CN100528147C - 低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物技术领域的低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法。将配成的溶液制备成水相-水相乳液；将完成水相-水相乳液冷冻；将完成样品冻干；将完成样品获得蛋白质-多糖玻璃体；通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳即油包固体—水包油的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成复乳即油包固体—油包油的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。本发明适用于诸如多肽、DNA、疫苗、抗体、或脂质体等其他结构脆弱的试剂。

Description

低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的制备方法。特别是一种低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法。

背景技术

由于吸收性能差、体内半衰期短，大部分的蛋白质药物需要通过频繁的注射给药。为了降低这种注射的频率，1970年代以来，这类药物的缓释剂型的研发吸引了本领域科学家的大量关注，至今仍是尚在攻关的课题。然而，大量的科研投入并没有取得预期的结果。到目前为止，尚未有一个成功的产品(唯一的一个缓释蛋白药物剂型-重组的人类生长激素上市不久便宣告失败，撤出了市场。技术久攻不破主要的障碍在于蛋白质在制剂过程和体内释放过程中的稳定性问题以及体内的突释和不完全释放。

在过去的几十年里，文献中见到过各种关于提高蛋白质在微囊包过程中的稳定性的方法的报道。但是，这些方法只能解决一个或一部分问题，而对于其他问题不能兼顾，甚至引发出新的问题。也有些方法只适用于特定的一种蛋白质。还有一些报导也由于研究者自身所关注的研究领域不同而显得互相矛盾。举个例子说明，对于市场上唯一同类产品--缓释重组人类成长激素(rhGH)来说，其稳定性是靠和锌形成络合物来实现的。而与锌形成络合物是rhGH在体内的自然形态。当这种锌络合制备方法用于另一种蛋白，如促红细胞生成素(EPO)，蛋白分子发生聚集的比率可以高达40％，引起导致免疫原性的顾虑。为避免蛋白在微囊包过程中因解除有机溶剂而变形失活，科学家预先将蛋白分子与糖类、无机盐或者其他保护剂制为固体颗粒状，从而采取一种固体分散在油相，在进一步分散在水相(即油包固体-水包油，S/O/W)的方法微囊包蛋白药物。这些蛋白稳定化辅料常常由于其高溶解度而产生强渗透压力，引起突释。比如，当溶解度高的硫酸盐用于提高EPO在微囊包过程中的素稳定性时，突释高达总剂量的55％。

[Cleland，J.L.，Jones J.S.，Stable formulations of recombinant humangrowth hormone and interferon-gama for microencapsulation inbiodegradable microspheres.Pharm.Res.，1996.13：1464-1475.](Cleland，J.L.，Jones J.S.，稳定的重组人生长素和珈吗干扰素剂型用于生物可降解的微球微囊化.药学研究，1996年，第13期，第1464-1475页)；Cleland和Jones研究了在W-O-W〔油包水-水包油〕和S-O-W微囊化过程中各种辅料对重组人类生长激素和干扰素的保护作用，发现甘露醇和海藻糖能够在防止蛋白在微胶囊过程中聚集这个方面起到最好的作用。Sanchez核查了类似的赋形剂对于另一种蛋白——破伤风类酶素的保护作用，结果发现在Cleland和Jones的报告中被认定为对复原重组人类生长激素和干扰素不起有效作用的葡聚糖能在水合条件下的释放阶段对蛋白质起到最好保护功能。这样的实验似乎说明了单糖在干燥过程中对蛋白能起到更好的保护作用，而高分子化合物则在释放阶段起到更好效果。不过，Sanchez的葡聚糖-PLGA复合微球缓释剂型的释放曲线显示60％的载药量发生了突释。这种突释放也许是由于直接冻干法制备的蛋白-辅料颗粒尺寸过大引起的。

