KR101069901B1

KR101069901B1 - 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약 및 아디포넥틴 분석방법

Info

Publication number: KR101069901B1
Application number: KR1020057016956A
Authority: KR
Inventors: 데츠야 타키가와; 스가루 아카마츠; 토키오 사와이; 아야코 니시무라
Original assignee: 오오쓰까 세이야꾸 가부시끼가이샤; 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2011-10-05
Also published as: PT1607742E; US7659125B2; KR20050118178A; CA2520438A1; JPWO2004086040A1; EP1607742A4; JP4509933B2; EP1607742A1; WO2004086040A1; AU2004223553B2; CA2520438C; ES2375188T3; AU2004223553A1; US20070037207A1; EP1607742B1; HK1085010A1; ATE534903T1

Abstract

본 발명은 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액을 함유하는 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약과 (1)아디포넥틴을 함유할 가능성이 있는 생물학적 액체를 취득하는 공정 및 (2)상기 공정에서 취득한 생물학적 액체를 상기 공정에서 취득한 상태 그대로, 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액과 접촉시켜, 라텍스 입자의 응집도를 광학적으로 분석하는 공정을 포함하는 아디포넥틴 분석방법에 관한 것이다. 상기 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약 및 분석방법에 의하면, 피험시료인 생물학적 액체를 전희석 및 전처리할 필요가 없어, 신속하고 간편하면서도 측정설비를 한정하지 않는 장점이 있다.

아디포넥틴, 라텍스법, 아디포넥틴 분석방법

Description

아디포넥틴 분석용 라텍스 시약 및 아디포넥틴 분석방법{Latex Reagent for Adiponectin and Method of Adiponectin Analysis}

본 발명은 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약 및 아디포넥틴 분석방법에 관한 것이다. 그리고, 본 명세서에 있어서 상기 「분석」에는 분석대상 물질의 양을 정량적 또는 반(半)정량적으로 결정하는 「측정」과 분석대상 물질의 존재 유무를 판정하는 「검출」이 모두 포함된다.

아디포넥틴은 1996년에 松澤(오사카대학 분자제어내과학, 현:住友병원) 등의 그룹에 의하여, 지방조직 내에서 특이적으로 발현하는 유전자 apM1(adipose most abundant gene transcript)의 유전자 산물로서 새로이 동정된 244개의 아미노산으로 구성된 분비 단백질이다 (비특허문헌 1 및 2). 아디포넥틴은 정상 사람 혈중에 수 ㎍ ~ 수십 ㎍/mL의 고농도로 존재하지만, 지방세포 특이적 분비단백질이면서 비만인에서는 유의하게 혈중 농도가 낮은 수치를 가지고, 관상동맥질환이나 2형 당뇨병, 특히 대혈관합병증에서 아디포넥틴이 낮은 수치로 발견된다. 또한, 아디포넥틴은 인슐린 저항성 및 동맥경화에 관계하는 분자로 알려져 있다. 상기 아디포넥틴을 신속하고 정확하게 측정하는 것은 동맥경화질환의 예방에 있어서 중요하게 받아들여지고 있다.

아디포넥틴의 측정법의 한가지로서, 분석 대상 물질에 대한 항체를 이용하는 면역학적 측정방법이 공지되어 있다 (비특허문헌 3). 상기 면역학적 측정수단으로서는 항원항체 반응에 의해 형성되는 면역복합체를 측정하기 위하여, 대사성 물질 또는 효소를 표식체로서 이용하는 방사능 면역어세이 또는 효소 면역어세이가 연구용 시약으로서 사용되고 있다 (비특허문헌 4, 5, 6, 7, 특허문헌 1, 2). 방사능 면역어세이법에서는 방사성 동위원소를 사용하기 때문에 측정시설이 한정되어 있고, 통상, 검체를 500배 희석하는 것이 필수적이며, 측정시간도 20~24시간이 걸린다. 또한, 효소면역측정법에 대해서는 통상, 검체의 도데실염산나트륨(SDS)에 의한 전처리가 필요하고, 검체를 약 5000배로 전희석하는 것이 필수적이며, 측정시간도 3시간 이상 걸린다. 이와 같이 종래의 아디포넥틴 측정에는 특정한 시설이 필요하거나, 복잡한 조작과 긴 측정시간이 필수적이었다.

상기의 각종 방법에서는 병태를 예민하게 반영하는 혈액을 검체로 한 경우, 복잡한 조작과 측정시간이 길기 때문에 범용성이 낮고, 다검체 처리에 적합하지 않은 것이 현실이다. 따라서, 신속하면서도 간편하고, 측정설비가 한정되지 않는 자동분석 측정시약의 개발이 요구되고 있다.

