CN107748263A - 一种纤维蛋白溶酶原的新用途及试剂盒 - Google Patents

一种纤维蛋白溶酶原的新用途及试剂盒 Download PDF

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徐忠伟
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Abstract

本发明涉及一种纤维蛋白溶酶原的新用途及试剂盒。通过检测脑脊液中PLG的含量，可准确判断TBI患者受伤严重程度；通过以上方法制备的试剂盒，可有效的检测脑脊液中PLG的含量，进而准确的评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度，具有特异性好、敏感度高、重现性好等优点，具有很大的应用价值。

Description

一种纤维蛋白溶酶原的新用途及试剂盒
技术领域
本发明属于医疗领域，特别涉及一种纤维蛋白溶酶原的新用途及 试剂盒。
背景技术
创伤性颅脑损伤(TBI)是世界上影响人类健康的一个重要因素， 具有极高的发生率，最近统计显示，美国每年有200万例TBI发生， 其中43％的TBI患者会遗留残疾，中国每年有100万例TBI发生，而中 国头部外伤数据显示，TBI患者的死亡率可以达到21.8％。
根据损伤程度，TBI可以分为轻度、中度和重度TBI。其划分方法 主要依据格拉斯哥昏迷评分(GCS)，即在TBI中，GCS在3到8之间的 患者为重度TBI，GCS在9到12之间的患者为中度TBI，GCS在13到 15之间的患者为轻度TBI。其中GCS评分主要通过睁眼反应、语言反应和运动反应对TBI患者伤情进行评估，由于主治医生的经验等原因， 评估结果往往具有一定的主观性，而且TBI往往伴随着多发伤，导致 医生根据与TBI无关的睁眼、语言和运动障碍对TBI病情的误判，此 外，不同国家、不同地域的语言也可能存在一定的交流障碍。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种纤维蛋白溶酶原的新 用途及试剂盒，该新用途及试剂盒可用于评估TBI患者伤情严重程度， 且结果准确，操作简便，具有较大的应用价值。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了用于检测纤维蛋白溶酶原(PLG)的物质在制备评估 或辅助评估TBI患者受伤严重程度的产品中的应用。
本发明提供了用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患 者受伤严重程度的试剂盒中的应用。
通过检测脑脊液中PLG的含量，可以评估或辅助评估TBI患者的 受伤严重程度，该评估方法特异性和灵敏性高，重现性好。
进一步改进，用于检测PLG的物质为抗PLG的抗体。
优选地，PLG的抗体具体为兔抗PLG抗体。
进一步优选地，兔抗PLG抗体为abcam公司的兔抗PLG抗体。
进一步地，PLG的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了PLG在制备评估TBI患者伤情严重程度的标记物 中的应用。
本发明还提供了一种用于评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度 的试剂盒，该试剂盒包括用于检测PLG的物质。
本发明通过在试剂盒中添加用于检测PLG的物质，可以通过检测 脑脊液中PLG的含量，评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度。
进一步改进，试剂盒包括保存液，所述保存液由重量份为1-5份 的海藻糖、15-30份的甘油、20-30份的血清和10-20份的1640培养 液组成。
本发明通过以海藻糖、甘油、血清和1640培养液作为保存液的组 成成分，使酶标抗PLG抗体的保存时间更长，保持酶标抗PLG抗体的 活性从而更加准确的测定脑脊液中PLG的含量，得出确切的诊断结果。
进一步改进，试剂盒还包括稀释液，所述稀释液由50-70份的磷 酸盐缓冲液(PBS)、10-25份的吐温100(tween100)和1-5份的牛 血清白蛋白(BSA)组成。
本发明通过以PBS、tween100和BSA作为稀释液的组成成分，使 酶标抗PLG抗体的稀释效果更好，从而更好的测定其PLG的含量。
本发明通过检测脑脊液中PLG的含量，可准确判断TBI患者受伤 严重程度；通过以上方法制备的试剂盒，可有效的检测脑脊液中PLG 的含量，进而准确的评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度。
附图说明
图1为试验例1的试验结果，图1为TBI大鼠脑组织损伤区以及 假手术组大鼠对应部位蛋白的荧光图；1表示兔抗PLG抗体免疫荧光分 析图，2表示用DAPI复染色图；3中merged表示a、b融合图；
图2-6为试验例2的试验结果，图2为兔抗PLG抗体的PLG检测 结果；图3为鼠抗PLG抗体的PLG检测结果；图4为羊抗PLG抗体的 PLG检测结果；图5为上海瑞齐生命科学有限公司兔抗PLG抗体的PLG 检测结果；图6为含上海普欣生物技术有限公司兔抗PLG抗体的PLG检测结果。
具体实施方式
实施例1
一种试剂盒，包括保存液，其中保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 1份 甘油 15份
血清 20份 1640培养液 10份。
