CN114137202A - 单克隆抗体保存液 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及抗体试剂领域，具体涉及单克隆抗体保存液，主体为缓冲溶液，在缓冲溶液中，包括如下的组分：糖类、甘油、氯化钠、防腐剂、葫芦脲、非离子表面活性剂、DMSO；其中，糖类为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、HCl‑Tris缓冲溶液或Hepes缓冲溶液中的一种，所述缓冲溶液的pH值为6.8～7.4。在本申请中，通过添加葫芦脲，并加入糖类物质和DMSO进行增容，使葫芦脲可以对抗体起到一定的保护作用，减少抗体在该保存液中时反复冻融造成的抗体损坏。
Description
技术领域
本申请涉及抗体试剂领域，更具体地说，它涉及单克隆抗体保存液。
背景技术
单克隆抗体是一种重要的生物医药物质，其在生物科学领域具有重要的运用，在检测、治疗等领域具有重要的意义。
在试剂盒检测中，需要对抗体进行标记并与抗原结合，进而测定抗原的浓度。一般情况下，单克隆抗体需要保存于保存液中，保存液一般保存于4℃或-20℃下，前者适用于短期保存，后者可以长期保存。
在抗体完成制备后，常常需要对抗体进行分装等操作。由于在实际使用中，单次使用的抗体量较少，因此难免需要对-20℃下保存的抗体溶解后再进行使用，使用完毕后又要将其冻回至-20℃下。在该过程中，抗体本身会有明显的损失。
发明内容
为了减少单克隆抗体保存时的因反复冻融造成的损失，本申请提供单克隆抗体保存液。
本申请中，提供了单克隆抗体保存液，主体为缓冲溶液，在缓冲溶液中，包括如下浓度的组分：
其中，糖类为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、HCl-Tris缓冲溶液或Hepes缓冲溶液中的一种，所述缓冲溶液的pH值为6.8～7.4。
在上述单克隆抗体保存液中，首先糖类物质和甘油可以起到降低凝固点的效果，使得整体在冻融过程中，冰点较低，在更低的温度才会产生结冰现象。同时，由于甘油的加入量并不多，因此在-20℃时，已经可以形成结冰的状态，且在上述过程中，体系内不易形成大量细小冰晶，整体热量传递过程均匀稳定，不易对抗体本身产生影响。
葫芦脲是一种新型化合物，其本体具有若干首尾相连苷脲单元，整体成环后，可以对抗体中的N端进行保护，减少保存液在结冰的过程中，抗体结构的损伤。且相较于其他包覆组分(如环糊精等)，葫芦脲结构与抗体之间的结合能力较弱，在抗体实际使用时，不需要进行其他分离过程，抗体即可与抗原较好地结合，进而完成检测过程。
非离子表面活性剂对于上述组分，具有较好的稳定作用，可以减少物料的聚沉，提高体系的均匀度。氯化钠除了提供必要的渗透压之外，还可以形成一定的离子强度，减少抗体之间的聚沉，使抗体更加稳定。且在上述组分中，葫芦脲的水溶性较差，因此加入DMSO和非离子表面活性剂对葫芦脲进行增容后，可以使葫芦脲较为均匀地分散于体系中。此外，上述技术方案中选用糖类物质和甘油共同使用，目的也在于使糖类物质分散于保存液中之后，可以更好地对葫芦脲进行分散，葡萄糖、蔗糖、海藻糖等小分子糖类物质生物相容性较好，且增溶效果较佳，在上述方案中，可以进一步可选的，所述缓冲溶液中还包括浓度为6～10mg/mL的明胶。
通过添加一定量的明胶，可以使保存液内形成一定的有机框架结构，在保存液结冰的过程中，可以对抗体进行较好的保护效果，进一步减少抗体因反复冻融造成的损失。
可选的，所述缓冲溶液中，还包括浓度为0.2～0.4mg/mL的低聚果糖。
在上述技术方案中，通过加入低聚果糖，一方面具有更好的稳定性，减少抗体体系和葫芦脲的沉聚沉同时，起到一定的替代抗生素的作用，减少细菌病毒感染的可能习惯。同时，低聚果糖可以通过果糖的结构，强化葫芦脲对抗体的保护效果。
可选的，所述低聚果糖为蔗果三糖。
经过实验，蔗果三糖在体系中与抗体的相容性较好，对抗体后续实验的影响较小，且对于抗冻融的效果有一定的提升。更高聚合度的蔗果四糖和蔗果五塘效果均弱于蔗果三糖。
可选的，所述非离子表面活性剂为鼠李糖脂和脂肪醇聚氧乙烯醚的组合，鼠李糖脂和脂肪醇聚氧乙烯醚的质量比为1∶2～1∶3。
