CN106771251A

CN106771251A - 兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒

Info

Publication number: CN106771251A
Application number: CN201710018772.1A
Authority: CN
Inventors: 王钊; 王金凤; 蒋欣
Original assignee: Cypress Diagnostic Products (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Cypress Diagnostic Products (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: CN106771251B

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒。为解决现有技术中存在的特异性差和灵敏度低的技术问题，提供一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体胶乳微球溶液。本发明的试剂盒采用的糖基化修饰鼠抗IgG4单克隆抗体操作简便，能够批量处理抗体，利于产业化；解决了无商业化HBR可用的问题，使得试剂在测定HAMA和RF干扰样本时，相对西门子试剂假阳性率大幅度降低；解决了切除FC段消除RF方法带来的灵敏度不足，本发明的线性范围可达到0.040‑4.000g/L。

Description

兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型(IgG4)检测试剂盒。

背景技术

正常人的IgG包括四个亚型，其IgG1占60～70％，IgG2占15～20％，IgG3占5～10％，IgG4占1～7％。IgG4相关性疾病是一种与IgG4淋巴细胞密切相关的慢性、系统性疾病，该类疾病以血清IgG4水平升高以及IgG4阳性细胞浸润多种器官和组织为特征，常见受累器官包括泪腺、胰腺和腹膜后间隙等，累及的器官或组织由于慢性炎症及纤维化进程可导致弥漫性肿大。该类疾病对皮质激素治疗反应良好。

IgG4为人体内含量最低的免疫球蛋白G亚型，所以检测试剂需要灵敏度较高，并且，检测试剂需要避免与其他种类的免疫球蛋白以及IgG1-3交叉反应，需要非常高的特异性。最理想的选择是特异性识别IgG4的单克隆抗体。目前仅有西门子的IgG4检测试剂被CFDA(国家食品药品监督管理局)批准广泛被使用，其采用的是高灵敏度的胶乳免疫比浊法。

本领域的免疫试剂开发人员熟知，免疫检测试剂的特异性不仅与抗体特异性相关，更需要屏蔽人体免疫系统对检测试剂所用抗体的干扰(各种人抗动物抗体，统称异嗜性抗体Heterophile Antibody)以及类风湿因子(RF)的干扰。其中20-40％的人群对HAMA(人抗鼠抗体)存在不同程度的干扰，在不发达地区，由于鼠源接触率更高，此比例更高。含有HAMA的人进行检测时，如果检测试剂盒没有抗干扰能力通常会出现假阳性结果，最经典的案例就是上世纪美国HCG早孕试纸假阳性事件。采用鼠源单克隆抗体开发免疫检测试剂时无法回避因HAMA带来的特异性问题。商业化高特异性识别的IgG4的鼠单克隆抗体已经出现多年，消除HAMA以及RF的试剂HBR(Heterophile Antibody Blocking Reagent)也已经在各种使用鼠单克隆抗体的检测试剂盒中被广泛使用，如菲鹏生物的Hire-E-010，迈迪安公司的TRU Blocker，SCantibody公司的HBR系列……。但是，鼠抗人IgG4抗体，其类免疫反应原理似于RF和HAMA，是识别免疫球蛋白本身的抗体，会被上述商业化HBR当做是识别免疫球蛋白的干扰物，并且可能上述HBR试剂中本身含有免疫球蛋白4的亚类；造成HBR与IgG4的鼠单克隆抗体之间交叉反应，使得IgG4检测试剂盒无法使用商业化的HBR屏蔽HAMA以及RF干扰。因此，为了消除RF的干扰，切除抗体FC段的方法在欧洲各诊断试剂公司被广泛采用，但是会损失一定的抗体亲和力，导致检测试剂灵敏度下降，使得必须提高样本量才能满足相应灵敏度不变，导致线性范围下降。在检测西门子IgG4试剂时也发现，HAMA干扰存在一定问题，出现不少假阳性样本。且其试剂灵敏度较低，不能实现较宽线性范围的检测。

