PT1607742E - Reagente de látex para a análise de adiponectina e método para a análise de adiponectina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "REAGENTE DE LÁTEX PARA A ANÁLISE DE ADIPONECTINA E MÉTODO PARA A ANÁLISE DE ADIPONECTINA"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a um reagente de látex para a análise de adiponectina e a um método para a análise de adiponectina. 0 termo "análise" ou "analisar", tal como aqui utilizado, compreende uma medição para determinar quantitativa ou semi-quantitativamente uma quantidade de um substância que se pretende analisar e a detecção para determinar a presença ou a ausência de uma substância que se pretende analisar.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A adiponectina é uma proteína secretória constituída por 244 aminoácidos, a qual foi identificada em 1996 por Matsuzawa (Department of Internai Medicine and Molecular Science, Osaka University; Sumitomo Hospital) et ai., como um produto genético de um gene apMl (transcrito genético mais abundante de adipose) expresso especificamente em tecidos adiposos (referências não patentes 1 e 2) . A adiponectina está presente numa concentração elevada (cerca de 1 pg/mL até diversas dezenas de pg/mL) em sangue humano normal. Embora a adiponectina seja especificamente segregada a partir de adipócitos, as pessoas obesas apresentam uma concentração significativamente reduzida no sangue e a adiponectina é reduzida em pacientes que padecem de doenças coronárias ou de diabetes de tipo II e em particular de macroangiopatia diabética. A adiponectina 2 pode ser considerada como uma molécula que está implicada na resistência à insulina e a arteriosclerose. Para a prevenção de doenças coronárias é importante um meio para a determinação rápida e precisa de adiponectina.

Como método para a determinação de adiponectina, é conhecido um método de medição imunológico que compreende a utilização de um anticorpo especifico para uma substância que se pretende analisar (referência não patente 3) . No método de medição imunológico, é utilizado um radioimunoensaio ou um imunoensaio com enzimas, no qual uma substância radioactiva ou uma enzima são utilizadas como marcador, para medir um imunocomplexo formado por meio de uma reacção entre antigénio-anticorpo (referências não patente 4 a 7 e referências de patente 1 e 2). No radioimunoensaio, os meios para a medição são limitados, uma vez que é utilizada uma substância radioactiva. Além disso, é normalmente necessário diluir uma amostra até 1/500, e demora cerca de 20 a 24 horas para se efectuar a medição. No imunoensaio com enzima, é normalmente necessário efectuar um pré-tratamento da amostra com dodecil-sulfato de sódio (SDS) e uma pré-diluição da amostra aproximadamente até 1/5000, e demora cerca de 2 horas ou mais para efectuar a medição. Conforme descrito antes, as determinações convencionais de adiponectina requerem a utilização de meios especiais, procedimentos complicados e um logo tempo de medição.

Quando se utiliza sangue, o qual reflecte de um modo fiel uma patologia, como amostra nos métodos convencionais anteriores, são necessários procedimentos complicados e longos tempos de medição, pelo que os métodos não são adequados para em ensaio geral ou um ensaio de 3 multiamostras. É desejável o desenvolvimento de um reagente de medição para uma análise automática em que a análise pode ser efectuada de um modo rápido e conveniente e que os meios para tal execução não sejam limitados.

Mais particularmente, a referência de patente 1 diz respeito a um método ELISA para a análise de adiponectina, no qual é utilizado um anticorpo monoclonal preparado por meio da utilização de um imunogénio de adiponectina expresso em Escherichia coli por meio de técnicas de recombinação genéticas. Na referência de patente 1 encontra-se descrito que no caso de se utilizar um método ELISA para determinar a concentração de adiponectina no plasma humano normal, na ausência de um pré-tratamento da amostra de plasma, o valor medido é inferior ao anteriormente previsto a partir de um resultado obtido por análise de 'Western blotting'. Como razão para tal, na referência de patente 1 refere-se a possibilidade do local que se pretende reconhecer pelo anticorpo poder estar disfarçado, uma vez que a adiponectina no sangue está montada com outros componentes do plasma para formar uma macromolécula de 290 kDa ou superior. No método ELISA descrito na referência de patente 1, a adiponectina no plasma pode ser determinada por diluição no plasma até 1/10 com um tampão que contém SDS, por aquecimento até à ebulição do plasma diluído durante 5 minutos, por diluição do plasma aquecido aproximadamente até 1/5000 como concentração final e por medição do plasma diluído a 1/5000. Isto é, o método ELISA descrito na referência de patente 1 requer um pré-tratamento (o tratamento térmico na presença de SDS) e uma pré-diluição da amostra. 4