采用鼠李糖脂和脂肪醇聚氧乙烯醚的组合作为乳化剂，稳定性和耐冻融性均较好。其中，脂肪醇聚氧乙烯醚主要通过脂肪长链和一端的羟基产生乳化效果，其分子链具有较好的柔性，在冻结的过程中，有助于进一步减少因分子结构变化产生的变质现象。而鼠李糖脂一端为糖基，另一端为长脂肪双链，该结构同样具有较好的柔性。这两种柔性的分子可以对葫芦脲和抗体之间的结构起到更好的包覆和保护作用，减少冻融过程中的抗体损坏。
可选的，所述缓冲溶液中，还包括浓度为0.2～0.3mg/mL的超氧化物歧化酶。
超氧化物歧化酶可以减少体系中氧化反应的发生，延长保存液的保存时间。
可选的，所述缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L。
上述浓度范围的缓冲溶液具有较好的耐冻融性，且对于抗体的相容性较好。
可选的，所述防腐剂为叠氮化钠或硫柳汞中的一种。
叠氮化钠和硫柳汞均具有较好的抗菌效果，作为防腐剂可以大幅延长抗体的保存时间。
可选的，所述葫芦脲为葫芦[6]脲。
选用葫芦[6]脲，其对于抗体的保护效果较好，且价格较为便宜，目前葫芦[6]脲已经有较为成熟稳定的合成方法，适用性较好。
综上所述，本申请包括如下至少一种有益效果：
1、在本申请中，通过添加葫芦脲，并加入糖类物质和DMSO进行增容，使葫芦脲可以对抗体起到一定的保护作用，减少抗体在该保存液中时反复冻融造成的抗体损坏。
2、在本申请进一步设置中，通过添加明胶，形成的有机骨架可以对抗体进行保护，进一步减少因反复冻融造成的损失。
3、在本申请进一步设置中，通过添加低聚果糖，提高稳定性的同时，进一步强化葫芦脲对抗体的保护效果。
具体实施方式
在以下实施例中，通过配置不同的保存液，其中，对部分保存液，通过保存不同的抗体，并对抗体的效价测定，测定保存结果的有效性。
实施例1～5及对比例，一种单克隆抗体保存液，其组分如表1所示。
表1、实施例1～5剂对比例1～15的组分配比
其中，糖类为蔗糖，防腐剂为叠氮化钠，葫芦脲为葫芦[6]脲，非离子表面活性剂为平平加o-15(购买自海安石化)，缓冲溶液的体积为100mL。
单克隆抗体保存液的配置方法如下：
先量取100mL事先配置好的缓冲溶液，再将其他组分加入到缓冲溶液中，一边加入一边保持搅拌，随后放置于4℃下备用。
将非离子表面活性剂替换为其他种类表面活性剂，具体如下。
对比例16，一种单克隆抗体保存液，与实施例2的区别在于，非离子表面活性剂等质量地替换为硬脂酸钠。
对比例17，一种单克隆抗体保存液，与实施例2的区别在于，非离子表面活性剂等质量地替换为十二烷基磺酸钠。
对比例18，一种单克隆抗体保存液，与实施例2的区别在于，非离子表面活性剂等质量地替换为十二烷基二甲基苄基氯化铵。
在实施例2的基础上，进一步添加组分，得到如下实施例。
实施例6，一种单克隆抗体保存液，与实施例2的区别在于，缓冲溶液中，还添加有0.6g的明胶。
实施例7，一种单克隆抗体保存液，与实施例6的区别在于，明胶的加入量为0.8g。
实施例8，一种单克隆抗体保存液，与实施例6的区别在于，明胶的加入量为1.0g。
实施例9，一种单克隆抗体保存液，与实施例7的区别在于，缓冲溶液中，还添加有0.2g的蔗果三糖。
实施例10，一种单克隆抗体保存液，与实施例9的区别在于，蔗果三糖的添加量为0.4g。
实施例11，一种单克隆抗体保存液，与实施例9的区别在于，蔗果三糖等量地替换为蔗果四糖。
实施例12，一种单克隆抗体保存液，与实施例9的区别在于，蔗果三糖等量地替换为蔗果五糖。
实施例13，一种单克隆抗体保存液，与实施例9的区别在于，缓冲溶液中，还添加有20mg超氧化物歧化酶。
实施例14，一种单克隆抗体保存液，与实施例13的区别在于，缓冲溶液中超氧化物歧化酶的添加量为30mg。
实施例15～19中，均涉及单克隆抗体保存液，在实施例13的基础上，对非离子表面活性剂进行了调整，具体如下。
实施例15，非离子表面活性剂为0.4g鼠李糖脂和0.8g平平加o-15。
实施例16，非离子表面活性剂为0.3g鼠李糖脂和0.9g平平加o-15。
实施例17，非离子表面活性剂为0.2g鼠李糖脂和1.0g平平加o-15。
实施例18，非离子表面活性剂为1.2g鼠李糖脂。
