CN106040187A - 一种人IgG4抗体的吸附柱及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人IgG4抗体的吸附柱及其制备方法和用途，包括柱体，其特征在于：柱体的两端封闭，在柱体的两端封闭处各设有一连接管，在柱体的内腔设有吸附剂，所述吸附剂由配基与载体结合构成，配基为抗人IgG4抗体，载体为琼脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠。所述柱体为圆柱体形状、椭圆柱形状或多边柱形状；先将柱体的一端封闭并在封闭处设置连接管，然后将吸附剂装入柱体的内腔，再将柱体的另一端封闭并在封闭处设置连接管，即制备成人IgG4抗体吸附柱。本发明通过利用人IgG4抗体吸附柱从人血中纯化人IgG4，或者人IgG4抗体吸附柱的再利用。具有高效、特异的纯化人IgG4抗体的特点，为IgG4的研究和应用奠定基础。

Description

一种人IgG4抗体的吸附柱及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种人IgG4抗体的吸附柱及其制备方法和用途。属于医疗器械技术领域。
背景技术
免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)是血清中免疫球蛋白的主要部分(约占Ig的75％)，分为四个亚型：IgG1(60％-70％)、IgG2(15％-20％)、IgG3(5％-10％)、IgG4(4％-6％)，而各亚型的免疫学特性和功能存在差异(Shakib F.The human IgG subclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.4th ed.Elsevier,2013)。IgG4是IgG抗体的四个亚型之一，含量虽少(成人：0.08-1.40g/L)，但最具生物学独特性：①IgG4铰链区(hinge region)的独特结构(Arch Biochem Biophys,2012,526(2):159-66)，决定了其显著缺乏激活补体C1q和结合FcγRs的能力(J Exp Med,1991,173(4):1025-8)，不能诱导显著的免疫应答；②IgG4可通过Fc-Fc结合其它IgG亚型，如IgG1、IgG2、IgG3(PloS one,2008,3(2):e1637)；以及通过与另一IgG4的Fab段交换形成新的Hybrid(杂合)IgG4，导致其单价有效，可阻止抗体形成免疫复合物(Science,2007,317(5844):1554-7)，推测这种作用模式有助于负调控炎症；③IgG4可竞争性抑制相同抗原特异性的IgE介导的嗜碱性粒细胞和肥大细胞活化，发挥抗过敏作用；④IgG4结合靶抗原的能力与其它亚型抗体无差异，因B淋巴细胞克隆在分化过程中，通过恒定区CH基因节段的重排，仅可引起免疫球蛋白类别转换，即识别抗原特异性不变(周光炎.免疫学原理.第三版.上海:科学出版社,2013)。
最近研究发现，IgG4抗体作为一种“非致炎(non-inflammatory)”分子(ClinExpImmunol,2015,181:191-206)，近年数个IgG4亚型的治疗性抗体已获FDA批准。但是如何纯化人IgG4抗体，尚未见相关专利。
为此，需要设计一种人IgG4抗体的吸附柱，并具有高效、特异的纯化人IgG4抗体的特点。
发明内容
本发明的目的之一，是为解决现有技术中不能高效纯化人IgG4抗体的问题，提供一种人IgG4抗体吸的附柱。具有高效、特异的纯化人IgG4抗体的特点。具有高效纯化人IgG4抗体的特点。
本发明的目的之二，是为了提供一种人IgG4抗体吸的附柱的制备方法。
本发明的目的之三，是为了提供一种人IgG4抗体吸的附柱的用途。
本发明的目的之一可以通过如下技术方案达到：
一种人IgG4抗体的吸附柱，包括柱体，其特征在于：柱体的两端封闭，在柱体的两端封闭处各设有一连接管，在柱体的内腔设有吸附剂，所述吸附剂由配基与载体结合构成，配基为抗人IgG4抗体，载体为琼脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠。
本发明的目的之一还可以通过如下技术方案达到：
作为一种优选方案，所述柱体呈圆柱体形状、椭圆柱形状或多边柱形状。
作为一种优选方案，所述抗人IgG4抗体，可以为人抗人IgG4抗体、小鼠抗人IgG4抗体、兔抗人IgG4抗体、驴抗人IgG4抗体或羊抗人IgG4抗体中的一种或二种以上组合。
作为一种优选方案，所述载体为氨基化或羧基化的琼脂糖微球，或者所述载体为氨基或羧基化的聚苯乙烯微球。
作为一种优选方案，所述载体为氨基化或羧基化的磁珠。
