JP6419794B2

JP6419794B2 - 主要な心臓有害事象に罹患する危険性を予測する方法

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Publication number: JP6419794B2
Application number: JP2016519364A
Authority: JP
Inventors: ベルクマンアンドレアス; ウンリョン
Original assignee: シュピーンゴテックゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2018-11-07
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Also published as: EP3052941A1; HK1226484A1; RU2727022C2; RU2016112154A3; WO2015049243A1; US20160252526A1; CA2925936A1; EP3052941B1; ES2731531T3; JP2016532093A; RU2016112154A; TR201905773T4; US20200300868A1; CN105765385A; CN105765385B

Description

本発明の対象は、急性心筋梗塞を患った対象が主要な心臓有害事象に罹患するか又は死亡する危険性を予測するための方法であって、
・該対象から得られた体液中の、プロタキキニン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；及び
・主要な心臓有害事象に罹患するか又は死亡する危険性と、該プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが主要な心臓有害事象に罹患するか又は死亡する高い危険性の予測となるように関連付けること、
を含む。
「高いレベル」という用語は、特定の閾値レベルを上回るレベルを意味する。

サブスタンスＰ（ＳＰ）は神経ペプチドであり：神経伝達物質として、及び神経調節物質として機能するウンデカペプチドである。これは、タキキニン神経ペプチドファミリーに属する。サブスタンスＰ及びその密接に関連した神経ペプチドニューロキニンＡ（ＮＫＡ）は、プレプロ−タキキニンＡ遺伝子の異なるスプライシング後に、ポリタンパク質前駆体から産生される。ＣＮＳにおいて、サブスタンスＰは疼痛伝達系に関与する。
ＳＰは、痛覚、炎症、血漿漏出、後毛細血管細静脈における血小板及び白血球凝集、並びに血管壁を透過する白血球走化性移動で役割を果たす（Otsuka M, Yoshioka K. Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins. Physiol Rev. 1993 Apr;73(2):229-308.）。

ニューロキニン（ＮＫ）受容体は、主に冠状血管及び心臓内の神経節に存在し、心室心筋又は心房心筋には存在しない（Hoover DB, Chang Y, Hancock JC, Zhang L. Actions of tachykinins within the heart and their relevance to cardiovascular disease. Jpn J Pharmacol. 2000 Dec;84(4):367-73.）。冠状動脈におけるＮＫ１受容体に対する直接的な作用は、ＮＯ媒介性血管拡張を引き起こし得るか（Otsuka M, Yoshioka K. Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins. Physiol Rev. 1993 Apr;73(2):229-308.）、或いは、この効果は冠動脈疾患を患っている患者では弱められる可能性があり（Bossaller C, Habib GB, Yamamoto H, Williams C, Wells S, Henry PD. Impaired muscarinic endothelium-dependent relaxation and cyclic guanosine 5’-monophosphate formation in atherosclerotic human coronary artery and rabbit aorta. J Clin Invest. 1987 Jan; 79(1):170-4.）、優位なＮＫ２媒介性血管収縮を引き起こす。ＳＰ及びニューロキニンＡは、コリン作動性ニューロンを介して負の心筋収縮作用及び周期変動作用をおよぼす（Hoover DB, Chang Y, Hancock JC, Zhang L. Actions of tachykinins within the heart and their relevance to cardiovascular disease. Jpn J Pharmacol. 2000 Dec;84(4):367-73.）。対照的に、ＮＫ１拮抗薬がラット心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルにおいて心筋収縮作用及び心筋弛緩作用を改善する一方で、ＳＰはノルエピネフリンの正の心筋収縮作用を減弱する（Wang LL, Guo Z, Han Y, Wang PF, Zhang RL, Zhao YL, Zhao FP, Zhao XY. Implication of Substance P in myocardial contractile function during ischemia in rats. Regul Pept. 2011 Apr 11;167(2-3):185-91.）。ＳＰ（ＮＫ１受容体を介して）は、モルモットにおいてＡＭＩ後の気絶心筋に関わった（Chiao H, Caldwell RW. The role of substance P in myocardial dysfunction during ischemia and reperfusion. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1996 Mar; 353(4):400-7.）。

しかしながら、ＳＰのいくつかの作用は、ＡＭＩにおいて潜在的に有益であり得る。ＳＰは虚血ポストコンディショニングに関与し（Ren JY, Song JX, Lu MY, Chen H. Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in isolated perfused heart from diabetic rats: Involvement of transient receptor potential vanilloid 1, calcitonin gene-related peptide and substance P. Regul Pept. 2011 Aug 8;169(1-3):49-57.）、そしてＮＫ１拮抗薬は、動物モデルにおける増大したＡＭＩサイズの傾向をもたらし得る（Zhang RL, Guo Z, Wang LL, Wu J. Degeneration of capsaicin sensitive sensory nerves enhances myocardial injury in acute myocardial infarction in rats. Int J Cardiol. 2012 Sep 20;160(1):41-7.）。虚血中の侵害受容知覚は、虚血領域の血管新生に役割を果たし得るＮＫ１受容体発現性骨髄前駆細胞の動員を引き起こし得る（Amadesi S, Reni C, Katare R, Meloni M, Oikawa A, Beltrami AP, Avolio E, Cesselli D, Fortunato O, Spinetti G, Ascione R, Cangiano E, Valgimigli M, Hunt SP, Emanueli C, Madeddu P. Role for substance p-based nociceptive signaling in progenitor cell activation and angiogenesis during ischemia in mice and in human subjects. Circulation. 2012 Apr 10;125(14):1774-86, S1-19.）。

心筋（Morrey C, Brazin J, Seyedi N, Corti F, Silver RB, Levi R. Interaction between sensory C-fibers and cardiac mast cells in ischemia/reperfusion: activation of a local renin-angiotensin system culminating in severe arrhythmic dysfunction. 1. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Oct;335(1):76-84.）及び肺（Guo Z, Wang XP, Wang JP, Zhou RH, Wang LL, Wu J. Up-regulation of substance P in the lungs during acute myocardial ischemia and infarction in rats. Regul Pept. 2010 Feb 25;160(1-3):160-7.）のＳＰは、ＡＭＩの動物モデルにおいて増強されることが観察され、ＡＭＩにおける役割が示唆された。
ＮＫ−１Ｒの刺激によってサブスタンスＰがヒト腱細胞のＴＮＦα誘発アポトーシスを低減する能力を有することが示された（Br J Sports Med doi:10.1136/bjsports-2013-092438）。
男性における調査は、ＳＰの非常に短い半減期（１２分）によって妨げられた（Conlon, J.M., Sheehan, L. Conversion of substance P to C-terminal fragments in human plasma. Regul. Pept. 1983; 7:335-345.）。不安定なＳＰの代用品である安定したＰＴＡ（Ｎ末端プロ−サブスタンスＰ；以前はＮ末端プロタキキニンＡ又はＮＴ−ＰＴＡとも呼ばれた）に関するアッセイの最近の発展（Ernst, A., Suhr, J., Kohrle, J., Bergmann, A. Detection of stable N-terminal protachykinin A immunoreactivity in human plasma and cerebrospinal fluid. Peptides 2008; 29 : 1201-1206.）は、ヒトの疾病におけるこのタキキニン系の役割に対する試験を可能にした。プロタキキニン断片ＰＴＡ１−３７は、サブスタンスＰの代用マーカーになり得る。

