CN103207270A - 西马特罗胶体金试纸条及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种西马特罗胶体金试纸条及其制备方法，其中西马特罗胶体金试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合物垫上含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆的抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。利用该试纸条能有效检测西马特罗。
Description
技术领域
本发明属于食品安全领域中涉及β2-受体激动剂残留检测领域。具体而言，本发明涉及西马特罗胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术
β2-受体激动剂(β2-agonist)是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物，西马特罗(Cimaterol)作为β2-受体激动剂的代表药物之一，它能调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌，但是长期用高剂量的西马特罗给动物饲喂时，西马特罗会对动物体内的营养进行再分配，促进蛋白质沉积而抑制脂肪形成，从而显著提高动物的瘦肉率。因此，近年来西马特罗成为了盐酸克伦特罗的一个主要的替代品应用于动物饲料中。西马特罗在体内代谢缓慢、作用时间久、性质稳定、药物残留率高，当人类食用残留该药物的动物性食品后势必会对健康产生相当的危害，所以研发出一种能够方便、快速、准确的定量检测动物性食品中西马特罗的方法具有相当的必要性。
目前，国内外检测西马特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱质谱联用技术(LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)。在食品安全检测中，往往先用ELISA进行初筛后，再对阳性样本用HPLC或GC-MS、LC-MS进行确证。但是上述方法所用的仪器设备昂贵复杂、成本高，同时需要对操作人员进行特殊培训，且实验结果不能立即显示，因此不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。
胶体金试纸条是以胶体金作为免疫层析的指示物，其原理是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过直接运用可目测的胶体金标记物而得到直观的实验结果。虽然该方法快速方便，但是胶体金试纸条仍有以下缺点：
(1)只有当金颗粒集聚到一定量(107个/mm2)时，才出现肉眼可见的紫红条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。
(2)样品基质效应明显，背景干扰大。
(3)无法实现定量检测。
因此，目前对于西马特罗的定量检测手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效检测西马特罗的试纸条和其制备方法及其用途。
在本发明的第一方面，参考图1，本发明提出了一种西马特罗胶体金试纸条，包括：
底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，
其中，所述结合物垫上是含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆抗体，
所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。由此，可以有效地获得西马特罗胶体金试纸条，从而对样品中西马特罗进行定量检测。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述的西马特罗胶体金试纸条的方法，其包括下列步骤：
制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线；
制备结合物垫；以及
组装试纸条，
其中，
用能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线；
用能与抗西马特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。
由此，由本发明提供的方法能有效制备前面所述的西马特罗胶体金试纸条，从而对样品中西马特罗进行定量检测。
根据本发明的实施例，用于制备检测线的西马特罗检测抗原是通过下列方法获得的：称取50mg西马特罗，用10mL pH1.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA，用pH8.00.01M的PBS溶解作为C液；冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4摄氏度磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条 件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及最终产物用0.01M pH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的西马特罗偶联物。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有西马特罗检测抗原的检测线，从而获得具有检测线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。
根据本发明的实施例，用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的：通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能够与西马特罗检测抗原结合的抗体的质控线，从而获得具有质控线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。
根据本发明的实施例，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的：将硝酸纤维素膜按20mm～30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL～1.0mg/mL的西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm～18mm；将经纯化浓度调整为0.5mg/mL～1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边11mm～13mm；将所述硝酸纤维素膜室温干燥30分钟，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37摄氏度下孵育30分钟。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备大小均一、位置固定并且分别具有特定浓度抗原、抗体的检测线和质控线，从而获得具有检测线和质控线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。
