JPH0353898A - 体液中の抗トロンビン３を測定する方法及び試薬 - Google Patents
体液中の抗トロンビン３を測定する方法及び試薬Info
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- JPH0353898A JPH0353898A JP2185456A JP18545690A JPH0353898A JP H0353898 A JPH0353898 A JP H0353898A JP 2185456 A JP2185456 A JP 2185456A JP 18545690 A JP18545690 A JP 18545690A JP H0353898 A JPH0353898 A JP H0353898A
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-
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、試料とトロンビン及びトロンビンの作用下に
発色する色原住基質との反応及び生じる色の測定による
、体液中の抗トロンビン■を測定する方法並びにそのた
めに好適な試薬に関する。
発色する色原住基質との反応及び生じる色の測定による
、体液中の抗トロンビン■を測定する方法並びにそのた
めに好適な試薬に関する。
抗トロンビンＩは、その調節に役立つ血液凝固系の１因
子である。血液凝固は、種々のプロテアーゼのカスケー
ド様結合作用によシ起こる。
子である。血液凝固は、種々のプロテアーゼのカスケー
ド様結合作用によシ起こる。
前後に接絖された活性化工程の最後のものは、トロンビ
ンを放出し、これは、再びフイブリノーデンの分解によ
シ、フィゾリンモノマーを生じ、これは凝集し、血栓を
形成する。最も重要な調節剤は抗トロンビンｌ（ＡＴＩ
）であシ、これはトロンビン及び他の血液凝固に寄与す
るプロテアーゼと一緒になって錯体（これは活性中心を
ブロツクする）を形成することができる。
ンを放出し、これは、再びフイブリノーデンの分解によ
シ、フィゾリンモノマーを生じ、これは凝集し、血栓を
形成する。最も重要な調節剤は抗トロンビンｌ（ＡＴＩ
）であシ、これはトロンビン及び他の血液凝固に寄与す
るプロテアーゼと一緒になって錯体（これは活性中心を
ブロツクする）を形成することができる。
血液中の抗トロンビンＩ一含分は、健康なヒトでは、比
較的狭い範囲内に存在する。減少されたわ゛１、トロン
ビン■一含分は、消費凝因病（Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｓｋ
ｏａｇｕｌｏｐａｔｈｉｅ）、重症の肝臓疾病又は類似
の病気によシ著るしく制限されうる。
較的狭い範囲内に存在する。減少されたわ゛１、トロン
ビン■一含分は、消費凝因病（Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｓｋ
ｏａｇｕｌｏｐａｔｈｉｅ）、重症の肝臓疾病又は類似
の病気によシ著るしく制限されうる。
低減された抗トロンビンＩ一含分は、現在、般に血栓症
の危険率と評価される。従って、多くの場合に、抗トロ
ンビン■一含分は、急性血栓症の場合にも低減されてい
る。従って、抗トロンビン■一含分は、馳床診断字に唄
けるｈａなパラメータである。
の危険率と評価される。従って、多くの場合に、抗トロ
ンビン■一含分は、急性血栓症の場合にも低減されてい
る。従って、抗トロンビン■一含分は、馳床診断字に唄
けるｈａなパラメータである。
す
既に、免疫学的方法を基旋と〆るか又は色原性基負の使
用下に３ける抗トロンビンＩを検出する種々の方法が公
知である。後者の場合には、試料に、この試料中に存在
するＡＴＩと反応（３） ？、失活されるトロンビンを添加する。次いで、過剰の
トロンビンを、トロンビンの作用によシ着色された物質
を形成する色原住基質と共にインキユベートシ、色形成
を評価することにより検出し、この際、抗トロンビンｌ
一含分は、色形成に対し間嫉的に関係している。抗ト！
ンビンＩの測定法は、例えば、次の文■献に記載されて
いる：ベルグマイヤ−（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ）のメソッ
ズ・オデ・エンザ゛イマティック・アナリシス（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ ； ＶｅｒｌａｇＯｈｅｍｉｅ）第３版、５巻４４
１〜４４８；工．ウイット（Ｗｉｔｔ）のノイエ●メト
ーデン●デル●デリンヌングスアナリイゼ・ミット・ク
ロモｒン●ズゾストラーテン（Ｎｅｕｅ Ｍｅｔｈｏｄ
ｅｎ ｄｅｒＧｅｒｉｎｎｕｎｇｓａｎａｌｙｓｅ ｍ
ｉｔ Ｏｈｒｏｍｏｇｅｎｅ＝＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｎ
）、ストルモルクン（Ｓｔｏｒｍｏｒｋｅｎ）のノイエ
・メトーデン・デル・グリンヌングスアナリイゼ（Ｎｅ
ｕｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｌｉｅｒＧｅｒｉｎｎｕｎｇ
ｓａｎａｌｙｓｅ） ｌ ｌ ９ 〜１ ２ １頁、オ
デガルト（Ｏｄｅｇａｒｄ）等ニよるヘモスタシス（４
） （ａａｅｍｏｓｔａｓ１ｓ）、 ７ ： ２ ０ ２
〜２ ０ ９ （１９７８Ｌファリード（Ｆａｒｅａｄ
）等によるクロモゲニツク・ペプチド●ズゾストラーテ
ス（ Ｏｈｒｏｍｏｇｅｎｉ ｃＫａｋｋａｒ．
Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ発行Ｘ１９７９）、１
８３〜１９１及びアヒルトガールド （Ａｂｉ’ｌｄｇａａｒｄ）等によるＴｈｒｏｍｂ．
Ｒｅａ． ｉ１、５４９〜５５３（１９７７）。
用下に３ける抗トロンビンＩを検出する種々の方法が公
知である。後者の場合には、試料に、この試料中に存在
するＡＴＩと反応（３） ？、失活されるトロンビンを添加する。次いで、過剰の
トロンビンを、トロンビンの作用によシ着色された物質
を形成する色原住基質と共にインキユベートシ、色形成
を評価することにより検出し、この際、抗トロンビンｌ
一含分は、色形成に対し間嫉的に関係している。抗ト！
ンビンＩの測定法は、例えば、次の文■献に記載されて
いる：ベルグマイヤ−（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ）のメソッ
ズ・オデ・エンザ゛イマティック・アナリシス（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ ； ＶｅｒｌａｇＯｈｅｍｉｅ）第３版、５巻４４
１〜４４８；工．ウイット（Ｗｉｔｔ）のノイエ●メト
ーデン●デル●デリンヌングスアナリイゼ・ミット・ク
ロモｒン●ズゾストラーテン（Ｎｅｕｅ Ｍｅｔｈｏｄ
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・メトーデン・デル・グリンヌングスアナリイゼ（Ｎｅ
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ｓａｎａｌｙｓｅ） ｌ ｌ ９ 〜１ ２ １頁、オ
デガルト（Ｏｄｅｇａｒｄ）等ニよるヘモスタシス（４
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〜２ ０ ９ （１９７８Ｌファリード（Ｆａｒｅａｄ
）等によるクロモゲニツク・ペプチド●ズゾストラーテ
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Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ発行Ｘ１９７９）、１
８３〜１９１及びアヒルトガールド （Ａｂｉ’ｌｄｇａａｒｄ）等によるＴｈｒｏｍｂ．
Ｒｅａ． ｉ１、５４９〜５５３（１９７７）。
一般に、試験時の防害をさけるために、試料は非常に著
るレく稀釈される。それというのも、試料の固有色、濁
シ及び一一値の偏シ並びに塩含分は、試験バッチ中の試
料量を少なく測定できる程、測定結果に少なく影響する
からである。
るレく稀釈される。それというのも、試料の固有色、濁
シ及び一一値の偏シ並びに塩含分は、試験バッチ中の試
料量を少なく測定できる程、測定結果に少なく影響する
からである。
従って、殊に分析装置での反応速度論的測定の実施の際
には、１：１５００までの範囲の試料稀釈率で操作され
る。しかしながら、このことはへ日常作業（Ｒｏｕｔｉ
ｎｅ） （特殊な緊急状態）にとっては非実際的である
。
には、１：１５００までの範囲の試料稀釈率で操作され
る。しかしながら、このことはへ日常作業（Ｒｏｕｔｉ
ｎｅ） （特殊な緊急状態）にとっては非実際的である
。
従って、公知の検出法を改良し、分析装置内で実施する
ことができ、短時間で、かつ試料稀釈することなしに実
施可能であｂ１特有の標準の使用を可能とする方法を提
供することが本発明の課題である。
ことができ、短時間で、かつ試料稀釈することなしに実
施可能であｂ１特有の標準の使用を可能とする方法を提
供することが本発明の課題である。
この課題は、試料とトロンビン及びトロンビンの作用下
に発色する色原住基質との反応及び生じる色の測定によ
る、体液中の抗トロンビンＩの測定法によシ解決され、
この反応は変性剤又はテトラペゾチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏの存在で実施し、基質として、トロンビ
ンに対するその感度がＴｏ ｓ−Ｇ’ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡと比べてＨ 〜Ｍｏｏの低いオリゴペプチ
ド基質を使用することよシ成る。
に発色する色原住基質との反応及び生じる色の測定によ
る、体液中の抗トロンビンＩの測定法によシ解決され、
