JP2005058111A

JP2005058111A - 糖鎖修飾制御方法

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Publication number: JP2005058111A
Application number: JP2003293314A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Omasa; 健史大政; Toshiomi Yoshida; 敏臣吉田; Mutsumi Takagi; 睦高木; Hiroo Katakura; 啓雄片倉; Toyoo Ouda; 豊雄應田; Kaoru Kobayashi; 薫小林; Hideo Miki; 秀夫三木
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp; Osaka University NUC
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp; Osaka University NUC
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2005-03-10

Abstract

【課題】本発明の課題は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた異種蛋白質の産生において、糖鎖修飾を制御する方法、より詳細にはフコース結合糖鎖量を抑制する方法を提供することである。
【解決手段】ＣＨＯ由来α１，６フコース転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列のうち、連続する少なくとも２０塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡを導入した異種蛋白質産生可能なＣＨＯ由来の細胞を培養することにより、フコース結合糖鎖量が抑制された異種蛋白質を産生する。

Description

本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた異種蛋白質の産生における糖鎖修飾制御方法に関する。

近年、遺伝子組換え型有用生理活性物質の生産が注目されている。これらのうち糖蛋白質を生産するときには、宿主として糖鎖修飾を行うことができる細胞、すなわち、動物細胞に代表される真核細胞を用いる必要がある。

糖鎖修飾は蛋白質生産においてみられるＤＮＡレベルでの厳密な制御はなされておらず、２０種類近くにも及ぶ一連の酵素反応によって行われるため、蛋白質の構造、宿主細胞の型、細胞の培養条件などの要素が、糖鎖修飾プロセスに影響を及ぼすことが知られている（バイオテクノロジー、第８巻、第４２１〜４２８頁、１９９０年発行）（同誌、第１３巻、第５９２〜５９６頁、１９９５年発行）（バイオケミストリー、第２８巻、第７６４４〜７６６２頁、１９８８年発行）。

したがって、細胞培養により糖蛋白質を生産するときには、多くの場合において、天然型と組換え型の糖鎖構造が異なる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２１１５３〜２１１５９頁、１９８９年発行）（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第２０３巻、第４５８〜４６５頁、１９８０年発行）。また、組換え型においても糖鎖の結合本数と結合構造の２点で不均一性が生じる。

糖蛋白質の糖鎖は蛋白質３次元構造の安定化、蛋白質分解に対する防衛、蛋白質分泌の促進、およびその糖蛋白質の生理活性などに影響を及ぼすことが明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７２巻、第３〜２０頁、１９８６年発行）（グリコバイオロジー、第１巻、第１１５〜１３０頁、１９９１年発行）（蛋白質核酸酵素、第３７巻、第１７１３〜１７４６頁、１９９２年発行）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．、第６０巻、第２５５〜２６１頁、１９８８年発行）（ＦＡＳＥＢＪ、第９巻、第１１５〜１１９頁、１９９５年発行）。

また、組換え糖蛋白質を医薬品として用いる場合、天然型と異なる糖鎖構造は免疫反応を引き起こす可能性もあり、組換え型が天然型と共通の糖鎖構造を持つことが望ましい。したがって、組換え糖蛋白質の生産においては、糖鎖構造の制御が大きな課題となっている。

糖鎖修飾には、糖加水分解酵素および糖転移酵素が関与しているが、特に糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体として受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、糖鎖形成において重要な役割を担っている。

糖転移酵素の１つであるフコース転移酵素（以下ＦＴという）は、別名フコシルトランスフェラーゼともいう。ＦＴは、生体内において、複合糖鎖、例えば、グルコサミンなどに対するフコースの結合に大きく関与していると考えられている。

本酵素は、フコースの転移様式により、Ｎ型とＯ型に分類され、Ｎ型はさらにα型とβ型に細分類される。また、転移位置により、１，２型、１，３型、１，４型、１，６型などに分類される。

このうち、α１，６型は、肝臓疾患患者においてその血中濃度が変動することから、当該疾患との関与が知られており、肝臓癌、慢性肝炎、肝硬変などの肝臓疾患の診断薬への適用が期待されている（特開平６−６５３００、同１１−３２７９６、同１１−３２７９７）。