发明内容

本发明的目的在于解决以上现有技术中存在的技术问题，提供一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型(IgG4)检测试剂盒，该试剂盒有效消除了HAMA和RF干扰，具体地，通过糖基化修饰鼠抗人IgG4单克隆抗体能够有效减弱其被RF和HAMA识别的亲和力，使用糖基化修饰后的鼠单克隆抗体开发免疫球蛋白G4试剂盒能达到减弱HAMA和RF干扰，提高试剂特异性的优点，解决了切除FC段消除RF方法带来的灵敏度不足的技术问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体胶乳微球溶液。

进一步的改进是，所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，还包括第二试剂，所述第二试剂为磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。

进一步的改进是，所述第一试剂是通过化学偶联法将糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体标记在胶乳微球上的。

进一步的改进是，所述第一试剂的糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体通过如下步骤制成：将糖化修饰液与IgG4单克隆抗体搅拌混匀即得，所述糖化修饰液的溶剂为纯化水，所述糖化修饰液的溶质由具有如下浓度的组分组成：NaCl：7～11g/L，葡萄糖：50g/L～70g/L，蔗糖：30～50g/L，防腐剂：0.9～1.2g/L。

进一步的改进是，所述糖化修饰液与IgG4单克隆抗体搅拌时的温度为25℃～30℃。

进一步的改进是，所述IgG4单克隆抗体为商业化单克隆抗体。

进一步的改进是，使用时，用所述糖化修饰液将所述商业化单克隆抗体稀释至浓度为0.15～0.40mg/mL。

进一步的改进是，所述防腐剂为叠氮钠。

本发明相对于现有技术的有益效果是：

(1)本发明的试剂盒采用糖基化修饰鼠抗IgG4单克隆抗体操作简便，能够批量处理抗体，利于产业化；

(2)解决了无商业化HBR可用的问题，使得试剂在测定HAMA和RF干扰样本时，相对西门子试剂假阳性率大幅度降低；

(3)解决了切除FC段消除RF方法带来的灵敏度不足，使试剂盒线性范围超过西门子0.04-2.000g/L线性范围；本发明的线性范围可达到0.040-4.000g/L。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，应当说明的是，以下仅是本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些应当都属于本发明的保护范围。

Good’s缓冲液指两性离子缓冲液。本发明中的(g/L)指的是每升溶液中所含有的溶质的质量，如糖化修饰液中NaCl为9g/L，即指每升溶液中含有NaCl的重量为9克。NaCl为抗体稀释液以及各种蛋白保存液中常用离子，可用其他离子(如氯化钾，硫酸镁等)替代，通常NaCl用量为生理盐水浓度9g/L，其用量与本发明的起关键作用的鼠单克隆抗体糖化修饰无关，对本发明实施效果影响甚微。防腐剂叠氮钠(NaN₃)通常用量为1g/L，仅起防腐效果，对发明实施效果影响甚微。

进一步的改进是，所述IgG4单克隆抗体为商业化单克隆抗体。

进一步的改进是，所述防腐剂为叠氮钠。

具体的糖化修饰方法如下：

糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体，其中IgG4单克隆抗体为商业化单克隆抗体，如Southernbiotech(货号9190-01,9200-01)，Saquin(货号M9170，M9124)等。

1、糖基化修饰：用所述糖化修饰液将上述商业化单克隆抗体稀释到0.15～0.40mg/mL浓度，在温度为25℃～30℃下，搅拌器转速为60～100rpm，低速搅拌24小时(稀释倍数过高即终浓度过低不利于抗体稳定也不利于后续使用，稀释倍数过小即终浓度过高，造成糖化修饰效果不佳。转速过低混匀效果不好，过高出现抗体沉淀影响抗体活性，温度过低糖化效果不明显，温度过高也影响抗体活性)。

2、Buffer置换：后续抗体根据用量以及使用目的，进行不同的buffer置换。在本发明中，后续用于常规化学偶联，置换为常用的包被buffer，如PBS缓冲液等。小体积(100ml以内)使用透析袋(如8kd)透析方式，大体积(超过100ml)可使用Cross-flow超滤置换，商用化超滤膜很多，选择截留分子量小于20kd的即可。该置换buffer方法属于生物学常规实验。

