的抗凝血酶III相同的性质。 
实施例5 
对纯化的重组抗凝血酶III样品的生物活性进行比较： 
1.测定肝素解离常数 
由于抗凝血酶III分子的三维结构可以通过抗凝血酶III与肝素的结合而变化，因此可以利用构成抗凝血酶III蛋白的色氨酸残基的荧光密度的变化来测定肝素解离常数。下列方程1）是在抗凝血酶III浓度和凝血酶浓度之间建立的（Meth.Enzymol.,222,525,1993）。 
方程1） 
ΔF F 0 = Δ F max F 0 × [ AT ] 0 + n [ H ] 0 + Kd - { ( [ AT ] 0 + n [ H ] 0 + Kd ) 2 - 4 n [ AT ] 0 [ H ] 0 } 1 / 2 2 [ AT ] 0
ΔF：荧光量的变化 
ΔFmax：荧光量变化的最大值 
F0：不加入肝素时的荧光强度 
[AT]0：抗凝血酶III的浓度 
[H]0：肝素浓度 
Kd：解离常数 
n：化学计量 
通过下列方法对实施例4-3中得到的各个用肝素亲和力分离的抗凝血酶III评价样品的肝素解离常数进行测定。首先，制备含20mM Na2HPO4、0.1M NaCl、0.1mM EDTA-2H2O和0.1%PEG6000的缓冲液（pH7.4）。该缓冲液用于对样品进行稀释。将0至20当量的肝素（SIGMA制造）加入到50nM抗凝血酶III中，测定各溶液在激发波长280nm和荧光波长340nm处的荧光强度。通过分析软件GraphPad prism4（Graphpad制造）使用方程式1）来分析解离常数。实施例4-3中得到的评价用样品的肝素解离常数测量结果（Kd值，单位nM）如表2所示。当Kd值变小时，ATIII与肝素的结合强度变强。因此，ATIII MS705峰（3）部分表现出最大的结合强度，然后是ATIII MS705峰（2）部分和ATIII DG44峰（2）部分，ATIII DG44峰（1）部分表现的结合强度最弱。 
表2 
2.测定肝素辅助因子活性 
已知抗凝血酶III的凝血酶抑制率在肝素存在时大幅增加。而且，凝血酶与抗凝血酶III的结合反应在摩尔比为1:1时发生，反应后二者互相均丧失活性，因此抗凝血酶的抗凝血酶反应在肝素存在时在非常短的时间内便完成。肝素辅助因子的活性通过抗凝血酶反应完成时残余的凝血酶活性来表示，或者换句话说，肝素辅助因子活性可以度量抗凝血酶反应完成时活化抗凝血酶III的量[Zoku Iyakuhin No Kaihatsu(A Sequel to Medicines,Continued),20,185（1992）]。 
为了测定肝素辅助因子活性，首先制备由0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl和0.2%白蛋白组成的缓冲液（pH8.3）。该缓冲液用于对样品进行稀释并制备酶溶液。向抗凝血酶III溶液中加入1.0ml含有2.5单位/ml凝血酶（Enzyme Research Laboratories制造）和0.6单位/ml肝素（SIGMA制造）的酶溶液，然后在37℃下反应5分钟。随后，向其中加入100μl2.0mM S-2238（Daiichi Pure Chemicals制造）作为凝血酶的特异性底物，显色2分钟，然后用50%乙酸中止反应。残余的凝血酶活性可从反应混合物中S-2238降解形成的对硝基苯胺的吸光度（A405nm）来计算。在这种情况下，将抗凝血酶III稀释至0.15至4μg/ml的范围内用于测量。使用Neuart作为标准品来绘制标准曲线，肝素辅助因子活性计算为每单位体积（液体体积）的活性（单位/ml）。测顶实施例4-3中得到的每个评价用样品的肝素辅助因子活性，得到的活性值用每单位质量的活性（单位/g）表达，结果如图8所示。ATIII MS705的峰部分（2）和ATIII MS705的峰部分（3）表现出与来源于人血浆的制剂Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）相似的活性，而ATIII DG44峰部分（1）和ATIII DG44峰部分（2）表现出的值低于Neuart。 
3.测定不存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数 
根据文献方法测定凝血酶抑制二级速率常数（J.Biol.Chem.,277, 24460（2002））。 
不存在肝素时ATIII的凝血酶抑制反应在相对于凝血酶来说抗凝血酶III过量的条件下可以被视为接近准一级反应（pseudo-primary reaction），因此形成下列方程2）。 
方程2） 
ln[T]t=-kobs*t+ln[T]0
[T]t：t小时后的凝血酶浓度 
[T]0：起始凝血酶浓度 
kobs：准一级速率常数 
t：时间 
方程3） 
kobs=k[AT] 
k：二级速率常数 
[AT]：抗凝血酶III的浓度 
因此，为了测定凝血酶抑制二级速率常数，首先制备含有20mM Na2HPO4、0.1M NaCl、0.1mM EDTA·2H2O和0.1%PEG8000的缓冲液（pH7.4）。该缓冲液用于对样品进行稀释并制备酶溶液。制备含有100nM抗凝血酶III和10nM凝血酶的酶溶液，在25℃下反应1至40分钟。在各时间，向其中加入100μ10.15mM S-2238（Daiichi Pure Chemicals制造）作为凝血酶的特异性底物，测量吸光度（A405nm）大约2分钟。从各个时间吸光度的改变计算残余的凝血酶浓度，使用上述方程2）来计算准一级速率常数。另外，使用上述方程3）计算不存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数（单位/M/秒）。实施例4-3中得到的评价用样品的二级速率常数如表3所示。S.D.表示标准误差。就不存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数而言，ATIII DG44峰（1）部分表现稍低的数值，而所有其它的评价用样品表现出与来源于人血浆 的抗凝血酶III Neuart相似的活性。 
表3 
4.测定存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数 
根据下列文献方法测定实施例4-3中得到的评价用样品在存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数[Biochem.J.,286,793（1992）]。首先制备含有20mM Na2HPO4、0.1M NaCl、0.1mM EDTA·2H2O和0.1%PEG 8000的缓冲液（pH7.4）。该缓冲液用于对样品进行稀释并制备酶溶液。将含有0.5至1nM凝血酶和5至25pM肝素（SIGMA制造）的酶溶液加入到100nM抗凝血酶III中，然后在25℃下反应1至30分钟，然后向其中加入100μ10.15mM S-2238（Daiichi Pure Chemicals制造）作为凝血酶的特异性底物，测量吸光度（A405nm）大约2分钟。从各个时间吸光度的改变计算残余的凝血酶浓度，使用上述方程2）来计算准一级速率常数。另外，使用下列方程4）计算存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数。 
方程4） 
k obs = k * [ H ] 0 * [ AT ] 0 Kd + [ AT ] 0 + k uncat * [ AT ] 0
kobs：准一级速率常数 
k：二级速率常数 
[H]0：肝素浓度 
Kd：肝素解离常数 
[AT]0：抗凝血酶III的浓度 
Kuncat：不存在肝素时的二级速率常数 
测定实施例4-3中得到的评价用样品在存在肝素时的凝血酶抑制二级速率常数（单位/M/秒），结果如表4所示。就数值而言，例如，2.5E+07是指2.5×l07。另外，S.D.表示标准误差。就二级速率常数而言，ATIII MS705峰（2）部分和ATIII MS705峰（3）部分表现出出类似于Neuart的活性，但是ATIII DG44峰（1）部分显示出相当低的数值，ATIII DG44峰（2）部分表现出的数值也略低。根据这一结果，发现使用CHO/DG44细胞系产生的重组抗凝血酶III中含有存在肝素时抗凝血酶活性低的部分。另一方面，发现从使用FUT8基因-双敲除细胞系产生的重组抗凝血酶III得到的部分主要表现出类似于来源于人血浆的抗凝血酶III的活性。 
表4 
分析实施例4和5中的结果显示，就糖链结构和生物活性而言，与CHO/DG44细胞系产生的重组抗凝血酶III相比，FUT8基因-双敲除细胞系产生的重组抗凝血酶III是一种与来源于人血浆的抗凝血酶III具有相似特性的蛋白。这一结果显示，FUT8基因-双敲除细胞系适用于作为人血浆来源抗凝血酶III的替代物。 
实施例6 
氨基酸修饰重组抗凝血酶III在FUT8基因-双敲除细胞中的表达： 
能够表达突变型人抗凝血酶III（下文中称为“ATIIIN135Q”）的FUT8基因-双敲除细胞通过下文所示的方法制备，其中从成熟型人抗凝血酶III的N-端计数第135位上的天冬酰胺残基被谷氨酸残基取代。在这一方面，由于ATIIIN135Q组合物有3个N-结合型糖链的加成位点，所有表达的重组抗凝血酶III成为β-型。 
1.制备质粒pBS-ATIIINl35Q 
首先，为抗凝血酶III基因序列（UniGene:Hs.75599，SEQ ID NO: 1）制备两个用于定点诱变的寡DNA引物（SEQ ID NO:30和31），将从N-端计数第167位上的天冬酰胺残基替换为谷氨酸残基。使用实施例2-2中制备的pBS-ATIII作为模板，使用上述引物和Quick定点诱变试剂盒（STRATAGENE制备）对抗凝血酶III cDNA序列进行定点诱变。根据试剂盒所附手册实施该方法。使用Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN制造）从由此得到的转化体制备质粒DNA样品，其核苷酸序列使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0（Applied Biosystems制造）和DNA测序仪ABI PRISM377（Applied Biosystems制造）进行分析。结果，得到含有突变型抗凝血酶III（ATIIIN135Q）全部翻译区cDNA序列的质粒pBS-ATIIIN135Q（图6）。 
2.制备表达载体pKAN-ATIIIN135Q 
将3μg上文中制备的pBS-ATIII135Q溶解在17μl无菌水中，向其中加入10单位EcoRI（Takara Bio制造）、10单位BamHI（Takara Bio制造）和2μl10×H缓冲液，制备20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。接下来，将3μg质粒pKANTEX93（WO97/10354）溶解在17.5μl无菌水中。向溶液中加入10单位EcoRI和2μl10×H缓冲液，制成20μl反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。反应之后，进行苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀，将由此回收的质粒溶解在17.5μ1无菌水中。向溶液中进一步加入10单位BamHI和2μl10×K缓冲液，制成20μl的反应混合物，在37℃下进行16小时消化反应。对上文得到的pBS-ATIIIN135Q片段（EcoRI-BamHI）和pKANTEX93片段（EcoRI-BamHI）均进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒（QIAGEN制造）对约1.4Kb和9.0Kb的DNA片段分别进行纯化。接下来，制备20μl含50ng纯化的pBS-ATIII片段（EcoRI-BamHI）、30ng纯化的pKANTEX93片段（EcoRI-BamHI）和Ligation High（Toyobo Co.,Ltd.制造）的反应混合物，在16℃下进行16小时连接反应。使用由此得到的质粒DNA对大肠杆菌株DH5α（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行转化。使用Spin Miniprep试剂 盒（QIAGEN制造）从得到的转化体制备质粒DNA，得到用于动物细胞的突变型AT抗凝血酶III表达质粒pKAN-ATIIIN135Q（图6）。 