实施例19～21，均涉及单克隆抗体保存液，在实施例15的基础上，调整了缓冲溶液的浓度，其中，实施例19～21的缓冲溶液浓度分别为20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L。
实施例22，一种单克隆抗体保存液，与实施例15的区别在于，糖类选用葡萄糖，防腐剂选用硫柳汞。
实施例23，一种单克隆抗体保存液，与实施例15的区别在于，糖类选用海藻糖(cas：99-20-7)。
对于上述实施例和对比例，首先验证保存液自身的稳定性，具体测定方法如下。
配置完成后保存液后，在室温下静置24h，观察保存液中是否有分层、上述单克隆抗体保存液的稳定性结果如表2所示。
表2、实施例1～23及对比例1～18的稳定性
| 编号 | 稳定性 | 编号 | 稳定性 | 编号 | 编号 |
| 实施例1 | 无沉淀不分层 | 实施例15 | 无沉淀不分层 | 对比例6 | 有部分沉淀 |
| 实施例2 | 无沉淀不分层 | 实施例16 | 无沉淀不分层 | 对比例7 | 有部分沉淀 |
| 实施例3 | 无沉淀不分层 | 实施例17 | 无沉淀不分层 | 对比例8 | 有部分沉淀 |
| 实施例4 | 无沉淀不分层 | 实施例18 | 无沉淀不分层 | 对比例9 | 有部分沉淀 |
| 实施例5 | 无沉淀不分层 | 实施例19 | 无沉淀不分层 | 对比例10 | 无沉淀不分层 |
| 实施例6 | 无沉淀不分层 | 实施例20 | 无沉淀不分层 | 对比例11 | 无沉淀不分层 |
| 实施例7 | 无沉淀不分层 | 实施例21 | 无沉淀不分层 | 对比例12 | 无沉淀不分层 |
| 实施例8 | 无沉淀不分层 | 实施例22 | 无沉淀不分层 | 对比例13 | 有部分沉淀 |
| 实施例9 | 无沉淀不分层 | 实施例23 | 无沉淀不分层 | 对比例14 | 有部分沉淀 |
| 实施例10 | 无沉淀不分层 | 对比例1 | 无沉淀不分层 | 对比例15 | 有部分沉淀 |
| 实施例11 | 无沉淀不分层 | 对比例2 | 无沉淀不分层 | 对比例16 | 有部分沉淀 |
| 实施例12 | 无沉淀不分层 | 对比例3 | 无沉淀不分层 | 对比例17 | 有部分沉淀 |
| 实施例13 | 无沉淀不分层 | 对比例4 | 有部分沉淀 | 对比例18 | 有部分沉淀 |
| 实施例14 | 无沉淀不分层 | 对比例5 | 有部分沉淀 |
通过上述实验可知，在添加了葫芦[6]脲之后，对于整体的稳定性有一定的影响，因此在不添加糖类、非离子表面活性剂、DMSO的情况下，对保存液整体的稳定性具有明显的不良影响，长期放置保存液自身就会发生沉淀或分层。因此，对比例4～9及对比例13～18均不属于可行的方案。
排除对比例4～9及对比例13～18后，进一步对上述保存液的抗冻融性能和保存稳定性进行测定，其中，对抗冻融性能，选用不同种类的单克隆抗体进行分别实验，并通过酶联免疫吸附剂测定法测定抗体的活性。其中，选取的抗体为：鼠抗人CA15-3单克隆抗体(货号MT00701)、CA125抗体(货号MT00602)和抗甲状腺球蛋白抗体(货号MH00602)，抗体在保存液中的浓度为1ug/mL。三种抗体均为隆基生物自产，具体检测方法如下：先用50mM的PH 9.6的CB缓冲稀释对对应的抗原进行稀释至1ug/mL，在96孔板中，按照100μL/孔的量进行包被，包被的时间为12h，包被温度为4℃，随后用PBST洗板三次，拍干后，用含有1％BSA的PBST溶液(浓度10mM，pH＝7.4)进行封闭，封闭时间为2h，温度为37℃随后用PBST洗板三次并拍干。
拍干后加入保存液中的抗体连同保存液，并加入到上述孔中，加入量为100μL/孔，加入完毕后37℃孵育30min，用PBST洗板三次并拍干，再加入二抗(HRP标记羊抗鼠IgG，1μg/mL，100μL/孔)，37℃孵育0.5h，随后用PBST洗板三次，拍干后分别加入显色液A和显色液B(各50μL/孔)，测定样本在450nm和630nm双波长下的OD值。
对于每组实施例，具体通过如下实验进行判定。
1、抗冻融性能，将保存有抗体的保存液在-20℃下冻结，再在4℃下溶解，反复十次，随后测定冻融前后的抗体吸光度下降比率。