보다 구체적으로 특허문헌 1에는 유전자 재조합 기술에 의하여 대장균에서 발현시킨 아디포넥틴을 면역원으로 하여 얻어진 단클론항체 및 다클론항체를 사용하는 아디포넥틴 분석용 ELISA법이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는 상기 ELISA법을 사용하여, 정상인 혈장 중의 아디포텍틴 농도를 상기 혈장을 전처리하는 일 없이 그 상태로 측정하였으나, 웨스턴 블럿팅 결과, 예측된 아디포넥틴 농도를 얻지 못하였다. 그 원인으로서, 혈중의 아디포넥틴이 다른 혈장성분과 결합하여 290kDa 이상의 큰 분자를 형성하기 때문에, 항체의 인식부위가 가려져 있는 것으로 생각되어진다고 개시되어 있다. 특허문헌 1에 기재된 ELISA법에서는 혈장을 SDS 함유 버퍼에서 10배 희석하여 5분간 천천히 끓이고, 최종적으로 약 5000배로 희석하여 측정하는 것에 의하여, 혈장 내의 아디포넥틴의 측정을 가능하게 하고 있다. 즉, 특허문헌 1 기재의 ELISA법에서는 전처리(즉, SDS 존재 하에서의 가열처리) 및 피험시료의 전희석이 필수적이다.

상기와 같은 전처리가 불필요한 아디포넥틴 분석용 ELISA법으로서는, 특허문헌 2의 혈중의 천연형 아디포넥틴에 특이적으로 반응하는 단클론항체(특히, 아디포넥틴의 3량체 구조 및/또는 전기 3량체가 응집한 구조를 가지는 천연형 아디포넥틴에 특이적으로 반응하는 단클론항체)를 사용하는 ELISA법이 개시되어 있다. 특허문헌 2의 기재에 의하면, 혈중의 아디포넥틴은 단량체 3개 부터 구성되는 3량체가 4~6개 씩 응집한 존재형태를 가지고 있는 것이 알려져 있고 (비특허문헌 8), 천연형 아디포넥틴에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 사용하는 것에 의하여, 피험시료의 전처리를 불필요하게 하고 있다. 그러나, 특허문헌 2에 기재된 ELISA에서도 피험시료의 전희석은 여전히 필수적인 공정이다. 또한, 특허문헌 2에서는, 어세이 방법으로서, 고상법(固相法), 경합법(競合法), 응집법, 비탁법(比濁法), 샌드위치 효소항체법 등이 예시되어 있으나, ELISA를 사용하는 것이 특히 바람직하다고 기재 되어 있으며, 실시예에서도 ELISA에 대해서만 기재되어 있다.

(비특허문헌 1)「바이오미케니컬 앤드 바이오피지칼 리서치 커뮤니케이션즈(Biochemical and Biophysical Research Communications)」(미국), 1996년, 제221권 P.286-289

(비특허문헌 2)「진(Gene)」, (네델란드), 1997년 제190권 p. 227-235

(비특허문헌 3) 廣瀨寬 등 연제번호 163 혈청 아디포넥틴 농도와 인슐린 저항성-건강인 및 2형 당뇨병환자에 있어서의 검토, 「제75회 일본 내분비학회 학술총회 사연집」, 일본내분비학회, 2002년 p.118

(비특허문헌 4) 大本安-등, 아디포넥틴의 ELISA 키트에 대하여 「바이오 클리니카(Bio clinica)」, 2002년 제17권, p. 156-159

(비특허문헌 5) 大本安-등, 아디포넥틴 ELISA 키트의 개발 및 혈중 존재양식의 해석 「메디칼 사이언스 다이제스트」2002년, 제28권 제12호, p. 40~43

(비특허문헌 6)「아아테리오스클레로시스 트롬보시스 앤드 바스큘라 바이올로지(Arteriosclerosis, Thrombosis and vascular biology)」, (미국), 2003년 제23호 p. 85-89

(비특허문헌 7) 「사큘레이션(Circulation)」, (미국), 2003년 제107권 p. 671-674

(비특허문헌 8) 「져널 오브 바이오케미스트리(Journal of Biochemistry)」, 1996년 제120권, p. 803-812

(특허문헌 1) 국제공개 제 WO 99/21577 호 팜플렛

(특허문헌 2) 국제공개 제 WO 03/016906호 팜플렛

발명의 개시

본 발명의 과제는 종래기술의 상기 결점을 해소하고, 피험시료인 생물학적 액체(예를들면, 혈액, 뇨, 세포배양액, 장기추출액, 골수액 또는 분비액 등, 특히 혈액)을 전희석 및 전처리할 필요없이, 신속하면서도 간편하고, 더욱이 측정설비의 제한이 없는 분석시약(특히 자동분석 측정장치용 분석시약)을 제공하는 것이다.