Como método ELISA para a análise de adiponectina que não necessite de tal pré-tratamento, na referência de patente 2 encontra-se descrito um método ELISA em que são utilizados um ou vários anticorpos monoclonais que reagem especificamente com uma adiponectina que ocorre naturalmente no sangue (em particular, um anticorpo monoclonal que reage especificamente com uma estrutura trimérica de adiponectina e/ou com adiponectina que ocorre naturalmente na qual são ainda montados trimeros). De acordo com a descrição na referência de patente 2, sabe-se que a adiponectina no sangue forma uma estrutura em que 4 ou 6 trimeros constituídos por 3 monómeros são montados (referência não patente 8) e que o pré-tratamento de uma amostra não é necessário no método ELISA descrito na referência de patente 2, uma vez que são utilizados um ou vários anticorpos monoclonais específicos para uma adiponectina que ocorre naturalmente. No entanto, a pré-diluição de uma amostra é um passo essencial no método ELISA descrito na referência de patente 2. Como ensaio, a referência de patente 2 dá como exemplo um método de fase sólida, um método competitivo, um método de aglutinação, um método turbidimétrico e um imunoensaio de enzima em sanduíche, e descreve ainda que o método ELISA é o mais preferível. Os exemplos descritos na referência de patente 2 não incluem variantes para além do método ELISA. A referência de patente 3 diz respeito a uma proteína do tipo adiponectina que possui efeitos terapêuticos e/ou preventivos para a arteriosclerose. A referência de patente 4 diz respeito a uma composição inibidora do crescimento dos músculos lisos e a uma composição para inibir a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais 5 vasculares, em que cada uma delas compreende o factor secretório específico do tecido adiposo apMl como ingrediente activo. Na referência de patente 5 encontra-se descrito um método para a detecção de fosfolípidos do bacilo da tuberculose por meio da observação da imagem de aglutinação formada quando se faz reagir o látex que contém as partículas de látex sensíveis, as quais suportam o fosfolípido do bacilo da tuberculose na superfície, com um fluido corporal. (referência não patente 1) Biochemical and Biophysical Research Communications, (E.U.A.), 1996, vol. 221, págs. 286-289 (referência não patente 2) Gene, (Holanda), 1997, vol. 190, págs. 227-235 (referência não patente 3) Hiroshi Hirose et al., No. 163, "Kessei adiponectin noudo to insulin teikousei: kenjyojin oyobi 2-gata tonyoubyou kanjya ni okeru kentou", "Meeting of the 75th Japanese endocrinology association study, Abstracts", The Japan Endocrine Society, 2002, pág. 118 (referência não patente 4) Yasuichi Ohmoto et al., "Adiponectin no ELISA kit ni tuite", Bio Clinica, 2002, vol. 17, págs. 156-159 (referência não patente 5) Yasuichi Ohmoto et al., "Adiponectin ELISA kit no kaihatsu to kecchu sonzai youshiki no kaiseki", Medicai Science Digest, 2002, vol. 28, No. 12, págs. 40-43 (referência não patente 6) Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, (E.U.A.), 2003, vol. 23, págs. 85-89 6 (referência não patente 2003, vol. 107, págs. 671-674 (referência não patente 1996, vol. 120, págs. 803-812 (referência de patente 1) (referência de patente 2) (referência de patente 3) (referência de patente 4) (referência de patente 5) 7) Circulation, (E.U.A.), 8) Journal of Biochemistry, WO 99/21577 WO 03/016906 EP-A-1 365 022 EP-A-1 033 134 JP-A-60111159

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Constitui um objecto da presente invenção solucionar as desvantagens supramencionadas da técnica anterior e proporcionar um reagente de análise (em particular, um reagente de análise para um analisador automático) no qual não seja necessário efectuar uma pré-diluição ou um pré-tratamento de um liquido biológico (por exemplo, sangue, urina, culturas de células, extractos de tecidos, um fluido cerebrospinal ou fluidos secretórios e em particular sangue) que se pretende analisar, em que a análise possa ser efectuada de um modo rápido e conveniente e os dispositivos para tal análise não sejam limitados.

Conforme descrito antes, os métodos ELISA conhecidos requerem um pré-tratamento (por exemplo, o tratamento térmico na presença de SDS) de uma amostra, salvo quando se utiliza o anticorpo monoclonal que possui uma especificidade especial (isto é, o anticorpo monoclonal reage de um modo especifico com uma estrutura trimérica de adiponectina e/ou com uma adiponectina que ocorre naturalmente que possui uma estrutura na qual são ainda montados os trimeros). Além disso, os métodos ELISA 7 conhecidos requerem uma pré-diluição da amostra. Com o objectivo de desenvolver um método rápido e conveniente para a análise de adiponectina sem ser necessária uma tal pré-diluição ou pré-tratamento, as requerentes realizaram estudos intensivos e, como resultado, concluíram que a adiponectina pode ser analisada sem um pré-tratamento por meio da utilização de um anticorpo policlonal anti-adiponectina num método de aglutinação com látex em vez dos métodos ELISA. Este método não requer uma pré-diluição da amostra e apresenta uma correlação excelente com o método ELISA conhecido que requer o pré-tratamento (isto é, o tratamento térmico na presença de SDS), conforme ilustrado nos exemplos por meio dos dados experimentais.

Nos métodos de análise imunológicos, em particular os mais recentes, são preferencialmente utilizados anticorpos monoclonais, devido à vantagem de reprodutibilidade como reagente. De igual modo, os anticorpos monoclonais são preferencialmente utilizados em métodos de aglutinação com látex. Esta tendência é suportada pelas referências de patente 1 e 2, isto é, os anticorpos monoclonais são utilizados nos métodos ELISA descritos nas referências de patentes 1 e 2. Ao contrário da abordagem comum, as requerentes utilizaram um anticorpo policlonal e concluíram, de um modo surpreendente, que era possível alcançar o objectivo anterior. 0 objectivo anterior pode ser solucionado pela presente invenção, isto é, um reagente de látex para a análise de adiponectina, o qual compreende uma suspensão de partículas de látex que suportam um anticorpo policlonal anti-adiponectina que se liga especificamente a adiponectina, em que o reagente de látex é seleccionado 8 entre: (i) um sistema de componente com um reagente, em que um tampão e as partículas de látex estão contidos nesse reagente e (ii) um kit constituído por dois reagentes, em que o primeiro reagente contém um tampão e o segundo reagente contém as partículas de látex.

Além disso, a presente invenção diz respeito a um método para a análise de adiponectina num líquido biológico, que contém, possivelmente, adiponectina, o qual compreende os passos de: fazer contactar o líquido biológico sem pré-tratamento, em que o referido pré-tratamento é a desnaturação química do liquido biológico com dodecil-sulfato de sódio, com um reagente de látex para efectuar a análise de adiponectina, conforme definida antes; e analisar opticamente o grau de aglutinação das partículas de látex.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A figura 1 representa um gráfico que mostra o resultado obtido através da medição de amostras retiradas a partir de pessoas saudáveis, utilizando o reagente de látex da presente invenção para a análise de adiponectina. A figura 2 representa um gráfico que mostra uma correlação entre o reagente de látex da presente invenção para a análise de adiponectina e um método EIA convencional.