ＷＯ２０１０／１２８０７１は、心筋梗塞後患者のような急性又は慢性疾患を有する対象の、ＡＣＥ阻害薬、利尿剤、及びβ−ブロッカーのような薬剤に対する応答者と不応答者、並びに薬剤を受けたとき有害影響を受ける者への分類について記載している。バイオマーカーとして、内皮機能／機能不全に影響するか又は関連する血管作用性ホルモンが使用される。血管作用性ホルモンは低レベルでは、（ホルモンがｐｒｏＡＮＰであるときには血栓溶解剤を除いた）薬剤の投与は、心筋梗塞を患った患者に対して好ましくない効果を有するのに対して、高レベルでは、薬物の投与が心筋梗塞を患った患者に対して有益な効果を有する。ＷＯ２０１０／１２８０７１によると、これは、低レベルのバイオマーカー（ｐｒｏＡＮＰを除く）が、（ホルモンがｐｒｏＡＮＰであるときには血栓溶解剤を除いた）薬剤の投与により心筋梗塞を患った患者に好ましくない効果を生じる、患者にとってより高い危険性を示唆することを意味している。さらにＷＯ２０１０／１２８０７１によると、バイオマーカー（ｐｒｏＡＮＰを除いた）のより高いレベルは、（ホルモンがｐｒｏＡＮＰであるときには血栓溶解剤を除いた）薬剤の投与により心筋梗塞を患った患者に有益な効果を生じる、患者にとって低い危険性を示唆する。

心臓病学的疾患に罹患している患者の効果的な処置及び管理には、重症度分類システムが必要である。ツール（ＮＴｐｒｏＢＮＰ、危険性スコア）が説明されているが、それらは不完全である。よって、現在の危険性の分類技術を改善する代替又は追加のツールが必要である。

本発明の対象は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を患った対象の主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を予測する方法であって：
・該対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；そして
・主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡の危険性と、該プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測となるように関連付けること、
を含む。

好ましい実施形態において、本発明の主題は、急性心筋梗塞を患った対象における主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を予測する方法であって：
・該対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；ここで、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡに結合する少なくとも１つの結合剤が使用され、そして、ここで、該結合剤はＰＴＡ１−３７に対して少なくとも１０⁷Ｍ^-1の親和性を有し；そして
・主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性と、該プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測となるように関連付け；
・これにより、プロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのより高いレベル、或いはＰＴＡ１−３７、配列番号２に結合する少なくとも１つの結合剤が使用されて判定される断片のより高いレベルが、主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡するより高い危険性を示すこと、
を含む。

具体的な実施形態において、本発明によるこの予測は、前記対象が薬剤によって引き起こされる好ましくない効果を示すか否か、又は前記対象が薬剤に対する応答者であるか又は不応答者であるかという予測ではない。
具体的な一実施形態において、本発明による予測は、前記対象が血栓溶解剤によって引き起こされる好ましくない効果を示すか否か、又は前記対象が血栓溶解剤に対して応答者であるか又は不応答者であるかという予測ではない。
よって、本発明の主題は、具体的な一実施形態において、薬剤に対する応答者、薬剤に対する不応答者、該薬剤を受けた後に好ましくない効果を示す対象への対象の分類を除く。特定の実施形態において、前記薬剤は血栓溶解剤である。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を患った対象の主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する本発明による方法は、本発明の一実施形態において、薬剤とは無関係であり、特に血栓溶解剤の効果とは無関係である。

主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性の予測は、疾患、病態又は事象の診断と同じでない。危険性の予測とは、バイオマーカーが計測及び予測の時点では存在しておらず、将来現れるであろう事象又は病態に罹患する危険性を予測又は判定することを意味し、ここで、診断とは、現れた現在の事象又は現在の病態を判定することを意味する。事象が起こった場合にのみそれらは変化するので、診断マーカーとして適している可能性があっても、予測力を全く有していないバイオマーカーが多く存在する。診断力を全く有していない多くの予測マーカーも存在する。どのような場合であっても、生体分子がいずれかの診断力又は予測力を呈する可能性があるか否か予測できない。

本発明の具体的な実施形態において、前記の主要な心臓有害事象は、心筋梗塞、脳卒中、急性心不全、及び死亡を含む群から選択される急性の主要な心臓有害事象である。具体的な一実施形態において、今後６カ月又は２年以内に前記の急性有害事象に罹患する危険性が予測される。具体的な一実施形態において、前記ＡＭＩは、前記患者からサンプル体液を採取する前のここ２４時間以内に起こった。具体的な一実施形態において、前記ＡＭＩは、前記患者からサンプル体液を採取する前のここ１週間以内に起こった。具体的な一実施形態において、前記ＡＭＩは、前記患者からサンプル体液を採取する前のここ１カ月以内に起こった。具体的な一実施形態において、前記ＡＭＩは、前記患者からサンプル体液を採取する前のここ２カ月以内に起こった。

本発明の具体的な実施形態において、急性心筋梗塞を患った対象における主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を予測する方法であって：
・該対象から得られた体液中の又はプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はのプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；そして
・主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性と、前記プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測となるように関連付けること、
を含む。

具体的な一実施形態において、対象は、体液を採取した時点で、及び／又は該対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルが判定される時点で、心不全を患っていない。
本発明による主要複合エンドポイントは、全死因死亡、心不全（ＨＦ）入院又は再発性ＡＭＩ（ｒｅ−ＡＭＩ）を含めた主要な心臓有害事象（ＭＡＣＥ）であって、それらは２年以内に評価されたものである。このことは、一実施形態において、主要な心臓有害事象が、全死因死亡、心不全（ＨＦ）入院又は再発性ＡＭＩ（ｒｅ−ＡＭＩ）を含む群から選択されることを意味している。具体的な一実施形態において、主要な心臓有害事象は、２年以内の全死因死亡、心不全（ＨＦ）入院又は再発性ＡＭＩ（ｒｅ−ＡＭＩ）を含む群から選択される。

ＨＦによる入院は、高用量の利尿剤、循環作動薬又は静脈内硝酸塩での処置を必要とする主な理由がＨＦである再入院と規定された。再発性ＡＭＩは、一般的な定義を使用して診断された（Thygesen K, Alpert JS, White HD; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation 2007;116:2634-53.）。第二のエンドポイントは、死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩと死亡及び／又はＨＦ再入院の複合、並びに個別のｒｅ−ＡＭＩであった。６カ月時点での死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩのエンドポイントは、この時点が危険性スコアの作成に使用される場合、ＧＲＡＣＥスコアに関する分析に使用された。エンドポイントは、その地域の病院のデータベース及びOffice of National Statistics Registryを参照し、並びに患者への電話によって得た。このことは、一実施形態において、主要な心臓有害事象が死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩ及び死亡及び／又はＨＦ再入院の複合、並びに個別のｒｅ−ＡＭＩを含む群から選択されることを意味する。具体的な一実施形態において、主要な心臓有害事象は、６カ月以内の死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩ及び死亡及び／又はＨＦ再入院の複合、並びに個別のｒｅ−ＡＭＩを含む群から選択される。