この反応は変性剤又はテトラペゾチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏの存在で実施し、基質として、トロンビ
ンに対するその感度がＴｏ ｓ−Ｇ’ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡと比べてＨ 〜Ｍｏｏの低いオリゴペプチ
ド基質を使用することよシ成る。
意外にも、変性剤もしくはテトラペプチドの添加及びト
ロンビンに対して比較的鈍感なオリゴペプチド基質の使
用によう、抗トロンビン■を正確かつ再現可能に測定す
ることが成巧し、この際、長い試験シリーズも分析装置
に悪影響を及ぼすことなく実施することができる。
ロンビンに対して比較的鈍感なオリゴペプチド基質の使
用によう、抗トロンビン■を正確かつ再現可能に測定す
ることが成巧し、この際、長い試験シリーズも分析装置
に悪影響を及ぼすことなく実施することができる。
体液内の抗トロンビンＩを測定するために、試料溶液に
トロンビンを過剰に（抗トロンビンＩに対して）加える
。この際に、抗トロンビンｌとトロンビンから錯体が生
じる。このような錯結合されたトロンビンはもはやプロ
テアーゼ活性を有しない。次いで、この溶液に、トロン
ビンによシ色形戒下に分解されうる基質を添加する。過
剰に存在する錯結合されなかったトロンビンのみが、基
質と反応する。測定信号は試料の抗トロンビンＩ濃度と
反比例する。この方法を実施するために、抗トロンビン
Ｉとトロンビンとの間の反応を促進するヘパリンを添加
するのが有利である。
トロンビンを過剰に（抗トロンビンＩに対して）加える
。この際に、抗トロンビンｌとトロンビンから錯体が生
じる。このような錯結合されたトロンビンはもはやプロ
テアーゼ活性を有しない。次いで、この溶液に、トロン
ビンによシ色形戒下に分解されうる基質を添加する。過
剰に存在する錯結合されなかったトロンビンのみが、基
質と反応する。測定信号は試料の抗トロンビンＩ濃度と
反比例する。この方法を実施するために、抗トロンビン
Ｉとトロンビンとの間の反応を促進するヘパリンを添加
するのが有利である。
この方法に好適な基質が多くあるが、そのうち、最も多
く使用されるものはＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ−アセテー｝ （ＯｈｒｏｍｏｚＪ ＴＨ）であ
る。
く使用されるものはＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ−アセテー｝ （ＯｈｒｏｍｏｚＪ ＴＨ）であ
る。
この試薬は高感度を有する。
本発明によれば、付加的に第１工程に変性剤又はテトラ
ペゾチドＧａｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを添加する。
ペゾチドＧａｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを添加する。
長い試験工程で、非稀釈試料の使用の際に（７）
はトロンビン出発値は一定のま筐残らないことが判明し
た。このことは、前記成分の添加によυ排除される。．
変性剤としては、この分野で公知の物質が好適である。
た。このことは、前記成分の添加によυ排除される。．
変性剤としては、この分野で公知の物質が好適である。
尿素又は塩酸グアニジンを使用するのが有利である。こ
の変性剤を、この試験で０．１〜１モル／ｌ又は基質溶
液中で１〜６モル／ｌの濃度で使用するのが有利である
。成分としてテトラペプチドを使用する際には、これを
テスト中で０．０４〜１ｙｎＪ’／一の範囲で添加する
のが有利である。
の変性剤を、この試験で０．１〜１モル／ｌ又は基質溶
液中で１〜６モル／ｌの濃度で使用するのが有利である
。成分としてテトラペプチドを使用する際には、これを
テスト中で０．０４〜１ｙｎＪ’／一の範囲で添加する
のが有利である。
変性剤もしくはテトラペゾチドは、既に試薬溶液に添加
するか又は試料溶液を試薬溶液と共にインキユベートす
る際に添加することができる。変性剤として尿素を使用
する際には、尿素を、まず基質と一緒に添加するのが有
利である。
するか又は試料溶液を試薬溶液と共にインキユベートす
る際に添加することができる。変性剤として尿素を使用
する際には、尿素を、まず基質と一緒に添加するのが有
利である。
それというのも、尿素は、トロンビン安定性に不都合な
影響を有するからである。
影響を有するからである。
本発明方法の更なる主要特徴はクロモチーム（ Ｏｈｒ
ｏｍｏｚｙｍ■） ＴＨに比べてその感度が込〜Ｍｏｏ
であるｚトロンビンに対する色原性オリゴペプ（８） ？ド基質の使用である。この条件を満たすすべての基質
ｖ１例えば、ＯＢＺ−Ｖａ７−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＨ
，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ， Ｈ
−Ｄ−ＶａＩ！−Ｌｕｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ，Ｂｚ−Ｖ
ａＡ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＨ ， Ｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ，Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ並びにＢｚ−Ｌｅｕ一工１ｅ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ（ ＯＢＺ ：カルボペンゾキシ、Ｂｚ：ベンゾイル
、Ｄ−Ｐｒｏ ： Ｄ−プロリン、Ｄ−Ｖａｌ： Ｄ−
バリン、ｐＮＡ ： ｐ−二ト■アニリン）が好適であ
る。
ｏｍｏｚｙｍ■） ＴＨに比べてその感度が込〜Ｍｏｏ
であるｚトロンビンに対する色原性オリゴペプ（８） ？ド基質の使用である。この条件を満たすすべての基質
ｖ１例えば、ＯＢＺ−Ｖａ７−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＨ
，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ， Ｈ
−Ｄ−ＶａＩ！−Ｌｕｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ，Ｂｚ−Ｖ
ａＡ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＨ ， Ｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ，Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ並びにＢｚ−Ｌｅｕ一工１ｅ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ（ ＯＢＺ ：カルボペンゾキシ、Ｂｚ：ベンゾイル
、Ｄ−Ｐｒｏ ： Ｄ−プロリン、Ｄ−Ｖａｌ： Ｄ−
バリン、ｐＮＡ ： ｐ−二ト■アニリン）が好適であ
る。
これらの例として挙げられている化合物は、全て色原体
として、トロンビンによシ分解されるｐ−ニトロアニリ
ンを有する。他の慣用の色原体例えば基質中にｐＮＡの
代シに存在しうる５一アミノー２−ニトロ安息査酸又は
メトキシーニトロアニリンも好適である。基質として、
式： Ｒ−ＯＣＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（ここでＲはＣ−原子数１〜３を有するアルキル基を表
わし、特にメチル基が有利である）のペグチドを使用す
るのが有利である。
として、トロンビンによシ分解されるｐ−ニトロアニリ
ンを有する。他の慣用の色原体例えば基質中にｐＮＡの
代シに存在しうる５一アミノー２−ニトロ安息査酸又は
メトキシーニトロアニリンも好適である。基質として、
式： Ｒ−ＯＣＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（ここでＲはＣ−原子数１〜３を有するアルキル基を表
わし、特にメチル基が有利である）のペグチドを使用す
るのが有利である。
特に、クロモツイム■ＴＨに比べて×ｏ−％０の低い感
度を有する基質を使用するのが有利である。
度を有する基質を使用するのが有利である。
基質が試験溶液中に存在する基質濃度は、そのミハエリ
ス定数に依シ決まる。その都度のミハエリス定数の２〜
２０倍の範囲の基質濃度が好適である。
ス定数に依シ決まる。その都度のミハエリス定数の２〜
２０倍の範囲の基質濃度が好適である。
この方法に使用されるトロンビン濃度は、本発明によれ
ば、技術水準で使用されているトロンビン濃度の３０倍
まで、有利に７〜１５倍〔トロンビン約６ ３ ０ Ｕ
／試験溶液ＩＪ（２５℃で基質としてのＴｏｓ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ｆ有する国際酵素単位トロ
ンビン）までに相当〕まで高めることができる。この範
囲内であるが、よシ少なくないトロンビンを用いて、本
発明方法で２ な訃直線状較正曲線を得ることができ、従で、反応速度
測定の実施は広範囲で、かつ特に快適な試験実施が分析
装置で、標準を用いるだけで可能になる。即ち、測定範
囲にわたる直線性が得られない場合は、多数の標準を用
いて操作すべきであシ、このことが、例えば緊急の場合
にｈａであるこの試験の迅速使用を困紬にする。
ば、技術水準で使用されているトロンビン濃度の３０倍
まで、有利に７〜１５倍〔トロンビン約６ ３ ０ Ｕ
／試験溶液ＩＪ（２５℃で基質としてのＴｏｓ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ｆ有する国際酵素単位トロ
ンビン）までに相当〕まで高めることができる。この範
囲内であるが、よシ少なくないトロンビンを用いて、本
発明方法で２ な訃直線状較正曲線を得ることができ、従で、反応速度
測定の実施は広範囲で、かつ特に快適な試験実施が分析
装置で、標準を用いるだけで可能になる。即ち、測定範
囲にわたる直線性が得られない場合は、多数の標準を用
いて操作すべきであシ、このことが、例えば緊急の場合
にｈａであるこの試験の迅速使用を困紬にする。
試料量は、この試験の測定範囲並びに技術的可能性に依
って決１る。下限は、分析装置のために１μｌである。
って決１る。下限は、分析装置のために１μｌである。
上限は分析装置の型に依シ決まシ、通例５μｌより多く
ない。この試料董が高いと、その他は同じ試験条件下で
は、狭い測定範囲を提供し、更に、よシ高い試料量では
、フイゾリン形成による妨害の程度が増大する。
ない。この試料董が高いと、その他は同じ試験条件下で
は、狭い測定範囲を提供し、更に、よシ高い試料量では
、フイゾリン形成による妨害の程度が増大する。
他方、よシ少ない試料量では、特有の測定信号が低下し
、このことは、非常に少ない量の秤取正確度の上昇に伴
ない、この試験の精度の劣悪化をもたらす。
、このことは、非常に少ない量の秤取正確度の上昇に伴
ない、この試験の精度の劣悪化をもたらす。
本発明のもう１つの目的は、抗トロンビン■の測定試薬
であシ、これは、トロンビン、変性剤又はテトラペゾチ
ドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ並びにトロンビンの
作用下に発色し、クロモツイム■ＴＨと比べて外〜％０
０のトロンビンに対する感度を有する色原住基質を含有
する。
であシ、これは、トロンビン、変性剤又はテトラペゾチ
ドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ並びにトロンビンの
作用下に発色し、クロモツイム■ＴＨと比べて外〜％０
０のトロンビンに対する感度を有する色原住基質を含有
する。
有利な実施形では、この試薬は、付加的にな訟ヘハリン
を含有する。
を含有する。
（１１）
次の実施例につき本発明を詳述する：
例１（比較）
Ｈｏｌ一緩衝液（ｐＨ８−１；これは同時にヘパリンを
充分な量（ ２ ＵＳＰ一単位／ ｍｌ ）で含有する
〕２０部と混合する。トロンビン出発値の測定のために
、このトロンビン試薬２ＴＬｌに、生理食塩水０．１０
ｍｌを、かつ酵素／基質一反応の開始時にトロンビン基
質溶液（クロモツィム■ＴＨ：Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ Ｘ試験バッチ中０．１６ｍモル／ｌ
）０．２００−を添加する。このように規定された試験
バッチ中では、反応速度ＣｊＷｍｉｎ ）が４ ０ ５
ｎｍで２５℃では０．２２０、３７℃では０．４ ０
０に達する。
充分な量（ ２ ＵＳＰ一単位／ ｍｌ ）で含有する
〕２０部と混合する。トロンビン出発値の測定のために
、このトロンビン試薬２ＴＬｌに、生理食塩水０．１０
ｍｌを、かつ酵素／基質一反応の開始時にトロンビン基
質溶液（クロモツィム■ＴＨ：Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ Ｘ試験バッチ中０．１６ｍモル／ｌ
）０．２００−を添加する。このように規定された試験
バッチ中では、反応速度ＣｊＷｍｉｎ ）が４ ０ ５
ｎｍで２５℃では０．２２０、３７℃では０．４ ０
０に達する。
例 ２
試料溶液中の抗トロンビン■を例１に記載の方法で測定
するが、ここでは、クロモツィム■ＴＨ ９本発明の基
質で代えた。
するが、ここでは、クロモツィム■ＴＨ ９本発明の基
質で代えた。
試料稀釈しない手による試験：
（１９）
非稀釈試料 ０．０ １ １１１１ （試験菫ｌ
ｍｌ当少試料３、６μｌに相当） トロンビン試薬 １．２５ｄ（試験中のトロンビン３
０ ８ Ｔｌ／Ｉｓ技術水準に対して１ ４．７ ４
倍） 基 質 ０．２ ５ ｄ （試験中のメチル−
ＯＣＯ−０１．ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰＮＡ Ｑ．２９
８ｍモル／Ａ’％尿素０−５モル／ｌ ）分析装置での
試験： 一ヒタチ（Ｈｉｔａｂｈｉ） ７０４ ／ ７０５ ：
非稀釈試料 ０．００３ｍＡ！（試験ｉｉ一当シ試
料７．１μｌに相当） トロンビン試薬 ０．５ ５ ０ ｍｌ（試験中のト
ロンビン３ ０ ８ Ｕ／ｉ及び Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ２４ ８■／ ｌ
）基 質 ０．０７０ｄ（試験中のＭｅＯ−ｆ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ０．２ ９ ８ｍモル
／／） 一ヒタチ７１７： 非稀釈試料 ０．００２ｍＡ！（試験ｉｉ １ｒｎ
ｌ当多試料６，６μに相当） トロンビン試薬 ０．２５０ｍＡ！（試験中のトロン
ビン３ ０ ８ Ｕ／ｔ及びＧｌ７−ｐｒＯ−Ａｒｇ−
ｐｒＯ ２ ４ ８ ”９／ ｌ ）基 質
０．０５０ｄ（試験中のＭｅＯ（３０−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．２ ９ ８ ｍモル／１１） 第１表 ここで選択された試験条件下に訃ける、クロモツイム■
ＴＨ及びＭｅＯＯＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
の使用時のトロンビン出発値（試料不合）の比較ＭｅＯ
ＯＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− クロモツイム■ＴＨＡｒｇ−
ｐＮＡ （ Ｊ Ｂ／ ｍｉｎ） （ Ａ ｌ／ ｍｉ
ｎ）ヒタチ７１７、３７℃ ［１．４００
５．７００ヒタチ７１入２５℃ ０．
２００ ２．９００ヒタチ７０４３７℃
０．３００ ４．３００ヒタチ７０
４％２５℃ ０．１５０ ２．１
００このヒタチ装置の酵素／基質一反応速度の測定可能
性の限度は約１．ｏ ｏ ＜ ａｉ／ｍｉｎ ）である
。
ｍｌ当少試料３、６μｌに相当） トロンビン試薬 １．２５ｄ（試験中のトロンビン３
０ ８ Ｔｌ／Ｉｓ技術水準に対して１ ４．７ ４
倍） 基 質 ０．２ ５ ｄ （試験中のメチル−
ＯＣＯ−０１．ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰＮＡ Ｑ．２９
８ｍモル／Ａ’％尿素０−５モル／ｌ ）分析装置での
試験： 一ヒタチ（Ｈｉｔａｂｈｉ） ７０４ ／ ７０５ ：
非稀釈試料 ０．００３ｍＡ！（試験ｉｉ一当シ試
料７．１μｌに相当） トロンビン試薬 ０．５ ５ ０ ｍｌ（試験中のト
ロンビン３ ０ ８ Ｕ／ｉ及び Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ２４ ８■／ ｌ
）基 質 ０．０７０ｄ（試験中のＭｅＯ−ｆ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ０．２ ９ ８ｍモル
／／） 一ヒタチ７１７： 非稀釈試料 ０．００２ｍＡ！（試験ｉｉ １ｒｎ
ｌ当多試料６，６μに相当） トロンビン試薬 ０．２５０ｍＡ！（試験中のトロン
ビン３ ０ ８ Ｕ／ｔ及びＧｌ７−ｐｒＯ−Ａｒｇ−
ｐｒＯ ２ ４ ８ ”９／ ｌ ）基 質
０．０５０ｄ（試験中のＭｅＯ（３０−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．２ ９ ８ ｍモル／１１） 第１表 ここで選択された試験条件下に訃ける、クロモツイム■
ＴＨ及びＭｅＯＯＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
の使用時のトロンビン出発値（試料不合）の比較ＭｅＯ
ＯＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− クロモツイム■ＴＨＡｒｇ−
ｐＮＡ （ Ｊ Ｂ／ ｍｉｎ） （ Ａ ｌ／ ｍｉ
ｎ）ヒタチ７１７、３７℃ ［１．４００
５．７００ヒタチ７１入２５℃ ０．
２００ ２．９００ヒタチ７０４３７℃
０．３００ ４．３００ヒタチ７０
４％２５℃ ０．１５０ ２．１
００このヒタチ装置の酵素／基質一反応速度の測定可能
性の限度は約１．ｏ ｏ ＜ ａｉ／ｍｉｎ ）である
。
他の公知の分析装置でも、この高いＡｐａ／ ｍｉｎ−
値では、もはや不可能な分析限度につき当たる。
値では、もはや不可能な分析限度につき当たる。
もちろん、同じことが手による試験にもあては壕シ、こ
こでは、前記条件下で予め稀釈せずに、基質としてクロ
モツイム■ＴＨを用いると、２５℃で３．３のＪＫ一値
が現われ、３７℃では３、０のＪＥ一値が現われる。
こでは、前記条件下で予め稀釈せずに、基質としてクロ
モツイム■ＴＨを用いると、２５℃で３．３のＪＫ一値
が現われ、３７℃では３、０のＪＥ一値が現われる。
（１５）
聰
入
０
任
Ｖ
誠
■
高い感度（クロモツイム■ＴＨの１７条もしくは２０％
）の基質を用いると、全ての試験バジョン（例えば３７
℃もしくは高いトロンビン濃度）で非常に良好な結果で
実施されるとはかぎらないことが明らかでロシ、本発明
方法を有利に試料稀釈せずに実施できる範囲が認められ
る。
）の基質を用いると、全ての試験バジョン（例えば３７
℃もしくは高いトロンビン濃度）で非常に良好な結果で
実施されるとはかぎらないことが明らかでロシ、本発明
方法を有利に試料稀釈せずに実施できる範囲が認められ
る。
（１７）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試料とトロンビン及びトロンビンの作用下に発色す
る色原性基質との反応及び生じる色の測定により、体液
中の抗トロンビンIIIを測定する方法において、この反
応を、変性剤又はテトラペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏの存在下で実施し、基質として、トロンビン
に対するその感度がＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