α１，６型はヒト、ブタ、ウシ、マウスなどで既に報告例がある（特開平９−２０１１９１、同１０−４９５９、同１０−４９６９、同１０−８４９７５、ＷＯ９７／２７３０３。ＪＢＣ、第２６６巻３２号、第２１５７２〜２１５７７頁、１９９１年発行。同、第２７１巻４４号、第２７８１０〜２７８１７、１９９６年発行。ＤＮＡＳｅｑ、第１１巻１−２号、第９１〜９６頁、２０００年、ＡＦ２４７１８６など）。また、ＣＨＯに由来するα１，６型については部分塩基配列が報告されている（ＷＯ００／６１７３９）。

一方、ＣＨＯ由来のＦＴとしてはα１，３型、Ｏ型が知られている（ＪＢＣ、第２７４巻１５号、第１０４３９〜１０４５０頁、１９９９年発行。ＵＳＰ−６１０００７６）。しかしながら、これらのものは、α１，６型とは全く別物である。

ところで、組換え糖蛋白質を調製するに当たり、糖鎖構造を制御する方法に関しては少数ながら報告例がある。培地中の糖組成あるいは糖濃度を変更することにより産生される糖蛋白質の糖鎖の種類あるいは分子量を改変する方法（特許文献１）、培地中にグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを添加することによりガラクトース残基の転移を抑制する方法（特許文献２）などであるが、これらはいずれもハイブリドーマを用いた抗体産生に関するものである。また、糖転移酵素（Ｎ−アセチルグルコシルトランスフェラーゼＶ）遺伝子を導入した動物細胞を用いて糖鎖構造を改変する方法（特許文献３）、動物細胞産生系において培養条件（糖組成）の変更により、産生する組換え蛋白質の糖鎖構造を改変する方法（特許文献４）なども知られている。

その一方で、生理活性物質（蛋白質）を遺伝子のレベルで制御する技術を利用して上記の糖鎖修飾に関与する酵素そのものを調節することも検討されている。例えばｍＲＮＡの段階で遺伝子の発現を消失させ、該遺伝子の機能を喪失した細胞や生物を作るための手法として、多くの分子が試みられており、例えばアンチセンス配列、リボザイム、キメラオリゴ等が検討されてきた。これらのうち、遺伝子制御・破壊する方法としてはアンチセンス法が最も代表的な手法である。アンチセンス法は標的とする遺伝子の標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とアンチセンスｍＲＮＡが相補的に結合することにより、翻訳抑制がおこる。

ところで最近、蛋白質の生理活性を制御する手段としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という手法が注目されている。ＲＮＡｉは機能を阻害したい遺伝子の特定領域と相同するセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ｄｓＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡの相同部分を干渉・破壊する現象である。当初は３０塩基対以上の長いｄｓＲＮＡによる効果が報告されてきたが、近年さらに短いＲＮＡｉ（２１〜２３塩基対）ｄｓＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）が有効であるとの報告がなされている（非特許文献１、２）。

さらに、ＣＨＯ細胞を用いて遺伝子組換えによる免疫グロブリンを産生する場合におけるＣＨＯ由来フコース合成関連酵素の遺伝子を標的とするＲＮＡｉの手法を用いた宿主細胞の調製方法が報告されている（特許文献５）。しかし、具体的にフコース合成関連酵素の遺伝子のいずれの領域を標的とするのか、またＲＮＡｉの手法により上記酵素の発現に関し、実際にどのような影響を及ぼしたのかについては全く報告されていない。
特開平６−２９２５９２号公開公報特開平１１−１２７８９０号公開公報特開平９−８４５８２号公開公報国際公開ＷＯ０２／０２７９３号パンフレット国際公開ＷＯ０２／３１１４０号パンフレットＮａｔｕｒｅ，４１１：ｐ．４９４−４９８（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｐｒ．１９；２９６（５５６７）：ｐ．５５０−５５３（２００２）

本発明の目的は、ＣＨＯ細胞を用いた異種蛋白質の産生において、糖鎖修飾を制御する方法、より詳細にはフコース結合糖鎖量を抑制する方法を提供することにある。

本発明者らは上記の事情を考慮し、ＣＨＯ由来α１，６フコース転移酵素の遺伝子の塩基配列を基にさらに研究を進めた結果、当該酵素の遺伝子の塩基配列に関する情報を利用することにより、ＣＨＯ細胞で異種蛋白質を産生する際に、糖鎖修飾を制御できることを初めて見出した。

