AT521641B1 - Verfahren zur Diagnose von Lebererkrankungen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnose einer Lebererkrankung bei einem Säugetier, umfassend den Schritt des Bestimmens der Menge eines Produkts, das durch das NOG-Gen in einer biologischen Flüssigkeitsprobe des Säugetiers kodiert wird, und der Diagnose einer Lebererkrankung, wenn die Menge des Produkts, die durch das NOG-Gen in der Probe des Säugetiers kodiert wird, von der Menge des Produkts abweicht, die durch das NOG-Gen kodiert wird, das in einer Probe eines gesunden Säugetiers bestimmt wird.

Description

Beschreibung
VERFAHREN ZUR DIAGNOSE EINER LEBERERKRANKUNG
TECHNISCHES GEBIET
[0001] Diese Erfindung bezieht sich auf die Erkennung pathologischer Veränderungen im Lebergewebe durch Messung eines Biomarkers.
STAND DER TECHNIK
[0002] Lebererkrankungen wie die Fettlebererkrankung („fatty liver disease“, FLD) sind in der allgemeinen Bevölkerung eine sehr verbreitete Pathologie. Es ist erwähnenswert, dass beispielsweise in der westlichen Bevölkerung die Unterernährung die häufigste Ursache für die nichtalkoholische Fettlebererkrankung („non-alcoholic fatty liver disease“, NAFLD) ist, mit einer geschätzten Inzidenz von 15 bis 20% und einer steigenden Zahl von Patienten, die Risikofaktoren für ihre Entwicklung aufweisen (Bedogni et al. 42(2005):44-52; Amarapurkar et al. Ann Hepatol 6(2007):161-163). Uberernährungs- und adipositasbedingte NAFLD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die mit Hypertriglyceridämie, Fettleibigkeit und Insulinresistenz verbunden ist, wie sie bei Patienten mit metabolischem Syndrom beobachtet wird (Higuchi und Gores, Curr Mol Med 3(2003):483-490).
[0003] Obwohl FLD zum Beispiel eine so weit verbreitete Krankheit ist, bleibt die nichtinvasive Diagnose ein unerfüllter medizinischer Bedarf. Nach wie vor muss sich die Mehrheit der Patienten einer schmerzhaften Biopsie unterziehen, da dies derzeit noch immer der Goldstandard für die Diagnose und das Staging der NAFLD ist. Es handelt sich jedoch um ein invasives Verfahren, das durch Stichprobenfehler, hohe Kosten, verfahrensbedingte Komplikationen und Beobachtervariabilität begrenzt ist, selbst wenn es von erfahrenen Pathologen durchgeführt wird. Die Kernspintomographie der Protonendichte-Fettfraktion (MRI-PDFF) und die Magnetresonanz-Elastographie (MRE) haben sich als genaue Werkzeuge zur Quantifizierung der Steatose herausgestellt, sind aber sehr teuer und nicht für alle Patienten zugänglich. Sie haben auch schwerwiegende Probleme bei der Erkennung von Entzündungen, was ein sehr wichtiger Faktor ist, um das Fortschreiten von SS zu NASH abzuschätzen, was für die Stratifikation und Therapieentscheidung der Patienten entscheidend ist. Daher besteht ein dringender Bedarf an nicht-invasiven Biomarkern für Lebererkrankungen, insbesondere an NAFLD-Biomarkern, gemessen in Körperflüssigkeiten wie Blut, um die oben genannten Probleme zu lösen.
[0004] So ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel bereitzustellen, die die Diagnose von Lebererkrankungen und die Uberwachung des Fortschritts von Lebererkrankungen mit nicht-invasiven oder minimal-invasiven Methoden ermöglichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
[0005] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnose einer Lebererkrankung bei einem Säugetier, umfassend den Schritt des Bestimmens der Menge eines Produkts, das durch das NOG-Gen in einer biologischen Flüssigkeitsprobe des Säugetiers kodiert wird, und der Diagnose einer Lebererkrankung, wenn die Menge des Produkts, die durch das NOG-Gen in der Probe des Säugetiers kodiert wird, von der Menge des Produkts abweicht, die durch das NOG-Gen kodiert wird, das in einer Probe eines gesunden Säugetiers derselben Spezies bestimmt wird.
[0006] Es stellte sich überraschend heraus, dass der Gehalt eines Produkts, das durch das NOG-Gen, vorzugsweise NOGGIN, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit kodiert wird, anzeigt, ob ein Säugetier, von dem die Probe gewonnen wurde, an einer Lebererkrankung leidet. Einer der Hauptvorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass das vom NOG-Gen kodierte Produkt in einer biologischen Flüssigkeitsprobe gemessen werden kann, so dass es nicht mehr notwendig ist, eine Leberbiopsie oder eine andere invasive Metho-
de durchzuführen, um eine biologische Probe zu erhalten.