根据本发明的实施例，结合物垫是通过下列步骤获得的：选用能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记胶体金；以及把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记的胶体金的结合物垫，从而获得具有结合物垫的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的西马特罗胶体金试纸条检测西马特罗的方法，包括以下步骤：配制已知系列浓度的西马特罗标准品并加入胶体金读取仪样本孔中，10min后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，读取检测数值，以及通过所述标准曲线计算所述检测样品中的西马特罗含量。由此，通过本发明所提供的方法，可以有效地制备采用该胶体金读取仪的校准曲线，从而配合本发明提供的西马特罗胶体金试纸条有效地对西马特罗进行定量检测。
有益效果
1、灵敏度高：本发明采用西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，能通过仪器替代肉眼观察实验结果，克服了肉眼判断带来的误差，从而提高了检测灵敏度，检测限低至1ppb。
2、定量：本发明采用西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，可以根据胶体金读取仪显示器上的显示数值和标准曲线即可得出被检样品中的西马特罗的含量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的检测西马特罗的胶体金试纸的结构图；
图2是根据本发明实施例的一种胶体金读取仪的示意图；
图3是根据本发明实施例的定量检测西马特罗流程图。
具体实施方式
本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1免疫抗原的合成
采用重氮化法合成西马特罗-BSA免疫抗原：称取西马特罗4.0mg于10mL锥形瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液1.5mL溶解，冰浴冷却；在避光条件下，边搅拌边逐滴加入用灭 菌双蒸水溶解的1mol/L NaNO2溶液适量(淀粉碘化钾试纸呈蓝黑色为宜)后，4摄氏度条件下反应6小时即得重氮化西马特罗；称取10mg BSA用1mL PBS(pH7.4)溶解，预冷后边搅拌边逐滴加入重氮化西马特罗，用1mol/L的NaOH溶液调pH至8.5左右后，4摄氏度条件下过夜反应；然后将反应产物在4摄氏度搅拌下用PBS透析3天，每天换液3次，透析后即得到纯化的西马特罗-BSA免疫抗原。
实施例2免疫原单克隆抗体的制备及效价检测
2.1西马特罗单克隆抗体的制备
使用重氮化法合成西马特罗-BSA人工抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5分钟弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37摄氏度水浴中。把1mL50%PEG-4000缓缓加入细胞中，在1分钟内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1分钟后，前30秒沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30秒加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5分钟，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37摄氏度、体积分数5%的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗西马特罗单克隆抗体。选4只经产BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经核酸-蛋白分析仪测定抗西马特罗单克隆抗体的含量。
2.2抗体效价的测定
采用间接ELISA方法测定抗西马特罗单克隆抗体效价。用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液稀释检测原至10μg/mL，再分别稀释至终浓度为2.5、1、0.25、0.05和0.01μg/mL，分别包被酶标板，每孔加入100μL，4摄氏度包被过夜。用0.01mol/L PBS250μL洗板两次。每孔加入1%明胶360μL，37摄氏度孵育1小时后，拍干。用0.01mol/L PBS将抗西马特罗单克隆抗体效价稀释1000，再倍比稀释6个梯度至128000倍；将免疫前小鼠血清作为阴性对照；以0.01mol/L PBS作为空白对照。每孔各加入样本、阴性对照、空白对照 各100μL，37摄氏度孵育0.5小时。按9:1比例用0.01mol/L PBS稀释酶标记羊抗鼠二抗，取100μL加入孔内，37摄氏度孵育0.5小时。取0.01mol/L PBS250μL洗板五次后，加入100μL TMB显色液，37摄氏度孵育15分钟，再加入50μL2mol/L硫酸溶液，用酶标仪测定OD450值。以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1且OD值大于0.3为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，结果表明，抗西马特罗单克隆抗体效价大于1:128000。
实施例3本发明中西马特罗胶体金试纸条的制备
3.1胶体金的制备
免疫胶体金技术的基本原理是，氯金酸在还原剂的作用下，可聚合为一定大小的金颗粒，形成带负电荷的、由于静电作用而稳定的疏水胶溶液。本公司采用柠檬酸三钠这种还原剂还原法制备胶体金，具体过程如下：取0.01%氯金酸100mL水溶液加热至沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液1.5mL，金黄色的氯金酸在2分钟内变为紫红色，关掉热源，继续高速搅拌10分钟后，调低转速至低档，继续搅拌1小时，冷却后用蒸馏水恢复原来的体积，即为制备的胶体金溶液。此胶体金溶液是否符合生产需求，除肉眼观察颜色需要为紫红色外，还需要采用紫外可见光分光光度计分析，胶体金溶液需在可见区525nm～527nm有最高吸收峰，同时，电镜图显示制备的胶体金颗粒均一性较好、颗粒大小约40nm。