实施例2
一种试剂盒，包括保存液，其中保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 3份 甘油 25份
血清 25份 1640培养液 15份。
实施例3
一种试剂盒，包括保存液，其中，保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 5份 甘油 30份
血清 30份 1640培养液 20份。
实施例4
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 50份 tween100 10份
BSA 1份。
实施例5
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 60份 tween100 15份
BSA 3份。
实施例6
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 70份 tween100 25份
BSA 5份。
对照例1
一种试剂盒，包括保存液，其中，保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 1份 甘油 15份
血清 10份 1640培养液 10份
枸橼酸 10份。
对照例2
一种试剂盒，包括保存液，其中，保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 1份 甘油 15份
枸橼酸 20份 1640培养液 10份。
对照例3
一种试剂盒，包括保存液，其中，保存液包括下列重量的成分：
海藻糖 1份 甘油 15份
血清 20份。
对照例4
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 25份 tween100 10份
BSA 1份 硫酸钠 25份。
对照例5
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 25份 tween100 10份
硫酸钠 26份。
对照例6
一种试剂盒，包括稀释液，其中，稀释液包括下列重量的成分：
PBS 50份 BSA 11份。
试验例1血纤维蛋白溶酶原可以作为TBI患者伤情严重程度的标记物 的发现过程
配对样本：6只TBI SD大鼠，以及假手术SD大鼠。
通过iTRAQ对TBI大鼠脑组织损伤区以及假手术组大鼠对应部位 蛋白进行标记，采用定量蛋白组学UPLC-LTQ Orbitrap-Velos超高压 液相与质谱分析TBI后大鼠损伤区脑组织蛋白表达变化；MaxQuant(版 本1.5.3.28)搜索Swiss-Prot(版本release 2015_08,7928query number)数据库。经典卡值：蛋白质丰度增加1.0倍或者蛋白质丰度 减少1.0倍。
通过免疫荧光技术证实PLG基因在TBI组中表达量显著上调。具 体的实验方法如下:分别取各个样本，进行免疫组织化学检测。一抗为 PLG抗体(Abcam,货号：ab154560)，二抗为羊抗兔荧光二抗(Abcam, 货号：ab150077)，结果见图1。
试验例2PLG在TBI患者脑脊液中的水平差异
检测样本：178例TBI患者的脑脊液(55例轻度TBI，61例中度 TBI，62例重度TBI)。
其中，各个患者均为知情同意的志愿者。
分组：
第一组：abcam公司的兔抗PLG抗体制备的评估或辅助评估TBI 患者受伤严重程度的产品。
第二组：abcam公司的鼠抗PLG抗体制备的评估或辅助评估TBI 患者受伤严重程度的产品。
第三组：abcam公司的羊抗PLG抗体制备的评估或辅助评估TBI 患者受伤严重程度的产品。
第四组：上海瑞齐生命科学有限公司的兔抗PLG抗体制备的评估 或辅助评估TBI患者受伤严重程度的产品。
第五组：上海普欣生物技术有限公司的兔抗PLG抗体制备的评估 或辅助评估TBI患者受伤严重程度的产品。
分别取各个样本，分别用以上五组进行酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测，测定PLG的含 量，178例TBI患者脑脊液PLG检测结果分别见图2-6(每个点代表1 个样本)。
由图2-6可知，第一组产品对TBI患者受伤严重程度的评估准确 度为100％；第二组产品的测定结果中，轻度患者数量由55例降低到 43例，中度患者由61例升高到64例，重度患者由62例升高到71例， 评估准确度由100％下降到86.52％；第三组产品的测定结果中，测定结 果中的轻度患者数量由55例上升到63例，中度患者由61例下降到57 例，重度患者由62例下降到58例，评估准确度由100％下降到88.76％； 第四组产品的测定结果中，测定结果中的轻度患者数量由55例下降到40例，中度患者由61例下降到60例，重度患者由62例上升到78例， 评估准确度由100％下降到82.02％；第五组产品的测定结果中，测定结 果中的轻度患者数量由55例下降到44例，中度患者由61例上升到65 例，重度患者由62例上升到69例，评估准确度由100％下降到87.64％。
因此，abcam公司的兔抗PLG抗体对TBI患者受伤严重程度的灵敏 度和特异性最大。
试验例3抗体保存时间试验
将酶标抗PLG抗体放置于实施例1-3和对照例1-3的试剂盒中， 并将试剂盒放置于-20℃冰箱中保存，分别于0、1、2、3、6、12、24 和36个月后取样，测定其蛋白含量，结果见表1。
表1不同的试剂盒对抗体的保存时间的试验结果