전술한 바와 같이, 공지의 아디포넥틴 분석용 ELISA법에서는, 특별한 반응특이성을 가지는 단클론항체(즉, 아디포넥틴의 3량체 구조 및/또는 전기 3량체가 응집한 구조를 가지는 천연형 아디포넥틴에 특이적으로 반응하는 단클론항체)를 사용하지 않는 한, 피험시료의 전처리(예를 들면, SDS 존재하에서의 가열처리)가 필수적이다. 또한, 어떠한 공지의 아디포넥틴 분석용 ELISA법에 있어서도, 피험시료의 전희석은 필수적이다. 본 발명자는 전희석 및 전처리의 필요가 없는, 신속하면서도 간편한 아디포넥틴 분석법의 개발을 목적으로 하여, ELISA법을 대신하여, 라텍스 응집법을 검토하는 과정에서, 항아디포넥틴 다클론항체를 사용하는 것에 의하여, 전처리없이 아디포넥틴의 분석이 가능하도록 하였다. 또한, 상기 방법에서는 피험시료의 전희석도 불필요하며, 더욱이 실시예의 실시 데이타에서 구체적으로 나타낸 것과 같이, 전처리(SDS 존재 하에서의 가열처리)를 필요로 하는 공지의 ELISA법과 좋은 상관성을 확인하였다.

일반적으로, 면역학적 분석방법에서는, 시료로서 재현성의 점에서 근년에는 특히 단클론항체를 사용하는 것이 많고, 라텍스 응집법에 있어서도, 단클론항체를 사용하는 경우가 많아지고 있다. 이는, 상기 특허문헌 1 또는 2에 기재된 아디포넥틴 분석용 ELISA법에 있어서도, 단클론항체를 사용하고 있는 것으로부터도 명백하게 알 수 있다. 본 발명자들은 이러한 상식적인 접근법에 반하여, 다클론항체를 사용하는 것에 의하여, 의외로 상기 과제를 해결하는 것이 가능하다는 것을 밝혀내었다.

상기 과제는 본 발명에 의한 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액을 함유하는 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약에 의하여 해결할 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 아디포넥틴을 함유할 가능성이 있는 생물학적 액체를 취득하는 공정, 및

(2) 상기 공정에서 취득한 생물학적 액체를 상기 공정에서 취득한 상태 그대로, 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액과 접촉시켜, 라텍스 입자의 응집정도를 광학적으로 분석하는 공정을 포함하는 아디포넥틴의 분석방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약을 사용하여, 건강한 사람의 검체를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약과 종래방법인 EIA 법과의 상관관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서는 그 분석에 있어서 라텍스 응집반응을 사용하였다. 본 발명에 있어서, 분석대상 화합물인 아디포넥틴은 지방조직이 분비하는 생리활성물질이다. 아디포넥틴은 지방조직 내에서 특이적으로 발현하는 유전자 apM1(adipose most abundant gene transcript)의 유전자 산물로서 동정된 244개의 아미노산으로 구성되는 분비 단백질이며(Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 221 p.286-289, 1996; Gene, Vol. 190, p.227-235, 1997), GVP28(gelatin-binding protein of 28kDa)로도 불리고 있다 (J. Biochem. Vol. 120, p.803-812). 아디포넥틴은 정상 사람의 혈중에 수 ㎍ ~ 수십 ㎍/mL의 농도로 존재하고 있으나, 지방세포 특이적 분비 단백질이면서도, 비만인에서는 유의하게 혈중농도가 낮은 수치를 가져, 관상동맥질환이나 2형 당뇨병, 특히 대혈관합병증에서 아디포넥틴의 저하를 발견할 수 있다. 또한, 아디포넥틴은 인슐린 저항성 및 동맥경화 모두에 관여하는 분자로 받아들여질 수 있다. 상기 아디포넥틴을 신속하면서도 정확하게 측정하는 것은 관상동맥질환의 예방에 중요하다고 생각되어진다.