即ち本発明は、
１．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来α１，６フコース転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列のうち、連続する少なくとも２０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡを導入した異種蛋白質産生可能なＣＨＯ細胞を培養することにより、フコース結合糖鎖量が抑制された異種蛋白質を産生する方法、
２．前記の転移酵素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する前項１に記載の異種蛋白質を産生する方法、
３．前記の転移酵素をコードする遺伝子が、配列番号２で表される塩基配列を有する前項１に記載の蛋白質を産生する方法、
４．前記のオリゴヌクレオチドが、配列番号２で表される塩基配列のうち、塩基番号第３００〜１６３０位の位置から選択されるものである、前項１に記載の蛋白質を産生する方法、
５．前記の二本鎖ＲＮＡが、配列番号３、５または７で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を含む、前項１に記載の異種蛋白質を生産する方法、
６．異種蛋白質が、アンチトロンビン−ＩＩＩである前項１〜５のいずれか１に記載の異種蛋白質を産生する方法、
７．配列番号３、５または７で表されるオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ、からなる。

本発明の方法によれば、ＣＨＯ細胞を用いて異種蛋白質を産生する場合に、糖鎖修飾を制御、具体的にはフコース糖鎖結合を抑制することができる。従って、通常の方法では、ヒト由来の糖蛋白質では観察されないようなフコース糖鎖高結合型の異種蛋白質しか産生できないような場合でも、本発明の方法によれば、ヒト型の糖鎖構造により近づけた、フコース糖鎖結合量が抑制された異種蛋白質を産生することができる。

Ａ．異種蛋白質産生可能なＣＨＯ細胞
（異種蛋白質）
本発明で使用される異種蛋白質は糖蛋白質（糖鎖が結合した蛋白質）であって、医薬品として有用な生理活性を有するものであれば特に限定されるものではない。好ましくは、ヒト由来のものであって、通常はフコース糖鎖が結合していないもの、または軽微なものを用いる場合に本発明の効果をより発揮することができる。このような異種蛋白質としては具体的には、血漿蛋白、例えば、血液凝固因子（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子など）、免疫グロブリン（抗体）、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン・トロンビン、フィブリノゲン・フィブリン、ハプトグロビン、プラスミノゲン、α１−プラスミンインヒビター、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、ヘパリンコファクター−ＩＩなど、インターフェロン（ＩＦＮ）、インスリン、成長因子、尿性トリプシンインヒビター、プラスミノゲン活性化因子（ウロキナーゼ（ＵＫ）、プロウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）など）、コロニー形成刺激因子（ＣＳＦ）、受容体、酵素、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ホルモン、リンホカイン、サイトカインなどが例示される。

（宿主）
本発明の宿主として用いられるＣＨＯ細胞としては、遺伝子組換え技術によって上記異種蛋白質を産生しうる細胞であれば良く、特に限定されるものではないが、具体的にはＣＨＯ−Ｋ１細胞などが例示される。また、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損株などの変異株であってもよい。

（発現系）
本発明の発現系としては、動物細胞で通常使用される発現系（プロモーター、シグナル配列など）を利用すればよい。上記のＡＴをコードする遺伝子を発現ベクター系に導入して、発現用宿主・ベクター系を構築する。ベクターは、プロモーター、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写終結配列（ターミネーター）を有する。制御配列（エンハンサー）、ＲＮＡスプライス配列、ポリＡ付加部位等をさらに有していても良い。また形質転換細胞中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有していてもよい。さらに高産生系として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を利用した遺伝子の増幅系を用いることもできる。

〔形質転換体（異種蛋白質産生可能なＣＨＯ細胞）の調製〕
遺伝子組換え技術を利用して糖蛋白質を産生可能な宿主（形質転換体）を調製する方法は公知の手法に準じて行えばよい。すなわち、異種蛋白質をコードする遺伝子を適当な発現プラスミドに担持させた形でＣＨＯ細胞に導入して形質転換体を調製する。発現プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクチン法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法などが例示される。これらの方法によりプラスミドまたはその線状断片を宿主染色体上に導入することができる。

Ｂ．ＣＨＯ由来α１，６フコース転移酵素（ＣＨＯ由来α１，６ＦＴ）をコードする遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡのＣＨＯ細胞への導入

