CN105807065B - BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。本发明还公开了BMP2和Noggin联合使用在制备预测强直性脊柱炎病理性成骨严重程度的试剂盒中的应用。本发明还公开了BMP2检测试剂盒和Noggin检测试剂盒。本发明通过同时检测BMP2和Noggin水平，可提高诊断强直性脊柱炎的特异性与敏感性，并可预测强直性脊柱炎病理性成骨的严重程度；本发明的BMP2检测试剂盒和Noggin检测试剂盒，降低了试剂盒检测容许范围下限，提高了检测准确性。

Description

BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的 应用
技术领域
本发明属于医疗卫生领域，尤其涉及BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。
背景技术
AS是一种常见的自身免疫性疾病，其患病率较高，在我国约为0.2-0.54％(可参见：Rong,J.G.Jieruo,Spondyloarthritis in china.Curr Opin Rheumatol,2013.25(4):p.460-7.)。AS好发于青年男性，常累及中轴骨关节，主要临床与病理特征是慢性进行性炎症与病理性成骨(可参见：Braun,J.J.Sieper,Ankylosing spondylitis.Lancet,2007.369(9570):p.1379-90.)。然而，AS的发病机制目前尚不明确，这导致目前AS诊断和治疗手段局限性大、有效性低。随着疾病的进展，AS患者将逐渐丧失生活和劳动能力，给患者带来了沉重的心理压力和经济负担，对社会的发展造成了巨大的影响和阻碍。因此，深入探讨AS的发病机制，开发新的行之有效的诊断和治疗方法显得尤为重要。
脊柱病理性成骨是导致AS患者丧失生活和劳动能力的最终原因。通过椎体边缘形成骨赘、骨桥，使本来具有相对活动性的脊柱关节逐渐融合为一个整体，导致患者脊柱活动明显受限，逐渐失去活动能力。目前的研究发现，脊柱病理性成骨的发生与进展程度在AS患者中个体差异巨大。部分患者在1-2年内可迅速进展至脊柱完全融合，但也有部分患者在长达10余年的观察中脊柱病理性骨化进展缓慢，甚至完全没有病理性成骨出现。然而，目前虽已有一些评分系统(如mSASSS评分)通过影像学检查以评估患者当前脊柱骨化的严重程度，但仍缺少提前预测AS患者脊柱病理性成骨进展速度与严重程度的方法。这使得提前有针对性的对可能出现严重脊柱病理性成骨的患者进行治疗变得十分困难。因此，开发新的用于预测AS患者病理性成骨的试剂和方法十分重要。
BMP2是转化生长因子超家族中一类具有调控骨骼发育和生长重要作用的蛋白，通过与其受体结合使下游Smad通路蛋白磷酸化，进而激活转录因子以促进骨形成(可参见：Lories,R.J.F.P.Luyten,Bone morphogenetic protein signaling andarthritis.Cytokine Growth Factor Rev,2009.20(5-6):p.467-73.)。Noggin是BMP2的天然拮抗剂，作为一种分泌型糖蛋白，Noggin通过与BMP受体竞争性结合BMP2，抑制下游Smad通路的激活以发挥拮抗BMP2的作用，最终抑制骨形成(可参见：Krause,C.A.GuzmanP.Knaus,Noggin.Int J Biochem Cell Biol,2011.43(4):p.478-81.)。既往研究表明，BMP2与Noggin之间的平衡在正常的生理性骨形成中有重要作用(可参见：Pizette,S.L.Niswander,BMPs are required at two steps of limb chondrogenesis:Formationof prechondrogenic condensations and their differentiation intochondrocytes.Dev Biol,2000.219(2):p.237-49.)，而AS患者体内BMP2、Noggin的表达均存在异常(可参见：Lories,R.J.I.DereseF.P.Luyten,Modulation of bonemorphogenetic protein signaling inhibits the onset and progression ofankylosing enthesitis.J Clin Invest,2005.115(6):p.1571-9.以及Tsui,F.W.H.W.TsuiH.F.LasK.P.PritzkerR.D.Inman,Serum levels of novel noggin andsclerostin-immune complexes are elevated in ankylosing spondylitis.Ann RheumDis,2013.)。我们的研究证实，AS患者体内成骨细胞BMP2表达增加(促进成骨能力增加)而Noggin表达减少(抑制成骨能力降低)，是导致AS患者病理性骨形成的最主要原因(可参见：Xie,Z.P.WangY.Li,et al.,Imbalance between BMP2and Noggin induces abnormalosteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in ankylosingspondylitis.Arthritis Rheumatol,2015.)。
在BMP2方面，目前已有1篇文章关于BMP2在AS诊断中的作用：Poddubnyy等发现BMP2能够预测AS患者脊柱病变的影像学进展(可参见：Poddubnyy,D.K.ConradG.Ruiz-Heiland,et al.,Prediction of radiographic spinal progression using biomarkersin patients with ankylosing spondylitis who are at high risk forprogression.ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES,2012.713:p.83-84.)；已有1项关于人BMP2或BMP4单克隆抗体制作并用于防止异位骨形成的专利(可参见：ZIMMERMAN,D.M.SELBYM.SRINIVASAN,et al.,New monoclonal antibody that binds an epitope onhuman BMP2or BMP4,useful for preparing a composition for treating orpreventing a disease associated with abnormal bone formation andossification.)：Zimmerman等通过分子生物学方法制作了一种新的BMP2或BMP4单克隆抗体，推测其可以用于防止异位骨化。在Noggin方面，目前已有2项关于通过Noggin诊断AS的专利(可参见：TSUI,F.W.L.R.D.INMAN,Categorizing patient having inflammatorybowel disease as being at risk for developing ankylosing spondylitis involvesdetermining level of auto-antibodies directed against noggin and sclerostinin patient of inflammatory bowel disease.以及TSUI,F.W.L.R.D.INMAN,Diagnosingsubject with ankylosing spondylitis,comprises providing sample from subject,detecting level of autoantibodies to noggin and sclerostin in sample,andcomparing level of autoantibodies to autoantibodies in control sample.)：Tsui等通过检测体内抗Noggin的自身抗体水平以进行AS诊断；已有1项专利、1篇文章关于通过注射Noggin治疗脊柱关节病(spondylo-arthropathies,SpA)小鼠动物模型(可参见：Lories,R.J.I.DereseF.P.Luyten,Modulation of bone morphogenetic proteinsignaling inhibits the onset and progression of ankylosing enthesitis.J ClinInvest,2005.115(6):p.1571-9.以及LUYTEN,F.R.LORIES,Treatment of spondylo-arthropathy,and related enthesitis,by administering agents that inhibitactivity or expression of bone morphogenic proteins.)：SpA是脊柱关节病的一类统称，AS是SpA中的一个类型，但SpA并不一定都是AS，Lories等通过DBA/1小鼠构建自发性SpA模型，予以5mg Noggin-Fc(每周两次，共三周六次)足部注射治疗，结果提示Noggin-Fc对比安慰剂能显著抑制脊柱骨化。
目前，已有多种商品化BMP2、Noggin检测试剂盒用于检测细胞培养上清、血清中的BMP2、Noggin水平(Sigma、Abcam、USCN life等)。然而我们在实验中发现，这些试剂盒虽能检测细胞培养上清的BMP2、Noggin水平，但对于血清却难以检测，究其原因是血清中水平较低，试剂盒容许范围难以到达该水平所致。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了BMP2和Noggin联合使用在制备预测强直性脊柱炎病理性成骨严重程度的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种BMP2检测试剂盒，包括：预包被有抗人BMP2抗体的固相载体、生物素标记的抗人BMP2抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、BMP2蛋白标准品和底物显色液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述BMP2检测试剂盒还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种；
所述标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液为含0.001％BSA的PBS缓冲液；
所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；
所述洗涤液为含0.001％Tween的PBS缓冲液；
所述底物显色液为TMB。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述BMP2检测试剂盒还包括BMP2检测数值对应指数表，所述BMP2检测数值对应指数表如下表所示：
本发明还提供了一种Noggin检测试剂盒，包括：预包被有抗人Noggin抗体的固相载体、生物素标记的抗人Noggin抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、Noggin蛋白标准品和底物显色液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述Noggin检测试剂盒还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种；
所述标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液为含0.001％BSA的PBS缓冲液；
所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；
所述洗涤液为含0.001％Tween的PBS缓冲液；
所述底物显色液为TMB。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述Noggin检测试剂盒还包括Noggin检测数值对应指数表，所述Noggin检测数值对应指数表如下表所示：
本发明还提供了所述的BMP2检测试剂盒以及所述的Noggin检测试剂盒联合作为强直性脊柱炎诊断试剂盒的应用。
本发明还提供了所述的BMP2检测试剂盒以及所述的Noggin检测试剂盒联合使用作为预测强直性脊柱炎病理性成骨严重程度的试剂盒的应用。
我们的研究已证实BMP2(表达增加)和Noggin(表达降低)是AS发病机制中的重要分子，也是导致病理性成骨的重要靶点，发明人通过检测AS患者血清BMP2、Noggin水平，并随访患者2年后影像学上脊柱骨化程度，发现联合检测血清BMP2和Noggin水平与AS患者mSASSS评分显著相关，是一种崭新的、有效的预测AS脊柱病理性成骨的方法。
本发明主要具备以下优点与目的：
1)本发明同时检测BMP2和Noggin水平来诊断强直性脊柱炎、预测强直性脊柱炎病理性成骨的严重程度，可提高特异性与敏感性。既往已有单独报道通过检测BMP2或Noggin自身抗体用于诊断AS，但其特异性、敏感性均较低，且其主要用于诊断AS而非预测其病理性成骨。本发明通过同时对两者进行检测，是预测AS患者脊柱病理性骨化的严重程度成为可能，也提高了预测的特异性与敏感性。
2)针对Noggin的检测而非抗Noggin自身抗体的检测。既往已有报道通过检测人体内抗Noggin自身抗体用于诊断AS的报道，但抗Noggin自身抗体的产生与B细胞等多种体内因素有关，且不是直接导致疾病发生的关键靶点。因此，直接检测Noggin水平更为准确。
3)首次提出通过检测BMP2和Noggin水平预测AS患者病理性成骨的严重程度。
4)本发明提供了新的BMP2检测试剂盒和Noggin检测试剂盒，提高试剂盒敏感性，降低其检测容许范围下限，提高检测准确性。
附图说明
图1显示了BMP2+Noggin综合指数与影像学mSASSS评分的相关关系曲线图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
由于目前AS的发病机制尚不清楚，致病分子靶点尚未明确，大大限制了对其脊柱病理性成骨的预测，因此，目前针对AS的脊柱病理性成骨的评估仅能通过影像学检查、并用mSASSS等进行评估，尚无法对其可能出现的病理性成骨及其程度进行预测。
目前虽有一些针对BMP2及Noggin在AS中作用的研究和专利，但这些成果也存在许多不足与缺点。Poddubnyy等研究提示BMP2水平可用于AS患者脊柱骨化的诊断和预测，但仅仅作为会议摘要报道，且没有报道其特异性与敏感性(可参见：Poddubnyy,D.K.ConradG.Ruiz-Heiland,et al.,Prediction of radiographic spinal progressionusing biomarkers in patients with ankylosing spondylitis who are at high riskfor progression.ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES,2012.713:p.83-84.)。Zimmerman等制作了一种新的BMP2或BMP4单克隆抗体，但仅仅推测其能用于AS等疾病的治疗，并没有进行相应的临床试验或动物实验(可参见：ZIMMERMAN,D.M.SELBYM.SRINIVASAN,et al.,New monoclonal antibody that binds an epitope on human BMP2or BMP4,useful forpreparing a composition for treating or preventing a disease associated withabnormal bone formation and ossification.)。Tsui等虽发现AS患者体内Noggin自身抗体升高可用于诊断AS，但没有提出检测AS患者体内Noggin是否具有诊断意义(可参见：Tsui,F.W.H.W.TsuiH.F.LasK.P.PritzkerR.D.Inman,Serum levels of novel nogginand sclerostin-immune complexes are elevated in ankylosing spondylitis.AnnRheum Dis,2013.以及TSUI,F.W.L.R.D.INMAN,Diagnosing subject with ankylosingspondylitis,comprises providing sample from subject,detecting level ofautoantibodies to noggin and sclerostin in sample,and comparing level ofautoantibodies to autoantibodies in control sample.)。Lories等发现Noggin-Fc一定程度上缓解SpA动物模型的病理性成骨，但由于SpA只是一类疾病的总称，AS仅为其中的一个类型，SpA并非都是AS，因此Noggin-Fc是否能用于AS实际上尚未明确(可参见：Lories,R.J.I.DereseF.P.Luyten,Modulation of bone morphogenetic protein signalinginhibits the onset and progression of ankylosing enthesitis.J Clin Invest,2005.115(6):p.1571-9.)。此外，目前关于BMP2与Noggin在AS中的研究仅仅关注的是两者中的其中一个，同时联合检测两者血清水平并用于预测脊柱病理性成骨的尚未见报道。
现有的方案主要是单独通过BMP2预测AS患者的影像学进展，或者通过检测抗Noggin自身抗体用于诊断AS，但尚没有见到同时检测BMP2与Noggin进行预测脊柱病理性成骨的报道。而本方法通过同时对两者进行检测，发现其能有效预测AS患者的脊柱骨化严重程度与进展情况。
目前，已有多种商品化BMP2、Noggin检测试剂盒用于检测细胞培养上清、血清中的BMP2、Noggin水平(Sigma、Abcam、USCN life等)，但其检测的容许范围下限较高，虽能检测细胞培养上清的水平，难以检测血清中较低浓度的BMP2、Noggin水平。而本发明中制备了新的检测试剂盒，其容许范围较大、敏感度较高，能有效检测血清BMP2、Noggin水平。
实施例1
检测试剂盒
(1)BMP2检测试剂盒，包括：预包被有抗人BMP2抗体的96孔板、96孔板覆膜、BMP2蛋白标准品(1000pg/支)、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、BMP2检测数值对应指数表；
(2)Noggin检测试剂盒，包括：预包被有抗人Noggin抗体的96孔板、96孔板覆膜、Noggin蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、Noggin检测数值对应指数表；
检测试剂盒的制备方法
(1)96孔板抗体包被：配置PH＝9.6的碳酸盐缓冲液，稀释抗人BMP2、抗人Noggin至5ug/ml，每孔加入0.2ml，于4℃孵育过夜，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟，即得预包被有抗人BMP2抗体的96孔板和预包被有抗人Noggin抗体的96孔板。
(2)标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液配置：吸取100ml PBS缓冲液，加入0.1g BSA，充分混匀。
(3)洗涤液配置：1000ml PBS缓冲液，加入1ml Tween溶液，充分混匀。
(4)终止液：配置2mol/L硫酸溶液，室温静置备用。
(5)96孔板覆膜购自RayBiotech公司；BMP2蛋白标准品、Noggin蛋白标准品购自R&D公司；生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、TMB底物显色液购自Sigma公司；检测数值对应指数表由本单位制作。BMP2检测试剂盒和Noggin检测试剂盒使用的标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、洗涤液、终止液均相同，均采用以上配制方法。
实施例2
检测试剂盒在诊断强直性脊柱炎及预测其病理性成骨严重程度中的应用
1、本发明的检测试剂盒的检测方法
(1)抽取AS患者外周血，室温静置1小时，吸取上层清液1000×g离心5min，留取上层血清，弃去沉淀；
(2)从试剂盒取一支标准品，10000rpm离心1min，用1ml样本稀释液溶解，通过倍比稀释法进行稀释7次(15.6-1000pg)；
(3)每孔加入标准品或检测样品100ul，贴上覆膜，于摇床室温孵育2h；
(4)弃去液体，每孔加入洗涤液200ul，洗涤3次，每次1min；
(5)用生物素标记抗体稀释液溶解稀释生物素标记抗体，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h；
(6)同步骤(4)；
(7)用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液溶解稀释辣根过氧化物酶标记亲和素，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h；
(8)同步骤(4)；
(9)每孔加入TMB底物显色液100ul，室温避光孵育30min；
(10)每孔加入终止液50ul；
(11)通过酶标仪在450nm波长检测各孔光密度，通过拟合标准曲线计算出实际数值
(12)抽血患者予以拍摄颈椎、腰椎正侧位片，予以mSASSS评分1；2年后随访拍摄颈椎、腰椎正侧位片，予以mSASSS评分2。mSASSS评分2减去mSASSS评分1即为mSASSS评分(2年)，代表2年内脊柱骨化进展程度。
在以上检测方法中，当用于检测BMP2时，步骤(2)中的试剂盒为BMP2检测试剂盒；当用于检测Noggin时，步骤(2)中的试剂盒为Noggin检测试剂盒。
2、结果分析
(1)检测范围：0.1-100pg/ml
(2)特异性：与BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9、Gremlin、Chordin、TNFa、TGFb、IFNy、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、IL10、CRP、ESR等无交叉反应
(3)回收率：
(4)线性：
(5)准确性：批内差CV<6.4％，批间差CV<5.8％
(6)研究结果
表1 BMP2检测数值对应指数
表2 Noggin检测数值对应指数
表3 正常人与AS患者对应综合指数与mSASSS评分
表4 正常人与AS患者基本情况
正常人(n＝10) AS患者(n＝35)
年龄 26.1±5.1 28.4±9.2
性别 男性8、女性2 男性28，女性7
CRP(mg/L) 3.3±1.1 12.8±2.5
ESR(mm/h) 9.3±3.4 24.5±5.1
HLA-B27阳性 0 34
备注：所有AS患者均符合强直性脊柱炎1984纽约修订诊断标准
如表1～表4所示，结果表明，正常人BMP2+Noggin综合指数、影像学mSASSS评分均较低，符合正常人无明显脊柱骨化结果；AS患者BMP2+Noggin综合指数、影像学mSASSS评分均高于正常人，符合AS患者脊柱骨化进展比正常人严重；AS患者脊柱病理性成骨进展情况(2年mSASSS评分)与BMP2-Noggin综合指数明显相关(Pearson系数为0.928，P值小于0.0001)，提示血清BMP2、Noggin水平与患者影像学上脊柱病理性成骨进展明显相关，具有预测AS患者脊柱病理性成骨进展严重程度的作用，如图1所示。
本发明的优点主要有：(1)通过检测BMP2与Noggin水平，鉴别出AS患者中可能出现脊柱病理性成骨的患者，并预测其严重程度，并及时予以治疗；(2)同时对BMP2与Noggin进行检测，提高了预测的准确性，增加了特异性与敏感性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.血清BMP2检测试剂盒以及血清Noggin检测试剂盒的联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用，其中，
所述血清BMP2检测试剂盒包括预包被有抗人BMP2抗体的固相载体、生物素标记的抗人BMP2抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、BMP2蛋白标准品和底物显色液，还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种以及血清BMP2检测数值对应指数表；
所述血清BMP2检测数值对应指数表如下表所示：
；
所述血清Noggin检测试剂盒包括预包被有抗人Noggin抗体的固相载体、生物素标记的抗人Noggin抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、Noggin蛋白标准品和底物显色液，还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种以及血清Noggin检测数值对应指数表；
所述标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液为含0.001％BSA的PBS缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含0.001％Tween的PBS缓冲液；所述底物显色液为TMB；
所述血清Noggin检测数值对应指数表如下表所示：
；
检测出患者血清中BMP2数值和Noggin数值后，根据上述指数表得出对应分数之和，以对应分数之和作为综合指数，用于诊断患者是否患有强直性脊柱炎。
2.血清BMP2检测试剂盒以及血清Noggin检测试剂盒的联合使用在制备预测强直性脊柱炎病理性成骨严重程度的试剂盒中的应用，
其中，所述血清BMP2检测试剂盒包括预包被有抗人BMP2抗体的固相载体、生物素标记的抗人BMP2抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、BMP2蛋白标准品和底物显色液，还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种以及血清BMP2检测数值对应指数表；
所述血清BMP2检测数值对应指数表如下表所示：
；
所述血清Noggin检测试剂盒包括预包被有抗人Noggin抗体的固相载体、生物素标记的抗人Noggin抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、Noggin蛋白标准品和底物显色液，还包括标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、终止液和洗涤液中的至少一种以及血清Noggin检测数值对应指数表；
所述标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液为含0.001％BSA的PBS缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含0.001％Tween的PBS缓冲液；所述底物显色液为TMB；
所述血清Noggin检测数值对应指数表如下表所示：
；
检测出患者血清中BMP2数值和Noggin数值后，根据上述指数表得出对应分数之和，以对应分数之和作为综合指数，用于预测患者强直性脊柱炎病理性成骨严重程度。
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