ｐＮＡと比べて１／５−１／１００の低いオリゴペプチ
ド基質を使用することを特徴とする、体液中の抗トロン
ビンIIIを測定する方法。 ２、オリゴペプチド基質として、式： Ｒ−ＯＣＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ〔式中Ｒ
は、Ｃ−原子数１〜６を有するアルキル基である〕を有
するペプチドを使用する、請求項１記載の方法。 ３、トロンビン、変性剤又はテトラペプチドＧｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ及びトロンビンの作用下に発色す
る基質として、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａと比べたその感度が１／５〜１／１００の低いオリゴ
ペプチド基質を含有することを特徴とする、抗トロンビ
ンIIIの測定試薬
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3923340.5 | 1989-07-14 | ||
| DE3923340A DE3923340A1 (de) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von antithrombin iii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0353898A true JPH0353898A (ja) | 1991-03-07 |
| JPH0734759B2 JPH0734759B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=6385054
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2185456A Expired - Fee Related JPH0734759B2 (ja) | 1989-07-14 | 1990-07-16 | 体液中の抗トロンビン▲ｉｉｉ▼を測定する方法及び試薬 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0408075B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0734759B2 (ja) |
| AT (1) | ATE119578T1 (ja) |
| AU (1) | AU622339B2 (ja) |
| DD (1) | DD298444A5 (ja) |
| DE (2) | DE3923340A1 (ja) |
| ES (1) | ES2069635T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA905489B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995000663A1 (fr) | 1993-06-28 | 1995-01-05 | Nippon Shoji Kaisha, Ltd. | Methode de titrage de l'activite de l'antithrombine iii et kit de reactifs conçu a cet effet |
| JP2008224687A (ja) * | 1998-06-25 | 2008-09-25 | Cardiovascular Diagnostics Inc | エカリンと磁性粒子を含む乾式化学試薬を用いてフィブリノーゲンアッセイを行う方法 |
| US9340820B2 (en) | 2009-08-26 | 2016-05-17 | Queen's University Of Belfast | Compounds and methods for protease detection |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU628960B2 (en) * | 1989-04-07 | 1992-09-24 | Teijin Limited | Method of immunologically assaying human thrombin- antithrombin III complex, assay reagent and kit therefor |
| DK0825443T3 (da) * | 1996-08-17 | 2001-08-06 | Aventis Behring Gmbh | Fremgangsmåde til mængdebestemmelse af glycosaminoglycaner i antitrombin III-holdige opløsninger |