具体的な一実施形態において、主要な心臓有害事象は、死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩである。具体的な一実施形態において、主要な心臓有害事象は、６カ月の時点での死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩである。
サブスタンスＰ／ニューロキニン、並びにプロタキキニン及びその断片又はプロタキキニン含有ペプチドはプロタキキニンから等モル量で放出されるので、プロタキキニン及びその断片又はプロタキキニン含有ペプチドは、放出されたサブスタンスＰ及び／又は放出されたニューロキニンの代用マーカーとして使用されてもよい。一実施形態において、サブスタンスＰ又はニューロキニンを除いたプロタキキニン及びその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルが判定される。別の実施形態において、サブスタンスＰ又はニューロキニンのレベルが判定される。特定のペプチド又はペプチド断片のレベルは、例えば、前記プロタキキニン及びその断片又はプロタキキニン含有ペプチドに結合する少なくとも１つの結合剤を使用するいずれかの利用可能な解析法によって判定され得る。斯かる結合剤は抗体であってもよい。前記のレベルは、例えば、質量分析法によって判定されてもよい。

上記の方法の一実施形態において、高レベルのプロ−タキキニン、そのスプライス変異体又はその断片は、閾値を超えたレベルであり、ここで、該閾値は、（約）１００ｐｍｏｌ／ｌ又は１００ｐｍｏｌ／ｌ超、好ましくは（約）８０ｐｍｏｌ／Ｌ又は８０ｐｍｏｌ／Ｌ超、好ましくは（約）７０ｐｍｏｌ／Ｌ又は７０ｐｍｏｌ／Ｌ超である。
閾値は使用した較正方法を考慮して見られるべきであり、そして、上記の値は該実施例１、２及び３で使用されるアッセイ及び較正方法を考慮して見られるべきである。実施例１に従って本発明に使用される較正方法により、健康な対象のプロ−タキキニンの中央レベルは５３ｐｍｏｌ／Ｌに判定された。

本発明の一実施形態において、前記の主要な心臓有害事象は、心筋梗塞、脳卒中、急性心不全を含む群から選択される急性の主要な心臓有害事象である。
本発明の一実施形態において、該対象からの前記体液サンプルは、ＡＭＩが起こった後の特定の時間枠内で採取され、この時間枠は、２カ月、より好ましくは１カ月、より好ましくは１週間、最も好ましくは２４時間以内である。
本発明の一実施形態において、前記高いレベルは、ここ６カ月以内又はここ２年以内の主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測である。

明細書を通じて、プロ−タキキニン及びプロ−タキキニンＡ（ＰＴＡ）なる用語は、同義的に使用される。該用語は、プロ−タキキニンＡの全ての種スプライス改変体、すなわちαΡΤΑ、βΡΤΑ、γΡΤΑ、及びδΡΤΑを含む。明細書を通じて、別段の記述がない限り、プロ−タキキニンの断片なる用語はまた、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含むことが理解されるべきである。

用語「サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片を判定すること」とは、通常、前述の分子内の領域に対する免疫反応性が判定されることを意味する。これは、特定の断片が選択的に測定されることは必要ないことを意味する。サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、プロ−タキキニン又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片のレベルを判定するために使用される結合剤は、該結合剤の結合領域を含む任意の断片に結合することが理解される。該結合剤は、抗体又は抗体断片又は非ＩｇＧ足場であってもよい。

これは明細書及び請求項を通じて、「プロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定する」という用語が、「先に言及した分子内の領域に対する免疫反応性を判定する」と同等であり、且つ、「プロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドに含まれる領域に結合する結合剤、例えば抗体のレベルを判定する」と同等であることを意味する。

用語「対象」とは、本明細書で使用するとき、生きているヒト又はヒト以外の生物を意味する。好ましくは、本明細書では、対象はヒト対象である。

該対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５のアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルと、主要な心臓有害事象に罹患する危険性との関連は連続的である、すなわち、レベルが高ければ高いほど危険性もより高い。これは、例えば、表２のデータから分かる。第一の四分位数、第二の四分位数、第三の四分位数及び第四の四分位数の比較では、それぞれ高い危険性を示している。
実用性のために、当業者は閾値を使用してもよい。
よって、「高いレベル」という用語は、閾値レベルを上回るレベルを意味し得る。
体液とは、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ｃｓｆ）、及び唾液を含む群から選択され得る。

具体的な実施形態において、該対象から体液サンプルを採取した時点での心血管疾患は急性心筋梗塞（ＡＭＩ）である。具体的な一実施形態において、ＡＭＩは、ＳＴＥＭＩ（ＳＴセグメント上昇型心筋梗塞）又はＮＳＴＥＭＩ（非ＳＴセグメント上昇型心筋梗塞）である。本発明の一実施形態において、該対象はＡＭＩを患っていた、ここで、一実施形態において、患者は、次の：２０分以上継続する胸痛、又は新規の病理学的Ｑ波又はＳＴセグメント及びＴ波変化から成る診断的連続心電図変化、のうちの少なくとも１つと共に９９パーセンタイルを超える心臓トロポニンレベルを有した。

本発明の別の具体的な実施形態において、対象における有害事象の予想、又はＡＭＩを患った後に別の有害事象に罹患する危険性が高い対象の同定は：トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＲＰ、ＬｐＬＡ２、サイスタチンＣ及びＡ型及びＢ型のナトリウム利尿ペプチド、それらの前駆体、及びそれらの断片、ＡＮＰ、ｐｒｏＡＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰトリグリセリド、ＨＤＬコレステロール又はその副画分、ＬＤＬコレステロール又はその副画分、ＧＤＦ１５、ＳＴ２、コペプチン、並びに例えばＰＵＲＳＵＩＴ、ＴＩＭＩ、ＧＲＡＣＥ及びＦＲＩＳＣ危険性スコアなどのいずれかのスコア（B.E Backus, A.J Six, J.H Kelder, W.B Gibler, F.L Moll,1 and P.A Doevendans, Risk Scores for Patients with Chest Pain: Evaluation in the Emergency Department, Curr Cardiol Rev. 2011 February; 7(1): 2-8.）からなる群から選択される、１つ以上の更なるマーカーのレベルを追加で判定することにより改善される。

本発明の特定の実施形態において、体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルに加えて、以下のマーカー：ｐｒｏＢＮＰ又はその１２アミノ酸以上の断片又は前駆体、及び／又はＣＲＰのレベルが判定され、使用される。

本発明の他の特定の実施形態において、追加で１つ以上の臨床的パラメーターが判定され、当該パラメーターとして：年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療、ボディーマスインデックス、糖尿病の存在、現在の喫煙が含まれる。

プロ−タキキニンは、以下の（単数若しくは複数の）配列を有してもよい：
配列番号１（プロ−タキキニンＡ（１−１０７））
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
体液において判定され得るプロ−タキキニンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択されてもよい：

配列番号２（プロ−タキキニン１−３７、Ｐ３７）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ
配列番号３（サブスタンスＰ）
ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号４（神経ペプチドＫ）
ＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号５（神経ペプチドガンマ）
ＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）
配列番号６（ニューロキニン１）
ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（−ＮＨ２）

配列番号７（Ｃ末端フランキングペプチド、ＰＴＡ１９２−１０７）
ＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥ
配列番号８（ＰＴＡアイソフォームα）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＭＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ

配列番号９（ＰＴＡアイソフォームベータ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＤＳＳＩＥＫＱＶＡＬＬＫＡＬＹＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ
配列番号１０（ＰＴＡアイソフォームデルタ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＧＨＧＱＩＳＨＫＭＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲ

配列番号１１（ＰＴＡアイソフォームガンマ）
ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡＲＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＧＫＲＤＡＧＨＧＱＩＳＨＫＲＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭＧＫＲＡＬＮＳＶＡＹＥＲＳＡＭＱＮＹＥＲＲＲＳＥＱ
配列番号１２（ＰＴＡ３−２２）
ＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫ
配列番号１３（ＰＴＡ２１−３６）
ＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩ

ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルを判定することは、サブスタンスＰ及びニューロキニンを含む、ＰＴＡ又はその断片に対する免疫反応性が判定されることを意味し得る。結合領域に依存して、ＰＴＡ、又はそのスプライス改変体又はその断片を判定するために使用される結合剤は、上記で示された分子の１個を超えて結合してもよい。これは、当業者に明らかである。

本発明に方法のより具体的な実施形態において、ｐ３７（ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ）のレベルが判定される。本発明のさらにより具体的な実施形態において、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡ内の２つの異なる領域に好ましくは結合する１を超える結合剤の場合において、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡに結合する少なくとも１又は２つの結合剤が使用される。該結合剤（単数又は複数）は、好ましくは、抗体又はその結合断片であってもよい。

さらにより具体的な実施形態において、（単数若しくは複数の）結合剤は、ＰＴＡ１−３７内の以下の領域の、それぞれ、１つ又は両方に結合するＰＴＡ、その改変体又は断片を判定するために使用される。

具体的な実施形態において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルは、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を用いたイムノアッセイにより測定される。ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその少なくとも５つのアミノ酸の断片の判定に有用であり得るイムノアッセイは、実施例１に概説されるステップを含んでもよい。全ての閾値及び値は、実施例１に従って使用される試験及び較正に相関して見る必要がある。当業者は、閾値の絶対値が使用される較正によって影響される可能性があることを知っている可能性がある。これは、本明細書で与えられる値及び閾値が、本明細書で使用される較正との関連で理解されるべきであることを意味する（実施例１）。
本発明による方法のより具体的な実施形態において、プロタキキニンのレベルが判定される。

本発明によれば、ＰＴＡに対する診断的結合剤又は他の追加のバイオマーカーは、抗体、例えば、ＩｇＧ、典型的な全長イムノグロブリン、又は、例えば、化学的に結合された抗体（断片抗原結合）のように、重鎖及び／又は軽鎖の少なくともＦ可変領域を含有する抗体断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂ断片、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体、例えば、Ｆａｂ−Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ３ドメインで二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインの助けを借りた多量体化を介して形成されたもの、例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介したもの、例えば、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２−断片、ｓｃＦｖ−断片、多量体化された多価又は／及び多重特異的ｓｃＦｖ−断片、二価及び／又は二重特異的ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（engager））、三機能性抗体、多価抗体、例えば、Ｇとは異なるクラス由来のもの；単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ又は魚類のイムノグロブリン由来のナノボディからなる群から選択される。具体的な実施形態において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体若しくはその断片、又は他の更なるバイオマーカーのレベルは、ＰＴＡ、そのスプライス改変体若しくはその断片、又はあるいは更なるバイオマーカーに結合する、より詳細には以下に記載される、アプタマー、非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤を用いたアッセイにより測定される。

プロタキキニン（ＰＴＡ）、そのスプライス改変体又はその断片のレベルを判定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは１０⁸Ｍ^-1のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片に対する親和性定数を示し、好ましい親和性定数は、１０⁹Ｍ^-1より大きく、最も好ましくは１０¹⁰Ｍ^-1を超える。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を相殺されることが考えられる可能性があり、この測定が、本発明の範囲外をもたらさないことを知っている。結合親和性は、サービス分析、例えば、Biaffm,Kassel,Germany（http://www.biaffm.com/de/）として提供される、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて判定されてもよい、上記も参照のこと。

ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片のレベルを判定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは１０⁸Ｍ^-1のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片に対する親和性定数を示し、好ましい親和性定数は、１０⁹Ｍ^-1より大きく、最も好ましくは１０¹⁰Ｍ^-1を超える。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによって、より低い親和性を相殺されることが考えられる可能性があり、この測定が、本発明の範囲外をもたらさないことを知っている。結合親和性は、サービス分析、例えば、Biaffm,Kassel,Germany（http://www.biaffm.com/de/）として提供される、Ｂｉａｃｏｒｅ法を用いて判定されてもよい。

親和性定数
抗体の親和性を判定するために、固定された抗体に対する、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片の結合の動力学は、Biacore 2000システム（GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany）を用いて、標識なしの表面プラズモン共鳴によって判定された。抗体の可逆的固定化は、製造業者の説明書（マウス抗体捕捉キット；GE Healthcare）に従って、ＣＭ５センサー表面に高密度で共有結合させた抗マウスＦｃ抗体を用いて実施した。（Lorenz et al.,“ Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy“; Antimicrob Agents Chemother. 2011 January; 55(1): 165-173.）。

ヒトＰＴＡ対照試料は、ICI-Diagnostics,Berlin,Germany http://www.ici-diagnostics.com/によって利用可能である。また、アッセイは、合成（本発明者らの実験では、合成のＰ３７、配列番号２）又は組換えＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片によって較正されてもよい。

本発明の一実施形態において、該方法は、対象において主要な心臓有害事象に罹患する危険性をモニターするため、又は治療経過をモニターするために、１回を超えて行われる。具体的な一実施形態において、該モニターリングは、採用された予防的及び／又は治療的測定に対して、該対象の応答を評価するために行われる。

本発明の一実施形態において、該方法は、危険群に該対象を分類するために使用される。

さらに、本発明の主題は、それぞれの領域が少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む、アミノ酸３−２２（ＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫ、配列番号１２）とアミノ酸２１−３６（ＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩ、配列番号１３）であるＰＴＡの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含む試料において、ＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片を判定するためのアッセイである。

本発明による試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はその断片を判定するためのアッセイの一実施形態において、該アッセイのその分析的アッセイ感受性は、健常な対象のＰＴＡ、そのスプライス改変体又はＰＴＡ断片を定量することができ、＜２０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜１０ｐｍｏｌ／Ｌ、及びより好ましくは＜５ｐｍｏｌ／Ｌである。

本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を判定するためのアッセイの一実施形態において、このようなアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全に自動化されたアッセイである。それは、ＥＬＩＳＡ、完全に自動化されたアッセイ又は手動アッセイであってもよい。それは、いわゆるＰＯＣ検定（ポイントオブケア）であってもよい。自動化又は完全に自動化されたアッセイの例としては、以下のシステム：Roche Elecsys（登録商標）、Abbott Architect（登録商標）、Siemens Centauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、Biomerieux Vidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）の１つについて使用されてもよいアッセイが挙げられる。試験フォーマットの例は、上記で与えられている。

本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を判定するためのアッセイの一実施形態において、該２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、検出されるために標識される。標識の例は、上記で与えられている。

本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を判定するためのアッセイの一実施形態において、該２つの結合剤のうちの少なくとも１つは、固相に結合される。固相の例は、磁気ビーズ、ポリスチレンチューブ又はマイクロタイタープレートである。一実施形態において、均質アッセイが使用され、例えば、Time Resolved Amplified Cryptate Emission（ＴＲＡＣＥ）が使用される。

本発明に従って試料中のＰＴＡ、そのスプライス改変体又は断片を判定するためのアッセイの一実施形態において、該標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。

本発明のさらなる主題は、該アッセイの成分が、１つ以上の容器に含まれていてもよい本発明のアッセイを含むキットである。

本発明による方法の具体的な実施形態において、年齢、性別、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、ボディーマスインデックス、胴囲、ウエスト−ヒップ比、現在の喫煙者、糖尿病の遺伝、及びこれまでの心血管疾患（ＣＶＤ）を含む群から選択される、さらなる少なくとも１つの臨床パラメーターが測定される。

本発明の主題はさらに、ＡＭＩに罹患した対象における主要な心臓有害事象に罹患する危険性を予測し、又は本発明による主要な心臓有害事象に罹患する危険性が高いＡＭＩに罹患した対象を同定するための方法であり、ここで、単独で又は他の診断に有用な実験室若しくは臨床パラメーターと併せて、プロタキキニン若しくはの少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルは、以下の選択肢から選択されてもよい方法によって、対象が主要な心臓有害事象に罹患する危険性を予測するために使用される：
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め判定された試料一式において、対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルの中央値との比較、
−「健常な」又は「見かけ上健常な」対象の集団において予め判定された試料一式において、対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルの変位値との比較、
−コックス比例ハザード分析に基づく、又はＮＲＩ（純再分類指数）若しくはＩＤＩ（統合判別指数）などの危険性指標計算を用いることによる計算。

本発明による方法の一実施形態において、前記方法は、ＡＭＩに罹患した対象における主要な心臓有害事象に罹患する危険性を観察するために複数回おこなわれる。
本発明による方法の別の実施形態において、前記観察は、採用した予防的対策及び／又は治療学的対策に対するＡＭＩに罹患した該対象の応答を評価するために実施される。
本発明による方法の別の実施形態において、前記方法は、ＡＭＩに罹患している前記対象を危険群に分類するのに使用される。
また、本発明は、本発明による方法を実施するためのポイントオブケアデバイスをも想定する。
また、本発明は、本発明による方法を実施するためにアッセイ及び／又はキットも想定する。

典型的なＰＴＡ用量／シグナルカーブを示す。検量線ＰＴＡ。２年時にＭＡＣＥを患った（赤色）又は患っていない（緑色）ヒトのＡＭＩ後５日間にわたる血漿ＰＴＡプロファイル。６カ月時点で死亡及び／又はＭＩエンドポイントを有する生存者及び患者における事象の確率の上下再分類を示す再分類プロット。６カ月時点での死亡及び／又はＭＩエンドポイントに関するデシジョンツリー。６カ月時点での死亡及び／又はＭＩエンドポイントのための、初期の分級子としてＰＴＡを使用したデシジョンツリー。７２．１ｐｍｏｌ／Ｌより低いか又は高い血漿ＰＴＡに従って分類した時間と共に死亡及び／又はＭＩ事象を示したカプランマイヤープロット。生存時間関数。ＭＥＡＳＵＲＥ＿１の推定周辺平均。

実施例１
ＰＴＡ−イムノアッセイ
抗ＰＴＡ抗体の生成
免疫化のためのペプチド／コンジュゲート：
免疫化のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドのコンジュゲートのために、追加のＮ末端システイン残基を用いて合成した（JPT Technologies,Berlin,Germany）。そのペプチドを、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Perbio-science,Bonn,Germany）を使用することによってＢＳＡに共有結合で連結した。カップリング手順を、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施した。

抗体を、以下の方法に従って作製した：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化）、２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバンド中）で免疫した。融合実験を実施する３日前に、動物に、１回の腹腔内注射及び１回の静脈内注射として与えられる、１００μｌの生理食塩水中に溶解した５０μｇのコンジュゲートを与えた。

免疫したマウスからの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を３７℃にて３０分間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合した。洗浄後に、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンをＨＡＴ培地中での成長によって選択した［２０％のウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補ったＲＰＭＩ１６４０培地］。２週間後に、ＨＡＴ培地を、３回の継代の間、ＨＴ培地に置き換え、それに続いて正常細胞培養培地に置き換えた。

融合の３週間後に、細胞培養上清を抗原に特異的なＩｇＧ抗体について一次スクリーニングした。陽性の試験微量培養を繁殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に、選択した培養物をクローニングし、限界希釈を使用することで再びクローニングし、アイソタイプを判定した。

（Lane, R.D. “A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”, J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. “Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies”, Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)）。

モノクローナル抗体産生
抗体を標準的な抗体製造法によって産生させ（Marx et al., Monoclonal Antibody Production (1997), ATLA 25, 121）、Protein A−クロマトグラフィーによって精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づき＞９５％であった。

抗体の標識及びコーティング
以下の手法に従って、アクリジニウムエステルを用いて全ての抗体を標識した：
標識された化合物（トレーサー、抗ＰＴＡ３−２２）：１００μｇ（１００μｌ）抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、In Vent GmbH,Germany）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識された抗体をBio-Sil SEC400-5（Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA）上のゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製された標識抗体を（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／１ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）に希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり、標識化合物の約８００，０００相対光単位（ＲＬＵ）（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、AutoLumat LB953（Berthold Technologies GmbH & Co.KG）を用いて測定された。

固相抗体（コーティングされた抗体）：
固相：ポリスチレンチューブ（Greiner Bio-One International AG,Austria）を抗ＰＴＡ２２−３６抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコーティングした（１８時間室温）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥させた。

ＰＴＡイムノアッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正因子）をコーティングしたチューブにピペットで入れ、標識抗体（２００μｌ）を添加後、チューブを２時間１８〜２５℃でインキュベートした。非結合のトレーサーを洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって除去した。チューブに結合した標識抗体は、Luminumeter LB953、Berthold、Germansyを用いて測定された。

較正：
２０ｍＭのＫ２ＰＯ４、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭアムスタチン、１００μＭロイペプチン、ｐＨ８．０中で希釈した合成Ｐ３７の希釈物を用いてアッセイを較正した。ＰＴＡ対照血漿は、ICI-diagnostics、Berlin、Germanyで入手可能である。

分析アッセイ感度は、（０−較正因子（ＰＴＡの添加なし）＋２ＳＤ２標準偏差（ＳＤ）の２０個の判定によって生じた中央値シグナル、対応するＰＴＡ濃度は標準曲線から計算される）４．４ｐｍｏｌ／Ｌであった。
実施例２

急性心筋梗塞を患っている患者の研究
研究集団：
我々は、２００４年８月から２００７年４月の間に大学病院のレスターＮＨＳトラストに入院した１１４８人のＳＴＥＭＩ（＝ＳＴセグメント上昇型心筋梗塞）及びＮＳＴＥＭＩ（＝非ＳＴセグメント上昇型心筋梗塞）患者を試験した。この観察コホート研究は、ヘルシンキ宣言を順守し、且つ、地域の倫理委員会によって承認された。患者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。９９パー千タイル値を超える心臓トロポニンＩレベルを次の：２０分以上継続する胸痛、又は新規の病理学的Ｑ波又はＳＴセグメント及びＴ波変化から成る診断的連続心電図変化、のうちの少なくとも１つと共に患者が示した場合に、ＡＭＩを診断した（Thygesen K, Alpert JS, White HD; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation 2007;116:2634-53.）。前月に既知の悪性腫瘍を患っていた、腎代償療法を受けた又は外科手術を受けた患者を除外した。概算腎糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）をModification of Diet in Renal Diseaseの式から算定した（Smilde TD, van Veldhuisen DJ, Navis G, Voors AA, Hillege HL. Drawbacks and prognostic value of formulas estimating renal function in patients with chronic heart failure and systolic dysfunction. Circulation 2006;114:1572-80.）。すべての患者が主治医の裁量で標準的治療と血管再生術を受けた。