MELHOR FORMA DE EXECUÇÃO DA INVENÇÃO

Na presente invenção, é utilizada uma reacção de aglutinação de látex para se analisar a adiponectina. A adiponectina, que é o composto que se pretende analisar na presente invenção, é uma substância fisiologicamente activa 9 segregada a partir dos tecidos adiposos. A adiponectina é uma proteína secretória constituída por 244 aminoácidos, que foi identificada como um produto genético de um gene apMl (transcrito genético mais abundante de adipose) expresso especificamente nos tecidos adiposos (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 221, págs. 286-289, 1996; e Gene, Vol. 190, págs. 227-235, 1997), também designado por GBP28 (proteína de ligação a gelatina de 28 kDa) (J. Biochem, vol. 120, págs. 803-812) . A adiponectina está presente numa concentração compreendida entre cerca de 1 pg/mL e diversas dezenas de pg/mL no sangue humano normal. Embora a adiponectina seja segregada especificamente a partir de adipócitos, as pessoas obesas apresentam uma concentração significativamente reduzida de adiponectina no sangue, e o nível de adiponectina é reduzido em pacientes que padecem de doenças coronárias ou de diabetes de tipo II, em particular de macroangiopatia diabética. A adiponectina pode ser considerada como uma molécula que está implicada na resistência à insulina e arteriosclerose. É importante na prevenção de doenças coronárias a medição de adiponectina de um modo rápido e preciso.

Uma amostra que pode ser analisada pela presente invenção não é particularmente limitada, desde que seja um líquido biológico que contenha adiponectina. Como amostra é pode referir-se, por exemplo, um líquido retirado directamente a partir de um organismo vivo [por exemplo, sangue (isto é, sangue total), urina, um fluido cerebrospinal ou fluidos secretórios] ou um líquido obtido por tratamento de materiais biológicos, tais como órgãos, 10 tecidos ou células recolhidas a partir de um corpo vivo [por exemplo, extractos de órgãos, tecidos ou células, ou culturas de tecidos ou células]. A adiponectina está presente numa concentração, por exemplo, compreendida entre cerca de 1 pg/mL e diversas dezenas de pg/mL (por exemplo, entre 0,5 e 50 pg/mL, de preferência entre 2 e 30 pg/mL e mais preferencialmente entre 5 e 15 pg/mL) no sangue humano normal.

Além disso, num liquido proveniente de materiais biológicos, os quais são normalmente preparados para ensaios clínicos em laboratório, a adiponectina está presente numa concentração compreendida entre cerca de 1 pg/mL e diversas dezenas de pg/mL. Além do mais, uma quantidade de um líquido para o tratamento de materiais biológicos, tal como uma solução para extracção ou uma solução para cultura, pode ser adequadamente seleccionado por meio de um testo piloto ou semelhante, para ajustar a concentração de adiponectina no liquido proveniente de materiais biológicos até cerca de 1 pg/mL a diversas dezenas de pg/mL.

Conforme descrito antes, um líquido biológico (em particular sangue) que se pretende analisar pode conter a adiponectina numa concentração compreendida entre cerca de 1 pg/mL e diversas dezenas de pg/mL. Um tal líquido biológico pode ser analisado, sem pré-diluição, pelo reagente de látex da presente invenção para a análise de adiponectina e pelo método da presente invenção para a análise de adiponectina.

Como partículas de látex utilizadas na presente invenção pode referir-se, por exemplo, partículas de látex de poliestireno ou partículas de látex do copolímero de 11 estireno-sulfato de estireno. 0 tamanho médio de partículas das partículas de látex que suportam uma substância que se liga a adiponectina pode ser seleccionado adequadamente num intervalo compreendido entre 0,05 e 1,0 μιη, em conformidade, por exemplo, com o líquido biológico que se pretende analisar, com a concentração de adiponectina ou com o equipamento de medição.

No caso de se analisar a adiponectina no sangue, então uma amostra humana normal contém adiponectina numa concentração elevada compreendida entre cerca de 1 pg/mL e diversas dezenas de pg/mL, sendo esta concentração significativamente reduzida no sangue de uma pessoa obesa. Assim sendo, a adiponectina no sangue pode ser determinada num intervalo amplo por meio da selecção adequada do tamanho de partículas de látex. Por exemplo, no caso de se utilizar um tamanho de partícula de 0,1 pm ou inferior, então pode não ser possível obter uma medição precisa para uma concentração clinicamente útil de 5 pg/mL ou inferior.

Pelo contrário, no caso de se utilizar um tamanho de partícula de 0,5 pm ou superior, então uma amostra que apresente um valor normal elevado pode não ser sempre determinado. No sistema de medição para adiponectina no sangue, são preferíveis as partículas de látex que possuem um tamanho médio de partículas compreendido entre 0,1 e 0,5 pm. A substância que se liga a adiponectina utilizada na presente invenção não é particularmente limitada, desde que seja um anticorpo policlonal anti-adiponectina que se ligue especificamente a adiponectina e que possa ser efectuada uma reacção de aglutinação de látex no caso de se fazer contactar um líquido biológico que contém a adiponectina 12 com a substância que se liga a adiponectina suportada pelas partículas de látex. Um anticorpo policlonal, que se liga especificamente a adiponectina, é, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina per se ou é possível utilizar um fragmento de anticorpo, tal como Fab, Fab', F(ab')2 ou Fv.