본 발명에 의해 분석가능한 피험시료는 아디포넥틴을 함유할 가능성이 있는 생물학적 액체라면 특별한 한정이 없으나, 예를 들면, 생체로부터 직접 채취하여 얻어진 생체액 [예를 들면, 혈액(즉, 전혈), 뇨, 골수액 또는 분비액 등], 또는 생 체로부터 채취된 생체재료(예를 들면, 장기, 조직 또는 세포 등)을 처리하여 얻어지는 생체재료 유래액(예를 들면, 장기, 조직 또는 세포의 각종 추출액 또는 세포 또는 세포의 각종 배양액 등) 등을 들 수 있다.

아디포넥틴은, 예를 들면, 정상 사람 혈중에는 약 수 ㎍ ~ 수십 ㎍/mL(예를 들면 0.5~50㎍/mL, 바람직하게는 2~30㎍/mL, 더욱 바람직하게는 5~15㎍/mL)의 농도로 존재한다.

또한, 일반적인 임상 검사용으로서 조제한 생체재료 유래액 중에는 수 ㎍/mL ~ 수십 ㎍/mL 농도의 아디포넥틴이 존재한다. 또한, 예비실험 등에 의해 처리액(예를 들면, 추출용 액체 또는 배양용 액체)의 양을 적의 선택하는 것에 의하여, 얻어진 생체재료 유래액 중의 아디포넥틴의 농도를 수 ㎍/mL ~ 수십 ㎍/mL로 하는 것이 가능하다.

이와 같이, 본 발명에 의해 분석가능한 생물학적 액체(특히, 혈액)는 아디포넥틴을 수 ㎍/mL ~ 수십 ㎍/mL의 농도로 포함하지만, 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약에 의하여, 혹은 본 발명의 아디포넥틴 분석방법에 의하여, 전희석하는 일 없이 분석할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 라텍스 입자로서는 공지의 라텍스 입자, 예를 들면, 폴리스틸렌, 또는 스틸렌-스틸렌술폰염산 공중합체 등으로 구성된 라텍스 입자를 들 수 있다. 특이적 결합체를 탑재하는 라텍스의 평균입경은, 예를 들면, 피험시료인 생물학적 액체의 종류, 아디포넥틴의 함유농도 또는 측정기기 등에 대응하여, 통상, 0.05~1.0μm의 범위에서 적의 선택할 수 있다.

예를 들면, 혈중 아디포넥틴을 분석하는 경우에는, 정상 사람 검체 중에 수 ㎍/mL ~ 수십 ㎍/mL의 고농도의 아디포넥틴이 존재하는 것, 그리고, 비만인에게는 유의하게 혈중농도가 낮은 수치가 되는 것으로부터, 상기 라텍스 입경을 적의 선택하는 것에 의하여, 혈중 라텍스 측정계의 측정범위가 보증가능하게 된다.

예를 들면, 입경이 0.1μm이하에서는 임상적 의의가 높은 5㎍/mL 이하의 측정 정확성이 보증되지 않으며, 직경이 0.5μm이상에서는, 정상 고수치 검체의 측정을 할 수 없게 된다. 따라서, 혈중 아디포넥틴의 측정계로서는 평균 직경 1~0.5μm의 라텍스 입자가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 특이적 결합체는 아디포넥틴과 특이적으로 결합가능하면서도, 라텍스 입자에 탑재한 상태에서 아디포넥틴을 함유하는 생물학적 액체와 접촉되는 경우에 라텍스 응집반응이 가능한 결합체라면, 특별히 한정되는 것이 없으며, 예를 들면, 항체(단클론항체 또는 다클론항체) 또는, 아디포넥틴에 특이적으로 결합가능한 아페타마(기능성 RNA)를 사용할 수 있다. 또한, 항체의 종류로서는 면역글로불린 분자자체 등, 항체 단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂또는 Fv 등도 사용가능하다.

특이적 결합체로서 항체를 사용하는 경우에는, 상기 항체로서, 예를 들면, 아디포넥틴 또는 그의 유도체(예를 들면, 아디포넥틴의 단편, 또는 아디포넥틴 혹은 그 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드)를 면역원으로 하여 얻어지는 항체를 이용할 수 있으며, 아디포넥틴 또는 그 유도체를 면역원으로 하여 얻어진 다클론항 체, 혹은 피험시료 중에 존재할 가능성이 있는 아디포넥틴에 있어서 외측에 노출되는 에피토프와 반응하는 단클론항체(특히, 아디포넥틴의 단량체를 면역원으로하여 얻어지고, 동시에 피험시료 중에 존재할 가능성이 있는 아디포넥틴에 있어서 외측에 노출되는 에피토프와 반응하는 단클론항체)가 바람직하다. 또한, 상기 아디포넥틴에는 여러 형태의 아디포넥틴, 예를 들면, 아디포넥틴의 단량체, 이량체 혹은 삼량체 또는 이들의 응집체가 포함된다.

상기 면역원으로서는 유전자 재조합 기술을 사용하여 조제한 아디포넥틴 또는 그 유도체 혹은 천연의 아디포넥틴을 사용할 수 있다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 아디포넥틴 또는 그 유도체를 면역원으로 하여 얻어진 항체는, 예를 들면, 국제공개 제 WO99/21577호 팜프렛에 기재된 방법에 의해 수득할 수 있다. 구체적으로는, 적당한 숙주 (예를 들면, 대장균, 효모, 곤충세포 또는 포유동물 세포)를 이용하여 아디포넥틴 또는 그 유도체를 발현시키고, 예를 들면, 대장균을 숙주로 하여 사용한 경우에는, 가용성 분획이나, 인클루전바디로서 얻어진 균체 내에 축적된 아디포넥틴 또는 그 유도체를 적당한 변성제(예를 들면, 염산 구아니신 또는 우레아)의 존재하에서 가용화한 후, 리폴딩하는 것에 의하여, 면역원으로서 사용할 수 있는 아디포넥틴 또는 그 유도체를 조제할 수 있다.

천연의 아디포넥틴을 면역원으로하여 얻어진 항체는, 예를 들면, 국제공개 제 WO03/016906호 팜플렛에 기재된 방법에 의하여 수득할 수 있다. 구체적으로는, 아디포넥틴의 젤라틴 결합성을 이용하여, 예를 들면, 대량의 사람 혈장을 젤라틴 결합 칼럼을 통과시키는 것에 의하여, 면역원으로하여 사용할 수 있는 아디포넥틴을 조제할 수 있다. 피검시료 중에 존재할 가능성이 있는 천연 아디포넥틴으로는, 예를 들면, 아디포넥틴의 단량체, 이량체 혹은 삼량체, 또는 이들의 응집체, 나아가 프로테아제로 절단분리되는 것에 의하여 생성되는 글로불라(globular) 영역을 들 수 있다.

얻어진 면역원을 통상의 방법에 따라, 동물(예를 들면, 토끼)에 면역하는 것에 의하여, 다클론항체를 얻을 수 있으며, 또한, 상기 면역원을 사용하여 하이브리도마를 제작하는 것에 의하여 단클론항체를 얻을 수 있다.

라텍스 담체의 감작은 임의의 공지의 방법으로 실시할 수 있으며, 예를 들면, 항체를 사용하는 경우에는 라텍스 담체에 항체를 물리적 또는 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 감작할 수 있다.

본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약은 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액을 포함하는 한, 그 형태는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들면, 특이적 결합체(예를 들면, 항아디포넥틴 항체)를 감작한 라텍스 입자와 완충액 모두를 포함하는 1 액체 계통의 시약: 혹은, 완충액인 제 1시약과 특이적 결합체(예를 들면, 항체)를 감작한 라텍스 입자를 포함하는 제2시약으로 구성되는 2 액체 계통의 시약 등, 여러 형태일 수 있다.

본 발명의 아디포넥틴 분석방법은 아디포넥틴을 포함할 가능성이 있는 생리학적 액체를 수득한 후, 수득한 상기 생물학적 액체에 대하여 전희석 및/또는 전처리하는 일 없이, 수득한 상태 그대로, 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액(바람직하게는 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)과 접촉시킨다.

예를 들면, 자동분석 측정장치를 사용하여 본 발명의 아디포넥틴 분석방법을 실시할 경우에는, 생물학적 액체를 취득한 후, 상기 생물학적 액체를 자동분석측정장치에 주입하기 전에는, 전희석 및/또는 전처리를 실시하지 않는다. 보다 구체적으로 생물학적 액체를 수득한 후, 취득한 상기 생물학적 액체에 대하여 전희석 및/또는 전처리하는 일 없이, 취득한 상태 그대로 자동분석 측정장치 안에 놓고 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액(바람직하게는, 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)과 접촉시킨다.

즉, 본 발명의 방법의 실시 양태의 하나인, 자동분석 측정장치를 사용하는 아디포넥틴 분석방법은,

(1) 아디포넥틴을 포함할 가능성이 있는 생물학적 액체를 취득하는 공정, 및

(2) 상기 공정으로 취득한 생물학적 액체를 상기 공정에서 취득한 상태 그대로 자동분석 측정장치 안에 놓고, 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액과 접촉시켜, 라텍스 입자의 응집정도를 광학적으로 분석하는 공정을 포함한다.

본 명세서에 있어서, [전희석]이란, 생물학적 액체를 취득한 후에나, 라텍스 입자 현탁액(바람직하게는 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)과 접촉하기 전에 실시하는 희석, 예를 들면, 종래의 면역학적 측정법(예를 들면, 방사능 면역어세이 또는 효소면역 어세이)에서 필요로 하는 검체의 희석(예를 들면, 가용화시 키기 위한 희석공정)을 의미한다. 또한, 「전처리」는, 생물학적 액체를 취득한 후에나, 라텍스 입자 현탁액(바람직하게는, 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)과 접촉하기 전에 실시하는 여러가지 처리, 예를 들면, 협잡물의 물리적 또는 화학적 분리 또는 생물학적 액체의 화학적 변성[예를 들면, 효소면역어세이에서 필요로하는 검체의 가용화제 또는 계면활성제 (예를 들면, 도데실 염산 나트륨)에 의한 변성]등을 의미한다.

또한, 라텍스 입자 현탁액으로서, 완충액인 제1시약과 특이적 결합체를 감작한 라텍스 입자를 포함하는 제2시약으로 구성되는 2액체 계통시약으로 이루어지는 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약을 사용하는 경우, 통상, 생물학적 액체와 제1시약을 접촉시킨 후, 제2시약을 접촉시킨다. 이 경우, 제1시약인 완충액에 의하여 생물학적 액체가 희석되지만, 이러한 희석은 범용 자동분석장치의 측정에 있어서 약 5분간의 반응으로서 반드시 수행되는 것으로, 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약과 접촉하기 전의 「전희석」에는 해당되지 않는다.

각종 생물학적 액체, 예를 들면, 혈액 중의 아디포넥틴 측정은 종래의 측정방법인 방사능 면역어세이 또는 효소 면역어세이를 사용한 경우에는 예를 들면, 500~5000배로 검체를 희석하는 단계를 필요로 하고 있다. 또한, 효소 면역어세이에서는, 검체를 가용화제 또는 계면활성제 [예를 들면, 도데실 염산 나트륨(SDS)]으로 처리하는 단계를 필요로 하고 있다.

이에 반해, 본 발명의 아디포넥틴 분석방법에서는, 예를 들면, 라텍스 입자의 입경을 적의 선택하는 (예를 들면, 혈중 아디포넥틴의 경우에는, 0.1~0.5μm의 입경이 바람직하다) 것에 의하여, 검체의 전희석과 전처리가 필요하지 않으며, 원료를 시료로 하여 라텍스 응집반응을 실시할 수 있다.

본 발명의 아디포넥틴 분석방법에 있어서는, 아디포넥틴에 대한 특이적 결합체를 탑재한 라텍스 입자(예를 들면, 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)을 사용하여 응집반응을 수행하고, 발생한 응집정도(응집도)를 광학적으로 분석(특히, 측정)하는 것에 의하여, 생물학적 액체 중(예를 들면 혈중)의 아디포넥틴의 양을 분석(특히, 측정)할 수 있다. 라텍스 입자의 응집도를 광학적으로 분석하는 구체적 방법에 있어서는, 예를 들면, 육안으로 관찰하든지 혹은, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 측정하는 광학기기를 사용하여 측정을 수행할 수 있다. 바람직한 측정파장은 300~800nm이다. 측정방법은 공지의 방법으로 수행하고, 사용하는 라텍스 입자의 크기(평균입경) 또는 농도의 선택 혹은 반응시간의 설정에 의하여, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도의 증가 혹은 감소를 측정하는 것에 의하여 수행할 수 있다. 또한, 이들 방법을 병용하는 것도 가능하다.

일반적으로, 라텍스 응집반응의 측정계에 존재하는 특이적 결합체 감작 라텍스의 농도는, 예를 들면, 공존하는 염, 단백질 또는 당류 등의 첨가물의 농도에 의하여 적의 선택할 수 있다. 일반적으로는 반응계의 최종액 양의 농도로서 특이적 결합체 감작 라텍스가 바람직하게는 0.05~10mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.1~2mg/mL이 되도록 조제할 수 있다. 특이적 결합체 감작 라텍스의 농도가 너무 낮으면, 응집반응의 저농도 측정이 충분하지 않을 경우가 있으며, 너무 높으면, 응집반응의 고농도 측정이 충분하지 않을 수 있어, 재현성이 나빠질 수 있다.