2、耐候性实验：将保存有抗体的保存液在4℃下放置3个月，测定放置前后抗体的吸光度下降比率。
实施例1～21、对比例1～3及对比例10～12的实验结果如表3所示。
表3、实施例1～21及部分对比例的实验结果
通过上述实验对比，不难得到如下结论。
对比例1～3中，与实施例1～3相比，缺少了葫芦脲组分，对比例10～12中，则将甘油全部替换成了糖类物质。这二者均导致保存液的抗冻融性能大幅下降。葫芦脲对于抗体的保护效果较为明显，在良好增溶的情况下，能够大幅降低保存液反复冻融后抗体的损失。上述效果在PBS体系、HCl-tris体系和HEPES体系中均适用。缺少甘油导致抗冻融能力差的原因，可能是在冻融过程中，缺少甘油的组分凝固点较高，会较快地形成冰晶，冰晶的单晶体积较大，对抗体分子有一定的影响。
在实施例6～8中加入了明胶，实施例9～12在实施例7的基础上进一步加入了低聚果糖。这二者的加入均对整体抗冻性能有明显的改善作用。明胶形成的交联结构有助于强化抗体和葫芦脲之间的保护效果，使得抗体的高级蛋白结构不易发生变化，而低聚果糖则强化了该交联结构的强度。且上述体系对于抗体的发光性能本身没有明显的影响。
实施例15～19中调整了非离子表面活性剂的使用，通过数据可以表明，鼠李糖脂和平平加在一定比例内可以形成较好的稳定效果，同时对于保存液的耐候性和抗冻融性均有明显的提升。不论单独使用鼠李糖脂或平平加o-15均没有此效果。可能原因在于，二者均具有较长的柔性碳链，且鼠李糖脂实际上具有多碳链结果，对于抗体而言，N端和C端的形态不同，意味着其需要不同的乳化剂进行保护，采用鼠李糖脂和平平及o-15的组合形成的保护交过较佳。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.单克隆抗体保存液，其特征在于，主体为缓冲溶液，在缓冲溶液中，包括如下浓度的组分：
糖类 10～30 mg/mL；
甘油 20～30 mg/mL；
氯化钠 8～10 mg/mL；
防腐剂 0.2～0.5mg/mL；
葫芦脲 0.2～0.5 mg/mL；
非离子表面活性剂 10～12mg/mL；
DMSO 5～10μL/mL；
其中，糖类为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的至少一种；所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、HCl-Tris缓冲溶液或Hepes缓冲溶液中的一种，所述缓冲溶液的pH值为6.8～7.4。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述缓冲溶液中还包括浓度为6～10 mg/mL的明胶。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述缓冲溶液中，还包括浓度为0.2～0.4 mg/mL的低聚果糖。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述低聚果糖为蔗果三糖。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述非离子表面活性剂为鼠李糖脂和脂肪醇聚氧乙烯醚的组合，鼠李糖脂和脂肪醇聚氧乙烯醚的质量比为1∶2～1∶3。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述缓冲溶液中，还包括浓度为0.2～0.3 mg/mL的超氧化物歧化酶。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述缓冲溶液的浓度为30～50 mmol/L。
8.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠或硫柳汞中的一种。
9.根据权利要求1所述的单克隆抗体保存液，其特征在于，所述葫芦脲为葫芦[6]脲。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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