（ＣＨＯ由来α１，６ＦＴの配列）
本発明のＣＨＯ由来α１，６ＦＴを構成するアミノ酸配列は配列表の配列番号１で示されるものである。また、当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列に翻訳される配列であれば、特に限定されるものではない。具体的には、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するものが挙げられる。

上記塩基配列を含むＤＮＡ鎖は、公知の方法によりＣＨＯ細胞から調製することができる。当該ＤＮＡ鎖は、例えばＣＨＯ細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で増幅することにより得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡの抽出は、市販のｍＲＮＡ抽出用キットなどを用いて行い、逆転写、ｃＤＮＡ合成、およびＤＮＡの増幅は、市販のｃＤＮＡ増幅キットなどを用いた５´−ＲＡＣＥ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、第８９９８〜９００２頁、１９８８年発行）または適当なプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などにより行うことができる。

また、ＣＨＯ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係るα１，６ＦＴをコードするＤＮＡ鎖をＰＣＲで増幅して得ることもできる。上記の方法により、ヒト、ウシ、ブタ、マウス由来のα１，６ＦＴをコードするＤＮＡ鎖の塩基配列を比較すると、表１に示すような相同性が確認される。

（二本鎖ＲＮＡおよびその相補鎖の調製）
本発明の二本鎖ＲＮＡとして、ＣＨＯ由来α１，６ＦＴをコードする遺伝子の塩基配列から選択された連続する少なくとも２０塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡを使用することができる。当該二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉの手法で用いるｓｉＲＮＡとして利用することができる。

本発明の二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉの目的に適した配列を有する領域から選択することが必要である。一般的には、開始コドンの５０から１００ヌクレオチド下流の領域を選択する。選択した領域からＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＡＡ（Ｎ２１）となる配列を探し、その配列のＧＣ含量が少なくとも３０％から７０％の間になるものを選択することが推奨されているようであるが、本発明の二本鎖ＲＮＡはこれに限定されるものではなく、ＲＮＡｉの目的に適するものであればどのような配列であっても良い。具体的には配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列もしくは配列番号２で表される塩基配列のうち塩基番号第３００〜１６３０位またはその相補鎖の位置から選択され、好ましくは塩基番号第４８０〜６００位、９２０〜１１００位もしくは１５５０〜１６３０位の位置から選択された連続する少なくとも２０塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる含む二本鎖ＲＮＡである。さらに好ましくは、各種由来α１，６ＦＴのうち、特にＣＨＯ由来α１，６ＦＴに特異的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡであることが好適である。

本発明の二本鎖ＲＮＡをＲＮＡｉの手法に用いるには、通常、塩基数が２１〜２３塩基であるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの一対の組合せからなる二本鎖ＲＮＡが必要である。その具体的として表２に示すような塩基配列を有するセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの組合せが例示される。

本発明の二本鎖ＲＮＡを構成するオリゴヌクレオチドは、公知の方法によって作製することができる。例えば化学的に合成することができるし、あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Expedite Model 8909 DNA合成機）等を用いて合成することができる。また、ｓｉＲＮＡ合成キットが既に市販されており（株式会社ニッポンジーンテク社等）、これらを利用してｓｉＲＮＡを合成することもできる。

（ＣＨＯ細胞への導入）
上記の二本鎖ＲＮＡをＣＨＯ細胞に導入するには、公知の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法などが挙げられる。上記二本鎖ＲＮＡは、異種蛋白質発現用ベクターをＣＨＯ細胞に導入する前または後に導入してもよい。さらに、本発明の二本鎖ＲＮＡは適当なベクター（ｓｉＲＮＡ発現専用ベクター）を用いて細胞内で恒常的に発現することもできる。当該ベクターは公知であり、例えば、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０：４４６−４４８（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３（２００２）に開示されたｓｉＲＮＡ発現専用ベクターを利用すればよい。また市販のものを用いることもできる。

さらに当該ベクターに二本鎖ＲＮＡを組み込む方法は、自体公知の方法を適用することができる。例えば、上記の文献に開示された内容に準じて実施することができる。また、二本鎖ＲＮＡに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによって、所望のベクターを得ることもできる。