3.2胶体金标记抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入西马特罗的单克隆抗体，1小时后加入抗体量相当的PEG，充分反应30分钟后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30分钟。在9000rpm下离心30分钟获得均一性金标抗体沉淀，再加入PNPB重悬备用。
3.3西马特罗胶体金快速检测试纸条的制备
依次将吸水纸、喷有西马特罗-BSA(检测线)和驴抗鼠IgG(质控线)的NC膜、喷有胶体金标记的西马特罗单克隆抗体的金标垫、样品垫和滤纸相互叠合固定在PVC底板上，再切成试纸条，装在塑料模块中，制成胶体金快速检测卡。
实施例4样品中西马特罗残留的检测
4.1标准曲线的建立
以西马特罗标准品配制成已知的浓度系列，将标准品分别滴加在制备的西马特罗胶体金试纸条上，10分钟后在胶体金读取仪上检测，测出其浓度对应的光密度值，然后以光密 度值与阴性光密度值的比值为纵坐标，对应浓度为横坐标绘制标准曲线。
4.2样品检测
新鲜猪尿样恢复室温，直接加入样本孔，10分钟后，如果T线和C线同时显示紫红色条带，表示检测结果为阴性；如果C线显色而T线不显色，表示检测结果是阳性；如果T线和C线同时都不显色，表示试纸条失效。将被检样品的检测卡放入胶体金读取仪中检测，最后根据检测样本的数据输出的数值，参照标准曲线即可得出检测样本中西马特罗的含量。
实施例5本发明中西马特罗胶体金试纸条的灵敏度实验
通过实验得到，本发明中的西马特罗胶体金试纸条的灵敏度可达1ppb，CV值小于15%。
实施例6本发明中西马特罗胶体金试纸条的特异性实验
在阴性的猪尿中（ELISA测定为阴性）分别加入去甲肾上腺素、肾上腺素、克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林和莱克多巴胺，使其终浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL尿液。用试纸条检测的标准方法检测，判断试纸条检测的特异性，每种浓度的猪尿样做5次重复。检测结果都为阴性，说明检测卡特异性较强。
实施例7本发明中西马特罗胶体金试纸条的保质期实验
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保存，每各一个月取出12个卡检测，用质控尿样检测，分别做阴性、0.5ppb、1ppb和2ppb样品，重复三次，得出数据后和生产时的数据对照，观察保质期时间。阴性显色从15个月开始下降，在一年时间内产品品质无变化，从而确定保质期为一年。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种西马特罗胶体金试纸条，其特征在于，包括：
底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，
其中，所述结合物垫上是含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆抗体，
所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。
2.一种制备权利要求1所述的西马特罗胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括下列步骤：
制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线；
制备结合物垫；以及
组装试纸条，
其中，
用能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线；
用能与抗西马特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于制备检测线的西马特罗检测抗原是通过下列方法获得的：
称取50mg西马特罗，用10mL pH1.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA，用pH8.00.01M的PBS溶解作为C液；
冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4摄氏度磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及
最终产物用0.01M pH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的西马特罗偶联物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的：
通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的：
将硝酸纤维素膜按20mm～30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL～1.0mg/mL的西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm～18mm；
将经纯化浓度调整为0.5mg/mL～1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边11mm～13mm；
将所述硝酸纤维素膜室温干燥30分钟，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37摄氏度下孵育30分钟。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，结合物垫是通过下列步骤获得的：
选用能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记胶体金；以及
把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。
7.一种采用如权利要求1所述的西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪定量检测西马特罗的方法，其特征在于，包括下列步骤：
配制已知系列浓度的西马特罗标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中，
10分钟后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，
将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，
读取检测数值，以及
通过所述标准曲线计算所述检测样品中的西马特罗含量。
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