3.将ATIIIN135Q表达质粒导入到FUT8基因-双敲除细胞中 
将实施例6-2中制备的质粒pKAN-ATIIIN135Q稳定地导入到实施例1中制备的FUT8基因-双敲除细胞。通过下列步骤根据电穿孔法[Cytotechnology,3,133（1990）]进行基因导入。首先，制备200μl含20μl NEBuffer3（New England Biolabs制造）和100单位限制性内切核酸酶MluI（New England Biolabs制造）的反应混合物，在37℃下进行5小时消化反应，对30μg质粒pKAN-ATIIIN135Q进行线性化。反应之后，通过苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀对反应混合物进行提纯，从而回收线性质粒。接下来，将实施例1中制备的FUT8基因-双敲除细胞悬浮在K-PBS缓冲液（137mmol/1KC1、2.7mmol/1NaCl、8.1mmol/1Na2HPO4、1.5mmol/1KH2PO4、4.0mmol/1MgCl2）中，制备8×107细胞/ml的悬液。将200μl细胞悬液（1.6×106细胞）与9μg上述的线性质粒混合后，将全部体积的细胞-DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette（电极间距离2mm，BIO-RAD制造）中，使用电穿孔装置Gene Pulser II（BIO-RAD制造）在350V脉冲电压和250μF电容的条件下进行基因导入。进行基因导入后，将细胞悬液悬浮在30ml补充有10%（v/v）胎牛血清（Life Technology制造）和50μg/ml庆大霉素（Nacalai Tesque制造）的IMDM培养基（Life Technology制造）中，并以100μl/孔接种到3个贴壁细胞用的96孔板（Greiner制造）中。在5%CO2和37℃的条件下进行培养。 
4.获取MTX-耐受性细胞系 
将上一条中得到的导入pKAN-ATIIIN135Q的细胞培养6天，然后弃去培养物上清液，加入100μl/孔的补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和50nM氨甲喋呤（MTX）（SIGMA制造）的IMDM培养基。继续培养9天，其间每3至4天重复一次该培养基更换。接下来，继续培养18天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、 50μg/ml庆大霉素和200nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，将最终形成的集落接种到24孔板（SIGMA制造）中。随后，继续培养19天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，任选地扩大培养，从而得到500nM MTX耐受性转化体。 
5.选择ATIIIN135Q高产细胞系 
从上一条中得到的几种500nM MTX-耐受性细胞系中每一个中收集1.5×106细胞，并将其悬浮在5ml补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基中，然后接种到组织培养瓶（Greiner制造）中培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用用抗凝血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA测定上清液中所含ATIIIN135Q的量，选择高产细胞系。根据ELISA试剂盒所附的说明书实施该方法，并使用Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）作为标准制剂。 
6.自然化至无血清培养基 
将上一条中制备的表达ATIIIN135Q的FUT8基因双敲除细胞系以实施例4-1中的相同方式自然化至无血清培养基。将细胞系悬浮在15ml实施例4-1中所述的无血清培养基中，达到5×105细胞/ml的密度，并将其接种到125ml圆锥瓶(Corning制造)中进行分批培养。在35℃下进行培养，旋转速度为90至100rpm，当进行传代时，通过将含5％CO2的空气吹至培养基的表面来更换锥形瓶中的空气，吹入空气的体积为培养容器体积的4倍或更多。三天之后，更换培养基，在第6天以5×105细胞/ml的接种密度进行传代。之后的2周，每隔3至4天重复一次传代，将细胞自然化至无血清培养基中。通过这种培养，得到可以在无血清培养基中生长并不会引起聚集的细胞系pKAN-ATIIIN135QAFMS705。将由此获得的每个细胞系悬浮在15ml无血清培养基中，达到3.0×105细胞/ml的密度，将其接种到125ml培养瓶中进行培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用抗凝血酶(ATIII)试剂盒(Affinity  Biological制造)的ELISA测定上清液中所含重组抗凝血酶III的量，确认其以培养物上清液中6μg/ml的浓度得以表达。在这一方面，细胞系pKAN-ATIIIN135Q AFMS705细胞系以细胞系名称pKAN-ATIIIN135Q AFMS705于2004年8月10日保藏在专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi，茨城，日本，其保藏号为FERM BP-10089。 
之后，根据实施例4中描述的方法获取具有其中还原末端N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的复合体型糖链结构的突变型重组抗凝血酶III，并确认复合体型N-糖苷连接糖链的数目为3。此外，根据实施例5中所述方法对抗凝血酶III的生物活性进行测定，结果确认，其肝素解离常数显著低于CHO/DG44细胞表达的突变型重组抗凝血酶III，而肝素辅助因子活性和凝血酶抑制二级速率常数则显著高于后者。 
实施例7 
获取不表达能够将GDP-甘露糖催化脱氢成GDP-4-酮-6-脱氧-GDP-甘露糖的酶的基因的细胞系： 
1.获取凝集素耐受性CHO/DG44细胞系 
使用贴壁细胞用的75cm2培养瓶（Greiner制造），将CHO/DG44细胞（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216（1980））在IMDM-FBS(10)-HT(1)培养基[含10%胎牛血清（FBS）（Invitrogen制造）和1×浓度HT添加物（Invitrogen制造）的IMDM培养基（Invitrogen制造）]中培养，使其增殖，直至恰好在汇合期前。用5ml Dulbecco PBS（下文中称为PBS）（Invitrogen制造）对细胞进行冲洗后，向其中加入1.5ml用PBS稀释的0.05%胰蛋白酶（Invitrogen制造），使细胞在下37℃保持5分钟，将其从培养容器底部剥离掉。通过离心操作回收剥落的细胞，该操作通常在细胞培养过程中进行，加入IMDM-FBS(10)-HT(1)培养基使细胞悬浮，达到1×l05细胞/ml的密度， 然后向其中加入或者不向其中加入0.1μg/ml烷基化试剂MNNG（SIGMA制造）。使细胞在CO2培养箱（TABAI制造）中在37℃下保持3天，以上文所述的相似方式，弃去培养物上清液，冲洗、剥离和回收细胞，并将其悬浮在IMDM-FBS(10)-HT(1)培养基中，然后将其以1,000细胞/孔的密度接种在贴壁培养用的96孔板（Asahi Techno Glass制造）中。向每孔中加入1mg/ml扁豆（Lens culinaris）凝集素（下文中称为LCA，Vector制造）作为培养基的最终浓度。在CO2培养箱中在37℃下培养2周后，得到由此形成的集落作为凝集素耐受性CHO/DG44细胞系。 
2.测定所得凝集素耐受性CHO/DG44细胞系的GDP-甘露糖4,6-脱水酶mRNA 
通过下列方式使用RT-PCR法对上一条中得到的每个凝集素耐受性CHO/DG44细胞系中能够将GDP-甘露糖催化脱氢转变成GDP-4-酮-6-脱氧-GDP-甘露糖的酶GDP-甘露糖4,6-脱水酶的表达量进行分析。 
（1）从凝集素耐受性CHO/DG44细胞系制备RNA，并制备单链cDNA 
使用RNeasy Protect Mini试剂盒（QIAGEN制造）根据所附说明书，分别从亲代细胞系CHO/DG44细胞和本实施例1中得到的每种凝集素耐受性CHO/DG44细胞系的1×107细胞中制备RNA样品。随后，使用用于RT-PCR的SUPER SCRIPT First-Strand合成系统（Invitrogen制造）根据所附说明书，在20μl反应混合物中从5μg每种RNA合成单链cDNA。 
（2）使用RT-PCR分析β-肌动蛋白基因的表达量 
为了检验上一条（1）中制备的来源于各细胞系的单链cDNA样品的性质，通过下列方式对β-肌动蛋白cDNA的PCR扩增进行考查。 
制备20μl含有0.5μ1上文（1）中制备的来源于各细胞系的每个 单链cDNA样品作为模板的反应混合物[1×EX Taq缓冲液（Takara Shuzo制造）、0.2mM dNTPs、0.5单位EX Taq聚合酶（Takara Shuzo制造）和0.5μM SEQ ID NO:32和33的合成寡DNA引物]，然后将反应混合物在94℃下加热5分钟，然后使用DNA Thermal Cycler480（Perkin Elmer制造）进行14次反应循环，每次循环由在94℃下反应1分钟和在68℃下反应2分钟组成。对得到的10μl PCR反应混合物进行琼脂糖电泳之后，使用Cyber Green（BMA制造）对DNA片段进行染色，然后使用Fluor Imager SI（Molecular Dynamics制造）测定预期的大约800bp DNA片段的量。结果，使用来源于每种细胞系的单链cDNA均能够检测到水平相似的β-肌动蛋白表达。 
（3）使用RT-PCR法分析GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因的表达量 