血漿サンプル：
血液サンプル（ＥＤＴＡ及びアプロチニンで抗凝固した）を、１５分間の床上安静後、診断直後、及び症状発症の３６時間以内を採血した。血漿を、血漿ＰＴＡ及びＮＴｐｒｏＢＮＰの盲検測定向けの一つのバッチで、アッセイするまで−８０℃にて保存した。

心エコー図：
経胸壁超音波心エコー図検査を、Sonos5500又はIE33装置（Philips Medical Systems, Reigate, UK）のいずれかを使用して、最初の入院中に８９５人（７７．９％）の患者に実施した。１６セグメントの左室壁運動指数（ＬＶＷＭＩ）スコアをAmerican Society of Echocardiography法に基づいて実施した（Schiller NB, Shah PM, Crawford M, et al. Recommendations for quantitation of the left ventricle by two-dimensional echocardiography. American Society of Echocardiography Committee on Standards, Subcommittee on Quantitation of Two-Dimensional Echocardiograms. J Am SocEchocardiogr. 1989; 2: 358-367.）。好適な患者では、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）を、ディスク式の二方向法を使用して計算した。ＬＶ収縮機能障害（ＬＶＳＤ）を、ＬＶＥＦ＜４０％又はＬＶＷＭＩ＞１．８と定義した。

急性冠状動脈性事象（ＧＲＡＣＥ）スコアの包括的登録：
急性冠症候群患者の国際的な観察データベースに基づいて、院内死亡率を予測するために（Granger CB, Goldberg RJ, Dabbous O, et al. Global Registry of Acute Coronary Events Investigators. Predictors of hospital mortality in the global registry of acute coronary events. Arch Intern Med. 2003; 163 : 2345-53.）又は６カ月間の死亡及び／又は再ＭＩと規定した主要な心臓有害事象（ＭＡＣＥ）に関して（Eagle KA, Lim MJ, Dabbous OH, et al. A validated prediction model for all forms of acute coronary syndrome: estimating the risk of 6-month post discharge death in an international registry. JAMA 2004;291:2727-33.）、ＧＲＡＣＥスコアを最初の概要説明のときに計算できる。我々は、６カ月の死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩエンドポイントとの比較のために退院に対するＧＲＡＣＥスコアを使用した。

エンドポイント：
本発明による主要複合エンドポイントは、全死因死亡、心不全（ＨＦ）入院又は再発性ＡＭＩ（ｒｅ−ＡＭＩ）を含めた主要な心臓有害事象（ＭＡＣＥ）であって、それらは２年以内に評価されたものである。ＨＦによる入院は、高用量の利尿剤、循環作動薬又は静脈内硝酸塩での処置を必要とする主な理由がＨＦである再入院と規定された。再発性ＡＭＩは、一般的な定義を使用して診断された（Thygesen K, Alpert JS, White HD; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation 2007;116:2634-53.）。第二のエンドポイントは、死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩと死亡及び／又はＨＦ再入院の複合、並びに個別のｒｅ−ＡＭＩであった。６カ月時点での死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩのエンドポイントは、この時点が危険性スコアの作成に使用される場合、ＧＲＡＣＥスコアに関する分析に使用された。エンドポイントは、その地域の病院のデータベース及びOffice of National Statistics Registryを参照し、並びに患者への電話によって得た。我々は１００％の経過観察を達成した。

統計解析：
統計的分析を、ＳＰＳＳバージョン２０（SPSS Inc, Chicago, Illinois）及びＳｔａｔａ１２．１（Texas,USA）で実施した。１５％の事象率及び共変量が最大３０％のバイオマーカーの変化を予測すると仮定すれば、６００人の患者のサンプルサイズは、１．５のバイオマーカーのハザード比を検出するために動かされる（ｐ＜０．０５にて９０％）。バイオマーカーレベルをｌｏｇ１０変換したので、そのためハザード比はこれらのマーカーのレベルで十倍増を指す。ＧＲＡＣＥスコアを元のスコアとして使用した。ノンパラメトリック検定法を、非Ｇａｕｓｓ形データ（マン−ホイットニーのＵ検定、クラスカルワリスの検定、及びスピアマン（ｒｓ）関連付け）に対して用いた。ＰＴＡレベルの独立予測因子を、一変量の一般線形モデルを使用して評価した。バイオマーカーの予後的価値を評価するために、「ベース」モデルをコックス生存分析を使用して作り出し、そしてそれは、一変量解析法の任意の試験エンドポイントに有意（ｐ＜０．１０）に関係する変数（年齢、性別、虚血性心疾患（ＩＨＤ）、高血圧又は糖尿病に関する既往歴、Ｋｉｌｌｉｐ分類、ｅＧＦＲ、及びログトロポニンＩ）を含んでいた。バイオマーカー（ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ＰＴＡ）をこのベースモデルに追加して、すべての変数が同時に入力されたそれぞれの相対予後的価値を評価する。第二の「比較」コックスモデルを、これらのバイオマーカーの相対予後力とＧＲＡＣＥスコアを評価するのに使用した。ＧＲＡＣＥスコアに対するＰＴＡの追加予後的価値は、Pencinaら（Pencina MJ, D'Agostino RB Sr, Steyerberg EW. Extensions of net reclassification improvement calculations to measure usefulness of new biomarkers. Stat Med. 2011; 30:11-21.）によって記載された無カテゴリ純再分類改善度（ＮＲＩ）の計算による再分類分析によって評価した。我々は、カイ二乗自動反復検出（ＣＨＡＩＤ、ＳＰＳＳを使用して実施した分析）を使用してデシジョンツリーを構築し、そしてそれは、従属変数を伴った最も強い相互作用を有するバイオマーカーを各ステップで選択した。

患者特性
ＰＴＡの四分位数による調査対象集団の特徴を表２に示す。より高いＰＴＡレベルを有する患者は、高齢の、女性で、高血圧、ＩＨＤ、糖尿病、ＨＦの既往歴があり、より高いＧＲＡＣＥスコア、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、及びグルコースレベルを有する。彼らはまた、より損なわれた心臓及び腎臓機能も有していた。

入院時のＰＴＡ四分位数による１１４８人のＡＭＩ患者の特徴。数値データをｎ（％）として提示する。Ｐ値は、連続変数又はカテゴリ変数のそれぞれに関するＡＮＯＶＡ（Ｆ統計値）又はクラスカル・ウォリス検定のために引用する。数値（％）又は平均±ＳＤを報告する。

相関分析
スピアマン分析（ｒｓ）は、ＰＴＡが年齢（０．５２１）、ｅＧＦＲ（−０．５５５）、拡張期ＢＰ（−０．１７８）、ＮＴｐｒｏＢＮＰ（０．４２８）、駆出分画（−０．１７５）（すべてＰ＜０．０００５）、及び心拍数（０．１００、Ｐ＜０．００１）に有意に創刊することを明らかにした。ＰＴＡは、トロポニン又はピーククレアチンキナーゼレベルとは相関しなかった。

一変量の一般線形モデルは、モデルにおいて説明される変化に従って降順で、次のＰＴＡレベルの独立予測因子を示した（表３）：ｅＧＦＲ、年齢、糖尿病及びＩＨＤの既往歴、１を超えるＫｉｌｌｉｐクラス、ＬＶ壁運動スコア、女性、及び拡張期ＢＰ。ｅＧＦＲは変化の大部分を占めた（２０．７％）。

ＰＴＡレベルの独立予測因子を示す一変量の一般線形モデル

ＰＴＡの日曲線
その２９人が２年以内にＭＡＣＥを患っている１１０人の患者に関して、５日間の連続した血漿サンプルを利用可能であった。図２は、血漿プロフィルが期間を通じてＰＴＡの有意な変化を示し（ｐ＜０．００１）、且つ、ＭＡＣＥを患っているヒトで高いレベルを示す（ｐ＜０．０３）頻回測定による一般線形モデルを実証している。
ｈｏｃ後試験では、１日目のＰＴＡレベルは３、４又は５日目より高かった（それぞれｐ＜０．００１、０．００４及び０．００２、多重比較のためにボンフェローニ補正した）。１日目と２日目のＰＴＡレベルは類似していた。ＭＡＣＥとＰＴＡの時間プロフィルとの統計的に有意な相互作用は存在しなかった。

生存分析
２年間にわたる経過観察中、（ｌｏｇ１０変換及び連続的変量として表された）高いＰＴＡレベルを有する患者は、追加のＭＡＣＥ、死亡、及びＨＦ又はｒｅ−ＡＭＩを患って再入院した（表２）。表４は、２年時点にてＭＡＣＥの転帰に影響した様々な因子の一変量及び多変量のハザード比を報告している。

ＡＭＩ後２年時点でのＭＡＣＥのコックス回帰分析。多変量解析結果は、（ＧＲＡＣＥ及びＬＶ収縮機能障害を除いた）ＭＡＣＥの予測のための一変量解析法により有意であった変数及びバイオマーカーを含めたモデル１について報告されている。多変量モデル２及び３は、死亡及び／又はｒｅ−ＭＩ（モデル２）と死亡及び／又はＨＦ再入院（モデル３）の複合エンドポイントに関するものである。有意なハザード比だけが報告されている。

２年時点でのＭＡＣＥを予測するための多変量解析では、有意な独立予測因子は、年齢、１を超えるＫｉｌｌｉｐクラス、スタチンを用いた治療法、ＡＣＥ／ＡＲＢ及び利尿剤、並びにＰＴＡを含んでいた。死亡及び／又はｒｅ−ＡＭＩ（モデル２）及び死亡及び／又はＨＦ再入院（モデル３）の第二の複合エンドポイントの予測のための他のモデルでは、ＰＴＡが独立予測因子である（それぞれｐ＜０．０００５及びｐ＜０．００２）。ＭＡＣＥ及びＬＶＳＤの心エコー徴候（データ未掲載）を含めたこれらの第二の複合エンドポイントのモデルにおいて、ＰＴＡは、ＬＶＳＤと一緒に有意な独立予測因子（すべてのためのＰ＜０．００５）である（ｐ値は０．０１５〜０．０２５の範囲に及ぶ）。

表５は、２年時点のｒｅ−ＡＭＩのエンドポイントに関する一変量及び多変量ハザード比を報告する。

表５：ＡＭＩ後２年時点でのｒｅ−ＭＩエンドポイントに関するコックス回帰分析。多変量解析結果は、（ＧＲＡＣＥ及びＬＶ収縮機能障害を除いた）一変量解析法に対して有意であった変数及びＮＴｐｒｏＢＮＰを含めたモデル１について報告した。多変量モデル２は、モデル１にｐｒｏ−ＳＰを追加した後のハザード比を報告する。多変量モデル３は、モデル２に心エコーＬＶＳＤを追加した後のハザード比を報告する。有意なハザード比だけを報告する。
有意な一変量予測因子及びＮＴｐｒｏＢＮＰを含むモデルでは、虚血性心疾患の過去の既往歴に関して有意（ｐ＝０．０５５）な傾向があった。これへのＰＴＡの追加は、ＰＴＡがｒｅ−ＡＭＩの有意な予測因子であることを明らかにした（モデル２、表５）。心エコーＬＶＳＤが追加されたとき、ＰＴＡは有意な傾向を示した（モデル３、表５）。

ＧＲＡＣＥスコアとの比較
広く使用したＧＲＡＣＥ危険性スコア（Eagle KA, Lim MJ, Dabbous OH, et al. A validated prediction model for all forms of acute coronary syndrome: estimating the risk of 6-month post discharge death in an international registry. JAMA 2004;291:2727-33.）を、６カ月時点での死亡及び／又はＭＩの予測のために初めに得た。ＧＲＡＣＥスコア、並びにバイオマーカーＮＴｐｒｏＢＮＰ及びＰＴＡは、一変量解析法におけるＭＡＣＥの予測因子であった（表６）。

６カ月時点でのエンドポイントに関するコックス回帰分析。一変量ＨＲは、６カ月時点のＭＡＣＥを指す。多変量モデルは、ＭＡＣＥの予測のためのＧＲＡＣＥスコアとバイオマーカー（モデル１）、死亡及び／又はＭＩ（モデル２）、並びに死亡及び／又はＨＦ（モデル３）を含んでいた。有意なハザード比だけを報告する。
６カ月時点でのＭＡＣＥ、死亡及び／又はＭＩ、並びに死亡及び／又はＨＦの多変量解析では、ＧＲＡＣＥスコア及びＰＴＡが予測因子であり、その一方で、ＮＴｐｒｏＢＮＰは、ＭＡＣＥ及び死亡及び／又はＨＦモデルのためだけに保持された（表６のモデル１と３）。

６カ月時点での死亡及び／又はＭＩに関する受容者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を使用すると、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）はＰＴＡの追加によりＧＲＡＣＥスコアだけに関して０．６９５（９５％ＣＩ０．６４９−０．７４１）から０．７２２（０．６７７−０．７６８）に増加した（ＧＲＡＣＥスコアのみと比較してＰ＝０．０１６）。このＲＯＣへのＮＴｐｒｏＢＮＰの追加により、ＡＵＣの更なる増大はなかったが（０．７２２（０．６７６−０．７６８））、このＡＵＣは、ＧＲＡＣＥスコアのみのものより有意に大きかった（Ｐ＝０．０２７）。

分析に勝手なカットオフ確率が選ばれないようにＮＲＩ（＞０）を計算するために、無カテゴリ再分類分析を、Pencinaら（Pencina MJ, D'Agostino RB Sr, Steyerberg EW. Extensions of net reclassification improvement calculations to measure usefulness of new biomarkers. Stat Med. 2011; 30:11-21.）によって記載されたように用いた。図３は、ＰＴＡ調整ＧＲＡＣＥスコアを使用した事象確率に対してプロットされたＧＲＡＣＥスコアのみを使用した事象確率を用いて、Steyerberg（Steyerberg EW, Vickers AJ, Cook NR, Gerds T, Gonen M, Obuchowski N, Pencina MJ, Kattan MW. Assessing the performance of prediction models. A framework for traditional and novel measures. Epidemiology 2010; 21:128-138.）によって提案された再分類プロットを示す。不利な転帰のなかったヒトにおけるＰＴＡによって調整した確率が下位に（すなわち、図３の対角線の下に）分類される。６カ月時点で死亡及び／又はＭＩエンドポイントのなかったヒトのＮＲＩは、２２．３（９５％ＣＩ１５．６−２９．０、Ｐ＜０．０００５）であり、エンドポイントを有するヒトでは９．３（９５％ＣＩ −６．７−２５．３、Ｐ＝ＮＳ）であって、３１．６（９５％ＣＩ１４．３−４９．０、Ｐ＜０．０００５）の全体的なＮＲＩ（＞０）を有して、ＰＴＡがエンドポイントを有していないヒトの下位分類によって、ＧＲＡＣＥスコア化からの危険性の分類を改善した（表７）。