Como substância que se liga a adiponectina é possível utilizar um anticorpo preparado por meio da utilização de adiponectina ou de um seu derivado (por exemplo, um fragmento de adiponectina ou um polipeptido fundido que contém adiponectina ou um seu fragmento) como imunogénio. Como anticorpo é preferível um anticorpo policlonal preparado por meio da utilização de adiponectina ou de um seu derivado como imunogénio, o qual reconhece um epítopo exposto de adiponectina possivelmente contido numa amostra. Neste sentido, a adiponectina compreende diversas formas de adiponectinas, por exemplo, um seu monómero, um seu dímero, um seu trímero ou um seu agregado.

Como imunogénio é possível utilizar, por exemplo, adiponectina ou um seu derivado preparado por técnicas de recombinação genética, ou uma adiponectina que ocorra naturalmente. 0 anticorpo preparado por meio da utilização, como imunogénio, de adiponectina ou de um seu derivado preparado por técnicas de recombinação genética pode ser preparado, por exemplo, através de um método descrito no documento W099/21577. Mais particularmente, é utilizado um hospedeiro adequado, tal como E. coli, levedura, células de insecto ou células de mamífero, para expressar a adiponectina ou um seu derivado. No caso de se utilizar E. coli como hospedeiro, então a adiponectina ou um seu derivado pode ser obtido como fracção solúvel ou como corpos de inclusão 13 no corpo de uma célula. A adiponectina, ou um seu derivado, acumulada nos corpos de inclusão pode ser solubilizada com um agente de desnaturação adequado, tal como cloridrato de guanidina ou ureia, e novamente dobrado para se obter adiponectina, ou um seu derivado, a qual pode ser utilizada como imunogénio. 0 anticorpo preparado utilizando como imunogénio uma adiponectina que ocorre naturalmente pode ser preparado, por exemplo, através de um método descrito no documento W003/016906. Mais particularmente, a adiponectina que pode ser utilizada como imunogénio pode ser preparada por meio da utilização de uma actividade de ligação a gelatina da adiponectina, por exemplo, aplicando uma quantidade grande de plasma humano a uma coluna de imobilização de gelatina. Como adiponectina que ocorre naturalmente possivelmente contida numa amostra é possível referir, por exemplo, um seu monómero, um seu dímero, um seu trímero, um seu agregado ou uma sua região globular gerada pela digestão com uma protease. 0 anticorpo policlonal pode ser obtido por imunização de um animal, tal como um coelho, com o imunogénio preparado em conformidade com um método convencional.

As partículas de látex podem ser sensibilizadas de acordo com um método convencional. Um anticorpo é utilizado como substância que se liga a adiponectina, sendo a sensibilização efectuada por ligação física ou química do anticorpo às partículas de látex. A forma do reagente de látex da presente invenção para analisar a adiponectina não está particularmente limitada, desde que contenha uma suspensão de partículas de látex que transportem uma substância que se ligue especificamente a 14 adiponectina. 0 reagente de látex da presente invenção é um sistema de componente de um reagente em que um tampão e as partículas de látex sensibilizadas com a substância que se liga a adiponectina estão contidas nesse reagente ou um sistema de componentes de dois reagentes (isto é, um kit constituído por dois reagentes), em que o primeiro reagente contém um tampão e o segundo reagente contém as partículas de látex sensibilizadas com a substância que se liga a adiponectina.

No método da presente invenção para a análise de adiponectina, é obtido um líquido biológico que contém possivelmente a adiponectina e depois faz-se contactar o líquido biológico sem pré-diluição e/ou pré-tratamento (isto é, mantendo o estado no qual o líquido biológico é obtido) com uma suspensão de partículas de látex a adiponectina.

Por exemplo, no caso de se utilizar um analisador automático no método da presente invenção, após se obter um líquido biológico, não se efectua uma pré-diluição e/ou um pré-tratamento antes do líquido biológico ser aplicado ao analisador automático. Mais particularmente, depois de se obter o líquido biológico sem pré-diluição e/ou pré-tratamento (isto é, mantendo o estado no qual o líquido biológico é obtido), faz-se contactar com uma suspensão de partículas de látex que transportam a substância que se liga especificamente a adiponectina no analisador automático. 0 método da presente invenção, de preferência utilizando um analisador automático, compreende os passos que consistem em: 15 fazer contactar o líquido biológico na ausência de pré-tratamento, em que o referido pré-tratamento é a desnaturação química do líquido biológico com dodecil-sulfato de sódio, com um reagente de látex para a análise de adiponectina num analisador automático e analisar opticamente o grau de aglutinação de partículas de látex. 0 termo "pré-diluição", tal como aqui utilizado, designa uma diluição que é efectuada após a obtenção de um líquido biológico e antes de promover o contacto do líquido biológico com a suspensão de partículas de látex. A pré-diluição compreende, por exemplo, uma diluição de uma amostra, normalmente necessária para um ensaio imunológico convencional (por exemplo, um radioimunoensaio ou um imunoensaio com enzimas), tal como uma etapa de diluição para solubilização.

De acordo com o método da presente invenção, o líquido biológico não é desnaturado quimicamente com dodecil-sulfato de sódio. 0 termo "pré-tratamento", tal como aqui utilizado, compreende diversos tratamentos que são realizados após a obtenção de um líquido biológico e antes de se promover o contacto do líquido biológico com a suspensão de partículas de látex (de preferência o reagente de látex da presente invenção para a análise de adiponectina). Os tratamentos compreendem, por exemplo, uma separação física ou quimica das impurezas a partir do líquido biológico e uma desnaturação química do líquido biológico [por exemplo, uma desnaturação de uma amostra com um agente de solubilização ou com um detergente (por exemplo, dodecil-sulfato de sódio), necessários para um imunoensaio com enzimas]. 16

Neste sentido, como suspensão de partículas de látex, no caso de se utilizar o reagente de látex da presente invenção ser constituído por um sistema de componentes de dois reagentes em que o primeiro reagente contém um tampão e o segundo reagente contém as partículas de látex sensibilizadas com a substância que se liga a adiponectina, então faz-se contactar normalmente um líquido biológico com o primeiro reagente e depois faz-se contactar a mistura com o segundo reagente. Neste caso, o líquido biológico é diluído com o tampão, como primeiro reagente. A diluição é um passo essencial para uma incubação de 5 minutos num analisador automático geral, não estando por tal motivo compreendido no termo "pré-diluição".