本发明的目的之二可以通过如下技术方案达到：
一种人IgG4抗体的吸附柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
1)制作形成柱体，使所述柱体为圆柱体形状、椭圆柱形状或多边柱形状；
2)制作吸附剂，将抗人IgG4抗体偶联在琼脂糖微球或聚苯乙烯微球或磁珠上，形成吸附剂；
3)制作人IgG4抗体吸附柱，首先将柱体的一端封闭并在封闭处设置连接管，然后将吸附剂装入柱体的内腔，再将柱体的另一端封闭并在封闭处设置连接管，即制备成人IgG4抗体吸附柱。
本发明的目的之二还可以通过如下技术方案达到：
进一步地，步骤2)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：
称适量溴化氢活化的琼脂糖微球置于1mmol/L的Hcl中悬浮溶胀，用pH值为8.3，含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3溶液洗涤，并于漏斗抽干，加入抗人IgG4抗体(1ml的微球加入5mg抗体)，发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-Hcl封闭琼脂糖微球，形成吸附剂。
进一步地，步骤3)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：
将吸附剂装入二端封闭的柱体的内腔，并在二端封闭处设置连接管，制备成基本吸附柱；依次用pH值为4.0,含0.5mol/l Nacl的0.1mol/L醋酸盐溶液和pH值为8.0,含有0.5mol/L Nacl的0.1mol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值为7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗涤吸附柱，得到偶联了吸附剂为抗人IgG4抗体的琼脂糖微球的人IgG4抗体吸附柱。
本发明的目的之三可以通过如下技术方案达到：
一种人IgG4抗体的吸附柱的用途，其特征在于：利用人IgG4抗体吸附柱从人血中纯化人IgG4；或者所述人IgG4抗体吸附柱的再利用，先用酸性缓冲液洗涤吸附柱，再用中性缓冲液平衡，最后于4度保存备用。
本发明具有如下突出的有益效果：
1、本发明由于设置了柱体，柱体的两端封闭，在柱体的两端封闭处各设有一连接管，在柱体的内腔设有吸附剂，所述吸附剂由配基与载体结合构成，配基为抗人IgG4抗体，载体为琼脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠，构成人IgG4抗体吸附柱；通过使用人IgG4抗体吸附柱，能够高效、特异的纯化人IgG4抗体，因此能够解决现有技术中不能高效纯化人IgG4抗体的问题，具有高效、特异的纯化人IgG4抗体的特点，为IgG4的研究和应用奠定基础。
2、本发明通过人IgG4抗体吸附柱的再利用，先用酸性缓冲液洗涤吸附柱，再用中性缓冲液平衡，最后于4度保存备用，因此，具有节约成本、经济效益高的有益效果。
附图说明
图1为本发明具体实施例中人IgG4抗体吸附柱的结构示意图。
具体实施方式
具体实施例1
参照附图1，本实施例涉及的人IgG4抗体的吸附柱，包括柱体1，柱体1的两端封闭，在柱体1的两端封闭处各设有一连接管2，在柱体1的内腔设有吸附剂，所述吸附剂由配基与载体结合构成，配基为抗人IgG4抗体，载体为琼脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠。
本实施例中：
所述柱体1呈圆柱体形状。所述抗人IgG4抗体为小鼠抗人IgG4抗体。所述载体为氨基化的琼脂糖微球。
本实施例涉及的一种人IgG4抗体的吸附柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
1)制作形成柱体1，使所述柱体1为圆柱体形状；
2)制作吸附剂，将抗人IgG4抗体偶联在氨基化的琼脂糖微球上，形成吸附剂；
3)制作人IgG4抗体吸附柱，首先将柱体1的一端封闭并在封闭处设置连接管2，然后将吸附剂装入柱体1的内腔，再将柱体1的另一端封闭并在封闭处设置连接管2，即制备成人IgG4抗体吸附柱。
本实施例中：
步骤2)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：
称适量溴化氢活化的琼脂糖微球置于1mmol/L的Hcl中悬浮溶胀，用pH值为8.3，含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3溶液洗涤，并于漏斗抽干，加入抗人IgG4抗体(1ml的微球加入5mg抗体)，发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-Hcl封闭琼脂糖微球，形成吸附剂。