接下来，对上一条（1）中得到的各个凝集素耐受性CHO/DG44细胞系中的GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因的表达量进行分析。为了通过PCR扩增GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因的cDNA，从SEQ ID NO:38所示、来源于CHO细胞的GDP-甘露糖4,6-脱水酶的cDNA序列制备具有SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的26聚体的合成寡DNA引物以及具有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的28聚体的合成寡DNA引物。随后，制备20μl含有0.5μ1上文（1）中制备的来源于各细胞系的每个单链cDNA样品作为模板的反应混合物[1×EX Taq缓冲液（Takara Shuzo制造）、0.2mM dNTP混合物、0.5单位EX Taq聚合酶（Takara Shuzo制造）和0.5μM SEQ ID NO:32和33的合成寡DNA引物]，将反应混合物在94℃下加热5分钟，然后使用DNA Thermal Cycler480（Perkin Elmer制造）进行30次反应循环，每次循环由在94℃下反应1分钟和在68℃下反应2分钟组成。对得到的10μl PCR反应混合物进行琼脂糖电泳之后，使用Cyber Green（BMA制造）对DNA片段进行染色，然后使用Fluor Imager SI（Molecular Dynamics制造）测定预期的大约430bp DNA片段的量。结果，在得到的凝集素耐受性CHO/DG44细胞系中存在有其中未观察到GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因表达的细胞系。将其中未观察到GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因表达的细胞系命名为细胞 系CHO SM。在这一方面，在考查由此得到的细胞系CHO SM对多种凝集素的耐受性时，细胞系CHO SM也显示了对与LCA识别相同糖链结构的凝集素的耐受性，所述的凝集素即为其它识别其中N-糖苷连接糖链中的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖残基的6-位通过α-键结合有岩藻糖1-位的糖链结构的凝集素。具体地说，它显示出对补充有最终浓度为1mg/ml豌豆（Pisum sativum）凝集素（下文中称为PSA，Vector制造）的培养基或者补充有最终浓度为1mg/ml橙黄网胞盘菌（Aleuria aurantia）凝集素（下文中称为AAL，Vector制造）的培养基的耐受性。 
3.对不表达能够将GDP-甘露糖催化脱氢转变成GDP-4-酮-6-脱氧-GDP-甘露糖的酶的基因的细胞系进行基因组分析 
使用贴壁培养用的T75培养瓶（Greiner制造），将上文得到的各个CHO/DG44细胞和CHO SM细胞系在IMDM-FBS(10)-HT(1)培养基中培养，直至恰好在汇合期前，然后根据文献所述的方法[Nucleic Acid Research,3,2303（1976）]制备基因组DNA，将由此得到的基因组DNA在300μl TE-RNase缓冲液（pH8.0）[10mmol/1Tris-HC1、1mmol/1EDTA、200μg/1RNase A]中溶解过夜。将上述制备的12μg基因组DNA分别用三种不同的限制性内切核酸酶EcoRI（Takara Shuzo制造）、HindIII（Takara Shuzo制造）和BglII（Talcara Shuzo制造）消化后，使用乙醇沉淀法回收DNA片段，然后将其溶解在20μl TE缓冲液（pH8.0）[10mmol/1Tris-HC1、1mmol/1EDTA]中，对其进行0.8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳。电泳之后，根据文献所述的方法将基因组DNA片段转移到尼龙膜上[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,3683（1979）]。转移后，在80℃下对尼龙膜进行2小时热处理。接下来，为了检验转移至尼龙膜上的基因组DNA的性质，使用被认为普遍存在于每种细胞系基因组中的α1,6-岩藻糖基转移酶（FUT8）基因作为探针进行DNA杂交。检测FUT8基因用的探针可以用下列方式制备。首先，将10μg含有WO02/31140实施例11所述小鼠FUT8 cDNA的质粒mfFUT8-pCR2.1溶解在50μl M缓冲液（Takara Shuzo制造）中，用限制性内切核酸酶HindIII（Takara Shuzo制造）消化过夜，然后用H缓冲液（Takara Shuzo 制造）更换反应混合物，并用限制性内切核酸酶EcoRI（Takara Shuzo制造）进一步消化过夜。反应结束后，对反应混合物进行2%琼脂糖电泳，纯化含FUT8外显子2的156bp EcoRI-HindIII片段。使用1.75MBq[α-32P]dCTP和Megaprime DNA标记系统dCTP（Amersham Pharmacia Biotech制造）对一部分由此得到的DNA片段25ng进行放射性标记。接下来，以下列方式进行杂交。首先，将上述尼龙膜密封在滚瓶中，加入15ml杂交溶液[4×SSPE、50×Denhaldt's溶液、0.5%（w/v）SDS、0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，在65℃下进行3小时预杂交。接下来，对32P-标记的探针DNA进行热变性处理，将其装入瓶中，在65℃下加热过夜。杂交之后，将尼龙膜浸在50ml2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。重复2次上述洗涤步骤后，将尼龙膜浸在50ml0.2×SSC-0.1%（w/v）SDS中，并在65℃下加热15分钟。洗涤之后，将尼龙膜在-80℃下在X-光胶片上曝光两晚进行显影。显影之后，将尼龙膜在剥离溶液（stripping solution）[1%SDS、0.1×SSC]中煮沸以释放探针，并将其再次与不同的探针杂交。通过上述方法，在细胞系CHO/DG44和细胞系CHO SM中每一个的基因组DNA中均检测到对FUT8基因外显子2具有特异性的片段。上述结果显示，转移在尼龙膜上的来源于细胞系CHO SM和细胞系CHO/DG44的基因组DNA样品具有相同的性质。 
另一方面，以下列方式制备对GMD基因外显子5有特异性的探针。首先，根据常规已知的人GMD基因组DNA序列（NCBI登记号No.NT-034880）设计特异性结合外显子5的寡DNA引物（SEQ ID NO:36和37）。该区域对应于SEQ ID NO:39所示人GMD cDNA序列的核苷酸346号至核苷酸538号的区域。接下来，制备100μl含10ng WO02/31140实施例15所述质粒pAGE249GMD的反应混合物[ExTaq缓冲液（Takara Shuzo Co.,Ltd.制造）、0.2mmol/1dNTPs、0.5μmol/1上述基因特异性引物（SEQ ID NO:36和37）]，进行聚合酶链式反应（PCR）。在94℃下加热5分钟，进行30次PCR循环，每次循环由在94℃下反应1分钟、在58℃下反应2分钟和在72℃下反应3分钟 组成。PCR之后，对反应混合物进行2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，纯化大约200bp的DNA片段。接下来，使用1.75MBq[α-32P]dCTP和Megaprime DNA标记系统dCTP（Amersham Bioscience制造）对25ng由此得到的DNA片段进行放射性标记。使用探针在上述尼龙膜上进行杂交。结果，在来源于CHO/DG44细胞的基因组DNA中发现有对GMD基因外显子5有特异性的片段，而在来源于细胞系CHO SM的基因组DNA中没有检测到对GMD基因外显子5有特异性的片段。上述结果显示，细胞系CHO SM是一种其中编码GMD的基因组区当中至少含外显子5的区域被缺失的GMD敲除细胞。 
实施例8 
重组抗凝血酶III在细胞系CHO SM中的表达： 
1.将ATIII表达质粒导入细胞系CHO SM 
将实施例2-3中制备的质粒pKAN-ATIII稳定地导入实施例7中制备的细胞系CHO SM。通过下列步骤根据常规已知的电穿孔法[Cytotechnology,3,133（1990）]进行基因导入。首先，制备200μl含20μl NEBuffer3（New England Biolabs制造）和100单位限制性内切核酸酶MluI（New England Biolabs制造）的反应混合物，在37℃下消化16小时，对30μg质粒pKAN-ATIII进行线性化。反应之后，通过苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀对反应混合物进行提纯，从而回收线性质粒。接下来，将实施例7中得到的细胞系CHO SM悬浮在K-PBS缓冲液（137mmol/1KC1、2.7mmol/1NaCl、8.1mmol/1Na2HPO4、1.5mmol/1KH2PO4、4.0mmol/1MgCl2）中，制备8×107细胞/ml的悬液。将200μl细胞悬液（1.6×106细胞）与9μg上述的线性质粒混合后，将全部体积的细胞-DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette（电极间距离2mm，BIO-RAD制造）中，使用电穿孔装置Gene Pulser II（BIO-RAD制造）在350V脉冲电压和250μF电容的条件下进行基因导入。进行基因导入后，将细胞悬液悬浮在30ml补充有10%（v/v）胎牛血清（Life Technology制造）和50μg/ml庆大霉素（Nacalai Tesque制造）的IMDM培养基（Life Technology制造）中，并以100μl/孔接种到3个贴壁细 胞用的96孔板（Greiner制造）中。在5%CO2和37℃的条件下进行培养。 
2.获取MTX-耐受性细胞系 
将上文得到的导入pKAN-ATIII的细胞培养6天，然后弃去培养物上清液，以100μl/孔加入补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和50nM氨甲喋呤（MTX）（SIGMA制造）的IMDM培养基。继续培养9天，其间每3至4天重复一次该培养基更换。接下来，继续培养18天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和200nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，将最终形成的集落接种到24孔板（SIGMA制造）中。随后，继续培养19天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，任选地扩大该过程，从而得到500nM MTX耐受性转化体。 
3.选择抗凝血酶III高产细胞系 
从上一条中得到的几种500nM MTX-耐受性细胞系中每一个中收集1.5×106细胞，并将其悬浮在5ml补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基中，然后接种到T25培养瓶中进行培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用用抗凝血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA测定上清液中所含ATIII的量。结果，确认重组人抗凝血酶III在培养物上清液中以513ng/ml的浓度得以表达，该转化体命名为pKAN-ATIII l GMDKO。 
之后，根据实施例4所述的方法获取具有其中还原末端N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的糖链结构的重组抗凝血酶III。此外，根据实施例5中所述方法对抗凝血酶III的生物活性进行测定，确认GMD敲除细胞中表达的重组抗凝血酶的肝素解离常数显著低于CHO/DG44细胞表达的重组抗凝血酶III，其肝素辅助因子活性和凝血酶抑制二级速率常数而则显著高于后者。 
实施例9 
氨基酸修饰重组抗凝血酶III在细胞系CHO SM中的表达： 
1.将ATIIIN135Q表达质粒导入到细胞系CHO SM中 
将实施例6-2中制备的质粒pKAN-ATIIIN135Q稳定地导入到实施例7中制备的细胞系CHO SM。通过下列步骤根据常规已知的电穿孔法[Cytotechnology,3,133（1990）]进行基因导入。首先，制备200μl含20μl NEBuffer3（New England Biolabs制造）和100单位限制性内切核酸酶MluI（New England Biolabs制造）的反应混合物，在37℃下消化16小时，对30μg质粒pKAN-ATIIIN135Q进行线性化。反应之后，通过苯酚/氯仿提取处理和乙醇沉淀对反应混合物进行提纯，从而回收线性质粒。接下来，将实施例7中制备的细胞系CHO SM悬浮在K-PBS缓冲液（137mmol/1KC1、2.7mmol/1NaCl、8.1mmol/1Na2HPO4、1.5mmol/1KH2PO4、4.0mmol/1MgCl2）中，制备8×107细胞/ml的悬液。将200μl细胞悬液（1.6×106细胞）与9μg上述的线性质粒混合后，将全部体积的细胞-DNA混合物转移至Gene Pulser Cuvette（电极间距离2mm，BIO-RAD制造）中，使用电穿孔装置Gene Pulser II（BIO-RAD制造）在350V脉冲电压和250μF电容的条件下进行基因导入。进行基因导入后，将细胞悬液悬浮在30ml补充有10%胎牛血清（Life Technology制造）和50μg/ml庆大霉素（Nacalai Tesque制造）的IMDM培养基（Life Technology制造）中，并以100μl/孔接种到3个贴壁细胞用的96孔板（Greiner制造）中。在5%CO2和37℃的条件下进行培养。 
2.获取MTX-耐受性细胞系 
将上文得到的导入pKAN-ATIIIN135Q的细胞培养6天，然后弃去培养物上清液，以100μl/孔加入补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和50nM氨甲喋呤（MTX）（SIGMA制造）的IMDM培养基。继续培养9天，其间每3至4天重复一次该培养基更换。接下来，继续培养18天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml 庆大霉素和200nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，将最终形成的集落接种到24孔板（SIGMA制造）中。随后，继续培养19天，其间每3至4天用补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基更换一次培养液，任选地扩大该过程，从而得到500nM MTX耐受性转化体。 
3.选择抗凝血酶IIIN135Q高产细胞系 
从上一条中得到的几种500nM MTX-耐受性细胞系中每一个中收集1.0×106细胞，并将其悬浮在5ml补充有10%透析胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和500nM MTX的IMDM培养基中，然后接种到T25培养瓶中进行培养。培养3天后，回收培养物上清液，使用抗凝血酶（ATIII）试剂盒（Affinity Biological制造）的ELISA测定上清液中所含ATIIIN135Q的量，确定高产细胞系。根据ELISA试剂盒所附手册实施该方法，并使用Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）作为标准制剂。结果，确认人抗凝血酶III在由此得到的表达抗凝血酶III的细胞系的培养物上清液中以45.4ng/ml的浓度得以表达，该转化体命名为细胞系pKAN-ATIIIN135Q GMDKO。 
之后，根据实施例4所述的方法获取具有其中还原末端N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的糖链结构的突变型重组抗凝血酶III，并确认N-糖苷连接型糖链的数目为3。此外，根据实施例5中所述方法对抗凝血酶III的生物活性进行测定，确认GMDKO细胞中表达的突变型重组抗凝血酶III的肝素解离常数显著低于CHO/DG44细胞表达的突变型重组抗凝血酶III，其肝素辅助因子活性和凝血酶抑制二级速率常数而则显著高于后者。 
实例10 
重组抗凝血酶III在酵母中的表达： 
尽管已知许多种酵母，但是毕赤（Pichia）属和酵母（Saccharomyces）属酵母可以作为典型的常用于表达重组蛋白的宿主 的例子。通常，已知被添加在这些酵母表达的重组蛋白上的N-糖苷连接型糖链的主要结构是高甘露糖型糖链，其中在还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，在非还原末端的分支区域有9至数十个甘露糖残基和几个至10个以上的甘露糖6-磷酸盐残基（Yeast,19,1191（2002））。另外，具有这种结构的高甘露糖型（high mannose tpye）糖链常常被称为高甘露糖型（hyper mannose type）糖链。 
在下述实例中，首先描述能够表达抗凝血酶III的毕赤（Pichia）株和酵母（Saccharomyces）株的制备方法，所述的抗凝血酶III上连接有具有高甘露糖型糖链和复合体型糖链中间结构的杂合型糖链作为N连接型糖链。 
1.制备其中基因组PNO1酶基因被破坏的毕赤酵母菌株 
使用毕赤酵母菌株如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GTS115（Invitrogen制造）的基因组DNA作为模板，通过PCR对毕赤酵母PNO1（N-连接寡糖1的磷酸甘露糖基化）基因（GenBank登记号：AB099514）翻译区的全部序列进行扩增。将由此扩增的大约3,200bp的PNO 1基因序列在用来源于酵母的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶（URA3）基因（GeaBank登记号：AF321098）替换其5’-末端部分序列后，插入到载体如pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen制造）中，制备用于PNO 1基因破坏的质粒。接下来，使用限制性内切核酸酶对100μg该质粒进行线性化，然后使用Pichia表达试剂盒（Invitrogen制造）中所述的电穿孔法将其稳定地导入毕赤酵母如GTS 115。接下来，使用尿嘧啶缺失YPD培养基（Invitrogen制造）将导入基因的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取基因组DNA。随后，使用该基因组DNA作为模板通过PCR对酵母PNO 1基因座的序列进行扩增，选择其中PNO 1基因座被同源重组破坏的酵母克隆。通过上述方法，可以将毕赤酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基、其结构中非还原末端上结合有9至几十个甘露糖残基的高甘露糖型糖链。 
2.制备其中基因组α-1,6-甘露糖基转移酶基因被破坏的毕赤酵母菌株 
使用毕赤酵母菌株如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33（Invitrogen制造）的基因组DNA作为模板，通过PCR对毕赤酵母的α-1,6-甘露糖基转移酶（OCH 1）基因（GenBank登记号：AF540063）进行扩增。将由此扩增的大约2,800bp的OCH1基因序列在用来源于酵母的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶（URA 3）基因（GeaBank登记号：AF321098）替换其5’-末端部分序列后，插入到载体如pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen制造）中，制备用于OCH 1基因破坏的质粒。接下来，使用限制性内切核酸酶SfiI（New England Biolabs制造）对100μg该质粒进行线性化，然后使用Pichia表达试剂盒（Invitrogen制造）中所述的电穿孔法将其稳定地导入毕赤酵母株，如上一条所述的PNO 1基因被破坏的菌株或者巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株JC308。接下来，使用尿嘧啶缺失YPD培养基（Invitrogen制造）将导入基因的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取基因组DNA。随后，使用该基因组DNA作为模板通过PCR对酵母OCH 1基因座的序列进行扩增，选择其中OCH 1基因座被同源重组破坏的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将毕赤酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基、其结构中非还原末端上结合有8个甘露糖残基的Man8型高甘露糖型糖链。 
3.制备导入重组嵌合α-1,2-甘露糖苷酶基因的毕赤酵母菌株 
使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN制造）从线虫（秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans））中提取总RNA，然后使用该RNA作为模板使用SuperscriptTM first-strand cDNA合成试剂盒（Invitrogen制造）制备第一链cDNA。接下来，使用该cDNA作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码线虫α-1,2-甘露糖苷酶（GenBank登记号：NM-073594）活性结构域的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母α-甘露糖苷酶（MNS 1）基因（GenBank登记号：M63598）前导肽的cDNA序列在5’-末端连接后插入到载体如用于酵母的表达载体pPICZ（Invitrogen制造）中，从而制备在酵母内质网中表达α-1,2-甘露糖苷酶的载体。接下来，将该载体通过电穿孔稳定地导入到上述PNO1基因和OCH1基因均被同源重组破坏的毕赤酵母菌株中。使用缺少尿嘧啶、含有zeosine（Inyitrogen制造）的YPD培养基（Invitrogen制造）将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。接下来，使用从该总RNA制备的第一链cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组嵌合α-1,2-甘露糖苷酶表达的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将毕赤酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基、其结构中非还原末端上结合有5个甘露糖残基的Man5型高甘露糖型糖链。 
4.制备导入重组UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运基因的毕赤酵母菌株 