| DE102005003145B4 (de) | 2005-01-21 | 2006-10-19 | Dade Behring Marburg Gmbh | Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3005540A1 (de) * | 1980-02-14 | 1981-08-20 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmung der biologischen aktivitaet von heparin im plasma |
| US4473639A (en) * | 1982-09-15 | 1984-09-25 | Miles Laboratories, Inc. | Reagent strip test for antithrombin-III |
| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3811647A1 (de) * | 1988-04-07 | 1989-10-26 | Behringwerke Ag | Verfahren und verpackung enthaltend mittel zur kinetischen bestimmung von faktor xiii |
-
1989
- 1989-07-14 DE DE3923340A patent/DE3923340A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-07-11 AU AU58885/90A patent/AU622339B2/en not_active Ceased
- 1990-07-12 DD DD90342731A patent/DD298444A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-13 ES ES90113483T patent/ES2069635T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-13 EP EP90113483A patent/EP0408075B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-13 AT AT90113483T patent/ATE119578T1/de active
- 1990-07-13 ZA ZA905489A patent/ZA905489B/xx unknown
- 1990-07-13 DE DE59008621T patent/DE59008621D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-16 JP JP2185456A patent/JPH0734759B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995000663A1 (fr) | 1993-06-28 | 1995-01-05 | Nippon Shoji Kaisha, Ltd. | Methode de titrage de l'activite de l'antithrombine iii et kit de reactifs conçu a cet effet |
| JP2008224687A (ja) * | 1998-06-25 | 2008-09-25 | Cardiovascular Diagnostics Inc | エカリンと磁性粒子を含む乾式化学試薬を用いてフィブリノーゲンアッセイを行う方法 |
| US9340820B2 (en) | 2009-08-26 | 2016-05-17 | Queen's University Of Belfast | Compounds and methods for protease detection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA905489B (en) | 1991-04-24 |
| ES2069635T3 (es) | 1995-05-16 |
| AU622339B2 (en) | 1992-04-02 |
| ATE119578T1 (de) | 1995-03-15 |
| EP0408075A3 (en) | 1992-02-26 |
| JPH0734759B2 (ja) | 1995-04-19 |
| DE59008621D1 (de) | 1995-04-13 |
| AU5888590A (en) | 1991-01-17 |
| EP0408075B1 (de) | 1995-03-08 |
| DE3923340A1 (de) | 1991-01-24 |
| EP0408075A2 (de) | 1991-01-16 |
| DD298444A5 (de) | 1992-02-20 |
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