JPWO2010128657A1 - 高分子アディポネクチン分析のための新規モノクローナル抗体とその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)LMWおよびMMWを分解する酵素による前処理を行い、酵素分解されずに残ったアディポネクチンを測定することによって、HMWだけを検出する方法(特許文献1)。
(2)アディポネクチン単量体には反応しないが、3量体及び/又はそれが凝集した構造を有する高分子アディポネクチンを認識する抗体を用い、当該高分子アディポネクチン抗原だけを検出する方法(特許文献2)。
[1]高分子アディポネクチンと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体、
[2]高分子アディポネクチンを抗原として用いることを特徴とする、[1]のモノクローナル抗体の製造方法、
[3][1]のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、高分子アディポネクチンの免疫学的分析方法、
[4]ラテックス凝集法である、[3]の免疫学的分析方法、
[5][1]のモノクローナル抗体を含む、高分子アディポネクチンの免疫学的分析用試薬、
[6][1]のモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を含む、[5]の免疫学的分析用試薬
に関する。
なお、前記分子量は、後述の比較例および実施例で実施したゲル濾過により決定される値であり、そのゲル濾過条件は以下のとおりである。
カラム:Superdex 200 prep grade(GE ヘルスケア バイオサイエンス)
移動層(溶媒):D−PBS
送液速度:1mL/min
分子量マーカー:
(1)ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin):67,000(Da)
(2)アルドース(Aldolase):158,000
(3)カタラーゼ(Catalase):232,000
(4)フェリチン(Ferritin):440,000
(5)チログロブリン(Thyroglobulin):669,000
(6)ブルーデキストラン2000(Blue Dextran 2000):2,000,000
このように、本発明により分析可能な生物学的液体(特に血液)は、HMWアディポネクチンを数μg/mL〜数十μg/mLの濃度で含むが、本発明のHMWアディポネクチン分析用試薬により、前希釈することなく、分析することができる。
(1)アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を取得する工程、及び(2)前記工程で取得した生物学的液体を、前記工程で取得した状態のままで、あるいは、適当な前希釈及び/又は前処理を実施した後、自動分析測定装置内において、HMWアディポネクチンに対する特異的抗体を担持したラテックス粒子懸濁液と接触させ、ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する工程
を含む。
公知のモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体との比較のために、公知モノクローナル抗体として、大腸菌組み替えアディポネクチン抗原をマウスに感作して作製した2種のモノクローナル抗体ANOC9121、Clone5Aを使用した。両モノクローナル抗体のヒト血中アディポネクチンへの反応性を表1にまとめた。両抗体共に非還元下のウエスタンブロッティングでは血中のMMW,HMWを同等に検出可能である。しかしながら、同一抗体同士のサンドイッチELISAではClone5Aは血液中の全ての分子を認識するが、ANOC9121同士のサンドイッチELISAではMMWへの弱い交差が見られた。
先に作製したANOC9121同士のサンドイッチELISAキットおよび、前処理を必要としない市販の高分子アディポネクチンELISAキット(富士レビオ)を用いて、二種類のヒト血清のゲル濾過画分を測定した。また、総アディポネクチンの測定はヒトアディポネクチンELISAキット(大塚製薬株式会社)を使用した。
本明細書の比較例および実施例で実施したゲル濾過は、特に断らない限り、以下の条件で実施した。
カラム:Superdex 200 prep grade(GE ヘルスケア バイオサイエンス)
移動層(溶媒):D−PBS
送液速度:1mL/min
分子量マーカー:
(1)ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin):67,000(Da)
(2)アルドース(Aldolase):158,000
(3)カタラーゼ(Catalase):232,000
(4)フェリチン(Ferritin):440,000
(5)チログロブリン(Thyroglobulin):669,000
(6)ブルーデキストラン2000(Blue Dextran 2000):2,000,000
その結果、図1に示すようにMMWの高くないサンプルでは、ANOC9121 ELISAキット、市販の高分子アディポネクチンELISAキット共に高分子(H)の特異測定が可能であった。一方、図2に示すようなMMW高値サンプルでは、MMWへの交差反応性が両キット共に確認されるため、HMW特異測定は困難となる。
なお、上記のゲル濾過条件において、HMW画分、MMW画分、及びLMW画分は、それぞれ、分子量が、>約440kDa、約250〜440kDa、<約250kDaの画分である。
公知モノクローナル抗体における問題点−2:ラテック試薬化の問題
ELISAにてMMW反応性を有するものの、HMW特異性の高いANOC9121モノクローナル抗体を用いてラテックス試薬の調製を試みた。