본 발명에 있어서, 특이적 결합체 감작 라텍스의 응집반응에 영향을 주는 다른 인자를 조절하는 것에 의하여, 라텍스 입자 응집반응을 더욱 정밀하게 측정하여, 저농도영역 및 고농도 영역의 정량가능범위를 더욱 확장할 수 있다. 라텍스 응집반응에 영향을 주는 다른 인자로서는, 예를 들면, 라텍스 입자의 농도, 라텍스 입자 상의 항체감작량 또는 라텍스 입자의 입경을 들 수 있다.

본 발명의 아디포넥틴 분석방법에 있어서 라텍스 응집반응의 조건은, 통상의 조건과 동일한 것이 좋고, 반응매체로서는 각종 생물학적 액체 중의 아디포넥틴 분석에 대한 각종 완충액이 적의 선택될 수 있다. 혈중 아디포넥틴을 분석하는 경우에는, 상기 완충액은 혈중 아디포넥틴을 실활시키지 않으며, 라텍스 응집반응을 저해하지 않는 이온강도와 pH를 가지는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, Good's 완충액, 글리신 완충액 또는 트리스 완충액 등을 사용할 수 있다. 반응의 pH는 5~10, 특히 6~8이 바람직하다. 반응온도는 0~50℃, 특히, 20~40℃가 바람직하다. 반응시간은 적절히 결정할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하고 있으나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1: 아디포넥틴 측정시약의 조제

(1) 항아디포넥틴 항체 감작 라텍스액의 조제

토끼 유래의 항인간 아디포넥틴 다클론항체를 0.5mg/ml의 농도로 0.01mol/L 트리스 완충액(pH 8.0)에 용해시킨 용액 9mL에 평균입경 0.2μm의 폴리스틸렌 라텍스(고형분 10중량%) 1mL을 첨가하여, 실온에서 60분간 교반하였다. 상기 용액에 소 혈청 알부민을 0.5중량% 함유하는 트리스 완충액(pH 8.0)을 첨가하여, 실온에서 60분간 교반한 후, 이 혼합물을 20,000rpm으로 원심분리하였다. 얻어진 침전물에 트리스 완충액(pH 8.0) 10mL을 첨가하여, 라텍스을 현탁시키고, 항아디포넥틴 항체 감작 라텍스액을 조제하였다.

또한, 본 실시예에서 사용한 상기 다클론항체는, 국제공개 제 WO99/21577호 팜플렛의 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제조된 다클론항체이고, 더욱 자세하게는, 유전자 재조합기술을 이용하여 조제한 아디포넥틴을 면역원으로하여 얻어진 다클론항체이다.

본 실시예에서는 동일한 조제조작에 기초하는 3종류의 항아디포넥틴 항체 감작 라텍스액(롯트 01~롯트 03)을 제조하고, 이하의 실시예 2에서 평가하였다.

(2) 완충액의 조제

0.5%(중량%) 농도로 소혈청 알부민을 함유하는 0.1mol/L 트리스 완충액(pH 8.0)에 0.9%(중량%) 농도의 염화나트륨을 첨가하여 완충액으로 사용하였다.

(3)인간 아디포넥틴 항원 측정시약

본 실시예에서 사용하는 인간 아디포넥틴 항원측정시약은, 상기 실시예 1 (2)에서 조제한 완충액으로 이루어진 제1시약과, 상기 실시예 1(1)에서 제조된 항아디포넥틴 항체감작 라텍스로 이루어진 제2시약으로 구성된 2 액체 계통의 시약으로 구성된다.

(4) 표준 아디포넥틴 항원액

마른 사람의 검체로부터 선택한 아디포넥틴 고농도 혈청을 생리식염수로 희석하여, 이미 알고있는 농도의 아디포넥틴을 함유한 표준 아디포넥틴 항원액을 제작하였다.

실시예 2: 혈중 아디포넥틴의 측정

(1) 혈중 아디포넥틴의 측정

측정검체(마른 사람의 검체로부터 채취한 혈액) 2μl에 실시예 1 (2)에서 조제한 완충액 90μl를 혼합하고, 37℃에서 적당한 시간동안 유지시킨 후, 실시예 1 (1)에서 제조한 항아디포넥틴 항체 감작 라텍스액 90μl를 첨가하여 교반하고, 그 직후 및 5분 후에 파장 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 동안의 흡광도의 변화량을 흡광도 변화량 (ΔAbs)으로 하였다. 표준 아디포넥틴 항원액으로부터 얻어진 ΔAbs와 그 항원농도로부터 검량선을 작성하였다. 상기 검량선을 이용하여, 피검 샘플의 ΔAbs로부터 아디포넥틴 수치를 계산하였다. 측정은 히타치 자동분석장치 7170형을 사용하여 수행하였다.