Ｃ．培養と異種蛋白質（糖蛋白質）の産生
（培地・培養）
公知の手法により目的とする異種蛋白質の遺伝子を組み込み、かつ上記の方法で本発明の二本鎖ＲＮＡを導入したＣＨＯ細胞を、公知の方法により培養する。培地としてはＣＨＯ細胞培養用のものであれば特に限定されない。例えば、基本培地（例、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＨａｍＦ培地など）および基本培地にウシ血清などを添加した血清含有培地、血清を含まない無血清培地などが例示される。無血清培地には、哺乳動物由来の蛋白質（例、インスリン、血清アルブミン、トランスフェリンなど）を添加したもの、哺乳動物由来の蛋白質を添加しないもの（組換え蛋白質または植物由来蛋白質を用いる）、蛋白質そのものを添加しないもの（いわゆる無血清無蛋白質培地であるが、蛋白質加水分解物を含む場合がある）、低分子量の合成品のみ添加したもの（糖、アミノ酸、脂質、ビタミン、核酸、ミネラル、アミン類などから構成される。いわゆる人工合成培地）などを用いることもできる。培養は通常、１５〜４３℃（好ましくは３０〜３７℃）程度で、１０〜４００時間程度行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることもできる。培養形式としては回分培養、半回分培養（フェドバッチ培養）、連続培養のいずれであってもよい。

（単離・精製）
培養により異種蛋白質（糖蛋白質）を産生させた後に、該ＣＨＯ細胞またはその培養物（培養液、培養上清）から本発明の糖蛋白質を得ることができる。当該糖蛋白質は公知の方法により精製することができる。例えば、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換体処理、アフィニティクロマトなどが挙げられる。また、公知の製剤化技術を施すことにより、本発明の糖蛋白質の製剤を調製することができる。

（性状）
産生された異種蛋白質は、その糖鎖構造において、本発明の二本鎖ＲＮＡを導入しない場合に比べて、フコース糖鎖の結合率が１０〜５０％程度低下している。

本発明をより詳細に説明するために参考例および実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

（参考例１）
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５６巻、第６００〜６０４頁（１９９２年）で開示された方法に準じて、ヒトアンチトロンビン−ＩＩＩ（以下、ＡＴ−ＩＩＩ）遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞のｄｈｆｒ欠損株に組み込んだものを、０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む低血清培地で馴化した（１３Ｄ−３５Ｄ株）。さらに、この１３Ｄ−３５Ｄ株を無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ培地中で馴化させて浮遊馴化株を作成した（１３Ｄ−３５ＤＳ株）。これらの株を以下の参考例および実施例に用いた。

（実施例１）
常法によりｓｉＲＮＡ（配列番号３〜８）を合成した。これらはＣＨＯ由来α１，６ＦＴに関する公知の塩基配列情報に基づいて設計されたものである。配列番号３のオリゴヌクレオチドは当該酵素のＮ末側から５４８〜５６８番目に相当するもの（センスＲＮＡ）であり、配列番号４のオリゴヌクレオチドはその相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）である。配列番号５のオリゴヌクレオチドは当該酵素のＮ末側から９２９〜９４９番目に相当するもの（センスＲＮＡ）であり、配列番号６のオリゴヌクレオチドはその相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）である。配列番号７のオリゴヌクレオチドは当該酵素のＮ末側から１５９９〜１６１９番目に相当するもの（センスＲＮＡ）であり、配列番号８のオリゴヌクレオチドはその相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）である。合成ｓｉＲＮＡを常法によりアニーリングした。ヒトアンチトロンビン−ＩＩＩ（以下ＡＴ−ＩＩＩ）発現用プラスミドを組込んだＣＨＯ細胞（１３Ｄ−３５ＤＳ株）に、当該ｓｉＲＮＡをリポフェクチン法により導入（トランスフェクション）した。

（前培養）
培養細胞を０．３×１０^６細胞／ウェルの細胞密度で２４ウェル・プレートに５００μＬ播種した。導入時に３０〜５０％のコンフルエントになるように調整した。通常培地（ＦＢＳ^＋、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ^＋、以下Ａｂ^＋）を使用し、１日培養した。

