CN108982871B

CN108982871B - 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用

Info

Publication number: CN108982871B
Application number: CN201810794398.9A
Authority: CN
Inventors: 杜杰; 尤宏钊; 焦萌; 王媛; 李玉琳; 姜文溪; 乔博康
Original assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Current assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN108982871A

Abstract

本发明提供了一种检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质的新用途，以及可溶性ST2(sST2)作为血清标志物的新用途。sST2作为血清标志物可以独立应用于小儿扩张型心肌病(DCM)患儿的危险分层和不良事件(全因死亡/心脏移植/因心衰再住院)预测；同时，sST2作为血清标志物可以提高传统标志物‑BNP的预测能力；并可用于监测DCM患儿疾病进展，不受肾功能和BMI的影响。本发明为儿童扩张型心肌病的患者危险分层、预后和疾病进展监控提供了科学依据，能够在不良事件发生前，极大的提前临床积极干预的决策时机，弥补了医学行业研究和临床应用的空白，具备临床和市场应用的巨大潜力和价值。

Description

血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用

技术领域

本发明属于生物技术、疾病的诊断、治疗和预后技术领域，具体涉及血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用。

背景技术

扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)主要表现为左心室扩大及收缩功能的异常，在未成年人患病率约为0.57-1.13/100000(Lipshultz SE,et al.N Engl JMed.2003)(Towbin JA,et al.JAMA,2006)，它是造成儿童发生充血性心力衰竭最为常见的原因之一，也是儿童心脏移植的首要原因(Lipshultz SE,et al.Future Cardiol.2013)。扩张型心肌病的预后普遍不良，美国、澳大利亚及欧洲的注册研究发现DCM患儿五年内的生存率为25％-40％(Lee TM,et al.Circ Res.2017)。

从DCM患儿中识别出可能发生不良事件的“高危”患者，一直是领域中非常棘手的问题(Kantor PF,et al.Expert Rev Cardiovasc Ther 2016)。为了识别处于高危期的DCM患儿，前人对于危险因素的分析结果确认了很多显而易见的预测因子，特别是影像学指标，如射血分数、左室扩大等，更低的射血分数和心室扩张可能提示预后不良(Alexander PM,et al.Circulation 2013)。因此，目前的指南推荐连续的超声心动图监测可以应用于反应扩张型心肌病患儿的病情和预测不良事件(Kantor PF,et al.Can J Cardiol.2013)。除此之外，血清标志物对于评价DCM病情进展和指导疾病的治疗起到了非常重要的作用(LeeTM,et al.Circ Res.2017)。尽管既往的前瞻性队列研究发现BNP升高是DCM患儿不良事件的独立预测因子(Gardner RS,et al.Eur Heart J.2003),但是单独利用BNP监测病情和指导治疗在临床应用中仍有争议，充满了不确定性(Bayes-Genis A,et al.EJIFCC.2016)。这主要是因为BNP在心肌病中作为反映心室容量负荷的指标,其上调有赖于心肌细胞和神经体液调节及免疫系统的相互作用(Cantinotti M,et al.Heart Fail Rev.2014Nov；19(6):727-42)，因此对于心肌细胞早期的病理改变不敏感。因此，基于多个血清标志物对患者进行更为精确的危险分层，从而在早期识别高危患儿，指导下一步的治疗，这对于DCM的二级预防非常重要。虽然诸多血清标志物对成人扩张型心肌病不良事件的发生具有预测价值(Gopal DM,J Cardiovasc Transl Res.2013)，但是目前针对于儿童DCM这一群体的血清标志物研究仍有待进一步探究。

ST2作为白介素-1受体家族的一员，分为膜受体型(ST2L)和可溶型(sST2)两个亚型。IL-33/ST-2L信号通路可以调节多个与DCM疾病发生发展相关的通路从而起到心脏保护作用，诸如炎症、纤维化、凋亡等(Miller AM,et al.Pharmacol Ther.2011)。目前认为心脏疾病中循坏sST2的升高多是由心脏分泌的。前人的体外实验发现心肌细胞受到生物力学负荷时，心肌细胞可以分泌sST2(Weinberg EO,et al.Circulation 2002),也有研究报道心肌梗死患者的血管内皮细胞也可以分泌sST2(Bartunek J,et al.J Am Coll Cardiol2008)。可溶型ST2(sST2)作为IL-33的诱饵受体，阻止IL-33/ST2L的相互作用进而抑制该通路对心脏的保护作用。在临床研究中，单独的sST2水平已被证明是稳定期和急性心力衰竭(HF)患者死亡的危险因素，并且与NT-proBNP无关(Bayés-Genís A et al.J Am CollCardiol.2017)。另外，连续检测sST2还可以用于监测AHF患者的病情，sST2的变化会先于不良事件的发生，从而对AHF治疗起到潜在的指导意义(van Vark LC et al.J Am CollCardiol.2017)。既往研究发现sST2可以反映扩张型心肌病血流动力学的变化，且不受DCM病因的影响(Broch K,et al.Int J Cardiol.2015)。在成人DCM患者中，sST2不但可以用于预测DCM合并AHF患者不良事件的发生(Binas D,et al.Open Heart.2018),还是DCM患者稳定期不良事件发生的独立预测因子(Wojciechowska C,et al.Hellenic JCardiol.2017)。尽管一些小规模的横断面研究描述了sST2在正常儿童中的水平及特点(Caselli C,et al.Biomark Med.2016)，但是sST2在扩张型心肌病患儿中的预测价值尚不得而知。