采用常规的化学偶联方式将糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体制成标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体的胶乳微球溶液和磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种，在全自动生化分析仪上使用西门子IgG4校准品校准绘制标准曲线，测试经西门子IgG4试剂筛选的干扰样本及稀释，比较抗干扰效果。

实施例1

按照各溶质的浓度NaCl：9g/L，葡萄糖：70g/L，蔗糖：50g/L，叠氮钠：1g/L用纯化水配成糖化修饰液，用所述糖化修饰液将Saquin(货号M9170，M9124)稀释到0.15mg/mL，25℃度60rmp转速搅拌24小时；置换buffer，使用常规化学偶联制备为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体的胶乳微球溶液作为第一试剂，采用Good’s缓冲液作为第二试剂，在全自动生化分析仪上使用西门子IgG4校准品绘制标准曲线，测试经西门子试剂筛选获得假阳性干扰样本。结果见下表1(注：根据CFDA对体外诊断试剂盒要求，多数项目线性偏差小于15％算合格，个别项目甚至要求线性偏差不能超过10％；线性偏差即测定值与稀释后测定回算估计值偏差)。本实施例的Good’s缓冲液可用磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或两种代替。本实施例NaCl的浓度可用NaCl：7g/L或11g/L代替。

表1实施例1的测定结果与现有的方案效果对比

可以看到，通过本发明，与西门子试剂相比原液与稀释回算偏差均大幅度缩小，虽然还有部分样本的强烈干扰无法完全消除，但实施例1相比西门子试剂假阳性率降低70％，并且，根据回算原液浓度小于1.400g/L的样本，本发明原液测定值均已降低到临床参考值1.400g/L以内，不会影响临床阴阳性判断，线性范围达到0.040～4.000g/L(3#和6#样本分别验证了线性范围低端和高端)；

实施例2

按照各溶质的浓度NaCl：9g/L；葡萄糖：50g/L；蔗糖：30g/L，叠氮钠：1g/L用纯化水配成糖化修饰液，用所述糖化修饰液将Saquin(货号M9170，M9124)稀释到0.40mg/mL，30℃度100rmp转速搅拌24小时；置换buffer，使用常规化学偶联制备为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体的胶乳微球溶液作为第一试剂，采用磷酸盐缓冲液作为第二试剂，在全自动生化分析仪上使用西门子IgG4校准品绘制标准曲线，测试经西门子试剂筛选获得假阳性干扰样本。结果见下表2(注：根据CFDA对体外诊断试剂盒要求，多数项目线性偏差小于15％算合格，个别项目甚至要求线性偏差不能超过10％；线性偏差即测定值与稀释后测定回算估计值偏差)。本实施例中的磷酸盐缓冲液可由甘氨酸缓冲液或Good’s缓冲液中的一种或两种代替。本实施例NaCl的浓度可用NaCl：7g/L或11g/L代替。

表2实施例2的测定结果与现有的方案效果对比

可以看到，通过本发明，与西门子试剂相比原液与稀释回算偏差均大幅度缩小，虽然还有部分样本的强烈干扰无法完全消除，但实施例2相比西门子试剂假阳性率降低70％，并且，根据回算原液浓度小于1.400g/L的样本，本发明原液测定值均已降低到临床参考值1.400g/L以内，不会影响临床阴阳性判断，线性范围达到0.040～4.000g/L(3#和6#样本分别验证了线性范围低端和高端)。