連続した再分類、三分位値又は０．０５及び０．１の２つの指定危険性閾値を使用した再分類分析は、６カ月時点での死亡及び／又はＭＩエンドポイントに関する、ＧＲＡＣＥスコア化のみを使用した分類へのＰＴＡの追加について純再分類改善度（ＮＲＩ）及びＮＲＩの有意性を示す。
三分位値を６カ月時点での死亡及び／又はＭＩの確率に関する２つのカットオフに選んだ場合、再分類分析は、ＰＴＡが有意な純ＮＲＩ（９．８、Ｐ＜０．０２５）でエンドポイントなしのヒトを主に下位分類したことを示した。
６カ月時点での死亡及び／又はＭＩの確率に関して２つのカットオ（５％及び１０％）フが選ばれた場合、６カ月時点での死亡及び／又はＭＩエンドポイントのないヒトのＮＲＩは、１１．７（Ｐ＜０．０００５）であり、エンドポイントを有するヒトのＮＲＩは有意ではなく、９．０（Ｐ＜０．００５）の全体的なＮＲＩに至った。

デシジョンツリー解析
バイオマーカーの最適な切り取り点を判定するために、我々は、患者を生存者又はエンドポイントを有する者に分類するために（ＰＴＡ及びＮＴｐｒｏＢＮＰレベル、並びにＧＲＡＣＥスコアを使用して）デシジョンツリーを構築した。６カ月時点での死亡及び／又はＭＩのエンドポイントに関しては（図４）、８２．８ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＰＴＡを、死亡及び／又はＭＩに関して低い危険性を有する（本来の集団における１５．５％と比較して６．３％）、２２５６ｐｍｏｌ／Ｌ未満の低いＮＴｐｒｏＢＮＰ及び１３７未満のＧＲＡＣＥスコアを有するヒトのサブグループ（ｎ＝５８３、全体の５０．８％）に選択した。

初期の分級子としてＰＴＡを使用したデシジョンツリー（図５）では、７２．０８ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＰＴＡレベル及び１３７未満のＧＲＡＣＥスコアを、事象率が６．８％である低危険性群の患者（ｎ＝５１２、全体の４４．６％）と規定する。そのうち、３人の患者（０．２６％）だけが６カ月以内に死亡し、そして、１人（０．０９％）が３０日以内に死亡した。１２１．６ｐｍｏｌ／Ｌ超のＰＴＡレベルを、３７．７％の死亡／ＭＩ率及び３０．７％の死亡率を有する高危険性患者群と規定した（図５）。

カプランマイヤー分析
７２．１ｐｍｏｌ／Ｌのカットオフ値を使用することで、死亡及び／又はＭＩの複合エンドポイントに関するカプランマイヤー生存分析により、このカットオフ未満のレベルを有する者（ｎ＝６８９、全体の６０％）と、このカットオフを超えたレベルを有する者の間の有意差を実証した（ログランク検定に関するＰ値＜０．０００５）（図６）。

Claims

急性心筋梗塞を患った対象における主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を予測する方法であって、デバイスにより行われる以下の工程：
・該対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；そして
・主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡の危険性と、該プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測となるように関連付けること、
を含み、
前記主要な心臓有害事象が、心筋梗塞、脳卒中、及び急性心不全を含む群から選択される急性の主要な心臓有害事象である、方法。
前記対象から得られた体液中のプロタキキニン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルを判定し；ここで、ＰＴＡ１−３７、配列番号２、ＥＥＩＧＡＮＤＤＬＮＹＷＳＤＷＹＤＳＤＱＩＫＥＥＬＰＥＰＦＥＨＬＬＱＲＩＡに結合する少なくとも１つの結合剤が使用され、そして、ここで、該結合剤がＰＴＡ１−３７に対して少なくとも１０⁷Ｍ^-1の親和性を有する、請求項１に記載の方法。
前記対象からの前記体液サンプルが、急性心筋梗塞発生後の特定の時間枠内で採取され、この時間枠が２カ月である、請求項１又は２に記載の方法。
前記対象からの前記体液サンプルが、急性心筋梗塞発生後の特定の時間枠内で採取され、この時間枠が１カ月である、請求項１又は２に記載の方法。
前記対象からの前記体液サンプルが、急性心筋梗塞発生後の特定の時間枠内で採取され、この時間枠が１週間である、請求項１又は２に記載の方法。
前記対象からの前記体液サンプルが、急性心筋梗塞発生後の特定の時間枠内で採取され、この時間枠が２４時間以内である、請求項１又は２に記載の方法。
前記高いレベルが、ここ６カ月以内又はここ２年以内の主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する高い危険性の予測である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の急性心筋梗塞を患った対象における主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を予測する方法。
更に、以下のマーカー：トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＲＰ、ＬｐＬＡ２、サイスタチンＣ及びＡ型及びＢ型のナトリウム利尿ペプチド、それらの前駆体、及びそれらの断片、ＡＮＰ、ｐｒｏＡＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰトリグリセリド、ＨＤＬコレステロール又はその副画分、ＬＤＬコレステロール又はその副画分、ＧＤＦ１５、ＳＴ２、コペプチン、並びにＰＵＲＳＵＩＴ、ＴＩＭＩ、ＧＲＡＣＥ及びＦＲＩＳＣ危険性スコアから選択されるいずれかのスコアのうちの１若しくは複数のレベルがデバイスにより判定され、そして、使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
追加で少なくとも１つの臨床的パラメーターがデバイスにより判定され、該パラメーターとして：年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療、ボディーマスインデックス、糖尿病の存在、現在の喫煙が含まれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記プロタキキニン若しくはその断片又はプロタキキニン含有ペプチドのレベルが、免疫学的アッセイによって評価される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、対象における主要な心臓有害事象に罹患する又は死亡する危険性を観察するために複数回実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記観察が、採用した予防的対策及び／又は治療的対策に対する前記対象の応答を評価するために実施される、請求項１１に記載の方法。
前記対象を危険群に分類するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのデバイスの使用。
前記デバイスがポイントオブケアデバイスである、請求項１４に記載の使用。
次の：
・プロＢＮＰ、又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片若しくは前駆体に対する結合剤、及び
・プロタキキニン若しくは少なくとも５アミノ酸から成るその断片又はプロタキキニン含有ペプチドに対する結合剤、及び／又はＣＲＰに対する結合剤、
を含んでいる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の主要な心臓有害事象に罹患する危険性を予測する方法のためのデバイスの使用。
前記結合剤が、抗体、抗体断片及び非Ｉｇ足場を含む群から選択される、請求項１６に記載の主要な心臓有害事象に罹患する危険性を予測する方法のためのデバイスの使用。