发明内容

基于上述现有技术中的空白，本发明研究了血清sST2与儿童扩张型心肌病不良事件发生的相关性，及其与既往报道过的危险因素的关系。本发明从一个多中心的队列研究-AOCC study中连续入组了94名儿童扩张型心肌病患儿，利用ELISA技术对血清中sST2水平进行检测。通过为期678±204天的随访，评价sST2与不良事件发生的相关性及预测价值。本发明发现了sST2作为血清标志物不仅可以用于DCM患儿的危险分层和不良事件(全因死亡/心脏移植/因心衰再住院)的预测，还可以提高传统标志物-BNP的预测能力。本发明进一步连续比较了19名发生远期不良事件(>6个月)的DCM患儿和数量相当的性别、年龄匹配的未发生事件患儿的基线、3个月和6个月的血清sST2水平，事件组的血清sST2水平始终维持高水平，而未发生事件组的血清sST2则呈现显著下降水平。综上所述，sST2不仅是DCM患儿不良事件发生的独立预测因子，也具有监测DCM疾病进展的潜在价值。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的一个目的是提供了检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质的新用途。

本发明提供了一种检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质在制备预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的产品中的应用。

本发明还提供了一种检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质和检测BNP、proBNP和/或nt-proBNP蛋白含量的物质共同用于制备预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的产品的用途。

本发明还提供了一种检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质在制备连续监测小儿扩张型心肌病(DCM)的病程进展的产品中的应用。

本发明另一个目的是提供了可溶性ST2(sST2)作为血清标志物的新用途。

本发明提供了一种可溶性ST2(sST2)作为血清标志物在预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件中的应用。

本发明还提供了一种可溶性ST2(sST2)和BNP、proBNP和/或nt-proBNP作为血清标志物在预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件中的联合应用。

本发明还提供了一种可溶性ST2(sST2)作为血清标志物在连续监测小儿扩张型心肌病(DCM)的病程进展中的应用。

根据上述应用或用途，所述预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的模型中可引入一个或多个临床变量；优选的，所述临床变量包括年龄，性别，左心室射血分数和/或左室舒张末径的z-score。

根据上述应用或用途，所述可溶性ST2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或所述可溶性ST2蛋白的编码核酸序列与SEQ ID NO.2具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

根据上述应用或用途，所述危险分层包括低危、中危和高危三层级；优选的，所述低危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率<18.5％，所述中危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率约为32.2％，所述高危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率约为88.2％；优选的，所述低危对应可溶性ST2蛋白含量x≤21.1ng/mL，所述中危对应可溶性ST2蛋白含量x为21.1<x<27.7ng/mL，所述高危对应可溶性ST2蛋白含量为x≥27.7ng/mL。上述可溶性ST2蛋白含量为血清、血浆或全血样品检测结果。

根据上述应用或用途，对于高危的患者主要采取以下三种应对措施：

1.避免剧烈体育活动；

2.预防感染；

3.门诊随诊：门诊随诊以每3个月1次，监测血生化、BNP、超声心动图。如果服用地高辛，需要监测血药浓度。

根据上述应用或用途，所述不良事件包括导致患者健康状况下降或死亡的事件；优选的，所述不良事件包括全因死亡、心脏移植、心力衰竭；优选的，所述不良事件包括近期不良事件和远期不良事件，所述近期表示初次诊断后≤6个月的期间，远期表示初次诊断后>6个月的期间。

根据上述应用或用途，所述检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质可选自以下组中的任意一种：

1)可溶性ST2蛋白的结合蛋白；

2)含有1)的酶联免疫试剂盒；

3)含有1)的胶体金试纸条；

4)含有1)的化学发光试剂盒；

5)含有1)的时间分辨荧光免疫试剂盒；或

6)含有1)的流式荧光检测试剂盒。

根据上述应用或用途，所述检测BNP、proBNP和/或nt-proBNP蛋白含量的物质可选自以下组中的任意一种：

1)BNP、proBNP和/或nt-proBNP的抗体；

2)含有1)的酶联免疫试剂盒；

3)含有1)的胶体金试纸条；

4)含有1)的化学发光试剂盒；

5)含有1)的时间分辨荧光免疫试剂盒；或

6)含有1)的流式荧光检测试剂盒。

根据上述应用或用途，所述结合蛋白为抗体或融合蛋白；优选的，所述抗体为单克隆抗体；优选的，所述融合蛋白包含可溶性ST2抗体的可变区和Fc片段。

术语及定义

除非特别说明，本申请中所使用的术语和定义均是本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员所知晓。

术语“可溶性ST2”，“sST2”，表示含有下述序列的可溶性蛋白，所述序列与NCBI登录号NP_003847.2(SEQ ID NO:1)至少90％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)；或者由下述序列的核酸所编码，所述序列与NCBI登录号NM_003856.3(SEQ IDNO:2)至少90％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。

术语“其他标志物”表示可用于诊断特定疾病的蛋白质、核酸、脂质或糖，或它们的组合(例如两种或多种)。本文中所述的方法可以包括检测来自受试者的生物样品中的可溶性人ST2和至少一种其他标志物的水平。可检测的其他标志物包括：proANP、NT-proANP、ANP、proBNP、NT-proBNP、BNP、肌钙蛋白(cTn)、CRP、肌酸酐、血尿素氮(BUN)、肝功酶、白蛋白、以及细菌内毒素。

术语“升高的”或者“升高”表示与参照水平(例如，未患疾病的受试者、没有呈现疾病的两种或更多种症状的受试者、或者为没鉴定为有发展疾病的风险的受试者中的人可溶性ST2水平；或者人可溶性ST2的阈值水平)相比，确定的或者测量的水平(例如，人可溶性ST2蛋白水平)存在差异，例如统计学上的显著差异(例如，增加)。在一些实施方案中，参照是阈值水平，任何超过它的水平都认为是“升高的”。本发明描述了人可溶性ST2的其他参照水平。

术语“心血管疾病”是指心脏和血管的病症，包括动脉、静脉、小动脉、小静脉、和毛细血管的病症。心血管疾病的非限定实例包括心脏肥大、心肌梗死、卒中、动脉硬化、和心力衰竭。其他心血管疾病的实例是本领域已知的。

术语“治疗性处置”或“治疗”表示将一或多种药剂给予受试者或者对受试者的身体实施医学程序(例如，诸如器官移植或心脏手术的手术)。可以给予受试者的药剂的非限制性例子包括硝酸盐、钙通道阻滞剂、利尿剂、血栓溶解剂、洋地黄、肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)调理剂(例如，β-肾上腺素能阻断剂、血管收缩素转化酶抑制剂、醛固酮拮抗剂、肾素抑制剂和血管紧张素II受体阻断剂)和胆固醇降低剂(例如，染料)。术语治疗性处置还包括调节(例如，增加或减少)受试者使用的一或多种药剂的剂量或频率、给予受试者一或多种新的药剂，或者从受试者的治疗方案中去掉一或多种药剂。

术语“受试者”在本发明中表示哺乳动物，尤其是人。

术语“生物样品”、“样本”包括任何体液或组织，例如血液、血清、血浆、尿液和身体组织中的一个或多个。在某些实施例中，样本为血清、血浆或血液样本。

术语“抗体”涵盖例如，单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗体片段(其显示出所需的生物学或免疫学活性，例如Fab片段、F(ab')2片段)、嵌合抗体、全人源抗体双特异性抗体、、三特异性和多特异性抗体(例如，二体、三体、四体)、微型抗体、螯合(chelating)重组抗体、三体或二体、内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(small modularimmunopharmaceuticals，SMIP)、结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体和含有VHH的抗体。在本申请中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与抗体可互换地使用。所述抗体可来自于IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。

术语“特异性结合(binds specifically to)于抗原的抗体”，在含有其他蛋白的样本中优先地结合于该抗原。

“死亡风险”意味着与参照群体(例如，健康对照群体)相比，受试者由于疾病或者与疾病相关的并发症而死亡的风险。文中使用的术语“死亡风险”不包括故意或者意外死亡，例如由砸伤或压伤(比如车祸)造成的死亡。

本发明所述“应用”或“用途”，既可表示以疾病诊断和治疗为目的的应用，也可表示非诊断或治疗目的的应用，例如，科学研究等。

本发明的有益效果：

1)本发明首次证明sST2作为血清标志物可以独立应用于DCM患儿的危险分层和不良事件(全因死亡/心脏移植/因心衰再住院)的预测，包括近期(6个月内)和长期(>6个月)的不良事件。

2)本发明首次证明sST2作为血清标志物可以提高传统标志物-BNP的预测能力，sST2和BNP两种血清标志物及多种临床变量在DCM患儿的危险分层和不良事件预测中可以联合使用，并且具备更高的敏感性，能够识别出更多的“高危”患儿。

3)本发明首次证明连续测量血清sST2可用于监测DCM患儿疾病进展，血清sST2的连续测量可以更好更准确地反映心衰血流动力学和结构的变化，而且不受肾功能和BMI的影响。

本发明为儿童扩张型心肌病的患者危险分层、预后和疾病进展监测提供了科学依据，能够在不良事件发生前，极大的提早了临床积极干预的决策时机，弥补了医学行业研究和临床应用的空白，具备临床和市场应用的巨大潜力和价值。

附图说明

图1.本发明研究流程图：经两轮筛选，其中符合入组标准的DCM患儿共有94名。

图2.基线血清sST2水平在队列中的分布。

图3.儿童DCM患者血清sST2水平与不良事件的关系：

A.儿童扩张型心肌病患者sST2水平的Box-Whisker图表显示(有)和(无)不良事件(全因死亡，心脏移植和随访期间心力衰竭相关事件)；

B.Kaplan-Meier曲线估计不良事件的风险，按sST2水平的三分位数排列；

C和D.森林图(Forest plots)展示了在6个月和随访期结束时主要不良事件的风险比率；根据sST2水平的四分位数，利用多因素Logistic回归模型或风险比(hazardratio)的多变量Cox模型(使用性别、年龄、左室射血分数、左室舒张末径的z-score，BNP、Beta受体阻滞剂的应用以及既往心衰史对模型进行了矫正)得出上述分析结果。5-95％的置信区间由横线长度表示。

图4.根据传统风险因素得出的不良事件的风险比(hazard ratio)。

图5.随访3个月和6个月后血清sST2的变化趋势：19个晚期不良事件患儿亚组和19个年龄、性别匹配的对照组的sST2血清水平基线和3个月后的sST2血清水平变化趋势。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：血清sST2的水平与儿童扩张型心肌病(DCM)不良事件发生的相关性研究

1、患者的入组条件和随访策略

图1显示了本发明研究的流程图。AOCC研究(中国心肌病患者诊断和预后研究)是一项双中心，观察性，前瞻性，综合性，多组学的研究。所有儿童(<18岁)于2015年9月至2017年3月在北京安贞医院和阜外医院就诊。

扩张型心肌病和心力衰竭由至少3名有经验的心脏病专家诊断和鉴定。扩张型心肌病被定义为存在至少下述2个标准：(1)有症状的心力衰竭；(2)左心室或双心室收缩功能障碍；(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张。收缩功能障碍定义为异常左室缩短分数(FS≤25％)。并且，心室扩张被定义为根据体表面积(BSA)和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差(den Boer SL，et al.Am J Cardiol.2016)。

排除标准包括：(1)发热；(2)免疫性疾病；(3)风湿热史；(4)已知心脏损伤的内分泌疾病；(5)预期生存天数<30天；(6)具有慢性肝病史或ALT>80U/L；(7)既往有肾功能不全的病史。

所有患者均每3个月进行一次随访。后续数据通过病历，电话访谈以及病人在门诊诊所对医务人员的定期访问等途径获得。

本发明的研究是按照赫尔辛基宣言的原则设计和实施的，并经北京安贞医院伦理委员会批准并获得所有知情同意书。更多细节详见Clinical Trials.gov(NCT03076580)。

2、样本和数据采集

从入组患者清晨空腹采集血液样品，装入抗凝剂的无菌聚烯烃树脂管中，然后在医院检验中心中以3000rpm离心10分钟。利用一次性滴管迅速吸取上清液，分装后在-80℃下保存。所有检测样品分析前将在-80℃保存时间均在2年以内。所有受试者/入组患者数据都来自医院的电子病历系统。实验室数据、超声心动图、样本定量按照既往已经发表的参考文献以公开的方式进行记录(Jiao M,You HZ,Yang XY,Yuan H,Li YL,Liu WX,Jin M,DuJ.Circulating microrna signature for the diagnosis of childhood dilatedcardiomyopathy.Scientific reports.2018；8:724)。

3、sST2蛋白和BNP蛋白含量测定

通过高灵敏度夹心免疫测定法(Critical Diagnostics，CA，USA)测定血清循环sST2蛋白含量。使用

Meter(Alere，Inc.，CA，USA)通过荧光免疫测定法测定血清BNP蛋白含量。上述两种测定方法的详细信息请见先前报道的文献：1)Wang Y,Tan X,Gao H,Yuan H,Hu R,Jia L,Zhu J,Sun L,Zhang H,Huang L,Zhao D,Gao P,Du J.Magnitude ofsoluble st2 as a novel biomarker for acute aorticdissection.Circulation.2018；137:259-269；2)Ma X,Yuan H,Luan HX,Shi YL,Zeng XL,Wang Y.Elevated soluble st2 concentration may involve in the progression ofatrial fibrillation.Clinica chimica acta；international journal of clinicalchemistry.2018；480:138-142。

4、数据统计分析

连续变量和分类数据分别以平均值±SD或百分比表示。

随访资料按计划收集，脱落的患者(drop-outs)被排除在外。使用Cox回归分析来确定预先定义的不良事件(死亡/心脏移植/心衰相关再住院)的预后预测因子，并在矫正协变量后评价风险模型。受试者工作特性曲线(ROC)用于评价ST2对于不良事件的判别能力，而Kaplan-Meier分析则用于可视化地评估在随访时间内ST2的基线水平与不良事件的相关性，对危险分层进行概率推算。使用SPSS 21.0(IBM，Chicago，IL，USA)和R3.4.0版(R CoreTeam，Vienna，Austria)完成数据分析。所有统计学检验都是双尾的，P值<0.05被认为是统计学差异显著的。

5、患者的基本描述

AOCC队列中共有338名心肌病患儿，其中符合入组标准的DCM患儿中共有94名(图1)。患儿的诊断结合症状、影像学结果和实验室检查，经由至少三位以上的心内科医生通过症状及超声心动图结果进行确认。94名DCM心肌病患儿的中位年龄为22.0(IQR:10.5-69.5)月，60.2％为女性。sST2的水平呈现右偏分布(图2)，中位水平为23.7ng/mL。

根据sST2水平三分位数分组，表1对患儿的基线资料进行描述。尽管sST2水平随年龄逐步升高，但是其它的指标并没有出现相同的趋势(表1)。在控制调整了性别和年龄的偏相关后发现sST2的水平与其它临床变量之间没有相关性，如表2所示。

表1.小儿扩张型心肌病患者血清sST2水平的基线特征

表2.矫正年龄和性别后sST2与临床变量之间的偏相关

本发明定义不良事件为死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院。血清sST2水平基线数据和实验室检查在表1中进行了描述。在中位数为678±204的随访时间，共28例患儿发生不良事件，其中全因死亡(n＝6)，心脏移植(n＝3)和再住院治疗心力衰竭(n＝19)。与未发生不良事件的患儿相比，发生不良事件患儿的BNP水平明显高于未发生事件的患儿。超声结果部分，不良事件组患儿表现为校正后的左室舒张末径明显大于未发生事件组，但左室射血分数无差异(表3)。

表3.有或没有不良事件的儿童DCM患者的基线特征

6、血清中sST2的水平与儿童扩张型心肌病(DCM)不良事件发生的相关性比较

本发明首先定义入组6个月内发生的不良事件(全因死亡/心脏移植/因心衰再住院)为近期不良事件(Near-term adverse event)。与未发生不良事件的患儿相比发现，无论近期(6个月内)还是整个随访期间，不良事件组的DCM患儿血清sST2水平均明显高于对照组(图3中A)。同时，Kaplan-Meier曲线发现处于基线sST2水平最高三分位数的患儿具有最高的不良事件发生率(Log rank P<0.001)(图3中B)。

如图3中C和D所示，为了确认sST2是否是儿童扩张型心肌病不良事件发生的独立预测因子，本发明分别利用logistic和COX多元回归模型进行分析，用与sST2或者结局事件相关的变量对模型进行了矫正(包括性别、年龄、左室射血分数、左室舒张末径的z-score，BNP、B受体阻滞剂的应用以及既往心衰史)。经过矫正后，ST2依旧是近期(Highest TertileOR(比值比)＝8.36，95％CI，1.094-73.52，P＝0.044)和长期(Highest Tertile HR＝4.23，95％CI，1.32-13.60，P＝0.015)随访中都可以用于不良事件发生的危险分层。同时，sST2与临床变量的相互作用如图4所示。由于没有一个得到的亚组完成HR(Hazard Ratio)的整个95％CI下降到1.00以下，所以sST2水平和临床其它协变量(年龄、性别、Beta-受体阻滞剂的应用、既往心衰史、Post-Myocarditis)之间没有统计学差异显著的相互作用。

综上，本发明证实在DCM患儿中，血清基线sST2水平与6个月内9(近期)和长期不良事件(死亡/心脏移植/因心衰再住院)的发生都具有显著的相关性，可作为儿童扩张型心肌病不良事件发生的独立预测因子应用于临床。

实施例2：血清sST2水平可提高血清BNP预测DCM患儿不良事件发生的预测能力

已有文献报道，BNP是DCM患儿不良事件发生的独立预测因子(Suthar D,etal.Pediatr Cardiol.2018)。本发明进一步验证sST2是否可以提高BNP的预测能力。

对于近期不良事件发生风险预测而言，将血清sST2水平增加至BNP预测DCM患儿不良事件发生风险的分析，导致C统计量(C-statistic)从0.697(95％CI，0.541-0.852；P<0.05)增加至0.812(95％CI，0.697-0.939；P<0.05)；NRI为0.204(95％CI，0.048-0.375)，而IDI也显示出相应的改进，详见表4。

对于长期不良事件发生风险预测而言，将血清sST2水平增加至BNP预测DCM患儿不良事件发生风险的分析，C统计量(C-statistic)从0.712(95％CI，0.604-0.819；P<0.05)增加至0.798(95％CI，0.697-0.899；P<0.05)，并且NRI为0.108(95％CI，0.091-0.289)，IDI值等于0.026(95％CI 0.002-0.0079)，详见表4。

表4.儿童DCM患者的风险评估模型(95％CIs)

临床指标包括：年龄、左室射血分数、左室舒张末径的Z-评分

与BNP相比较，P<0.05.

同样地，将血清sST2水平和已报道过的传统危险因素(年龄，左心室射血分数，左室舒张末径的z-score)作为临床变量加入到由BNP构成的模型当中，可对DCM患儿近期和长期不良事件的风险预测能力显著改善。对于近期(6个月内)不良事件发生风险预测而言，NRI为0.226(0.056-0.397)，P<0.05；C统计量(C-statistic)，0.831(0.769-0.913)(加入临床变量)与0.812(0.697-0.939)(未加入临床变量)，0.697(0.541-0.852)(单独BNP)，P<0.05。对于长期不良事件发生风险预测而言，NRI为0.319(0.048-0.590)，P<0.05；C-统计量(C-statistic)，0.798(0.697-0.899)(未加入临床变量)对0.859(0.782-0.936)(加入临床变量)，0.712(0.604-0.819)(单独BNP)，P<0.001。

综上，本发明证明sST2作为血清标志物可以提高传统标志物-BNP对DCM患儿近期和长期不良事件的风险的预测能力，sST2和BNP两种血清标志物、以及临床变量(年龄，左心室射血分数，左室舒张末径的z-score)在DCM患儿的危险分层和不良事件预测中可以联合使用，并且具备更高的敏感性。

实施例3：连续监测血清sST2水平可用于DCM患儿病程监测

前人的研究发现sST2的水平升高先于不良事件的发生，提示sST2可能在临床实践中用于预后和检测病情(van Vark LC et al.J Am Coll Cardiol.2017)。为了最大限度地避免儿童发育带来的混杂偏移，本发明利用一个巢式病例对照(Sadek AA,et al.ElectronPhysician.2017)来评价重复测量血清sST2的预测价值。

除了7名近期不良事件的患儿外，有21名DCM患儿在入组后6个月后发生了不良事件(定义为晚期事件)，其中有19名患儿在3个月和6个月的随访中分别采集了血清标本的样本；进一步选择了19个性别、年龄和抗DCM治疗干预一致的患儿作为对照(表5)。

表5.用于连续监测sST2的儿童DCM患者的基线资料描述

随访期间的sST2表达水平如图5所示。不良事件(>6个月)组的患者3个月和6个月的血清sST2水平无明显升高，而对照组水平逐渐下降。尽管基线水平的差异并不显著，但事件组与对照组之间ST2的水平差距逐渐拉大。值得注意的是，在达到主要终点的患者中，63％在发生终点事件之前具有U型sST2模式的趋势，而随访期间出现sST2持续下降趋势的DCM患儿中，80％患儿未发生不良事件。另外，我们还发现6个月sST2/基线水平的比值也是不良事件的独立危险预测因素(OR(比值比)＝5.20,95％CI 1.01-26.77)，独立于BNP可预测不良事件的发生风险。

Van Vark,et al在496名急性心衰住院患者中连续检测了sST2水平后发现sST2的动态变化和不良事件的发生有强相关性，并且是sST2的水平升高要早于终点事件发生的时间(van Vark LC et al.J Am Coll Cardiol.2017)。与前人结果相似，在本发明的研究中，与无事件对照组相比，血清sST2的水平在晚期事件(>6个月)组中始终维持。这两个结果都提示sST2的变化可能先于心脏结构异常。ST2分为两个主要亚型，跨膜型的ST2L和可溶型的sST2。在正常的心脏中，心脏成纤维细胞分泌的IL-33与ST2L结合，通过刺激NF-KB通路起到抑制炎症、纤维化和肥大的作用。而可溶型ST2(sST2)则可以阻止IL-33/ST2L的相互作用从而增加心脏重构(Kakkar R,et al.Nat Rev Drug Discov,2008)。而炎症和纤维化则是扩张型心脏病重要的病理生理学表现(Japp AG,et al.J Am Coll Cardiol.2016)，这也解释了高水平sST2与DCM患儿不良事件高发生率之间的相关性。由于与BNP相比，sST2具有更低的生物变异度(Piper S,et al.Am J Cardiol.2016)，因此，它是更好的用于监测DCM患者病程发展和治疗预后的血清标志物。

综上，上述结果都支持血清sST2持续维持较高水平的现象提示DCM患儿远期预后不良。连续测量血清sST2可独立应用于监测DCM患儿疾病进展，帮助医生及时进行临床决策。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市心肺血管疾病研究所

<120> 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用

<130> CP11802237C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Phe Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr

1 5 10 15

Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu

20 25 30

Ile Val Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp

35 40 45

Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg

50 55 60

Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala

65 70 75 80

Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg

85 90 95

Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn

100 105 110

Val Pro Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn

115 120 125

Ser Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro

130 135 140

Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Arg

145 150 155 160

Ala His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala

165 170 175

Gly Asp Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr

180 185 190

Ser Val Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe

195 200 205

Ser Leu Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gln Asn Glu Ile Lys Glu

210 215 220

Val Glu Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly

225 230 235 240

Lys Gly Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr

245 250 255

Lys Ile Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln

260 265 270

Asn Gln Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg

275 280 285

Ile Ala Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gln Tyr Asp Cys Leu

290 295 300

Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg

305 310 315 320

Lys Asn Pro Ser Lys Glu Cys Phe

325

<210> 2

<211> 3909

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

agtctatgag gagggaccta caaagactgg aaactattct tagctccgtc actgactcca 60

agttcatccc ctctgtcttt cagtttggtt gagatatagg ctactcttcc caactcagtc 120

ttgaagagta tcaccaactg cctcatgtgt ggtgaccttc actgtcgtat gccagtgact 180

catctggagt aatctcaaca acgagttacc aatacttgct cttgattgat aaacagaatg 240

gggttttgga tcttagcaat tctcacaatt ctcatgtatt ccacagcagc aaagtttagt 300

aaacaatcat ggggcctgga aaatgaggct ttaattgtaa gatgtcctag acaaggaaaa 360

cctagttaca ccgtggattg gtattactca caaacaaaca aaagtattcc cactcaggaa 420

agaaatcgtg tgtttgcctc aggccaactt ctgaagtttc taccagctgc agttgctgat 480

tctggtattt atacctgtat tgtcagaagt cccacattca ataggactgg atatgcgaat 540

gtcaccatat ataaaaaaca atcagattgc aatgttccag attatttgat gtattcaaca 600

gtatctggat cagaaaaaaa ttccaaaatt tattgtccta ccattgacct ctacaactgg 660

acagcacctc ttgagtggtt taagaattgt caggctcttc aaggatcaag gtacagggcg 720

cacaagtcat ttttggtcat tgataatgtg atgactgagg acgcaggtga ttacacctgt 780

aaatttatac acaatgaaaa tggagccaat tatagtgtga cggcgaccag gtccttcacg 840

gtcaaggatg agcaaggctt ttctctgttt ccagtaatcg gagcccctgc acaaaatgaa 900

ataaaggaag tggaaattgg aaaaaacgca aacctaactt gctctgcttg ttttggaaaa 960

ggcactcagt tcttggctgc cgtcctgtgg cagcttaatg gaacaaaaat tacagacttt 1020

ggtgaaccaa gaattcaaca agaggaaggg caaaatcaaa gtttcagcaa tgggctggct 1080

tgtctagaca tggttttaag aatagctgac gtgaaggaag aggatttatt gctgcagtac 1140

gactgtctgg ccctgaattt gcatggcttg agaaggcaca ccgtaagact aagtaggaaa 1200

aatccaagta aggagtgttt ctgagacttt gatcacctga actttctcta gcaagtgtaa 1260

gcagaatgga gtgtggttcc aagagatcca tcaagacaat gggaatggcc tgtgccataa 1320

aatgtgcttc tcttcttcgg gatgttgttt gctgtctgat ctttgtagac tgttcctgtt 1380

tgctgggagc ttctctgctg cttaaattgt tcgtcctccc ccactccctc ctatcgttgg 1440

tttgtctaga acactcagct gcttctttgg tcatccttgt tttctaactt tatgaactcc 1500

ctctgtgtca ctgtatgtga aaggaaatgc accaacaacc gtaaactgaa cgtgttcttt 1560

tgtgctcttt tataacttgc attacatgtt gtaagcatgg tccgttctat acctttttct 1620

ggtcataatg aacactcatt ttgttagcga gggtggtaaa gtgaacaaaa aggggaagta 1680

tcaaactact gccatttcag tgagaaaatc ctaggtgcta ctttataata agacatttgt 1740

taggccattc ttgcattgat ataaagaaat acctgagact gggtgattta tatgaaaaga 1800

ggtttaattg gctcacagtt ctgcaggctg tatgggaagc atggcggcat ctgcttctgg 1860

ggacacctca ggagctttac tcatggcaga aggcaaagca aaggcaggca cttcacacag 1920

taaaagcagg agcgagagag aggtgccaca ctgaaacagc cagatctcat gagaagtcac 1980

tcactattgc aaggacagca tcaaagagat ggtgctaaac cattcatgat gaactcaccc 2040

ccatgatcca atcacctccc accaggctcc acctcgaata ctggggatta ccattcagca 2100

tgagatttgg gcaggaacac agacccaaac cataccacac acattatcat tgttaaactt 2160

tgtaaagtat ttaaggtaca tggaacacac gggaagtctg gtagctcagc ccatttcttt 2220

attgcatctg ttattcacca tgtaattcag gtaccacgta ttccagggag cctttcttgg 2280

ccctcagttt gcagtataca cactttccaa gtactcttgt agcatcctgt ttgtatcata 2340

gcactggtca cattgcctta cctaaatctg tttgacagtc tgctcaacac gactgcaagc 2400

tccatgaggg cagggacatc atctcttcca tctttgggtc cttagtgcaa tacctggcag 2460

ctagccagtg ctcagctaaa tatttgttga ctgaataaat gaatgcacaa ccaaattatt 2520

gataccaaat gttttttttg tgtacatttc tacttctcta gctataagtc ttaattatac 2580

aacaaaatac tatttttata tttatgtttg gtaaattcaa taactttcct catcatttgg 2640

aaagtcaaat tgtttattgc ttccctacag ttttttctga atctagcagg attttaatga 2700

tatcattata atttgacaca ataaaaggac aacatgaaac tgatgaatct ttattgggtt 2760

aatttcagac actatataat cttttaaaaa tgtaacattc ttttttatat ataaataatt 2820

ggtggcatca caaatagcca aagcagggtg gagagagtga tccttcctgg gtgcaggcaa 2880

gaaggggata tgttttctac agagttttca aaacagtgat aaagctgtct acaagtcatt 2940

gtgcttttta tcatcactat gcccagacaa tgtgaaacat cagagatgaa gtgctcttcc 3000

cacagaggtg gactgatcct tctccccact cccttggtgt gtctctgaat gcaatgttgt 3060

cttggaaaac agctttccaa gcatttcact cctgagcact tgccagtttc ctcacttgtt 3120

cttcacatat ccaggcaaag acatcctgtt tgctatatga agcattgtat cccgtataaa 3180

aggaaggaaa gagagaaata tatttttaca ctcatcactc ctcaggggct gtacaatcat 3240

gtagaaattg tttaatgtgc ctgtcaaata gccaaagagt gttaaaccct gagttcccac 3300

ccatgtgtgt ggtatggtta ggattcatcc agatacacag agagaggcac aacaggagga 3360

gaaaggatag gggtgtgggg acagcgggcc cccaatatgg tgtaatcgtg gcaggtctct 3420

gcctgaagtg ctatgtgggg tttttcttgt tttaattttg actttaaccc ctgatttgta 3480

agtttttcat aaaataaaca gaatcataac tcatgtagat ggctataagt gccgtagtgt 3540

tctgtgggtc tctggtgtct gccagtgata agtgtggcac cccaggaagg ctgtggaccc 3600

catcaaggtg ctatgtgagg gccatgcttg gggtggtggt gggcccagta gaccctgcag 3660

ccatccatcc agcctgccca ctcacactgc ccttgtgtac tcctgctttg ctacgttatc 3720

attgatcaat gtccctggtt acctatgtgt ttgaattatc ttcgtgttac aggtgtttaa 3780

tgattttgct ccttctagct tatttgtatt tcacctgttt ttctttaaat caacatggtt 3840

acactctgtt tcagcaactg tataaattaa acacaaatta ttactactgc taaaaaaaaa 3900

aaaaaaaaa 3909

Claims

1.检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质在制备预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的产品中的用途，

所述危险分层包括低危、中危和高危三层级；

所述低危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率<18.5％，

所述中危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率约为32.2％，

所述高危指在初次诊断后≤3年的期间不良事件发生率约为88.2％；

所述低危对应可溶性ST2蛋白含量x≤21.1ng/mL，

所述中危对应可溶性ST2蛋白含量x为21.1<x<27.7ng/mL，

所述高危对应可溶性ST2蛋白含量为x≥27.7ng/mL；

所述不良事件包括全因死亡、心脏移植、心力衰竭。

2.检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质和检测BNP、proBNP和/或nt-proBNP蛋白含量的物质共同用于制备预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的产品的用途。

3.根据权利要求1或2所述用途，其特征在于，所述预测或辅助预测小儿扩张型心肌病(DCM)的危险分层和/或不良事件的产品中可引入一个或多个临床变量，所述临床变量包括年龄，性别，左心室射血分数和/或左室舒张末径的z-score。

4.检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质在制备连续监测小儿扩张型心肌病(DCM)的病程进展的产品中的用途。

5.根据权利要求1、2、4任一项所述用途，其特征在于，所述可溶性ST2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述可溶性ST2蛋白由SEQ ID NO.2所示核酸序列编码产生。

6.根据权利要求1-2任一项所述用途，其特征在于，所述不良事件包括近期不良事件和远期不良事件，所述近期表示初次诊断后≤6个月的期间，远期表示初次诊断后>6个月的期间。

7.根据权利要求1、2、4任一项所述用途，其特征在于，所述检测可溶性ST2(sST2)蛋白含量的物质可选自以下组中的任意一种：

1)可溶性ST2蛋白的结合蛋白；

2)含有1)的酶联免疫试剂盒；

3)含有1)的胶体金试纸条；

4)含有1)的化学发光试剂盒；

5)含有1)的时间分辨荧光免疫试剂盒；或

6)含有1)的流式荧光检测试剂盒。

8.根据权利要求7所述用途，其特征在于，所述结合蛋白为抗体或融合蛋白。

9.根据权利要求8所述用途，其特征在于，

所述抗体为单克隆抗体；

所述融合蛋白包含可溶性ST2抗体的可变区和Fc片段。