在S-O-W过程中，预制备的蛋白颗粒的大小十分重要。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine protein Microparticles throughLyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，17：1376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，HiroshiYamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通过冷冻蛋白和聚乙二醇水混合溶液制备球型蛋白微球，药学研究，2000年，第17期，第1376-1373页)；Morita发现当固体蛋白质颗粒的直径从5微米增大到20微米时，不仅初期的释放速率翻倍，其微囊包封率从80％下降到20％。Cleland讨论了在S-O-W过程前缩小蛋白质微粒体积大小的方法。进一步粉碎蛋白质冻干粉不能得到直径小于10微米的微粒，而把这些粉末研磨成更小的尺寸的方法却受阻于研磨热引起的蛋白质性变。虽然喷雾式干燥法能得到预期大小的蛋白质微粒，但是其间的切力和产生的热量却又会由于有了气体液体界面的介入而引起性变。喷雾干燥法或许可以提供足够小的蛋白颗粒，但是喷嘴附近的高剪切力和液体与空气间的界面张力会使蛋白变性。更不妙的是，喷雾干燥或喷雾式冷冻干燥中须使用表面活性剂，而表面活性剂有促成了蛋白质在下一步制剂程序中与溶剂互相作用。Maa等报道了在喷雾干燥之前预先将重组人类生长激素和锌络合的方法防止蛋白质成分的聚集。不过锌络合会导致生长激素以外的蛋白变性。Motita等用PEG沉淀蛋白质的方法制备了蛋白超微颗粒。但是，在微囊包过程中这些微粒还是直接处于有机溶剂的作用下。由于蛋白质对于高分子化合物基质的内部表面的吸附作用，未受任何保护的蛋白质和PLGA的直接接触会引起不完全的释放。为了避免亲水-疏水分界面，用亲水性双相体系制备高分子化合物微粒。然而，在乳化阶段必须靠共价或离子同步交联作用来固化颗粒，从而使蛋白质暴露在活性反应物中。

结构脆弱的蛋白大分子药物的缓释剂型的开发需要一个能够全面解决上述所有问题而且简便易行(比如不需依靠液氮制备)的技术方案。经对现有技术文献的检索发现，经对现有技术文献的检索发现[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo；THE PREPARATION METHOD OF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASEEMULSION AND ITS USE，Publication Number International：WO/2002/000778，Application No.：PCT/CN2001/001033](陈励；朱华；金拓；稳定的高分子水相-水相乳液的制备及其应用，公开号为，WO/2002/000778，国际申请号为PCT/CN2001/001033)，该专利揭示了一种新型的稳定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制备方法和在制药及生物技术中的应用。该乳液与常规乳液的根本区别在于其分散相和连续相均为水溶液。即通过将高分子电解质引入高分子亲水两项体系(aqueous two-phase system)产生扩散双电层，从而开发了一个独特的材料体系：稳定的不需连续搅拌或者(对分散相的)即时固化高分子水相-水相乳剂。将这一体系用于蛋白大分子药物缓释微球剂型的制备，获得了理想的结果。然而，有些蛋白分子可能与高分子电解质发生相互作用，造成聚集。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微粒的方法。使其不用有机溶剂和表面活性物质制备蛋白质-多糖玻璃体微粒的方法，能够有效地保存蛋白质、多肽、DNA、RNA、anti-RNA、疫苗、抗体、脂质体和病毒等的结构和活性，并能够有效地达到临床应用缓释的要求。

本发明是通过以下技术方案实现的，一种低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法。本发明包括如下步骤：

①将等和多糖溶于水中配成溶液，将蛋白加入多糖溶液(作为分散相)和与多糖溶液不互溶的水溶性高分子[聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)或聚吡咯烷酮(PVP)、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯-乙烯醋酸共聚物(PEV)、或聚乙烯醇(PVA)或它们的组合，以下称为连续相]溶液在低于室温高于冰点的温度下制备成水相-水相乳液；

②将完成步骤①的水相-水相乳液冷冻；

③将完成步骤②的样品冻干；

④将完成步骤③的样品用溶剂洗涤除去PEG、PEO或PVP连续相获得蛋白质-多糖玻璃体。

⑤通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即油包固体-水包油(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油包固体-油包油(S/O/O)的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。

所述的蛋白-多糖玻璃体其特征为蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％，保护剂0％-10％，聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮为20％-80％。

所谓低温水相-水相乳液法是指在-7℃-10℃，以0℃-4℃为佳，将蛋白多糖溶液和聚乙二醇、聚环氧乙烷(PEO)或聚吡咯烷酮(PVP)溶液混合形成乳液，然后冷冻过夜，再在真空冷冻干燥。真空冷冻干燥后的样品并用有机溶剂洗去PEG连续相同样得到0.5-5微米的蛋白-多糖玻璃体微粒。

所述的蛋白-多糖玻璃体，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0-10％以下；以小于1-5％为佳。