[0007] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein nicht-invasives oder minimalinvasives Verfahren zur Diagnose von Lebererkrankungen wie Fettlebererkrankungen (FLD), insbesondere nichtalkoholische Fettlebererkrankungen (NAFLD) oder alkoholische Fettlebererkrankungen („alcoholic fatty liver disease“, AFLD). Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen einfacher Steatose („simple steatosis“, SS) und nicht-alkoholischer Steatohepatitis („non-alcoholic steatohepatitis“, NASH). Es wurde festgestellt, dass die Menge des vom NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe eines Säugetiers, insbesondere eines Menschen, der an einfacher Steatose leidet, deutlich niedriger ist als in der Probe eines Säugetiers derselben Art, das an nicht-alkoholischer Steatohepatitis leidet. Die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe, die von einem Säugetier erhalten wurde, das an einfacher Steatose leidet, ist mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 25% niedriger als bei einer Probe von einem Säugetier der gleichen Art, das an nichtalkoholischer Steatohepatitis leidet. Einfache Steatose kann bei einem Säugetier, insbesondere bei einem Menschen, diagnostiziert werden, wenn die Menge des vom NOG-Gen in der Probe kodierten Produkts zwischen 3 und 7 pmol/l, vorzugsweise zwischen 4 und 6 pmol/l liegt. Nichtalkoholische Steatohepatitis kann bei einem Säugetier diagnostiziert werden, wenn die Menge des vom NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe zwischen 7,5 und 11 pmol/l liegt, vorzugsweise zwischen 8 und 10 pmol/l.
[0008] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Überwachen des Fortschritts einer Lebererkrankung oder der Behandlung einer Lebererkrankung bei einem Säugetier, umfassend den Schritt des Bestimmens der Menge eines Produkts, das durch das NOG-Gen kodiert wird, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit des Säugetiers.
[0009] Da der Gehalt eines Produkts, das durch das NOG-Gen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Säugetiers kodiert wird, durch den Gesundheitszustand der Leber beeinflusst wird, kann die Konzentration des NOG-Genprodukts direkt zur Überwachung des Fortschritts einer Lebererkrankung oder ihrer Behandlung verwendet werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
[0010] Fig. 1A zeigt den Serum-Noggin-Spiegel (Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts) bei Patienten mit SS, NASH und Kontrollen. Die Serum-Noggin-Werte waren bei SS- und NASH-Patienten viel niedriger als bei Kontrollen (p für Trend = 0,040), ohne zwischen SS- und NASH-Patienten unterschiedlich zu sein. *: p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe
[0011] Fig. 1B zeigt Serum log(Noggin Spiegel) (Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts) bei NAFLD-Patienten, die zufällig einer Vitamin-E-Monotherapie oder einer kombinierten Spironolacton- und Vitamin-E-Therapie zugeordnet sind. Die Noggin-Werte stiegen in beiden Gruppen im zweiten Monat ähnlich an und blieben danach bis zum Ende der Studie stabil. *: p < 0,05 im Vergleich zu den Basislinien-Noggin-Werten.
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
[0012] "Diagnostizieren" und "Diagnose", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Methoden, mit denen ein Fachmann schätzen und bestimmen kann, ob ein Säugetier an einer bestimmten Krankheit oder einem bestimmten Zustand leidet oder nicht. Diese Diagnose wird auf der Grundlage eines Biomarkers gestellt, dessen Menge (einschließlich Anwesenheit oder Abwesenheit) auf das Vorhandensein, die Schwere oder das Fehlen des Zustandes hinweist.
[0013] "Lebererkrankung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jeden pathologischen Zustand der Leber, der ihre Funktion beeinflusst.
[0014] "Ein vom NOG-Gen kodiertes Produkt", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf
MRNA-Moleküle, Peptide, Polypeptide, Proteine und Fragmente davon, die aus der kodierenden Region des NOG-Gens transkribiert oder translatiert werden.
[0015] Das "NOG-Gen" kodiert für ein Protein namens Noggin (UniProtKB - Q13253), das an der Entwicklung vieler Körpergewebe beteiligt ist, darunter Nervengewebe, Muskeln und Knochen. Es ist bekannt, dass Noggin mit Mitgliedern einer Gruppe von Proteinen interagiert, die als knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) bezeichnet werden. BMPs helfen, die Entwicklung von Knochen und anderen Geweben zu kontrollieren.
[0016] Noggin ist ein sekretiertes homodimeres Glykoprotein, das ein Antagonist der knochenmorphogenetischen Proteine („bone morphogenic proteins“, BMPs) ist. Humane Noggin cDNA kodiert ein 232 Aminosäure (aa) Vorläuferprotein (UniProtKB - Q13253; SEQ ID No. 1); die Spaltung eines 27 aa Signalpeptids erzeugt das 205 aa reife Protein, das einen N-terminalen sauren Bereich, ein zentrales basisches Heparin-bindendes Segment und eine C-terminale Cystein-Knotenstruktur enthält. Bisher wurde NOGGIN im Bereich der Verbreitung von Tumorzellen in den Knochen, der ankylosierenden Spondylitis oder der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) untersucht, jedoch nicht bei einer Pathologie der Leber. Uberraschenderweise fanden die Erfinder einen starken Zusammenhang mit einer sehr häufigen Form der Lebererkrankung.