由上述试验结果可知，对照例1-3是在本发明提供的试剂盒的基 础上进行常规的增加、删除和替换，如对照例1中增加枸橼酸，对照 例2用枸橼酸替换血清，对照例3删除1640培养液。
实施例1-3的试剂盒中的酶标抗PLG抗体的蛋白浓度在24个月以 内，蛋白浓度没有变化，在第36个月时蛋白浓度稍有变化，而对照例 1-3的试剂盒中的酶标抗PLG抗体的蛋白浓度在第6个月甚至第三个月 就开始降低，到第36个月时，蛋白浓度极低，而实施例2的试剂盒对 酶标抗PLG抗体的保存时间长于实施例1和实施例3，证明本发明提供 的试剂盒对酶标抗PLG抗体的保存时间更长，证明当试剂盒包括3份 海藻糖、25份的甘油、25份的血清和15份的1640培养液时，对酶标 抗PLG抗体的保存时间最长，进而保证酶标抗PLG抗体的特异性和灵 敏度。
试验例4酶标抗PLG抗体的稀释试验
将酶标抗PLG抗体放置于实施例4-6和对照例4-6的试剂盒的稀 释液中稀释，并观察稀释后酶标抗PLG抗体的均匀度，结果见表2。
表2酶标抗PLG抗体稀释试验结果
由上述试验结果可知，对照例4-6是在本发明提供的试剂盒的基 础上进行常规的增加、删除和替换，如对照例4中增加硫酸钠，对照 例5用硫酸钠替换BSA，对照例6删除tween100。
由上述实验结果可知，实施例4-6的试剂盒中的稀释液对酶标抗 PLG抗体进行稀释后的均匀度均在90％以上，而对照例4-6的试剂盒中 的稀释液对酶标抗PLG抗体进行稀释后的均匀度相对较低，且实施例5 的试剂盒中的稀释液对酶标抗PLG抗体的稀释效果好于实施例4和实 施例6，证明当试剂盒包括60份PBS、15份的tween100和3份的BSA 时，对酶标抗PLG抗体的稀释效果最好。
序列表
<110> 北京臻惠康生物科技有限公司
<120> 一种抗PLG的新用途及试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
mehkevvlll llflksgqge plddyvntqg aslfsvtkkq lgagsieeca akceedeeft 60
crafqyhske qqcvimaenr kssiiirmrd vvlfekkvyl secktgngkn yrgtmsktkn 120
gitcqkwsst sphrprfspa thpsegleen ycrnpdndpq gpwcyttdpe krydycdile 180
ceeecmhcsg enydgkiskt msglecqawd sqsphahgyi pskfpnknlk knycrnpdre 240
lrpwcfttdp nkrwelcdip rcttpppssg ptyqclkgtg enyrgnvavt vsghtcqhws 300
aqtphthnrt penfpcknld enycrnpdgk rapwchttns qvrweyckip scdsspvste 360
qlaptappel tpvvqdcyhg dgqsyrgtss ttttgkkcqs wssmtphrhq ktpenypnag 420
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pwcyttnprk lydycdvpqc aapsfdcgkp qvepkkcpgr vvggcvahph swpwqvslrt 600
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Claims (10)

1.用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的产品中的应用。
2.用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒中的应用，其特征在于，所述用于检测PLG的物质为抗PLG的抗体。
4.如权利要求3所述的用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒中的应用，其特征在于，所述PLG的抗体具体为兔抗PLG抗体。
5.如权利要求4所述的用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒中的应用，其特征在于，所述兔抗PLG抗体为abcam公司的兔抗PLG抗体。
6.如权利要求2所述的用于检测PLG的物质在制备评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒中的应用，其特征在于，所述PLG的序列如SEQ ID NO.1所示。
7.PLG在制备用于评估TBI患者伤情严重程度的标记物中的应用。
8.一种用于评估或辅助评估TBI患者受伤严重程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测PLG的物质。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括保存液，所述保存液由重量份为1-5份的海藻糖、15-30份的甘油、20-30份的血清和10-20份的1640培养液组成。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括稀释液，所述稀释液由50-70份的PBS、10-25份的tween100和1-5份的BSA组成。
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