（トランスフェクション）
３種のｓｉＲＮＡを全量５０μＬでＦＢＳ⁻、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ⁻（以下Ａｂ⁻）培地で希釈・攪拌した（ｓｉＲＮＡ、ａ）。リポフェクチン（リポフェクタミン２０００、インビトロゲン社）を攪拌し、全量５０μＬとなるようにＦＢＳ⁻、Ａｂ⁻培地で希釈・攪拌した。２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡに対してリポフェクチンを１μＬの割合で加えた。室温で５分間インキュベーションした（リポフェクチン、ｂ）。上記のａとｂを混合した（合計１００μＬ）。攪拌し、室温で２０分間静置して、ｓｉＲＮＡとリポフェクチンの複合体を形成させた（複合体、ｃ）。ウェルの細胞をＦＢＳ⁻、Ａｂ⁻培地で洗浄した後に、０．９ｍＬの同培地を加えた。各ウェルに１００μＬのｃの複合体を加え、ウェルを穏やかに揺らした。４時間後に通常培地（ＦＢＳ^＋、Ａｂ^＋）を１００μＬ加えた。２４時間後にサンプリングし、１ｍＬの新たな培地（ＦＢＳ⁻、Ａｂ⁻）を加えた。細胞の増殖状態を観察しつつサンプリングを行った。

（測定）
ＥＬＩＳＡによるＡＴ−ＩＩＩ濃度測定およびＡＡＬ結合分析（全ＡＴ−ＩＩＩ当たりのフコース修飾されたＡＴ−ＩＩＩの割合を測定する）を行った。ＡＡＬ結合分析は糖特異的に結合する蛋白質であるレクチンを用いて、フコースが結合した糖鎖量を測定するものであり、ＷＯ０２／０２７９３に開示された方法に準じて行った。

（結果）
ｓｉＲＮＡ（配列番号３と同４の組合せ、配列番号５と同６の組合せ、配列番号７と同８の組合せ）を各々１０μＭの量で導入した場合の、培養６日目におけるＡＴ−ＩＩＩのフコース糖鎖結合量を表３に示す。

（実施例２）
ｓｉＲＮＡを５０ｎＭの量で導入した場合について実施例１と同様に実験を行った。

（実施例３）
ｓｉＲＮＡを１００ｎＭの量で導入した場合について実施例１と同様に実験を行った。

本発明の方法によれば、ＣＨＯ細胞を用いて異種蛋白質を産生する場合に、糖鎖修飾を制御することができ、具体的にはフコース糖鎖結合を抑制することができる。従って、通常の方法では、ヒト由来の糖蛋白質では観察されないようなフコース糖鎖高結合型の異種蛋白質しか産生できないような場合でも、本発明の方法によれば、ヒト型の糖鎖構造により近づけた、フコース糖鎖結合量が抑制された異種蛋白質を産生することができる。すなわち、より安全性の高い異種蛋白質（糖蛋白質）を安定的に医療の場に供給することが可能となる。

配列表配列番号１：本発明のＣＨＯ由来α１，６フコース転移酵素のアミノ酸配列
配列表配列番号２：当該酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列
配列表配列番号３：当該酵素のセンスＲＮＡ（５４８〜５６８番目に相当）
配列表配列番号４：その相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）
配列表配列番号５：当該酵素のセンスＲＮＡ（９２９〜９４９番目に相当）
配列表配列番号６：その相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）
配列表配列番号７：当該酵素のセンスＲＮＡ（１５９９〜１６１９番目に相当）
配列表配列番号８：その相補鎖（アンチセンスＲＮＡ）

Claims

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来α１，６フコース転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列のうち、連続する少なくとも２０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡを導入した異種蛋白質産生可能なＣＨＯ細胞を培養することにより、フコース結合糖鎖量が抑制された異種蛋白質を産生する方法。
前記の転移酵素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の異種蛋白質を産生する方法。
前記の転移酵素をコードする遺伝子が、配列番号２で表される塩基配列を有する請求項１に記載の蛋白質を産生する方法。
前記のオリゴヌクレオチドが、配列番号２で表される塩基配列のうち、塩基番号第３００〜１６３０位の位置から選択されるものである、請求項１に記載の蛋白質を産生する方法。
前記の二本鎖ＲＮＡが、配列番号３、５または７で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を含む、請求項１に記載の異種蛋白質を生産する方法。
異種蛋白質が、アンチトロンビン−ＩＩＩである請求項１〜５のいずれか１に記載の異種蛋白質を産生する方法。
配列番号３、５または７で表されるオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ。