BR112021003539A2 - método para diagnóstico de uma doença do fígado - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA DO FÍGADO. A presente invenção refere-se a um método para diagnóstico de uma doença de fígado em um mamífero compreendendo a etapa de determinação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico de dito mamífero e diagnóstico de uma doença de fígado se a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra do dito mamífero é diferente da quantidade do produto codificado pelo gene NOG determinada em uma amostra de um mamífero saudável.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO PARA DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA DO FÍGADO". Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se à detecção de mudanças patológicas em tecido de fígado através de medição de um biomarca- dor. Antecedentes da Técnica
[0002] Doenças de fígado como doença de fígado gordo (FLD) são patologias muito comuns na população em geral. É digno de nota que na população Ocidental, má nutrição é a causa mais comum de doen- ça de fígado gordo não alcoólica (NAFLD), por exemplo, com uma in- cidência estimada de 15 a 20%, e um número crescente de pacientes apresentando fatores de risco para seu desenvolvimento (Bedogni et al. 42(2005):44–52; Amarapurkar et al. Ann Hepatol 6(2007):161–163). NAFLD relacionada com super-nutrição e obesidade é um distúrbio de múltiplos fatores e ligado a hiper trigliceridemia, obesidade, e resistên- cia a insulin, como observado em pacientes com syndrome metabólica (Higuchi and Gores, Curr Mol Med 3 (2003): 483-490).
[0003] Embora FLD, por exemplo, seja uma tal doença de ampla disseminação seu diagnóstico não – invasivo permanece uma neces- sidade médica não satisfeita. Ainda a maioria de pacientes tem de so- frer dolorosa biópsia, uma vez que atualmente, isto ainda é o padrão ouro para diagnóstico e classificação de estágio de NAFLD. Entretan- to, este é um procedimento invasivo e é limitado por erro de amostra- gem, alto custo, complicações relacionadas com procedimento, e vari- abilidade de observador, mesmo quando realizado por patologistas experientes. Formação de imagem de ressonância magnética de den- sidade de próton de fração de gordura (MRI-PDFF) e elastografia de ressonância magnética (MRE) emergiram como ferramentas acuradas para quantificação de esteatose mas são muito caras e não acessíveis para todos os pacientes. Elas também têm severos problemas na de- tecção de inflamação, que é um fator muito importante para estimar a progressão de SS para NASH, que é chave para estratificação de pa- ciente e decisões de terapia. Por isso, há uma necessidade desespe- rada de biomarcadores de doença de fígado não invasivos, em particu- lar biomarcadores de NAFLD, medidos em fluidos do corpo como san- gue, para resolver os problemas mencionados acima.
[0004] Assim, é um objeto da presente invenção prover um méto- do e meios permitindo o diagnóstico de doenças do fígado e o monito- ramento do progresso de doenças do fígado usando métodos não in- vasivos ou minimamente invasivos. Sumário da Invenção
[0005] A presente invenção refere-se a um método para diagnósti- co de uma doença de fígado em um mamífero compreendendo a eta- pa de determinação de quantidade de um produto codificado pelo ge- ne NOG em uma amostra de fluido biológico de dito mamífero e diag- nóstico de doença de fígado se a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra de dito mamífero é diferente da quantida- de do produto codificado pelo gene NOG determinada em uma amos- tra de um mamífero saudável da mesma espécie.
[0006] Foi surpreendentemente verificado que o nível de um pro- duto codificado pelo gene NOG, preferivelmente NOGGIN, em uma amostra de fluido biológico indica se um mamífero do qual a dita amostra foi obtida sofre de uma doença do fígado. Uma das maiores vantagens do método da presente invenção é o fato de que o produto codificado pelo gene NOG pode ser medido em uma amostra de fluido biológico de modo que não é mais necessário realizar uma biópsia de fígado ou qualquer outro método invasivo de modo a obter-se uma amostra biológica.