使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN制造）从酵母（乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis））中提取总RNA，然后使用该RNA作为模板使用SuperscriptTM first-strand cDNA合成试剂盒（Invitrogen制造）制备cDNA。接下来，使用该cDNA作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码酵母UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子（GenBank登记号：AF106080）全部翻译区的cDNA进行特异性扩增。接下来，将由此扩增的大约3,700bp的cDNA插入到位于载体如用于酵母的表达载体pPIC3.5K（Invitrogen制造）的乙醇加氧酶启动子序列下游的限制性内切核酸酶EcoRI切割位点和NotI切割位点之间，从而制备可以在酵母高尔基体内表达UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子的载体。接下来，将该载体通过电穿孔稳定地导入到上文所述的导入α-1,2-甘露糖苷酶基因的毕赤酵母菌株中。使用含试剂G418（Nacalai Tesque制造）的YPD培养基将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。之后，使用从该总RNA制备的cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组UDP-N-乙酰氨基葡萄 糖转运子表达的酵母克隆菌株。 
5.制备导入重组嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶-I基因的毕赤酵母菌株 
使用人肝脏cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码N-乙酰葡糖胺转移酶-I（GenBank登记号：M55621）活性结构域的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到位于载体如用于酵母的表达载体pAUR123（Takara Bio制造）的乙醇加氧酶启动子序列下游的限制性内切核酸酶KpnI切割位点和XbaI切割位点之间，从而制备在酵母高尔基体内表达N-乙酰葡糖胺转移酶-I的载体。接下来，将该载体根据表达载体pAUR123所附手册中所述的醋酸锂法导入到上文所述的导入UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运基因的毕赤酵母菌株中。使用含有试剂aurobrassidin A（Takara Bio制造）的YPD培养基将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。接下来，使用从该总RNA制备的cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组N-乙酰葡糖胺转移酶的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将毕赤酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成具有下列结构的杂合型糖链：其中Man5型高甘露糖型糖链的非还原末端上连接有一个N-乙酰氨基葡萄糖残基，所述的Man5型高甘露糖型糖链在还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，在非还原末端上具有5个甘露糖残基。 
因此，已经描述了主要表达杂合型糖链，即高甘露糖型糖链和复合体型糖链的中间结构作为N-糖苷连接型糖链的毕赤酵母菌株的制备方法。除了上述的毕赤菌株之外，酵母属（Saccharomyces）酵母也是经常用作表达重组蛋白的酵母的例子。以下描述主要表达杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的酵母属酵母菌株的制备方法。 
6.制备其中基因组α-1,6-甘露糖基转移酶基因和α-1,3-甘露糖基转移酶基因被破坏的酵母属（Saccharomyces）酵母菌株 
根据Nakayama等人的方法（EMBO Journal,11,2511（1992）），选择其中OCH1基因座被同源重组破坏的酵母克隆。根据Sherman等人（Methods in Enzymology,194,21（1991））的方法，从其中OCH 1基因座被破坏的酵母属酵母菌株诱导单倍体细胞，然后将其与其中α-1,3-甘露糖基转移酶（MNN 1）基因被破坏的突变酵母菌株LB1-10B（University of Califonia）的单倍体细胞混合，然后在缺氮条件下培养，形成二倍体合子。接下来，将由此得到的合子使用缺少尿嘧啶和亮氨酸的YPD培养基在室温下培养，从每个成熟集落中提取基因组DNA。随后，使用该基因组DNA作为模板，通过PCR对酵母OCH 1基因座（GenBank登记号：AF540063）序列和MNN 1基因座（GenBank登记号：AF540063L23753）序列分别进行扩增，选择其中OCH 1基因座和MNN 1基因座均被破坏的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将酵母属酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基、其结构中非还原末端上结合有8个甘露糖残基的Man8型高甘露糖型糖链。 
7.制备导入重组嵌合α-1,2-甘露糖苷酶基因的酵母属酵母菌株 
使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN制造）从真菌（Aspergillus saitoi）中提取总RNA，然后使用该RNA作为模板使用SuperscriptTMfirst-strand cDNA合成试剂盒（Invitrogen制造）制备cDNA。接下来，使用该cDNA作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码真菌α-1,2-甘露糖苷酶（GenBank登记号：D49827）的全部翻译区的cDNA进行特异性扩增。将酵母内质网特异性信号肽（EMBO Journal.,7,913（1988），即编码组氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸的cDNA序列和翻译终止密码子连接到由此扩增的大约1,500bp的其翻译终止密码子已经被除去的cDNA的3’末端上后，将其插入到载体如用于酵母的表达载体pPICZ（Invitrogen制造）或类似物中，从而制备在酵母内质网中表达α-1,2-甘露糖苷酶的载体。接下来， 将该载体通过电穿孔导入到上述α-1,6甘露糖基转移酶基因和α-1,3甘露糖基转移酶基因均被破坏的酵母属酵母菌株中。使用缺少尿嘧啶、含有zeosine（Invitrogen制造）的YPD培养基（Invitrogen制造）将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。接下来，使用从该总RNA制备的cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组嵌合α-1,2-甘露糖苷酶表达的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将酵母属酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基、其结构中非还原末端上结合有5个甘露糖残基的Man5型高甘露糖型糖链。 
4.制备导入重组UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运基因的酵母属酵母菌株 
使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN制造）从酵母（乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis））中提取总RNA，然后使用该RNA作为模板使用SuperscriptTM first-strand cDNA合成试剂盒（Invitrogen制造）制备cDNA。接下来，使用该cDNA作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码酵母UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子（GenBank登记号：AF106080）全部翻译区的cDNA进行特异性扩增。接下来，将由此扩增的大约3,700bp的cDNA插入到位于载体如用于酵母的表达载体pPIC3.5K（Invitrogen制造）的乙醇加氧酶启动子序列下游的限制性内切核酸酶EcoRI切割位点和NotI切割位点之间，从而制备可以在酵母高尔基体内表达UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子的载体。接下来，将该载体通过电穿孔稳定地导入到上文所述的导入α-1,2-甘露糖苷酶基因的酵母属菌株中。使用含试剂G418（Nacalai Tesque制造）的YPD培养基将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。之后，使用从该总RNA制备的cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子表达的酵母克隆菌株。 
5.制备导入重组嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶基因的酵母属酵母菌 株 
使用人肝脏cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码N-乙酰葡糖胺转移酶-I（GenBank登记号：M55621）活性结构域的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到位于载体如用于酵母的表达载体pAUR123（TakaraBio制造）的乙醇加氧酶启动子序列下游的限制性内切核酸酶KpnI切割位点和XbaI切割位点之间，从而制备在酵母高尔基体内表达N-乙酰葡糖胺转移酶-I的载体。接下来，将该载体根据表达载体pAUR123所附手册中所述的醋酸锂法导入到上文所述的导入UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运基因的酵母属酵母菌株中。使用含有试剂aurobrassidin A（Takara Bio制造）的YPD培养基将导入基因后的酵母在室温下培养，从每个成熟集落中提取总DNA。接下来，使用从该总RNA制备的cDNA作为模板进行PCR，选择其中发现有重组N-乙酰葡糖胺转移酶-I表达的酵母克隆菌株。通过上述方法，可以将酵母属酵母表达的N-糖苷连接型糖链的主要结构修饰成具有下列结构的杂合型糖链：其中Man5型高甘露糖型糖链的非还原末端上连接有一个N-乙酰氨基葡萄糖残基，所述的Man5型高甘露糖型糖链在还原末端的核心残基中具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，在非还原末端上具有5个甘露糖残基。 
因此，已经描述了主要表达其中Man5型高甘露糖型糖链的非还原末端上连接有一个N-乙酰氨基葡萄糖残基的杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的毕赤酵母菌株或酵母属酵母菌株的制备方法。以下描述主要具有杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的制备方法。 
10.制备重组人抗凝血酶III表达载体 
根据Yamauchi等人的方法（Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,56,600（1992）），使用人肝脏cDNA（Clontech制造） 作为模板，KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）作为扩增酶，对编码全长成熟型人抗凝血酶III的cDNA进行特异性扩增。之后，将由此得到的cDNA插入到位于载体如用于酵母的表达载体pPIC6α（Invitrogen制造）的乙醇加氧酶启动子序列下游的限制性内切核酸酶切割位点ClaI和XbaI切割位点之间，从而制备表达和分泌成熟型人抗凝血酶III的载体pPIC6α/hATIII。 
11.制备导入重组人抗凝血酶III基因的酵母菌株 
用限制性内切核酸酶SalI（New England Biolabs制造）消化HIS4基因内部，将得到的片段进行苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，从100μg上文所述的表达和分泌成熟型人抗凝血酶III的载体pPIC6α/hATIII制备线性化载体。接下来，根据Mochizuki等人（Protein Expression and Purification,23,55（2001））的方法，将该线性化抗凝血酶III表达载体通过醋酸锂法导入到毕赤酵母菌株或酵母属酵母菌株中，所述的毕赤酵母菌株能够主要表达如上文本实例第5条中所述的杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链，所述的酵母属酵母菌株能够主要表达如上文本实例第9条中所述的杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链。使用含试剂杀稻瘟菌素（blasticidin）（Invitrogen制造）的YPD培养基（Invitrogen制造）将导入基因后的酵母在室温下培养，得到耐受性集落。接下来，将各个杀稻瘟菌素耐受性集落接种到液体YPD培养基（Invitrogen制造）中，在30℃下进行24小时或更长时间的分批培养。使用来源于人血浆来源抗凝血酶III药物制剂Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）或类似物作为标准物质，采用人抗凝血酶III ELISA试剂盒（Affinity Biologicals制造）对培养后得到的培养物上清液进行分析。通过该分析，可以检测到培养物上清液中所含的重组人抗凝血酶III并对其浓度进行测定。这种分泌到酵母培养物上清液中、具有不含有岩藻糖作为N-糖苷连接型糖链的杂合型糖链的重组抗凝血酶III可以通过实施例4中所述的方法进行纯化。此外，纯化的抗凝血酶III蛋白的糖链结构可以通过实施例4所述的方法进行分析。 
因此，已经描述了主要具有不含岩藻糖作为N-糖苷连接型糖链的杂合型糖链的重组人抗凝血酶III可以使用下列宿主制备：主要表达其中Man5型高甘露糖型糖链的非还原末端上连接有一个N-乙酰氨基葡萄糖残基的杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的毕赤酵母菌株，或者以相同方式修饰的酵母属酵母菌株。接下来，下文描述使用这种表达主要具有杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株，制备表达主要具有复合型双链糖链作为不含岩藻糖的N-连接性糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株的方法。 
12.制备导入重组嵌合α-甘露糖苷酶II基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码α-甘露糖苷酶II活性结构域（GenBank登记号：U31520）的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达α-甘露糖苷酶II的载体。接下来，将该载体稳定地导入到上文本实施例第11条中所述的酵母菌株中，所述的酵母菌株表达主要具有杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认嵌合α-甘露糖苷酶II的表达。 
13.制备导入重组嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶-II基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码N-乙酰葡糖胺转移酶-II活性结构域（GenBank登记号：U15128）的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达N-乙酰葡糖胺转移酶-II的载体。 接下来，将该载体稳定地导入到上一条所述得到的酵母菌株中，上一条中已经将嵌合α-甘露糖苷酶II稳定地导入表达主要具有杂合型糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶-II的表达。通过上述方法，可以将稳定导入嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶-II的酵母菌株表达的基因重组抗凝血酶III所具有的N连接型糖链的主要结构修饰成下列复合体型双链糖链：其不含岩藻糖，在还原末端核心区具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，其结构中非还原末端通过双分支结构结合有3个甘露糖残基，2个非还原末端的每一个上均连有1个N-乙酰氨基葡萄糖残基。 
14.制备导入重组UDP-半乳糖转运基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码UDP-半乳糖转运子（GenBank登记号：AB042425）全部翻译区的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达的UDP-半乳糖转运子的载体。接下来，将该载体稳定地导入到上文所述的酵母菌株中，所述的酵母菌株表达主要具有不成熟复合体型双触角糖链的重组人抗凝血酶III。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认UDP-半乳糖转运子的表达。 
15.制备导入重组嵌合β-1,4-半乳糖基转移酶基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码β-l,4-半乳糖转移酶（GenBank登记号：M22921）的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达β-l,4-半乳糖转移酶的载体。接下来，将 该载体稳定地导入到上一条所述得到的酵母菌株中，上一条中已经将嵌合β-l,4-半乳糖转移酶稳定地导入表达主要具有不成熟复合体型双触角糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株中。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认嵌合β-l,4-半乳糖转移酶的表达。通过上述方法，可以将稳定导入嵌合β-l,4-半乳糖转移酶的酵母菌株表达的基因重组抗凝血酶III所具有的N连接型糖链的主要结构修饰成下列不成熟复合体型双链糖链：其不含岩藻糖，在还原末端核心区具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，其结构中非还原末端通过双分支结构结合有3个甘露糖残基，2个非还原末端的每一个上均连有1个N-乙酰氨基葡萄糖残基。 
15.制备导入重组嵌合β-1,4-半乳糖基转移酶基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码β-l,4-半乳糖转移酶（GenBank登记号：M22921）的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达β-l,4-半乳糖转移酶的载体。接下来，将该载体稳定地导入到上一条所述得到的酵母菌株中，上一条中已经将嵌合β-l,4-半乳糖转移酶稳定地导入表达主要具有不成熟复合体型双触角糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株中。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认嵌合β-l,4-半乳糖转移酶的表达。通过上述方法，可以将稳定导入嵌合β-l,4-半乳糖转移酶的酵母菌株表达的基因重组抗凝血酶III所具有的N连接型糖链的主要结构修饰成下列不成熟复合体型双链糖链：其不含岩藻糖，在还原末端核心区具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，其结构中非还原末端通过双分支结构结合有3个甘露糖残基，2个非还原末端的每一个上均连有1个N-乙酰氨基葡萄糖残基。 
16.制备导入重组CMP-唾液酸转运基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码CMP-唾液酸转运子（GenBank登记号：D87969）全部翻译区的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达CMP-唾液酸转运子的载体。接下来，将该载体稳定地导入到上文所述的酵母菌株中，所述的酵母菌株表达主要具有不成熟双触角糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认CMP-唾液酸转运子的表达。 
17.制备导入重组嵌合唾液酸转移酶基因的酵母菌株 
使用来源于人组织如肝脏来源的cDNA（Clontech制造）作为模板，使用特异性引物和KOD聚合酶（Toyobo Co.,Ltd.制造）进行PCR，对编码α2,3-唾液酸转移酶（GenBank登记号：L23768）或α2,6-唾液酸转移酶（GenBank登记号：X62822）活性结构域的cDNA进行特异性扩增。将由此扩增的cDNA在与编码酵母甘露糖基转移酶（MNN 9）基因（GenBank登记号：L23752）前导肽的cDNA序列在其5’-末端连接后，插入到用于酵母的表达载体启动子序列的下游，从而制备在酵母高尔基体内表达唾液酸转移酶的载体。接下来，将该载体稳定地导入到上一条所述得到的酵母菌株中，上一条中已经将嵌合唾液酸转移酶稳定地导入表达主要具有不成熟复合体型双链糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组人抗凝血酶III的酵母菌株中。根据其辅源营养和耐药性对基因导入后的酵母克隆进行选择，然后通过RT-PCR来确认嵌合唾液酸转移酶的表达。通过上述方法，可以将稳定导入嵌合唾液酸转移酶的酵母菌株表达的基因重组抗凝血酶III所具有的N连接型糖链的主要结构修饰成下列不成熟复合体型双触角糖链：在还原末端核心区具有2个N-乙酰氨基葡萄糖残基，其结构中非还原末端通过双分支结构结合有3个甘露糖残基，2个非还原末端的每一个上分别连有1个半乳糖残基和1个唾液酸。 
18.使用酵母制备重组抗凝血酶III蛋白 
将上一条中制备的酵母菌株（其表达主要具有其中还原末端未结合岩藻糖、非还原末端连接有唾液酸的复合体型双链糖链的重组抗凝血酶III）接种在液体YPD培养基（Invitrogen制造）中，并在30℃下进行24小时或更长时间的分批培养，将重组抗凝血酶III分泌到培养物上清液中。使用来源于人血浆来源抗凝血酶III药物制剂Neuart（Mitsubishi Pharma Corporation制造）或类似物作为标准物质，采用人抗凝血酶III ELISA试剂盒（Affinity Biologicals制造）对培养后得到的培养物上清液进行分析。通过该分析，可以检测到培养物上清液中所含的重组抗凝血酶III并对其浓度进行测定。另外，分泌到该酵母培养物上清液中、主要具有不含有岩藻糖的复合体型双触角糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组抗凝血酶III可以通过实施例4中所述的方法进行纯化。此外，纯化的抗凝血酶III蛋白的糖链结构可以通过实施例4所述的方法进行分析。 
因此，已经显示，主要具有不含岩藻糖的复合体型糖链作为N-糖苷连接型糖链的重组抗凝血酶III可以通过下列方法制备：制备表达主要具有不含岩藻糖的复合体型糖链作为N-糖苷连接型的重组抗凝血酶III的酵母菌株，培养该酵母。在这一方面，在本实例中酵母表达的抗凝血酶III是一种生物活性与FUT8双敲除细胞表达的抗凝血酶III和来源于人血浆的抗凝血酶III相当的蛋白。 
工业应用
本发明提供了含有具有复合体型N-糖苷连接的糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。 
序列列表自由文本： 
SEQ ID NO:20–合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:21-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:22-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:23-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:24-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:25-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:26-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:27-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:28-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:29-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:30-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO.31-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:32-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:33-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:34-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:35-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:36-合成序列的说明：合成DNA 
SEQ ID NO:37-合成序列的说明：合成DNA 

Claims (24)

1.一种抗凝血酶III组合物的制造方法，其包括：在培养基中培养通过将编码抗凝血酶III的DNA导入经基因重组修饰的宿主细胞中获得的转化体，在培养物中形成并积累含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构；和从培养物中回收所述的抗凝血酶III组合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未与岩藻糖1-位结合的结构。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的宿主细胞中的基因组被修饰成：与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失。
4.根据权利要求1至3中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞中编码与所述细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组中的所有等位基因已经被敲除。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶选自GDP-甘露糖4,6-脱水酶（GMD）和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶（Fx）。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-甘露糖4,6-脱水酶是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA；
（b）与由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白的DNA。
7.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-甘露糖4,6-脱水酶是选自（a）、（b）和（c）的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白；
（b）由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白；
（c）由与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性的蛋白。
8.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的DNA；
（b）与由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
9.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶是选自（a）、（b）和（c）的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的蛋白；
（b）由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白；
（c）由与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶活性的蛋白。
10.根据权利要求3或4的方法，其中所述与复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α-键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶是α1,6-岩藻糖基转移酶。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的α1,6-岩藻糖基转移酶是由选自下列（a）至（d）的DNA编码的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的DNA；
（b）含有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的DNA；
（c）与由SEQ ID NO:11所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA；
（d）与由SEQ ID NO:12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。
12.根据权利要求10的方法，其中所述的α1,6-岩藻糖基转移酶是选自下列（a）至（f）的蛋白：
（a）含有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的蛋白；
（b）含有SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的蛋白；
（c）由SEQ ID NO:13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
（d）由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
（e）由与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
（f）由与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。
13.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述的转化体为FERM BP-08472、FERM BP-10083、FERM BP-10084、FERMBP-10088或FERM BP-10089。
14.根据权利要求1至12中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞是选自下列（a）至（j）的细胞：
（a）来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
（b）大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
（c）小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞；
（d）小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞；
（e）来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；
（f）人白血病细胞系Namalwa细胞；
（g）胚胎干细胞；
（h）受精卵细胞；
（i）植物细胞；
（j）酵母。
15.根据权利要求1至14中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III组合物具有复合体型N-糖苷连接的糖链，所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。
16.根据权利要求1至15中任意一项的方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未与岩藻糖1-位结合的结构。
17.根据权利要求1至16中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求1至17中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
19.根据权利要求1至18中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
20.根据权利要求1至19中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由选自下列（a）和（b）的DNA编码的多肽：
（a）含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA；
（b）与由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。
21.根据权利要求1至20中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III来源于哺乳动物。