결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다. 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이, 항 아디포넥틴 항체 감작 라텍스액 롯트 01~03은 아디포넥틴 희석이론 수치의 저농도 영역으로부터 고농도 영역까지 측정가능하다는 것을 확인하였다.

(2) 최소 검출한계의 결정

측정검체로서 건강한 정상인 검체를 사용하는 이외에는, 실시예 2 (1)의 조작을 반복하였다.

결과를 표 2에 나타내었다. 표에 있어서, 각 기호 「N」, 「MAX」, 「MIN」, 「RANGE」, 「MEAN」, 「SD」및 「CV」는 각각 「측정대상수」, 「최대치」, 「최소치」, 「최대치와 최소치의 차」, 「평균치」,「표준편차」및 「변동계수」를 의미한다.

표 2 로부터 0μg/mL의 ΔAbs의 MEAN + 2SD와 MEAN - 2SD가 중복되지 않는 농도는 0.1μg/mL인 것을 확인하였다.

(3) EIA법과의 상관성 확인

본 발명의 라텍스법은 측정검체로서 건강한 정상인의 검체를 사용하는 것 이외에는 실시예 2 (1)의 조작을 반복하였다.

또한, EIA법은 시판 연구용 시약(인간 아디포넥틴 ELISA 키트; 오츠카제약주식회사)을 사용하여 실시하였다. 상기 ELISA 시약은 국제공개 제 WO99/21577호 팜플렛에 기재된 ELISA법에 기초한 시판 시약이며, 항 아디포넥틴 항체로서, 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 아디포넥틴을 면역원으로 하여 얻어진 단클론항체와 다클론항체의 조합을 사용하는 것으로, 피험시료의 전처리(SDS 존재하에서 가열처리)및 희석조작을 필요로 한다.

결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터, 시판 연구용 시약인 EIA 법과의 상관성은 Y=0.9938x-0.0015(R=0.9889)로 양호한 상관성이 확인되었다.

(4) 협잡물의 영향 확인

측정검체로서, 건강한 정상인의 검체에 각종 협잡물(비리루빈 F, 비리루빈 C, 헤모글로빈, 유미, 인트라팩터 또는 류마티 인자)를 소정 농도 첨가한 검체를 사용한 것 이외에는 실시예 2 (1)의 조작을 반복하였다.

결과를 표 3 ~ 표 14에 나타내었다. 표 3 ~ 표 14로부터 비리루빈 F, 비리루빈 C, 헤모글로빈, 유미, 인트라팩터 및 류마티 인자(RF)의 각 공존물질의 각농도에 있어서의 영향은 전부 ±10% 이내인 것으로 확인되었다.

본 발명에 의하면, 라텍스 입자를 사용하여 라텍스 응집반응에 기초한 생물 학적 액체 중(바람직하게는 혈중)의 아디포넥틴 분석에 있어서, 검체를 전처리하는일 및 전희석하는 일없이, 저농도영역에서부터 고농도영역까지 측정범위를 확대할 수 있다. 또한, 신속하면서도 간편하고, 측정설비를 한정하지도 않는다.

최근, 다수의 피검시료를 단시간에 처리하기 위하여 자동분석장치가 보급되고, 더욱이 고감도화가 요구되는 것과 함께, 특히, 항체(또는 항원)을 결합한 라텍스 입자와의 응집반응을 이용하는 라텍스 응집법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에 의하면, 전처리 및/또는 전희석을 필요로 하지 않기 때문에, 단기간(예를 들면, 약 10분~15분)에 측정이 가능하다. 본 발명의 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약(바람직하게는 혈액 중 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)은, 자동분석 측정장치용의 분석시약으로서 적당하다.

이상, 본 발명을 특정의 양태에 따라 설명하였으나, 당업자에게 자명한 변형과 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

항아디포넥틴 폴리클로날 항체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액을 함유하는, 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약.
제1항에 있어서, 라텍스 입자는 항아디포넥틴 모노클로날 항체를 탑재하지 않는 것을 특징으로 하는 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약.
아디포넥틴을 포함할 가능성이 있는 생물학적 액체를 SDS(도데실 황산 나트륨)에 의한 화학적 변성 전처리를 실시하지 않고, 항아디포넥틴 폴리클로날 항체를 탑재한 라텍스 입자 현탁액과 접촉시켜, 라텍스입자의 응집 정도를 광학적으로 분석하는 공정을 포함하는 아디포넥틴의 분석방법.
제3항에 있어서, 라텍스 입자는 항아디포넥틴 모노클로날 항체를 탑재하지 않는 것을 특징으로 하는 아디포넥틴의 분석방법.