进一步地，还可以称适量溴化氢活化的琼脂糖微球于1mmol/L Hcl中悬浮溶胀，用pH值为8.3，含有0.5mol/L NaCL的0.1mol/L NaHCO3溶液洗涤，并于漏斗抽干，加入小鼠抗人IgG4抗体(1ml的微球加入5mg抗体)，发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-Hcl封闭琼脂糖微球，并装入呈圆柱体形状且上下各有一根连接管道的柱体内，制备成吸附柱；依次用pH值为4.0,含0.5mol/l Nacl的0.1mol/L醋酸盐溶液和pH值为8.0,含有0.5mol/L Nacl的0.1mol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值为7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗涤吸附柱，得到偶联了吸附剂为小鼠抗人IgG4抗体的琼脂糖微球的人IgG4抗体吸附柱。
步骤3)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：
将吸附剂装入二端封闭的柱体1的内腔，并在二端封闭处设置连接管2，制备成基本吸附柱；依次用pH值为4.0,含0.5mol/l Nacl的0.1mol/L醋酸盐溶液和pH值为8.0,含有0.5mol/L Nacl的0.1mol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值为7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗涤吸附柱，得到偶联了吸附剂为抗人IgG4抗体的琼脂糖微球的人IgG4抗体吸附柱。
本实施例涉及的人IgG4抗体吸附柱的应途，其特征在于：利用人IgG4抗体吸附柱从人血中纯化人IgG4；具体为“
首先，将人血清或细胞培养上清加入人IgG4抗体的吸附柱中；其次，用pH值为7.4、浓度为0.05mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗10个柱床体积；再用pH值为2.4、浓度为0.10mol/L的Gly-Hcl洗脱人的IgG4抗体，检测洗脱液中蛋白含量。收集洗脱液，并立即向其中加入pH值为9.0、浓度为1.0mol/L的Tris-Hcl或者浓度为1mol/L的NaHCO3将洗脱液中和至pH值为7.2，并对洗脱的蛋白进行定量；
用人IgG4抗体吸附柱纯化正常人血清(5ml)中的IgG4抗体结果如表一所示。
表一：
样品1(mg/ml) 样品2(mg/ml) 样品3(mg/ml)
上样前 0.728 1.049 1.364
上样后 0.012 0.022 0.017
洗脱液 0.694 0.983 1.275
得率(％) 96.93％ 95.53％ 94.65％
或者人IgG4抗体吸附柱的再利用，具体为：
先用pH值为2.4、浓度为0.10mol/L的Gly-Hcl洗涤3个柱床体积；再用pH值为7.4、浓度为0.03mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗涤吸附柱3个柱床体积，至pH为7.4，保存备用。
具体实施例2
本实施例的特点是：
所述柱体1呈椭圆柱形状或多边柱形状。所述抗人IgG4抗体，可以为人抗人IgG4抗体、兔抗人IgG4抗体、驴抗人IgG4抗体或羊抗人IgG4抗体中的一种或二种以上组合。所述载体为氨基化或羧基化的琼脂糖微球，或者所述载体为氨基或羧基化的聚苯乙烯微球；或者所述载体为氨基化或羧基化的磁珠。
制备人IgG4抗体吸附柱的具体方法如下：
以制备的氨基化的磁珠(SiO2包覆Fe3O4)作为吸附材料，将兔抗人IgG4抗体(终浓度3mg/mL)与磁珠在含有0.5mol/L NaCL的0.1mol/L NaHCO3溶液中混合，室温反应12h(每1小时混匀1次)，用磁铁分离磁珠；再以pH值为8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-Hcl封闭磁珠，并装入呈圆柱体形状且上下各有一根连接管道的柱体内，制备成吸附柱；依次用pH值为4.0,含0.5mol/l Nacl的0.1mol/L醋酸盐溶液和pH值为8.0,含有0.5mol/L Nacl的0.1mol/LTris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值为7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗涤吸附柱，得到偶联了吸附剂为兔抗人IgG4抗体的磁珠的人IgG4抗体吸附柱；