实施例3

按照各溶质的浓度NaCl：9g/L；葡萄糖：70g/L；蔗糖：50g/L，叠氮钠：1g/L用纯化水配成糖化修饰液，用所述糖化修饰液将Southernbiotech(货号9190-01,9200-01)稀释到0.15mg/mL，25℃度100rmp转速搅拌24小时；置换buffer，使用常规化学偶联制备为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体的胶乳微球溶液作为第一试剂，采用甘氨酸缓冲液作为第二试剂，在全自动生化分析仪上使用西门子IgG4校准品绘制标准曲线，测试经西门子试剂筛选获得假阳性干扰样本。结果下表3(注：根据CFDA对体外诊断试剂盒要求，多数项目线性偏差小于15％算合格，个别项目甚至要求线性偏差不能超过10％；线性偏差即测定值与稀释后测定回算估计值偏差)。本实施例中的甘氨酸缓冲液可由磷酸盐缓冲液或Good’s缓冲液中的一种或两种代替。本实施例的叠氮钠的浓度可用0.9g/L或1.2g/L代替。

表3实施例3的测定结果与现有的方案效果对比

可以看到，通过本发明，与西门子试剂相比原液与稀释回算偏差均大幅度缩小，虽然还有部分样本的强烈干扰无法完全消除，但实施例3相比西门子试剂假阳性率降低90％，并且，根据回算原液浓度小于1.400g/L的样本，本发明原液测定值均已降低到临床参考值1.400g/L以内，不会影响临床阴阳性判断，线性范围达到0.040～4.000g/L(3#和6#样本分别验证了线性范围低端和高端)。

实施例4：

按照各溶质的浓度NaCl：9g/L；葡萄糖：60g/L；蔗糖：60g/L，叠氮钠：1g/L用纯化水配成糖化修饰液，用所述糖化修饰液将Southernbiotech(货号9190-01,9200-01)稀释到0.30mg/mL，27℃度80rmp转速搅拌24小时；置换buffer，使用常规化学偶联制备为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体的胶乳微球溶液作为第一试剂，采用甘氨酸缓冲液作为第二试剂，在全自动生化分析仪上使用西门子IgG4校准品绘制标准曲线，测试经西门子试剂筛选获得假阳性干扰样本。结果见下表4(注：根据CFDA对体外诊断试剂盒要求，多数项目线性偏差小于15％算合格，个别项目甚至要求线性偏差不能超过10％；线性偏差即测定值与稀释后测定回算估计值偏差)。本实施例中的甘氨酸缓冲液可由磷酸盐缓冲液或Good’s缓冲液中的一种或两种代替。本实施例的NaCl可用氯化钾或硫酸镁代替。

表4实施例4的测定结果与现有的方案效果对比

可以看到，通过本发明，与西门子试剂相比原液与稀释回算偏差均大幅度缩小，虽然还有部分样本的强烈干扰无法完全消除，但实施例4相比西门子试剂假阳性率降低80％，并且，根据回算原液浓度小于1.400g/L的样本，本发明原液测定值均已降低到临床参考值1.400g/L以内，不会影响临床阴阳性判断，线性范围达到0.040～4.000g/L(3#和6#样本分别验证了线性范围低端和高端)。

根据以上说明书记载的内容即可较好的实现本发明的技术方案。

Claims

1.一种兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂，所述第一试剂为标记有糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体胶乳微球溶液。

2.根据权利要求1所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，还包括第二试剂，所述第二试剂为磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂是通过化学偶联法将糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体标记在胶乳微球上的。

4.根据权利要求1或2所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的糖基化修饰的鼠抗人免疫球蛋白G4单克隆抗体通过如下步骤制成：将糖化修饰液与IgG4单克隆抗体搅拌混匀即得，所述糖化修饰液的溶剂为纯化水，所述糖化修饰液的溶质由具有如下浓度的组分组成：NaCl：7～11g/L，葡萄糖：50g/L～70g/L，蔗糖：30～50g/L，防腐剂：0.9～1.2g/L。

5.根据权利要求4所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述糖化修饰液与IgG4单克隆抗体搅拌时的温度为25℃～30℃。

6.根据权利要求5所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述IgG4单克隆抗体为商业化单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，使用时，用所述糖化修饰液将所述商业化单克隆抗体稀释至浓度为0.15～0.40mg/mL。

8.根据权利要求4所述的兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠。