CN1887274A

CN1887274A - 蛋白质－多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法

Info

Publication number: CN1887274A
Application number: CNA2006100291286A
Authority: CN
Inventors: 金拓; 袁伟恩; 吴飞
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2007-01-03

Abstract

本发明涉及的是一种生物技术领域的蛋白质－多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。包括如下步骤：①把蛋白质加入多糖溶液，通过冷冻分离，使蛋白质被分配在多糖分散相中；②将溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；③将有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到微粒；④将微粒分散在缓释注射的高分子；⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒中；⑥通过将微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳，或者通过微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。本发明对蛋白大分子药物的制剂方法适用于诸如多肽、DNA、疫苗、抗体、或脂质体等其他结构脆弱的试剂。

Description

蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的制备方法。特别是一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。

背景技术

当结构脆弱的生物活性试剂，如蛋白质、多肽、核酸、病毒、疫苗、抗体、或脂质体等被包埋在生物相容性高分子材料中时，一般不可避免的接触有机溶剂(因为这些材料是脂溶性)，往往导致这些试剂变性失活。为了避免这种由于接触油水界面导致的变性失活，这些试剂通常在包埋前，制备成试剂-多糖或小糖的固体颗粒。为了达到缓释目的和避免严重的突释效应，蛋白-糖或多糖的颗粒通常要求小于10μm。蛋白质量或多肽预先包在水溶性的高分子粒子中，再包埋在可降解聚合物的装置也可以提高释放动力学曲线、减少不完全释放和突释。把蛋白质担载到好的多糖粒子中是一件非常坚决任务，由于报道颗粒的制备方法通常药用到有机溶剂、界面张力(如油水界面或水空气界面，亲水和疏水界面)、高剪切力、高温条件和其它因素严重影响蛋白质的活性。不过最近在此领域有些进步。

现有技术中的专利[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo THE PREPARATION METHODOF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASE EMULSION AND ITS USE，Publication Number International：WO/2002/000778 Application No.：PCT/CN2001/001033](稳定的高分子水相-水相乳液的制备及其应用公开号为，WO/2002/000778国际申请号PCT/CN2001/001033)，该技术揭示了一种新型的稳定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制备方法和在制药及生物技术中的应用。该乳液与常规乳液的根本区别在于其分散相和连续相均为水溶液。这一乳液的主要用途在于对于有机溶剂敏感的化学及生物药物的剂型制备。其中生物药物包括蛋白，多肽，DNA，及活病毒。与常规乳液相比，主要优点在于上述敏感的治疗试剂不会因为与有机溶剂的接触而变性失活。对于上述治疗试剂的制备，保存，运输和释放提供了独到的优化机制，不过这个体系有点缺陷。如需要相对高的两种亲水性的高分子(一种是多糖和聚乙二醇)还需要第三种水溶性的聚合物(带有负电荷骨架聚电解质)形成一个稳定的乳液，聚电解质有稳定分散相多糖的效果防止其融合，如果蛋白质的溶解度小，多糖和蛋白质的比例太高，以至担载蛋白质的能力太低，因为多糖必须足够高才能发生相分离)。另外有些蛋白质可能和聚电解质(形成稳定的乳液必须的)发生作用，以至形成离子性的聚集。因此，需要一个更好方法把蛋白质担载在多糖玻璃体中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法。使其在降温过程中发生相分离并使多糖成为分散相，然后冻干并除去连续相得到多糖玻璃体微粒过程中，不需使用有机相(或称油相)乳化，不需使用交联剂、固化剂、表面活性剂稳定，不存在水-油、水-气等强界面张力的界面。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

①把蛋白质加入多糖溶液，通过水相-水相冷冻分离使蛋白质被分配在多糖分散相中；

②将载有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷冻相分离，再将体系冷冻干燥，得干粉；

③将所得的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒的直径在0.06微米-10微米；

④将含有多糖玻璃体微粒分散在缓释注射的高分子；

⑤将蛋白以外的试剂用同样的方法担载于多糖玻璃体微粒中；

⑥通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即水/油/固体(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油/油/固体(S/O/O)的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。

所述的蛋白-多糖玻璃体，其蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％，保护剂0％-10％，聚乙二醇为20％-80％。

所述的保护剂为缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0-10％。

所述的保护剂为Mg(OH)₂、ZnCO₃、及MgCO₃，盐类为Zn(AC)₂、ZnCl₂、CaSO₄、MgSO₄，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。

所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶包括：聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶。

所述的蛋白质为：促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干扰素(INF)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(ECGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遗传因子和用于治疗的蛋白质或多肽。

所述的蛋白以外的试剂为：反义核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗体、疫苗、或脂质体。

所述的微粒其特征为蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％、保护剂0％-10％、高分子为20％-80％。

所述的温敏型凝胶，载于多糖玻璃体微粒或多糖溶液中的蛋白被选择性地分配在多糖相中处于热力学上更稳定的状态。此外，热敏液-胶体系在升温相变(从液体到胶状)过程中发生脱水收缩引起的突释，而分配在多糖相中的蛋白则可以在相当程度上避免这类突释。制备热敏液-胶体系时，本发明的方法制备的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液可以被直接加入低温下处于液体状态的温敏型凝胶。

所述的蛋白质所制备的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液中的蛋白可以是溶液状态或者纳米粒状态。

多糖玻璃体的除了在制剂过程中保护蛋白外，通过本发明中的方法所制备的多糖玻璃体微粒还具有在体温及水合条件下长时间地保持蛋白活性，并且改善蛋白释放动力学的作用。冷冻相分离是将低浓度(低于8％)的多糖溶液和PEG溶液混合形成均一的溶液，然后冷冻(避免液氮、干冰等速冻条件下)。冷冻过程中多糖相与PEG相发生相分离，多糖相成为分散相，PEG相成为连续相，而蛋白通过倾向于多糖的分配而存在于分散相中。冷冻相分离的样品冷冻干燥，并用有机溶剂洗去PEG连续相同样得到0.06-10微米的蛋白-多糖玻璃体微粒，即蛋白-多糖玻璃体微粒。

本发明提供了一种简便且有效的方案，使蛋白大分子缓释剂型的研发过程中长期存在的技术难题一并得到更好的解决。

具体实施方式

实施例的基本条件：蛋白质-多糖玻璃体的制备和微球的制备或载蛋白质-多糖玻璃体的敏感型凝胶。

实施例1：微球的制备

一.制备蛋白多糖玻璃体

用超纯水分别制备5％的聚乙二醇和10％的多糖水溶液，精确称取5克PEG和5克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水95克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待聚乙二醇和5％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取5毫克蛋白溶于9.5毫升水中待用。

将上述的多糖、蛋白和聚乙二醇水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成水相-水相乳液；或称取按照多糖和聚乙二醇的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水溶解，再按照多糖和蛋白的重量比为1∶1加入，使之形成形成水相-水相溶液。

将制备蛋白、聚乙二醇和多糖形成水相-水相溶液，一些没有分配到多糖相的蛋白质，在降温过程中再分配到多糖分散相中，冷冻过夜。再在真空冷冻干燥机冻干；得到干粉用二氯甲烷洗涤三次除去聚乙二醇连续相获得载蛋白多糖玻璃体。

得到的载蛋白多糖分散相玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使蛋白的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。还可以直接用于吸入剂型。

二.载有蛋白质-多糖玻璃体的微球制备

称取一定比例的PVA和NaCl，加超纯水，同时加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4℃冰箱待用。该溶液浓度为1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。

精确称取PLGA适量，加二氯甲烷适量，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。

称取蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm～120μm的微球。

制备的微球可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。

实施实例2：制备控释和缓释PLGA微球

一、制备蛋白-多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体的微球制备

称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩涡混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然后称取10mg的一步颗粒加入乙腈的溶液中，并在磁力搅拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性剂span80，在电力搅拌器以200rpm搅拌下充分混匀。把分散有一步颗粒的乙腈溶液逐滴加入搅拌中的外油相溶液中，搅拌固化5个小时，抽滤，得到的微球颗粒用50ml石油醚洗三次，减压干燥10个小时，收集微球，在现微镜观察微球的粒径为50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。还可以控制条件制得1μm-10μm用于疫苗制剂。

制备的微球可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。

实施实例3：载有蛋白-多糖玻璃体温敏型凝胶制备

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体热敏液-胶体制备

称取蛋白蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，在4℃均匀分散于0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白AqueSpheres微粒均匀分散于PLGA-PEG-PLGA溶液中，将所得均匀分散于PLGA-PEG-PLGA的混悬液加热到37℃固化，做体外释放。而临床应用则现配现用。

实施实例4：载有蛋白-多糖玻璃体凝胶的微球

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体水凝胶的微球

本发明合成了两嵌段mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的高分子材料制备了装载了多糖蛋白的水凝胶颗粒，发现释放的时间缩短和释放速度加快。

具体制备方法如下：

1溶液的配制

(1)PVA、NaCl水溶液

(2)PLGA的二氯甲烷溶液

分别称取mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL适量，加二氯甲烷适量，漩涡振荡，使它们分别溶于二氯甲烷中，得mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。

2微球的制备

称取蛋白AqueSpheres微粒10mg，均匀分散于0.5g上述的二氯甲烷溶液中，mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白AqueSpheres微粒均匀分散于mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-GL溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm～120μm的微球。

实施实例5：微球的制备

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

三、载有蛋白-多糖玻璃体的微球制备

精确称取PLGA适量，加二氯甲烷适量，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。称取蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，然后通过喷雾仪器，把之喷到液氮和乙醇中，再通过程序升温硬化微球。制备的微球粒径为50μm～120μm的微球。

这些微球可以皮下注射，形成储库，然后持续缓释放蛋白药物。这些微球中的多糖相不仅可以在制剂过程中保护蛋白，还可以用来改善其释放动力学。对于给定蛋白担载量的微球来说，多糖的用量是一个方便的因素可用来调控蛋白分子的释放速率和释放模式。增加多糖的用量，则释放速率提高，不完全释放的问题得到改善，但突释的可能性增大。减小多糖的用量则起到相反的效果。仔细地选择多糖的用量同时结合可降解高分子的分子量及亲水-疏水性能可以达到既控制突释，又避免不完全释放的目的。

Claims

1、一种蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

④将含有多糖玻璃体微粒分散在缓释注射的高分子；

⑥通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。

2、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的蛋白-多糖玻璃体，其蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％，保护剂0％-10％，聚乙二醇为20％-80％。

3、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的保护剂为缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0-10％。

4、根据权利要求3所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的保护剂为Mg(OH)₂、ZnCO₃、及MgCO₃，盐类为Zn(AC)₂、ZnCl₂、CaSO₄、MgSO₄，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。

5、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶包括：聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶。

6、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的蛋白质为：促红细胞生成素、重组人粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、疫苗、干扰素、生长激素、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板生长因子、内皮生长因子、神经生长因子、骨衍生性生长因子、骨形成蛋白、组织多肽抗原、抗体、凝血因子VIII及IX遗传因子和用于治疗的蛋白质或多肽。

7、根据权利要求1所述的蛋白质-多糖玻璃体微粒缓释微球的制备方法，其特征是，所述的蛋白以外的试剂为：反义核苷酸、小分子RNA、基因、抗体、疫苗、或脂质体。