本实施例涉及的用途如下：
1)人IgG4抗体的纯化
首先，将人血清或细胞培养上清加入人IgG4抗体的吸附柱中；其次，用pH值为7.2、浓度为0.02mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗6个柱床体积；再用pH值为2.5、浓度为0.20mol/L的Gly-Hcl洗脱人的IgG4抗体，检测洗脱液中蛋白含量。收集洗脱液，并立即向其中加入pH值为8.5、浓度为0.8mol/L的Tris-Hcl或者浓度为0.5mol/L的NaHCO3将洗脱液中和至pH值为7.4，并对洗脱的蛋白进行定量。
用IgG4吸附磁珠纯化SLE患者血清(5ml)中的IgG4抗体结果如表二所示。
表二
或者2)IgG4吸附磁珠的再利用
先用pH值为2.2、浓度为0.05mol/L的Gly-Hcl洗涤磁珠为5次；再用pH值为7.2、浓度为0.02mol/L、且含有0.5mol/L NaCl的PBS洗涤磁珠为5次，至pH为7.2，保存备用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人IgG4抗体的吸附柱，包括柱体(1)，其特征在于：柱体(1)的两端封闭，在柱体(1)的两端封闭处各设有一连接管(2)，在柱体(1)的内腔设有吸附剂，所述吸附剂由配基与载体结合构成，配基为抗人IgG4抗体，载体为琼脂糖微球、聚苯乙烯微球或磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种人IgG4抗体的吸附柱，其特征在于：所述柱体(1)呈圆柱体形状、椭圆柱形状或多边柱形状。
3.根据权利要求1所述的一种人IgG4抗体的吸附柱，其特征在于：所述抗人IgG4抗体，可以为人抗人IgG4抗体、小鼠抗人IgG4抗体、兔抗人IgG4抗体、驴抗人IgG4抗体或羊抗人IgG4抗体中的一种或二种以上组合。
4.根据权利要求1所述的一种人IgG4抗体的吸附柱，其特征在于：所述载体为氨基化或羧基化的琼脂糖微球，或者所述载体为氨基或羧基化的聚苯乙烯微球。
5.根据权利要求1所述的一种人IgG4抗体的吸附柱，其特征在于：所述载体为氨基化或羧基化的磁珠。
6.一种人IgG4抗体的吸附柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
1)制作形成柱体1，使所述柱体1为圆柱体形状、椭圆柱形状或多边柱形状；
2)制作吸附剂，将抗人IgG4抗体偶联在琼脂糖微球或聚苯乙烯微球或磁珠上，形成吸附剂；
3)制作人IgG4抗体吸附柱，首先将柱体1的一端封闭并在封闭处设置连接管2，然后将吸附剂装入柱体1的内腔，再将柱体1的另一端封闭并在封闭处设置连接管2，即制备成人IgG4抗体吸附柱。
7.根据权利要求6所述的一种人IgG4抗体的吸附柱制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：称适量溴化氢活化的琼脂糖微球置于1mmol/L的Hcl中悬浮溶胀，用pH值为8.3，含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3溶液洗涤，并于漏斗抽干，加入抗人IgG4抗体(1ml的微球加入5mg抗体)，发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-Hcl封闭琼脂糖微球，形成吸附剂。
8.根据权利要求6所述的一种人IgG4抗体的吸附柱制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的制作吸附剂，具体方法如下：将吸附剂装入二端封闭的柱体1的内腔，并在二端封闭处设置连接管2，制备成基本吸附柱；依次用pH值为4.0,含0.5mol/l Nacl的0.1mol/L醋酸盐溶液和pH值为8.0,含有0.5mol/L Nacl的0.1mol/L Tris-Hcl交替洗吸附柱，最后，用pH值为7.4的0.05mol/L的PBS平衡液洗涤吸附柱，得到偶联了吸附剂为抗人IgG4抗体的琼脂糖微球的人IgG4抗体吸附柱。
9.一种人IgG4抗体的吸附柱的用途，其特征在于：利用人IgG4抗体吸附柱从人血中纯化人IgG4；或者所述人IgG4抗体吸附柱的再利用，先用酸性缓冲液洗涤吸附柱，再用中性缓冲液平衡，最后于4度保存备用。
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