(1)ANOC9121モノクローナル抗体感作ラテックス試薬の調製
ANOC9121モノクローナル抗体を0.5mg/mLの濃度で0.01mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)に溶解した液9mLに、平均粒径0.2μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%)1mLを添加し、室温にて60分間攪拌した。次いで、この液に、ウシ血清アルブミンを0.5重量%含有するトリス緩衝液(pH8.0)を添加し、室温にて60分間攪拌した後、この混合液を20000rpmで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液(pH8.0)10mLを添加し、ラテックスを懸濁させ、ANOC9121モノクローナル抗体感作ラテックス液を調製した。
0.5%(重量%)濃度でウシ血清アルブミンを含有する0.1mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)に、0.9%(重量%)濃度の塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。
本比較例で使用するヒトアディポネクチン抗原測定試薬は、(2)で調製した緩衝液からなる第1試薬と、(1)で調製したANOC9121モノクローナル抗体感作ラテックスからなる第2試薬とからなる2液系の試薬として構成した。
(1)アディポネクチン分画の測定
ヒト血清中のアディポネクチン分画(MMW低値サンプル)35μLに、アディポネクチン測定用試薬の調製(2)で調製した緩衝液90μLを混合し、37℃で適時保持した後、アディポネクチン測定用試薬の調製(1)で調製したANOC9121モノクローナル抗体感作ラテックス液90μLを添加攪拌し、この後、5分後の波長570nmでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量(ΔAbs)とした。標準アディポネクチン抗原液から得られるΔAbsとその抗原濃度とから検量線を作成した。その検量線を用いて、被検サンプルのΔAbsからアディポネクチン値を計算した。測定は、日立自動分析装置7170型を用いて行った。
既に市販している総アディポネクチン分析用ラテックス試薬の結果(図3のD)と比較すると、ANOC9121を用いたアディポネクチン分析用ラテックス試薬は、LMWに相当する分画に反応性を示さなかったものの、HMW、MMW共に総アディポネクチン分析用ラテックス試薬と同等に検出することが明らかとなり、MMW低値サンプルでもMMWを検出してしまい、ELISAの性能を再現することはできなかった。
(1)免疫原の調製および新規モノクローナル抗体の作製
既に試行した大腸菌組み替えアディポネクチンによる抗体作製では、HMW特異性の高いモノクローナル抗体の作製は困難と判断し、ヒト血液中アディポネクチンからHMW画分だけを抽出しモノクローナル抗体の作製を行った。ヒト血液中総アディポネクチンの精製には、前述のANOC9121結合カラムを用いた。同カラムは、3〜10mg/mLの精製ANOC9121をCNBr−活性化セファロース4Bの4gとカップリングする事で作製し、リン酸緩衝液で洗浄後の同カラムに5〜20mLのヒト血清をアプライした。リン酸緩衝液で余分な血清成分を洗浄除去後、溶出液にてヒト血液中アディポネクチンを溶出した。溶出液としては数mol/L尿素等の蛋白変性剤や、カオトロピックイオン、また数mol/Lの塩化ナトリウム溶液が使用可能であるが、本実施例では6mol/L尿素を使用した。更に、溶出されたアディポネクチンは、ゲル濾過精製により、HMW画分のうち、HMWのピークよりも高分子量側だけを回収することで、ヒト血中アディポネクチンのHMWを精製した。
作製されたハイブリドーマから、より天然(Native)型のアディポネクチンに特異性の高いモノクローナル抗体をスクリーニングするため、全く変性の起きていないアディポネクチンとして血液中のアディポネクチンを利用した。詳細には、Fc部分を消化したANOC9121 F(ab’)2を作製し、ANOC9121 F(ab’)2固相プレートを作製した。本F(ab’)2プレートに、適宜希釈したヒト血清を反応させ、続いてハイブリドーマの培養上清を反応させた。更にホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)標識した抗マウスIgG Fc抗体を添加しインキュベートした後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの発色の強度を測定することにより、天然型のアディポネクチンに特異性、親和性共に高いモノクローナル抗体clone8Dを産生するマウス−マウスハイブリドーマClone8Dをスクリーニングした。
血液中より精製したHMWアディポネクチン画分を用いて作製した、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体Clone8Dを用いてヒト血中のアディポネクチン分子を、ウエスタンブロッティングにより解析した。サンプルとして、非還元非加熱条件下および2−メルカプトエタノールによる還元条件下でヒト血液を電気泳動し、これに前述のANOC9121、Clone5A、およびClone8Dの3種類の抗体を反応させ、染色した。ヒト血中アディポネクチンは、非還元非加熱条件下では、HMWやMMW、LMW等の多様な形態で存在する一方、還元条件下では、3量体以上の形態が消失し、単量体である約28,000Daの形態若しくは2量体相当の分子として存在する。モノクローナル抗体ANOC9121は、非還元非加熱条件下および還元下において、これら全ての分子量体を認識した。一方モノクローナル抗体Clone5Aおよび今回ヒト血中アディポネクチンを用いて作製したClone8Dは、還元変性された単量体を認識しないが、非還元非加熱条件下の高分子量体を認識する事が示されたが、ウエスタンブロッティングで評価する限りでは高分子量体への反応性は3者の間に大きな差異は見られなかった。
新規に作製したモノクローナル抗体のELISAによる評価
Clone8Dを用いたサンドイッチELISAを構築し、HMW特異性を従来のサンドイッチELISAと比較した。詳しくは、リン酸緩衝液に5〜10μg/mL濃度で希釈したClone8Dを、市販96穴ELISAプレートに添加し一晩固相化反応を行った。続いて、0.1〜1%のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液にてブロッキング操作を行った。この抗体固相プレートに、Superdex200カラム(GEヘルスケア)を用いてHPLC分画したヒト血清を反応させ、洗浄後ビオチン標識したClone8Dを反応させた。更にHRP結合ストレプトアビジンを添加し、インキュベートした後、過剰量のHRP結合ストレプトアビジンを洗浄した。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの添加により得られる発色の強度を測定することにより、各画分のアディポネクチン量を決定した。
更に、同一画分を、比較例1で使用した、ANOC9121同士のサンドイッチELISAキット、前処理を必要としない市販の高分子アディポネクチンELISAキット(富士レビオ)で測定しMMWへの交差性を確認した。また、総アディポネクチンの測定にはヒトアディポネクチンELISAキット(大塚製薬株式会社)を使用した。その結果を図4及び図5に示す。Clone8Dを用いたサンドイッチELISA(図4及び図5のF)は他の測定法に比し、図5に示すようなMMW低値の検体だけでなく、図6に示すようなMMWを大量に含有する検体においてもMMWへの交差性を示さずHMW特異的な測定が可能であった。
新規モノクローナル抗体を用いた高分子アディポネクチン分析用ラテックス試薬の調製
(1)Clone8Dモノクローナル抗体感作ラテックス試薬の調製
Clone8Dモノクローナル抗体を0.5mg/mLの濃度で0.01mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)に溶解した液9mLに、平均粒径0.2μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量%)1mLを添加し、室温にて60分間攪拌した。次いで、この液に、ウシ血清アルブミンを0.5重量%含有するトリス緩衝液(pH8.0)を添加し、室温にて60分間攪拌した後、この混合液を20000rpmで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液(pH8.0)10mLを添加し、ラテックスを懸濁させ、Clone8Dモノクローナル抗体感作ラテックス液を調製した。
0.5%(重量%)濃度でウシ血清アルブミンを含有する0.1mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)に、0.9%(重量%)濃度の塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。
本実施例で使用するヒトアディポネクチン抗原測定試薬は、(2)で調製した緩衝液からなる第1試薬と、(1)で調製したClone8Dモノクローナル抗体感作ラテックスからなる第2試薬とからなる2液系の試薬として構成した。
(1)アディポネクチン分画の測定
ヒト血清中のアディポネクチン分画35μLに、アディポネクチン測定用試薬の調製(2)で調製した緩衝液90μLを混合し、37℃で適時保持した後、アディポネクチン測定用試薬の調製(1)で調製したClone8Dモノクローナル抗体感作ラテックス液90μLを添加攪拌し、この後、5分後の波長570nmでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量(ΔAbs)とした。標準アディポネクチン抗原液から得られるΔAbsとその抗原濃度とから検量線を作成した。その検量線を用いて、被検サンプルのΔAbsからアディポネクチン値を計算した。測定は、日立自動分析装置7170型を用いて行った。
結果を図6に示す。図6において、Dは市販のヒトアディポネクチン ラテックスキット(三菱化学ヤトロン)の結果を、Gは本発明のClone8D抗体感作ラテックス試薬の結果を示す。本試薬を用いてヒト血清アディポネクチンのゲル濾過画分を測定した結果、HMW特異的なラテックス凝集反応を確認できた。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (6)
- 高分子アディポネクチンと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体。
- 高分子アディポネクチンを抗原として用いることを特徴とする、請求項1に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、高分子アディポネクチンの免疫学的分析方法。
- ラテックス凝集法である、請求項3に記載の免疫学的分析方法。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含む、高分子アディポネクチンの免疫学的分析用試薬。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を含む、請求項5に記載の免疫学的分析用試薬。
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