No caso de se utilizar um radioimunoensaio ou um imunoensaio com enzimas convencional para a análise de adiponectina contida em diversos líquidos biológicos, tais como sangue, um passo de diluição de uma amostra, por exemplo, de 1/500 até 1/5000 constitui um passo essencial. Além disso, num imunoensaio com enzimas um passo de tratamento de uma amostra com um agente de solubilização ou com um detergente [por exemplo, dodecil-sulfato de sódio (SDS)] constitui um passo essencial.

Pelo contrário, no método de acordo com a presente invenção para a análise de adiponectina, uma reacção de aglutinação de látex pode ser efectuada utilizando um líquido biológico original na ausência de pré-diluição ou pré-tratamento, por exemplo, por meio de uma selecção adequada do tamanho de partículas da partícula de látex. No caso de se analisar a adiponectina no sangue, então é preferível utilizar um tamanho de partículas compreendido entre 0,1 e 0,5 pm. 17

No método de acordo com a presente invenção para a análise de adiponectina, são utilizadas partículas de látex que transportam uma substância que se liga especificamente a adiponectina para se efectuar uma reacção de aglutinação, sendo o grau de aglutinação analisado opticamente (em particular, determinado) para analisar (em particular, determinar) a quantidade de adiponectina presente numa amostra biológica, tal como no sangue. A análise óptica do grau de aglutinação de partículas de látex pode ser efectuada, por exemplo, por observação visual ou por meio de um instrumento óptico para a medição da intensidade da luz dispersa, da absorvência ou da intensidade da luz transmitida. De preferência, o comprimento de onda de medição está compreendido entre 300 e 800 nm. 0 grau de aglutinação pode ser efectuado, por exemplo, em conformidade com um método conhecido, por meio da selecção de um tamanho (tamanho médio de partícula) da partícula de látex, da concentração de partículas de látex ou do tempo de reacção, e determinado o aumento ou a diminuição da intensidade da luz dispersa, da absorvência, da intensidade de luz transmitida ou de uma sua combinação.

De um modo geral, a concentração de partículas de látex sensibilizadas com a substância que se liga a adiponectina, que está presente no sistema de reacção de aglutinação de látex, pode ser adequadamente seleccionada em conformidade, por exemplo, com uma concentração de aditivos coexistentes, tais como sais, proteínas ou sacáridos. A concentração de partículas de látex (como concentração final no sistema de reacção) está preferencialmente compreendida entre 0,05 e 10 mg/mL e mais preferencialmente entre 0,1 e 2 mg/mL. No caso de a 18 concentração de partículas de látex ser demasiado reduzida, a reacção de aglutinação poderá não ser sempre determinada de um modo preciso num intervalo de concentração reduzido, sendo, por tal motivo, a sua reprodut ibilidade por vezes reduzida. No caso de a concentração ser demasiado elevada, então a reacção de aglutinação poderá não ser sempre determinada de um modo preciso num intervalo de concentração elevado, sendo, por tal motivo, a sua reprodutibilidade por vezes reduzida.

Na presente invenção, a reacção de aglutinação de partículas de látex pode ser determinada de um modo mais preciso e um intervalo mensurável numa concentração reduzida e numa concentração elevada pode ser estendido, ajustando outros factores que podem afectar a reacção de aglutinação de partículas de látex sensibilizadas com a substância que se liga a adiponectina. Como factores é possível referir, por exemplo, a concentração de partículas de látex, a quantidade de anticorpo sensibilizado nas partículas de látex ou o tamanho de partícula da partícula de látex. A reacção de aglutinação de látex no método da presente invenção para a análise de adiponectina pode ser efectuada sob condições idênticas às utilizadas para uma reacção de aglutinação de látex convencional. Como meio de reacção é possível seleccionar adequadamente diversos tampões de acordo com a análise de adiponectina em diversos líquidos biológicos. No caso de se analisar a adiponectina no sangue, então a força iónica e o pH do tampão não se encontram particularmente limitados, desde que o tampão não provoque a inactivação de adiponectina no sangue e não iniba a reacção de aglutinação de látex. Como tampão é 19 possível utilizar, por exemplo, tampão de Good, tampão de glicina ou tampão tris. 0 valor de pH da reacção está preferencialmente compreendido entre 5 e 10 e mais preferencialmente entre 6 e 8. A temperatura de reacção está preferencialmente compreendida entre 0°C e 50°C e mais preferencialmente entre 20 °C e 40°C. O tempo de reacção pode ser seleccionado adequadamente.

EXEMPLOS A presente invenção será agora melhor ilustrada, não de uma forma limitativa, pelos exemplos seguintes.

Exemplo 1: preparação do reagente para a medição de adiponectina (1) Preparação de líquido de látex sensibilizado com anticorpo anti-adiponectina

Dissolveu-se um anticorpo policlonal humano anti-adiponectina proveniente de coelho em tampão tris 0,01 mol/L (pH 8,0) numa concentração de 0,5 mg/mL. A 9 mL da solução de anticorpo policlonal adicionou-se 1 mL de uma solução de látex de poliestireno (tamanho médio de partícula = 0,2 pm, teor em sólidos = 10% em peso) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 60 minutos. Adicionou-se um tampão tris (pH 8,0) que continha 0,5% em peso de albumina do soro de bovino à mistura. Agitou-se a solução resultante à temperatura ambiente durante 60 minutos e centrifugou-se a 20000 r.p.m..

Colocou-se em suspensão o precipitado resultante, isto é, látex, em 10 mL de tampão tris (pH 8,0) para se preparar um 20 líquido de látex sensibilizado com o anticorpo anti-adiponectina.

Neste sentido, preparou-se o anticorpo policlonal anterior pelo método descrito no exemplo 1 do documento W099/21577. Isto é, um anticorpo policlonal obtido utilizando como imunogénio a adiponectina preparada por técnicas de recombinação genética.

Neste exemplo, preparou-se três líquidos (lotes nos 01 a 03) de látex sensibilizado com o anticorpo anti-adiponectina de acordo com o procedimento supramencionado e avaliou-se no exemplo 2 seguinte. (2) Preparação do tampão

Adicionou-se cloreto de sódio numa concentração de 0,9% em peso a tampão tris 0,1 mol/L (pH 8,0) que continha 0,5% em peso de albumina de soro de bovino, para preparar um tampão. (3) Reagente para a medição do antigénio de adiponectina humana

Construiu-se um reagente, utilizado neste exemplo, para a medição de um antigénio de adiponectina humana como um sistema de componentes de dois reagentes constituído pelo tampão preparado no exemplo 1(2) com primeiro reagente e o látex sensibilizado com o anticorpo anti-adiponectina preparado no exemplo 1(1) como segundo reagente. (4) Líquidos padrão de antigénio de adiponectina

Diluiu-se um soro que continha a adiponectina numa concentração elevada, a qual foi recolhida a partir de um sujeito não obeso, com soluto salino fisiológico para se 21 preparar líquidos padrão de antigénio de adiponectina que contêm concentrações conhecidas de adiponectina.

Exemplo 2: medição de adiponectina no sangue (1) Medição de adiponectina no sangue A 2 pL de cada amostra que se pretende determinar (sangue recolhido de um sujeito magro) adicionou-se 90 pL do tampão preparado no exemplo 1(2) e manteve-se em repouso a mistura a 37°C. A esta mistura adicionou-se 90 pL do liquido de látex sensibilizado com o anticorpo anti-adiponectina preparado no exemplo 1(1) e agitou-se. Após a última adição, determinou-se a absorvência para um comprimento de onda de 570 nm durante 5 minutos. Considerou-se a alteração quantitativa desde esse instante no valor de absorvência como a alteração quantitativa em termos de absorvência (AAbs). Preparou-se uma curva de calibração dos líquidos padrão de antigénio de adiponectina com base em cada AAbs dos líquidos padrão de antigénio de adiponectina e da sua concentração. Utilizou-se a curva de calibração para calcular a quantidade de adiponectina a partir do valor de AAbs de cada amostra. A medição foi efectuada utilizando um analisador automático (Hitachi 7170, Hitachi Ltd.).

Os resultados são apresentados no quadro 1 e na figura 1. Conforme ilustrado no quadro 1 e na figura 1, confirmou-se que os líquidos de látex sensibilizados lotes nos 01 a 03 podem ser utilizados para medir o valor de adiponectina desde uma concentração reduzida até uma concentração elevada no que diz respeito aos valores teóricos de adiponectina diluída. 22

Quadro 1

Lote de reagente Lote 01 Lote 02 Lote 03 (a) (b) (b) (b) pg/mL Abs x10 4 AbsxlO4 Abs x10 4 0, 00 -3 -2 -2 0,20 13 10 12 0,39 26 25 28 0, 79 52 52 54 1, 18 81 78 82 1,57 108 106 110 1,97 135 133 138 2,36 162 164 164 2, 75 191 188 196 3, 14 220 215 220 3,54 248 245 254 3,93 275 273 284 7, 86 570 567 582 11, 79 860 844 877 15, 72 1161 1140 1182 19,65 1443 1415 1456 23,58 1707 1680 1722 27,51 1947 1895 1982 31,44 2164 2110 2201 35,37 2342 2311 2405 39,30 2497 2486 2562 47, 16 2679 2626 2724 70, 74 3071 2990 3115 23

Lote de reagente Lote 01 Lote 02 Lote 03 (a) (b) (b) (b) pg/mL AbsxlO4 AbsxlO4 AbsxlO4 94,32 3134 3052 3189 117,90 3042 2968 3138 [(a) : Valor teórico de adiponectina diluída; e (b): sensibilidade] (2) Determinação da sensibilidade mínima detectável (limite de detecção inferior)

Repetiu-se o procedimento descrito no exemplo 2(1), com a excepção de se terem recolhido as amostras que se pretende medir a partir de pessoas saudáveis.

Os resultados são apresentados no quadro 2. No quadro 2, os termos "N", "MAX", "MIN", "Intervalo", "Média", "DP" e "CV" designam, respectivamente, "número de sujeitos que se pretende medir", "valor máximo", "valor mínimo", "diferença entre o valor máximo e o valor mínimo", "valor médio", "desvio padrão" e "coeficiente de variação".

Conforme ilustrado no quadro 2, confirmou-se que uma concentração em que o valor "Média+2DP" de AAbs (0 pg/mL) não se sobrepunha ao valor "Média-2DP" era de 0,1 pg/mL. 24

Quadro 2 0 pg/mL 0,1 pg/mL 0,2 pg/mL 0,3 pg/mL 0,4 pg/mL 0,5 pg/mL 0,6 pg/mL 0,7 pg/mL 0,8 pg/mL 0,9 pg/mL 1 pg/mL 1 0,000 0,061 0,253 0,314 0,406 0,429 0,566 0,260 0,834 0,933 0,948 2 0,000 0,038 0,161 0,337 0,436 0,505 0,543 0,650 0,826 0,750 1,016 3 0,000 0,092 0,260 0,299 0,444 0,513 0,574 0,673 0,826 0,902 1,032 4 0,000 0,061 0,184 0,322 0,375 0,444 0,605 0,704 0,742 0,902 1,085 5 0,000 0,077 0,237 0,329 0,329 0,513 0,528 0,704 0,773 0,895 1,032 6 0,000 0,100 0,253 0,360 0,375 0,482 0,582 0,658 0,811 0,895 1,032 7 0,008 0,100 0,222 0,314 0,436 0,505 0,536 0,696 0,795 0,955 0,971 8 0,000 0,107 0,191 0,337 0,398 0,498 0,566 0,681 0,818 0,917 0,986 9 0,000 0,061 0,138 0,314 0,436 0,482 0,612 0,643 0,818 0,910 1,039 10 0,000 0,123 0,207 0,276 0,360 0,498 0,566 0,696 0,826 0,948 1,001 N 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 MAX 0, 008 0,123 0,260 0,360 0,444 0,513 0,612 0,704 0,834 0,955 1,085 MIN 0, 000 0,038 0,138 0,276 0,329 0,429 0,528 0,620 0,742 0,750 0,948 Intervalo 0, 008 0, 085 0,122 0,084 0,115 0,084 0,084 0,084 0,092 0,205 0,137 Média 0,001 0,082 0,211 0,320 0,399 0, 487 0,568 0,672 0,807 0,901 1,014 DP 0, 003 0,027 0, 042 0,023 0,039 0, 029 0, 027 0,029 0,029 0,057 0,039 cv 316,23% 32,36% 19,83% 7,17% 9,78% 5,93% 4, 84% 4,29% 3,60% 6,34% 3,86% Média-2DP - 0,03 0,13 0,27 0,32 0,43 0,51 0,61 0,75 0,79 0,49 Média+2DP 0,01 - - - - - - - - - -

(3) Confirmação de correlação com o método EIA

Como método látex da presente invenção, repetiu-se o procedimento descrito no exemplo 2(1), com a excepção de se terem recolhido as amostras que se pretende medir a partir de pessoas saudáveis.

Foi efectuado um método EIA utilizando um reagente de laboratório comercialmente disponível (kit ELISA de adiponectina humana; Otsuka Pharmaceutical). 0 reagente ELISA é um reagente que se encontra comercialmente disponível com base num método ELISA descrito no documento W099/21577. No reagente ELISA, utiliza-se uma combinação de um anticorpo monoclonal e de um anticorpo policlonal, preparado por meio da utilização de adiponectina como imunogénio preparada por técnicas de recombinação genética, como anticorpos anti-adiponectina e constituem passos 25 essenciais o passo de pré-tratamento (um tratamento térmico na presença de SDS) de uma amostra e o passo de diluição.

Os resultados são apresentados na figura 2. Conforme ilustrado na figura 2, a correlação entre o método látex da presente invenção e o método EIA utilizando o reagente de laboratório comercialmente disponível satisfaz a seguinte equação: Y = 0,9938 x - 0,0015 (R = 0,9889), tendo-se confirmado uma correlação elevada. (4) Confirmação do efeito de impurezas

Repetiu-se o procedimento descrito no exemplo 2(1), com a excepção de se terem utilizado amostras preparadas por adição de diversas impurezas (bilirrubina F, bilirrubina C, hemoglobina, turbidez de formazina, intrafat ou factor reumatóide) a concentrações desejadas a amostra recolhidas a partir de pessoas saudáveis, que se pretende medir.

Os resultados são apresentados nos quadros 3 a 14. Confirmou-se que o efeito de cada impureza [bilirrubina F, bilirrubina C, hemoglobina, turbidez de formazina, intrafat ou factor reumatóide (FR)] para cada concentração está compreendido entre ± 10%. 26

Quadro 3 bilirrubina F (a) (mg/dL) amostra 1 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 2, 14 100,0% 1/5 6,0 2,10 98,0% 2/5 12,0 2,09 97,5% 3/5 18,0 2,09 97,5% 4/5 24, 0 2,09 97,5% 5/5 30,0 2,06 96,3% [(a): concentração adicionada, (b): valor medido, e (c): taxa de recuperação nos quadros 3 a 14]

Quadro 4 bilirrubina F (a) (mg/dL) amostra 2 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 6, 45 100,0% 1/5 6,0 6, 45 100,1% 2/5 12,0 6,42 99,5% 3/5 18,0 6, 41 99,3% 4/5 24, 0 6,43 99,6% 5/5 30,0 6,44 99,8% 27

Quadro 5 bilirrubina C (a) (mg/dL) amostra 1 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 2,07 100,0% 1/5 6,0 2, 05 99,2% 2/5 12,0 2,08 100,5% 3/5 18,0 2, 05 99,2% 4/5 24, 0 2,06 99, 7% 5/5 30,0 2,08 100,6%

Quadro 6 bilirrubina C (a) (mg/dL) amostra 2 (b) ( pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 6,41 100,0% 1/5 6,0 6, 41 100,0% 2/5 12,0 6,43 100,3% 3/5 18,0 6, 45 100,6% 4/5 24, 0 6,41 99,9% 5/5 30,0 6,37 99, 4% 28

Quadro 7 (a) (mg/dL) amostra 1 hemoglobina (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 2,06 100,0% 1/5 100,0 2,06 100,0% 2/5 200,0 2,04 99,2% 3/5 300,0 2,06 100,3% 4/5 400,0 2,08 101,1% 5/5 500,0 2,06 100,2% Quadro 8 (a) (mg/dL) amostra 2 hemoglobina (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 6,40 100,0% 1/5 100,0 6,43 100,5% 2/5 200,0 6,26 97,9% 3/5 300,0 6,38 99, 7% 4/5 400,0 6,39 99,8% 5/5 500,0 6, 41 100,3% 29

Quadro 9 formazina Turbidez (a) (turbidez) amostra 1 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 2, 12 100,0% 1/5 400,0 2,13 100,5% 2/5 800,0 2,07 97, 8% 3/5 1200,0 2,06 97, 0% 4/5 1600,0 2, 11 99, 7% 5/5 2000,0 2,07 97,6%

Quadro 10 formaz ina Turbidez (a) (turbidez) amostra 2 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 6,38 100,0% 1/5 400,0 6,37 99,8% 2/5 800,0 6,34 99, 4% 3/5 1200,0 6,35 99, 4% 4/5 1600,0 6,38 99,9% 5/5 2000,0 6,94 100,9% 30

Quadro 11 intrafat (a) (%) amostra 1 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 2,10 100,0% 1/5 1,0 2, 12 100,8% 2/5 2,0 2,10 100,0% 3/5 3,0 2, 14 101,9% 4/5 4,0 2, 15 102,2% 5/5 5, 0 2,13 101,3%

Quadro 12 intrafat (a) (%) amostra 2 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0,0 6,42 100,0% 1/5 1,0 6,42 100,0% 2/5 2,0 6, 44 100,3% 3/5 3,0 6,34 98, 7% 4/5 4,0 6,32 98,4% 5/5 5, 0 6,31 98,2% 31

Quadro 13 FR (a) (IU/mL) amostra 1 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0, 0 2,10 100,0% 1/5 50,0 2,06 98, 1% 2/5 100,0 2,05 97, 3% 3/5 150,0 2,10 100,0% 4/5 200,0 2,03 96,7% 5/5 250,0 2,12 100,6%

Quadro 14 FR (a) (IU/mL) amostra 2 (b) (pg/mL) (C) (%) 0/5 0, 0 6,42 100,0% 1/5 50,0 6,30 98,2% 2/5 100,0 6,39 99,6% 3/5 150,0 6,27 97, 8% 4/5 200,0 6,30 98,2% 5/5 250,0 6,42 100,1%

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com a presente invenção, na análise para adiponectina presente num liquido biológico (de preferência no sangue) com base numa reacção de aglutinação de látex, utilizando partículas de látex, o intervalo mensurável pode ser estendido desde uma concentração reduzida até uma concentração elevada na ausência de um pré-tratamento ou de uma pré-diluição de uma amostra. Além disso, a análise da presente invenção pode ser efectuada de um modo rápido e 32 conveniente, em que os dispositivos para tal não são limitados.

Um analisador automático capaz de manusear diversas amostras num curto periodo de tempo é agora utilizado, sendo desejada uma elevada sensibilidade. Assim sendo, um método de aglutinação de látex que utilize uma reacção com uma partícula de látex que transporte um anticorpo (ou um antigénio) é amplamente utilizado. A análise da presente invenção não requer um pré-tratamento e/ou uma pré-diluição, pelo que a análise pode ser efectuada num curto periodo de tempo (por exemplo, aproximadamente 10 a 15 minutos). O reagente de látex da presente invenção para a análise de adiponectina (de preferência de adiponectina no sangue) é adequado como reagente de análise para um analisador automático.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a variantes especificas, há diversas alterações e modificações que serão evidentes para os especialistas na matéria que são possíveis, sem no entanto fugir do âmbito das reivindicações anexas. 33

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • WO 9921577 A [0007] [0025] [0044] [0055] • WO 03016906 A [0007] [0026] • EP 1365022 A [0007] • EP 1033134 A [0007] • JP 60111159 A [0007]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Research Communications, (U.S.A.), 1996, vol. 221, 286- 289 [0007] • Gene, (Netherlands), 1997, vol. 190, 227-235 [0007] • Hiroshi Hirose et al. Kessei adiponectin noudo to insulin teikousei: kenjyojin oyobi 2-gata tonyoubyou kanjya ni okeru kentou", "Meeting of the 75th Japanese endocrinology association study, Abstracts. The Japan Endocrine Society, 2002, 118 [0007] • Yasuichi Ohmoto et al. Adiponectin no ELISA kit ni tuite. Bio Clinica, 2002, vol. 17, 156-159 [0007] • Yasuichi Ohmoto et al. Adiponectin ELISA kit no kaihatsu to kecchu sonzai youshiki no kaiseki. Medicai Science Digest, 2002, vol. 28 (12), 40-43 [0007] 34 • Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, (U.S.A.), 2003, vol. 23, 85-89 [0007] • Circulation, (U.S.A.), 2003, vol. 107, 671-674 [0007] • Journal of Biochemistry, 1996, vol. 120, 803-812 [0007] • Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, vol. 221, 286-289 [0014] • Gene, 1997, vol. 190, 227-235 [0014] • J. Biochem, vol. 120, 803-812 [0014]

Claims (2)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Reagente de látex para a análise de adiponectina, o qual compreende uma suspensão de partículas de látex que transportam um anticorpo policlonal anti-adiponectina que se liga especificamente a adiponectina, em que o reagente de látex é seleccionado entre: (i) um sistema de componentes de um reagente, em que um tampão e as partículas de látex estão contidos nesse reagente e (ii) um kit constituído por dois reagentes, em que o primeiro reagente contém o tampão e o segundo reagente contém as partículas de látex.

2. Método para a análise de adiponectina num líquido biológico que contém, possivelmente, adiponectina, o qual compreende os passos que consistem em: fazer contactar o líquido biológico na ausência de um pré-tratamento, em que o referido pré-tratamento consiste na desnaturação química do líquido biológico com dodecil-sulfato de sódio, com um reagente de látex para a análise de adiponectina de acordo com a reivindicação 1; e analisar opticamente o grau de aglutinação de partículas de látex.