22.一种通过根据权利要求1至21中任意一项的方法获得的抗凝血酶III组合物。
23.一种含有根据权利要求22的抗凝血酶III组合物作为活性成分的药物。
24.根据权利要求23的药物，其为诊断、预防或治疗伴有血液凝固的疾病的药剂。
CN201410016193.XA 2003-10-09 2004-10-08 抗凝血酶iii组合物的制造方法 Pending CN103993056A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003350164 2003-10-09
JP2003-350164 2003-10-09

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200480035813.9A Division CN1890262B (zh) 2003-10-09 2004-10-08 抗凝血酶ⅲ组合物的制造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103993056A true CN103993056A (zh) 2014-08-20

Family

ID=34431032

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200480035813.9A Expired - Lifetime CN1890262B (zh) 2003-10-09 2004-10-08 抗凝血酶ⅲ组合物的制造方法
CN201410016193.XA Pending CN103993056A (zh) 2003-10-09 2004-10-08 抗凝血酶iii组合物的制造方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200480035813.9A Expired - Lifetime CN1890262B (zh) 2003-10-09 2004-10-08 抗凝血酶ⅲ组合物的制造方法

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1676860B1 (zh)
JP (1) JP4263191B2 (zh)
KR (1) KR101017336B1 (zh)
CN (2) CN1890262B (zh)
AT (1) ATE554097T1 (zh)
AU (1) AU2004279741B2 (zh)
CA (1) CA2542035C (zh)
ES (1) ES2383371T3 (zh)
HK (1) HK1091500A1 (zh)
WO (1) WO2005035563A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111109248A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 武汉博士德生物工程有限公司 一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法
CN115247160A (zh) * 2022-07-28 2022-10-28 格进(杭州)生物技术有限责任公司 蛋白核心岩藻糖基化修饰的检测方法
CN117567597A (zh) * 2024-01-17 2024-02-20 成都艾科斯伦医疗科技有限公司 一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007099988A1 (ja) * 2006-02-28 2007-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ変異体とその用途
KR20140072201A (ko) 2006-07-05 2014-06-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
CN107630011A (zh) * 2006-07-05 2018-01-26 催化剂生物科学公司 蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶
KR101510778B1 (ko) 2007-07-12 2015-04-10 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물
EP2311864A4 (en) 2008-08-13 2013-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION
EP2727930B1 (en) * 2011-06-29 2019-12-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for purifying antithrombin
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
CN104884952A (zh) 2012-12-28 2015-09-02 生化学工业株式会社 付之鲎试验的抗凝血酶iii用的前处理剂及前处理方法
EP3218490B1 (en) * 2014-11-15 2018-10-31 Zumutor Biologics, Inc. Dna-binding domain of crispr system for production of non-fucosylated and partially fucosylated proteins
EP3278814B1 (en) * 2015-03-31 2021-08-18 Kyowa Kirin Co., Ltd. Therapeutic composition containing antithrombin gamma
JPWO2020166557A1 (ja) 2019-02-11 2021-12-16 協和キリン株式会社 妊娠高血圧腎症の治療方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843705A (en) 1995-02-21 1998-12-01 Genzyme Transgenic Corporation Transgenically produced antithrombin III
EP0816503B1 (en) * 1996-01-24 2006-07-05 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
EP1298217A4 (en) * 2000-07-05 2004-09-08 Mitsubishi Pharma Corp GLYCOPROTEIN PRODUCTION PROCESS
EA013224B1 (ru) * 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
WO2003085107A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
EP1498490A4 (en) * 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
JP2005058111A (ja) * 2003-08-14 2005-03-10 Univ Osaka 糖鎖修飾制御方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111109248A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 武汉博士德生物工程有限公司 一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法
CN115247160A (zh) * 2022-07-28 2022-10-28 格进(杭州)生物技术有限责任公司 蛋白核心岩藻糖基化修饰的检测方法
CN115247160B (zh) * 2022-07-28 2024-03-15 格进(杭州)生物技术有限责任公司 蛋白核心岩藻糖基化修饰的检测方法
CN117567597A (zh) * 2024-01-17 2024-02-20 成都艾科斯伦医疗科技有限公司 一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒
CN117567597B (zh) * 2024-01-17 2024-03-22 成都艾科斯伦医疗科技有限公司 一种抗凝血酶Ⅲ及抗Xa活性检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CA2542035C (en) 2013-02-26
EP1676860B1 (en) 2012-04-18
HK1091500A1 (en) 2007-01-19
ATE554097T1 (de) 2012-05-15
AU2004279741A1 (en) 2005-04-21
CN1890262A (zh) 2007-01-03
ES2383371T3 (es) 2012-06-20
KR20060125732A (ko) 2006-12-06
WO2005035563A1 (ja) 2005-04-21
KR101017336B1 (ko) 2011-02-28
ES2383371T9 (es) 2012-12-14
JP4263191B2 (ja) 2009-05-13
JPWO2005035563A1 (ja) 2007-11-22
CN1890262B (zh) 2015-01-28
EP1676860A4 (en) 2008-12-31
CA2542035A1 (en) 2005-04-21
EP1676860A1 (en) 2006-07-05
AU2004279741B2 (en) 2010-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6523404B2 (ja) 抗体組成物を生産する細胞
CN1930288B (zh) 基因组被修饰的细胞
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
JPWO2003055993A1 (ja) Ｃｄ２０に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2003085118A1 (ja) 抗体組成物の製造方法
JPWO2003085119A1 (ja) 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
CN103993056A (zh) 抗凝血酶iii组合物的制造方法
US8501914B2 (en) Recombinant protein S composition
US7691810B2 (en) Method of producing recombinant antithrombin III composition
EP1688437A1 (en) Antibody composition specifically binding to il-5 receptor
WO2006109698A1 (ja) 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
WO2006109695A1 (ja) 遺伝子組換えハプトグロビン組成物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140820