所述的缓冲物质为Mg(OH)₂、ZnCO₃、及MgCO₃，盐类为Zn(AC)₂、ZnCl₂、CaSO₄、MgSO₄，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇及它们的组合。

所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白及它们的组合、凝胶包括：聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶、它们的组合。

所述的蛋白质为：促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干扰素(INF)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(ECGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遗传因子和用于治疗的蛋白质或多肽及它们的组合。

所述的蛋白以外的试剂为：反义核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗体、疫苗、脂质体、或它们的组合。

所述的微球其特征为蛋白质0.01％-50％、多糖为0.01％-50％、保护剂0％-10％、高分子为20％-80％，其粒径为1微米-120微米。

所述的温敏型凝胶，其特征为载于蛋白-多糖玻璃体微粒或多糖溶液中的蛋白被选择性地分配在多糖相中处于热力学上更稳定的状态。此外，温敏型凝胶系在升温相变(从液体到胶状)过程中发生脱水收缩引起的突释，而分配在多糖相中的蛋白则可以在相当程度上避免这类突释。所述的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液可以被直接加入低温下处于液体状态的温敏型凝胶或它们的组合。

所述的蛋白质-多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有蛋白的多糖溶液中的蛋白可以是溶液状态或者纳米粒状态。

所述的多糖玻璃体的除了在制剂过程中保护蛋白外，通过本发明中的方法所制备的多糖玻璃体微粒还具有在体温及水合条件下长时间地保持蛋白活性，并且改善蛋白释放动力学的作用。

所述的低温水相-水相乳液法中也可以先在蛋白溶液中添加多价金属离子使之与蛋白分子络合成微粒在添加到多糖相中再通过冷冻干燥及洗去连续相制备成蛋白-多糖玻璃体微粒。

本发明提供了一种简便且有效的方案，使蛋白大分子缓释剂型的研发过程中长期存在的技术难题一并得到更好的解决。

具体实施方式

实施例的基本条件：蛋白质-多糖玻璃体的制备和微球的制备或载蛋白质-多糖玻璃体的敏感型凝胶制备。

实施例1：微球的制备

1.制备蛋白-多糖玻璃体

用超纯水分别制备10％的聚乙二醇和10％的多糖水溶液，精确称取10克PEG和10克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水90克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取800毫克蛋白溶于7.2毫升水中待用。

①在0℃-4℃条件下，将上述的多糖、蛋白和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成水相-水相乳液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水溶解，再按照多糖和蛋白的重量比为1∶1加入，使之形成水相-水相乳液。

②预冻蛋白、PEG和多糖水相-水相乳液

将制备蛋白、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些没有分配到多糖相的蛋白质，在降温过程中再分配到多糖分散相中，冷冻过夜。

③完成步骤②的样品在真空冷冻干燥机冻干；

④完成步骤③的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载蛋白多糖玻璃体。

得到的蛋白-多糖玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使蛋白质的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。

2.载有蛋白质-多糖玻璃体的微球制备

称取1g和5g的PVA和NaCl，加超纯水94g，同时加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4℃冰箱待用。该溶液浓度为1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。

精确称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。

称取蛋白质-多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白质-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm-120μm的微球。

制备的微球可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。

实施实例2：制备控释和缓释PLGA微球

一、制备蛋白-多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体的微球制备

称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩涡混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然后称取10mg的一步颗粒加入乙腈的溶液中，并在磁力搅拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性剂span80，在电力搅拌器以200rpm搅拌下充分混匀。把分散有一步颗粒的乙腈溶液逐滴加入搅拌中的外油相溶液中，搅拌固化5个小时，抽滤，得到的微球颗粒用50ml石油醚洗三次，减压干燥10个小时，收集微球，在现微镜观察微球的粒径为50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。还可以控制条件制得1μm-10μm用于疫苗制剂。

制备的微球可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。

实施实例3：载有蛋白-多糖玻璃体温敏型凝胶制备

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体热敏液-胶体制备

称取蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，在4℃均匀分散于0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA-PEG-PLGA溶液中，将所得均匀分散于PLGA-PEG-PLGA的混悬液加热到37℃固化，做体外释放。而临床应用则现配现用。

实施实例4：载有蛋白-多糖玻璃体凝胶的微球

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

二、载有蛋白-多糖玻璃体水凝胶的微球

我们还自己合成了两嵌段mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的高分子材料制备了装载了多糖蛋白的水凝胶颗粒。我们发现释放的时间缩短和释放速度加快。

具体制备方法如下：

1溶液的配制

(1)PVA、NaCl水溶液

称取一定比例的PVA和NaCl，加超纯水，同时加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4℃冰箱待用。该溶液浓度为1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。

(2)PLGA的二氯甲烷溶液

分别称取mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL适量，加二氯甲烷适量，漩涡振荡，使它们分别溶于二氯甲烷中，得mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。

2微球的制备

称取蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g上述的二氯甲烷溶液中，mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白-多糖玻璃体微粒均匀分散于mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm～120μm的微球。

实施实例5：微球的制备

一、制备载蛋白多糖玻璃体按照实例1方法

三、载有蛋白-多糖玻璃体的微球制备

精确称取PLGA适量，加二氯甲烷适量，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。称取蛋白-多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，然后通过喷雾仪器，把之喷到液氮和乙醇中，再通过程序升温硬化微球。制备的微球粒径为50μm～120μm的微球。

应用

蛋白质、脂质体、病毒颗粒等稳定性差的治疗物质同样可以避免有机溶剂、浓缩盐、极端pH值、交联剂、强剪切力、高温和高界面张力等因素影响，通过两相间的分配被包封到分散相玻璃体微滴中，进一步通过冷冻干燥或者其他干燥方法处理之后，形成粒径分布均一的、紧密的玻璃体微球，(可用于蛋白药物吸入或者缓释输送)。制剂过程中所使用的辅料都是人体可以注射的。制备的蛋白质-多糖玻璃体可以直接用于吸入剂型，保护结构脆弱的生物试剂如蛋白质和多肽等药物；微球和载有蛋白质-多糖玻璃体温敏型水凝胶可以直接用于临床皮下注射给药或植入皮下起缓控释蛋白质的效果。将蛋白-多糖微粒进一步用于蛋白药物涂层支架、蛋白药物缓释骨架。多糖相不仅可以在制剂过程中保护蛋白，还可以用来改善其释放动力学。对于给定蛋白担载量的微球来说，多糖的用量是一个方便的因素可用来调控蛋白分子的释放速率和释放模式。增加多糖的用量，则释放速率提高，不完全释放的问题得到改善，但突释的可能性增大。减小多糖的用量则起到相反的效果。仔细地选择多糖的用量同时结合可降解高分子的分子量及亲水-疏水性能可以达到既控制突释，又避免不完全释放的目的。

Claims (3)

1、一种低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法，其特征是，包括以下步骤：

①将多糖溶于水中配成溶液，将蛋白加入多糖溶液，生成含有蛋白的多糖水溶液作为分散相，然后将与多糖水溶液不互溶的水溶性高分子溶液作为连续相，含有蛋白的多糖水溶液和与多糖水溶液不互溶的水溶性高分子溶液在低于室温高于冰点的温度下制备成水相-水相乳液；

所述的多糖为葡聚糖、纤维素或它们的组合；

所述的水溶性高分子为聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮；

所述的在低于室温高于冰点的温度，是指-7℃至10℃；

②将完成步骤①的水相-水相乳液冷冻；

③将完成步骤②的样品冻干；

④将完成步骤③的样品用二氯甲烷作为溶剂洗涤除去聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮连续相，获得蛋白质-多糖玻璃体；

⑤通过将蛋白-多糖玻璃体微粒分散在PLGA溶液中形成初乳，再分散在水相中形成复乳即油包固体-水包油的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者将其添加到聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸或聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶或其组合中；

所述微球其特征为：蛋白质0.01％-50％、多糖0.01％-50％、保护剂0％-10％以及聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮20％-80％，其粒径为1微米-120微米；

所述保护剂为海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、甘油或它们的组合。

2.根据权利要求1所述的低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法，其特征是，所述的在低于室温高于冰点的温度，是指0℃至4℃。

3、根据权利要求1所述的低温水相-水相乳液制备蛋白质-多糖玻璃体缓释微球的方法，其特征是，所述的蛋白质为：促红细胞生成素、重组人粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素、生长激素、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管內皮细胞生长因子、血小板生长因子、神经生长因子、骨衍生性生长因子、骨形成蛋白、凝血因子VIII及IX或它们的组合。