[0007] A presente invenção também refere-se a um método não invasivo ou minimamente invasivo para diagnóstico de doenças de fí- gado como doença de fígado gordo (FLD), em particular doenças de fígado gordo não alcoólicas (NAFLD) ou doença de fígado gordo al- coólica (AFLD).
[0008] O método da presente invenção também permite discrimi- nação entre esteatose simples (SS) e esteato hepatite não alcoólica (NASH). Foi verificado que a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra obtida de um mamífero, em particular de um humano, sofrendo de esteatose simples é significantemente menor que na amostra de um mamífero da mesma espécie sofrendo de este- ato hepatite não alcoólica. A quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra obtida de um mamífero sofrendo de esteatose simples é pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 25%, inferior comparada a uma amostra de um mamífero da mesma espécie so- frendo de esteato hepatite não alcoólica. Esteatose simples pode ser diagnosticada pode ser diagnosticada em um mamífero, em particular em um humano, se a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra está entre 3 e 7 pmol/L, preferivelmente entre 4 e 6 pmol/L. Esteato hepatite não alcoólica pode ser diagnosticada em um mamífero se a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra está entre 7,5 e 11 pmols/L, preferivelmente entre 8 e 10 pmols/L.
[0009] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um mé- todo para monitoramento de progresso de uma doença de fígado ou o tratamento de uma doença de fígado em um mamífero compreenden- do a etapa de determinação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico de dito mamífero.
[0010] Uma vez que o nível de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico de um mamífero é influenci- ado pelo status de saúde do fígado, a concentração de dito produto de gene NOG pode ser diretamente usada para monitorar o progresso de uma doença de fígado ou seu tratamento. Breve Descrição das Figuras
[0011] A Fig. 1A mostra níveis de noggin em soro (média +/- erro padrão da média) em pacientes com SS, NASH e controles. Níveis de noggin em soro foram muito menores em pacientes de SS e NASH que controles (p para tendência = 0,040), sem serem diferentes entre pacientes SS e NASH. * : P < 0,05 comparado ao grupo controle.
[0012] A Fig. 1B mostra log soro (níveis de noggin) (média +/- erro padrão da média) em pacientes de NAFLD randomicamente designa- dos para monoterapia com vitamina E ou para terapia combinada com spirolactona e vitamina E. Níveis de noggin aumentaram similarmente em ambos os grupos no mês 2 e permaneceram estáveis após a se- guir até o fim do estudo. *: p < 0,05 comparado aos níveis de noggin de linha base. Descrição das Modalidades
[0013] “Diagnosticando” e “diagnóstico”, como aqui usado, refe- rem-se a métodos através dos quais aqueles versados na técnica po- dem estimar e determinar se ou não um mamífero está sofrendo de uma dada doença ou condição. Este diagnóstico é feito nas bases de um biomarcador, a quantidade (incluindo presença ou ausência) do qual é indicativa da presença, severidade ou ausência da condição.
[0014] “Doença de fígado”, como aqui usada, refere-se a qualquer condição patológica do fígado influenciando seu funcionamento.
[0015] “Um produto codificado pelo gene NOG”, como aqui usado, refere-se a moléculas de mRNA, peptídeos, polipeptídeos, proteínas e seus fragmentos que são transcritos ou traduzidos a partir da região codificante do gene NOG.
[0016] O “gene NOG” codifica uma proteína noggin (UniProtKB – Q13253) que está envolvida no desenvolvimento de muitos tecidos do corpo, incluindo tecido de nervo, músculos e ossos. Noggin é conheci- da interagir com membros de um grupo de proteínas chamado de pro- teínas morfogenéticas de osso (BMPs). BMPs ajudam a controlar o desenvolvimento de osso e outros tecidos.
[0017] Noggin é uma glicoproteína homodimérica secretada que é um antagonista de proteínas morfogenéticas de osso (BMPs). cDNA de noggin humana codifica uma proteína precursora de 232 aminoáci- dos (aa) (UniProtKB – Q13253; SEQ ID NO: 1); clivagem de um peptí- deo sinal de 27 aa gera a proteína madura de 205 aa que contém uma região ácida terminal-N, um segmento de ligação de heparina básico central e uma estrutura de nó – cisteína terminal-C. Até agora NOG- GIN tem estado sob investigação na área de disseminação de células de tumor para osso, espondilite anquilosante ou hipertensão arterial pulmonar (PAH) mas não com qualquer patologia do fígado. Surpre- endentemente os inventores verificaram uma forte associação com uma forma muito comum de doença do fígado.
[0018] SEQ ID No. 1 (UniProtKB - Q13253): MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGGQHYLHIR- PAPSDNLPLVDLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGF- MATSPPEDRPGGGG- GAAGGAEDLAELDQLLRQRPSGAMPSEIKGLEF- SEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDLGS- RFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLR-
[0019] “Uma amostra de um mamífero saudável”, como aqui usa- do, refere-se a uma amostra referência obtida através de medição de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em pelo menos um, preferivelmente pelo menos dois, mais preferivelmente pelo me- nos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez, mais preferivelmente pelo menos 20, mamíferos que não sofrem de qualquer doença que seja um resultado de, ou resulte em um desequilíbrio do nível de nog- gin incluindo tumor, espondilite anquilosante, hipertensão arterial pul- monar (PAH), doenças do fígado e qualquer outra doença. “Mamíferos saudáveis” não mostram qualquer patologia documentada de tecido de fígado. A amostra do mamífero saudável é da mesma fonte (por exem- plo, sangue, soro)e da mesma origem (por exemplo, humana, cão, ga- to, cavalo) como a amostra de fluido biológico do mamífero que é examinada em relação a doenças de fígado.
[0020] De acordo com uma realização preferida da presente in- venção uma doença de fígado é diagnosticada quando a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra do dito mamífero é significantemente menor ou maior, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, menor ou maior, mais preferivelmente menor, comparada à quantidade do produto codificado pelo gene NOG determinado em uma amostra de um mamífero sau- dável.
[0021] Uma doença de fígado é diagnosticada se em uma amostra de um mamífero a quantidade do produto codificado pelo gene NOG é diferente da quantidade do produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de um mamífero saudável. Foi verificado que uma diferença de pelo menos 25% indica a presença de uma doença do fígado.
[0022] De acordo com uma outra realização preferida da presente invenção uma doença do fígado é diagnosticada quando a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra de dito mamífero, em particular humano, é menor que 12 pmols/L, preferivelmente menor que 11 pmols/L, mais preferivelmente menor que 10 pmols/L, mais preferivelmente menor que 9 pmols/L. Os métodos da presente inven- ção permitem diagnosticar qualquer doença do fígado ou monitorar o tratamento e/ou progresso de doenças do fígado. Entretanto, em uma realização particularmente preferida da presente invenção a doença de fígado é uma esteatose hepática (doença de fígado gordo, FLD).
[0023] Esteatose hepática (fígado gordo) é caracterizada por uma acumulação intracelular de lipídeos e subsequente formação de gotí- culas de lipídeos (LD1) no citoplasma de hepatócitos que é associada com um aumento do fígado (hepatomegalia). Quando esteatose do fígado ainda é acompanhada por inflamação, a condição é chamada esteato hepatite. Ambas condições patológicas são subordinadas sob o termo de doença de fígado gordo não alcoólica (NAFLD) se álcool pode ser excluído como uma causa primária. Assim, NAFLD refere-se a esteatose assim como a seus estágios progressivos (isto é, esteato hepatite). Doença de fígado gordo não alcoólica (NAFLD) inclui estea- tose simples (SS) e esteato hepatite não alcoólica (NASH), que pode avançar para cirrose e carcinoma hepatocelular.
[0024] De acordo com uma realização preferida da presente in- venção a esteatose hepática é selecionada do grupo consistindo em doença de fígado gordo não alcoólica (NAFLD), preferivelmente estea- to-hepatite não alcoólica (NASH) ou esteatose simples (SS).
[0025] De acordo com outra realização preferida da presente in- venção o produto codificado pelo gene NOG é Noggin (UniProtKB – Q13253).
[0026] Proteínas, polipeptídeos e mRNA/cDNA codificando estas moléculas podem ser determinados e/ou quantificados usando méto- dos bem conhecidos na técnica. De acordo com uma realização prefe- rida da presente invenção a quantidade do produto codificado pelo ge- ne NOG é determinada através de um ensaio imuno, ensaio de ligante – receptor, micro arranjo de proteína, método de espectroscopia de massa, biossensor ou método de cromatografia líquida.
[0027] Particularmente preferidos são métodos envolvendo anti- corpos ou seus fragmentos capazes de ligarem-especificamente pro-
dutos codificados pelo gene NOG. Portanto, o ensaio imuno é preferi- velmente selecionado do grupo consistindo em ensaio imune fluores- cente (FIA), ensaio imuno sorvente ligado a enzima (ELISA) com de- tecção cromogênica ou luminométrica e ensaio rádio imune (RIA).
[0028] Ensaios imunes particularmente preferidos usam anticorpos rotulados com fluorescência. De modo a aperfeiçoar a sensitividade de tais ensaios imunes estes ensaios podem ser baseados em fluores- cência aperfeiçoada de metal como descrito, por exemplo, em WO 2017/046320.
[0029] De acordo com uma realização preferida da presente in- venção a amostra de fluido biológico é uma amostra de sangue, soro, plasma, urina ou fluido salivar.
[0030] De acordo com outra realização preferida da presente in- venção o mamífero é um ser humano, camundongo, rato, bovino, equino, felino ou indivíduo canino.
[0031] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um kit para determinação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico para diagnóstico de uma doença de fígado em um mamífero ou para monitoramento de progresso de uma doença de fígado ou o tratamento de uma doença de fígado em um mamífero.
[0032] Kits preferidos podem compreender anticorpos ou seus fra- gmentos ligando-se ao produto codificado pelo gene NOG, os ditos anticorpos ou seus fragmentos sendo opcionalmente imobilizados so- bre um suporte sólido, e anticorpos rotulados fluorescentemente ou seus fragmentos ligando-se ao produto codificado pelo gene NOG.
[0033] De modo a aperfeiçoar a sensitividade do método de detec- ção o suporte sólido é preferivelmente pelo menos parcialmente cober- to com um metal, preferivelmente com prata. Suportes sólidos particu- larmente preferidos são mostrados em WO 2017/046320.
[0034] O kit da presente invenção ainda pode compreender pelo menos um calibrador contendo específicas quantidades de proteína Noggin, pelo menos um controle com uma quantidade predefinida de proteína Noggin e/ou pelo menos um tampão para diluição de amos- tras de alta leitura, uma enzima ou uma preparação de anticorpo de detecção específica de Noggin rotulada com fluoróforo e uma micro- placa revestida com um anticorpo de captura específico de Noggin.
[0035] A microplaca revestida com um anticorpo de captura espe- cífico de Noggin compreende uma superfície de estrutura e é pelo me- nos parcialmente coberta com um revestimento de metal como des- crito em WO 2017/046320. Exemplos
[0036] A presente invenção ainda é ilustrada pelo exemplo que se segue, entretanto, sem ser restrita ao mesmo. Exemplo: Material & Métodos Pacientes e desenho de estudo
[0037] Critérios de inclusão para pacientes de NAFLD (“doença de fígado gordo não alcoólica”) foram: 1) age > 18 anos; 2) formação de imagem de ultrassom indicando fígado gordo e testes de função anor- mal de fígado por pelo menos 6 meses antes de biópsia de fígado; e 3) consentimento de paciente para biópsia de fígado. Indivíduos empare- lhados para idade-sexo e índice de massa de corpo (BMI) foram recru- tados para grupo controle, consistiram em indivíduos saudáveis que sofreram verificação regular para necessidades profissionais. Critérios de inclusão para os controles foram: 1) idade > 18 anos; 2) nenhuma história de anormal formação de imagem de ultrassom de fígado ou anormais testes de função de fígado; 3) formação de imagem de ul- trassom de fígado correntemente normal e testes de função de fígado normais. Critérios de exclusão foram os mesmos para pacientes e con-
troles, alvejando excluir causas secundárias de fígado gordo, incluindo medicações ou suplementos possivelmente afetando NAFLD (Polyzos S, et al. Ann Hepatol. 2013; 12(5) : 749-757).
[0038] O estudo foi um RCT (experimento controlado randomiza- do) de rótulo aberto, 52-semanas, um centro, com grupo controle ativo. O RCT consistiu na visita de seleção, visita de linha base, e três visitas adicionais durante a fase de tratamento (visita 2: semana 8; visita 3: semana 26; e visita 4: semana 52).
[0039] Pacientes NAFLD elegíveis foram randomizados para rece- berem vitamina E (400 IU / dia em duas doses iguais; grupo 1) ou spi- ronolactona (25 mg uma vez por dia) plus vitamina E (400 IU / dia em duas doses iguais; grupo 2) por 52 semanas. Randomização foi reali- zada com Excel (Microsoft Corp.) e alocação para tratamento foi feita como descrito em Polyzos AS et al. (Diabetes Obes Metab. 2017; 19 (12) : 1805-1809). Métodos Analíticos
[0040] Dados antropométricos (peso, altura, circunferência de cin- tura) foram anotados e amostras de soro matinais (8-9 am) em jejum foram coletadas em todas as visitas. Testes de laboratório para função de fígado (isto é, aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT), gama-glutamil transferase (GGT)) e metabolismo de glicose (is- to é, glicose, insulina) foram realizados com métodos padrões usando analisadores automáticos, como previamente descrito (ver Polyzos SA et al. Diabetes Obes Metab. 2017;19(12):1805-1809; and Polyzos S, et al. Ann Hepatol. 2013;12(5):749-757)..
[0041] A concentração em soro de noggin foi medida usando um ensaio imune fluorescente de alta sensitividade baseado em placas de microtitulação plasmonicas (FluoBolt-Noggin; Fianostics GmbH, Áus- tria), que aumenta o sinal de corantes fluorescentes várias centenas de vezes como descrito em Hawa G et al. (Anal Biochem. 2018 May 15; 549:39-44). Este ensaio detecta noggin humana bioativa, livre, que não está ligada a BMPs. Resumidamente, o protocolo de ensaio inclui: revestimento adsortivo de captura de anticorpo em tampão fosfato 50 mM (PBS) / NaCl 150 mM pH 7,4, por toda noite a 4oC seguido por la- vagem com PBS contendo Triton X-100 0,1%. Bloqueio de ligação não específica foi obtido com uma solução proprietária de FIANOSTICS contendo polímeros sintáticos e compostos mercapto. Após uma outra etapa de lavagem, duplicatas de 20 microlitros de anticorpo noggin an- ti-humano rotulado com AlexaFluor680 foram incubadas por toda noite em temperatura ambiente no escuro. Medições foram feitas usando um leitor de microplaca de fluorescência padrão. Amostras lendo ac ima de 100 pmols/L de noggin foram diluídas com tampão ensaio e novamente corridas para verificar linearidade do sinal. Coeficiente de variação (CV) inter-ensaio foi de 2-7% e CV intra-ensaio foi 4-10%.
[0042] Biópsia de fígado foi realizada em todos os pacientes NA- FLD sob orientação de tomografia computadorizada e foi interpretada de acordo com os critérios de esteato hepatite não alcoólica (NASH) de Clinical Research Network (Kleiner DE, et al. Hepatology. 2005; 41 (6): 1313-1321).
[0043] Ínidce de massa córporea (BMI), modelo de homeostase de avaliação-IR (HOMA-IR), escore de fígado gordo NAFLD e Índice de Razão ST-para-Plaqueta (APRI) foram calculados, como previamente descrito (ver Polyzos AS et al. Diabetes Obes Metab. 2017; 19(12):1805-1809). Escore de gordura no fígado NAFLD e APRI foram previamente selecionados entre quatro índices não invasivos de estea- tose hepática e cinco índices não invasivos não invasivos de fibrose hepática, respectivamente, porque eles se adaptaram melhor aos res- pectivos resultados histológicos de linha base, especificamente para esta RCT. Análise Estatística
[0044] Dados contínuos são apresentados como média +/- erro padrão da média (SEM). Teste Kolmogorov-Smirnov foi usado para verificar a normalidade de distribuições de variáveis contínuas. Na se- ção de caso – controle, quadrado – Chi ou teste exato de Fischer foi usado para comparações entre variáveis categóricas. Coeficiente de Spearman (rs) foi usado para correlações bivariadas. Teste-T de amostras independentes ou teste de Mann-Whitney foram usados para comparações entre dois grupos de variáveis contínuas. Análise de uma-via de variância (ANOVA) ou teste Kruskal-Wallis foram usados para comparações de mais que dois grupos de variáveis contínuas. Análises de uma-via de co-variância (ANCOVA) foi usada para ajuste para potenciais co-fundadores. Análise de regressão linear múltipla foi usada para identificar tendências para diferenças dentro de sujeitos, entre sujeitos e dentro de interação de tempo variável*, não ajustada ou ajustada (ANCOVA de duas-vias) para potenciais co-fundadores. A assunção de esfericidade foi testada com teste de Mauchly de esferi- cidade. Correção Bonferroni foi usada, se necessário, para múltiplas comparações emparelhadas. Dados de RCT foram analisados usando análise intenção-para-tratar.
[0045] Variáveis que não foram uniformemente distribuídas foram transformadas logaritmicamente antes de entrarem em testes reque- rendo a assunção de distribuições normais. Significância foi fixada em p < 0,05 (duas-caudas). Análises estatísticas foram realizadas com SPSS 21.0 para Macintosh (IBM Corp., Armonk, NY). Resultados Seção Caso – Controle
[0046] Trinta e um pacientes com NAFLD histologicamente confir- mada (15 com SS, 16 com NASH de linha de fronteira ou definida) e 24 controles foram incluídos nesta seção. Como especificamente sele- cionados, não existiram diferenças entre grupos em sexo, idade, BMI e circunferência de cintura. AST, ALT, GGT, glicose, insulina e HOMA-IR foram estatisticamente diferentes entre grupos com maiores tendên- cias em grupo NASH.
[0047] Níveis de noggin foram menores no inteiro grupo NAFLD (n = 31; 7,4 +/- 1,5 pmols/L) que o grupo controle (n = 24; 13,7 +/- 2,7 pmols/L; p = 0016). Similarmente, níveis de noggin foram menores em pacientes de SS (5,8 +/- 1,5 pmols/L) e NASH (8,7 +/- 2,4 pmols) do que os controles (13,7 +/- 2,7 pmols/L; p para tendência = 0,040) (ver Fig. 1A). Após ajuste sequencial para idade (modelo 1), idade e sexo (modelo 2), idade, sexo e log (ALT) (modelo 3), idade, sexo, log (ALT) e circunferência de cintura (modelo 4), idade, sexo, log (ALT), circunfe- rência de cintura e log (HOMA-IR) (modelo 5), log (noggin) permane- ceu significantemente diferente entre grupos (Tabela 1). Tabela 1. Dados comparativos não ajustados e ajustados entre paci- entes com SS, NASH de linha de fronteira e definida, e controles Controles SS NASH Valor-p para ten- dência* Não ajustada Log (noggin; pmol/L) 0,96 +/- 0,09 0,55 +/- 0,12 a 0,68 +/- 0,13 0,028 Modelo 1 Log (noggin; pmol/L) 0,96 +/- 0,10 0,55 +/- 0,13a 0,68 +/- 0,12 0,030 Modelo 2 Log (noggin; pmol/L) 0,95 +/- 0,10 0,55 +/- 0,13a 0,68 +/- 0,12 0,039 Modelo 3 Log (noggin; pmol/L 1,06 +/- 0,12 0,51 +/- 0,13a 0,55 +/- 0,14 0,015 Modelo 4 Log (noggin; pmol/L) 1,02 +/- 0,11 0,50 +/- 0,13 0,70 +/- 0,15 0,020 Modelo 5 Log (noggin; pmol/L) 0,99 +/- 0,11 0,52 +/- 0,13a 0,69 +/- 0,16 0,046 Dados são apresentados como média +/- erro padrão da média (SEM) para valores não ajustados e como média marginal estimada +/- erro padrão da média (SEM) para valores ajustados. a: p < 0,05 comparado ao grupo controle (Bonferroni ajuste post-hoc) Modelo 1: ajuste para idade; modelo 2: ajuste para idade e sexo; mo- delo 3: ajuste para idade, sexo e log (ALT); modelo 4: ajuste para ida-
de, sexo, log (ALT) e circunferência de cintura; modelo 5: ajuste para idade, sexo, log (ALT), circunferência de cintura e log (HOMA-IR). Abreviações: ALT, alanina transaminase; HOMA-IR, avaliação de mo- delo homeostático de resistência a insulina; NASH, esteato hepatite não alcoólica; SS, esteatose simple.
[0048] Dentro de pacientes (n = 31), níveis de noggin não foram diferentes entre grupos de diferente grau de esteatose, inflamação por- tal e lobular, expansão, e fibrose. Seção RCT
[0049] Trinta e um pacientes de NAFLD (15 com SS e 16 com NASH) foram randomicamente designados para grupo 1 (n = 17; 11 mulheres) ou grupo 2 (n = 14; 12 mulheres). Em linha base, os dois grupos foram similares para todos os parâmetros e não existiram dife- renças em eventos adversos durante tratamento.
[0050] Níveis Log (noggin) similarmente aumentaram após trata- mento em ambos os grupos (grupo 1; linha base: 0,66 +/- 0,13; mês 2: 0,98 +/- 0,09; mês 6: 1,03 +/- 0,07; mês 12: 1,02 +/-0,07 pmol/L, e gru- po 2; linha base 0,58 +/- 0,13; mês 2: 0,82 +/- 0,10; mês 6: 0,82 +/- 0,11; mês 12: 0,83 +/- 0,11 pmol/L; Fig. 1B). Mais especificamente, log (noggin) não foi diferente entre grupos (p = 0,20), mas aumentou den- tro de grupo sobre o tempo (p < 0,001). Não houve diferença signifi- cante na interação grupo*tempo (p = 0,62). Após correção para com- parações múltiplas, log (noggin) aumentou significantemente em mês 2 (p = 0,008 comparado a linha base) e permaneceu estável em mês 6 (p = 0,005 comparado a linha base) e 12 (p = 0,001 comparado a linha base) sem ainda aumento (ver Fig. 1B). Discussão
[0051] Níveis de noggin inferiores foram mostrados pela primeira vez em NAFLD (SS e NASH). Níveis de noggin aumentaram similar- mente após um tratamento de 2 meses com monoterapia de vitamina
E ou a combinação de spironolactona e vitamina E, presumivelmente devido a ação de vitamina E.
[0052] Uma vez que a patogênese de NAFLD é multifatorial, uma combinação de tratamentos antes que monoterapia pode ser mais efi- caz para alvejamento simultâneo de mais de um fator patogênico. En- tretanto, a adição de spironolactona a vitamina E ainda não aumenta noggin. Embora noggin seja aumentada por vitamina E, sua mudança não foi associada com mudanças em índices de esteatose hepática e índices, implicando que isto não afeta os mesmos.
[0053] Em conclusão, menores níveis de noggin foram observ ados em pacientes de NAFLD do que controles, e níveis de noggin aumentaram similarmente após baixas doses combinadas de spirono- lactona plus vitamina E ou monoterapia de vitamina E em pacientes NAFLD.
Claims (16)
1. Método para diagnóstico de uma doença de fígado em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de determinação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico de dito mamífero e diagnosticando uma doença de fígado se a quantidade do produto codificado pelo ge- ne NOG na amostra de dito mamífero é diferente da quantidade do produto codificado pelo gene NOG determinada em uma amostra de um mamífero saudável.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma doença de fígado é diagnosticada quando a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra do dito mamífero é significantemente menor ou maior, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, menor ou maior, comparada à quantidade do produ- to codificado pelo gene NOG determinada em uma amostra de um mamífero saudável.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma doença de fígado é diagnosticada quando a quantidade do produto codificado pelo gene NOG na amostra de um mamífero, preferivelmente amostra humana, é menor que 12 pmols/L, preferivelmente menor que 11 pmols/L, mais preferivelmente menor que 10 pmols/L, mais preferivelmente menor que 9 pmols/L.
4. Método para monitoramento de progresso de uma doen- ça de fígado ou o tratamento de uma doença de fígado em um mamí- fero, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de determi- nação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico do dito animal.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a doença de fígado é uma estea-
tose hepática (doença de fígado gordo, FLD).
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a esteatose hepática é selecionada do grupo consis- tindo em doença de fígado gordo não alcoólica (NAFLD), preferivel- mente esteato hepatite não alcoólica (NASH) ou esteatose simples (SS).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o produto codificado pelo gene NOG ser Noggin.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade do produto codifica- do pelo gene NOG é determinada através de um ensaio imune, ensaio de ligante – receptor, micro-arranjo de proteína, método de espectros- copia de massa, biossensor ou método de cromatografia líquida.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ensaio imune é selecionado do grupo consistindo em ensaio imune fluorescente (FIA), ensaio imuno sorvente ligado – enzima (ELISA) com detecção cromogênica ou luminométrica e ensaio rádio imune (RIA).
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológi- co é uma amostra de sangue, soro, plasma, urina, ou fluido salivar.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser huma- no, camundongo, rato, bovino, equino, felino, ou indivíduo canino.
12. Uso de um kit, caracterizado pelo fato de que é para de- terminação de quantidade de um produto codificado pelo gene NOG em uma amostra de fluido biológico para diagnóstico de uma doença de fígado em um mamífero ou para monitoramento de progresso de uma doença de fígado ou o tratamento de uma doença de fígado em um mamífero.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o kit compreende anticorpos ou seus fragmentos li- gando-se ao produto codificado pelo gene NOG, os ditos anticorpos ou seus fragmentos sendo opcionalmente imobilizados sobre um suporte sólido, e anticorpos rotulados fluorescentemente ou seus fragmentos ligando-se ao produto codificado pelo gene NOG.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é pelo menos parcialmente coberto com um metal, preferivelmente com prata.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o kit ainda compreende pelo me- nos um calibrador contendo específicas quantidades de proteína Nog- gin, pelo menos um controle com uma quantidade predefinida de pro- teína Noggin e/ou pelo menos um tampão para diluição de amostras de alta leitura, uma preparação de anticorpo de detecção específica de Noggin rotulado com fluoróforo e uma microplaca revestida com um anticorpo de captura específico de Noggin.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a microplaca revestida com um anticorpo de captura específico de Noggin compreende uma superfície de estrutura e está pelo menos parcialmente coberta com um revesti- mento de metal.
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