[0017] SEQ ID Nr. 1 (UniProtKB - Q13253):
MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGGOQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDPIF DPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGAAGGAEDLAELDQ LLRORPSGAMPSEIKGLEFSEGLAQGKKORLSKKLRRKLOMWLWSOQOTFCPVL YAWNDLGSRFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCOQOR RGGORCGWIPIQYPHSECKCSC
[0018] "Eine Probe eines gesunden Säugetiers", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Referenzprobe, die durch Messung der Menge eines vom NOG-Gen kodierten Produkts bei mindestens einem, vorzugsweise mindestens zwei, noch mehr bevorzugt mindestens fünf, noch mehr bevorzugt mindestens zehn, noch mehr bevorzugt mindestens 20 Säugetiere erhalten wird, die nicht an einer Krankheit leiden, die eine Folge des Noggin-Spiegels ist oder in einem Ungleichgewicht des Noggin-Spiegels resultiert, einschließlich Tumor, Spondylitis ankylosans, pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH), Lebererkrankungen und einer anderen Krankheit. "Gesunde Säugetiere" zeigen keine dokumentierte Pathologie des Lebergewebes. Die Probe des gesunden Säugetiers stammt aus der gleichen Quelle (z.B. Blut, Serum) und dem gleichen Ursprung (z.B. Mensch, Hund, Katze, Pferd) wie die biologische Flüssigkeitsprobe des Säugetiers, die im Hinblick auf Lebererkrankungen untersucht wird.
[0019] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Lebererkrankung diagnostiziert, wenn die Menge des Produkts, das durch das NOG-Gen in der Probe des Säugetiers kodiert wird, signifikant niedriger oder höher ist, vorzugsweise mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 25%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, niedriger oder höher, am bevorzugtesten niedriger, als die Menge des Produkts, die durch das NOG- Gen kodiert wird, das in einer Probe eines gesunden Säugetiers bestimmt wird.
[0020] Eine Lebererkrankung wird diagnostiziert, wenn in einer Probe eines Säugetiers die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts von der Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts in einer Probe eines gesunden Säugetiers abweicht. Es stellte sich heraus, dass ein Unterschied von mindestens 25% auf das Vorhandensein einer Lebererkrankung hinweist.
[0021] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Lebererkrankung diagnostiziert, wenn die Menge des Produkts, das durch das NOG-Gen in der Probe des Säugetiers, insbesondere des Menschen, kodiert wird, niedriger als 12 pmol/l,
vorzugsweise niedriger als 11 pmol/l, noch mehr bevorzugt niedriger als 10 pmol/l, noch mehr bevorzugt niedriger als 9 pmol/l. Die Methoden der vorliegenden Erfindung ermöglichen es, jede Lebererkrankung zu diagnostizieren oder die Behandlung und/oder den Verlauf von Lebererkrankungen zu überwachen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Lebererkrankung jedoch eine hepatische Steatose (Fettlebererkrankung, FLD).
[0022] Die hepatische Steatose (Fettleber) ist gekennzeichnet durch eine intrazelluläre Ansammlung von Lipiden und die anschließende Bildung von Lipidtröpfchen (LD1) im Zytoplasma der Hepatozyten, die mit einer Vergrößerung der Leber (Hepatomegalie) verbunden ist. Wenn die Steatose der Leber weiterhin von einer Entzündung begleitet wird, spricht man von einer Steatohepatitis. Beide pathologischen Zuständen werden unter dem Begriff der alkoholfreien Fettlebererkrankung (NAFLD) zusammengefasst, wenn Alkohol als Hauptursache ausgeschlossen werden kann. So bezieht sich NAFLD sowohl auf die Steatose als auch auf ihre progressiven Stadien (d.h. Steatohepatitis). Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) umfasst die einfache Steatose (SS) und die alkoholfreie Steatohepatitis (NASH), die zu Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom führen kann.
[0023] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Lebersteatose ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), vorzugsweise der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) oder der einfachen Steatose (SS).
[0024] Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das vom NOG-Gen kodierte Produkt Noggin (UniProtKB - Q13253).
[0025] Proteine, Polypeptide und MRNA/cDNA, die für diese Moleküle kodieren, können mit den in der Technik bekannten Methoden bestimmt und/oder quantifiziert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Menge des durch das NOGGen kodierten Produkts durch einen Immunoassay, Ligandenrezeptorassay, Proteinmikroarray, Massenspektroskopieverfahren, Biosensor oder Flüssigkeitschromatographieverfahren bestimmt.
[0026] Besonders bevorzugt werden Verfahren mit Antikörpern oder Fragmenten davon, die in der Lage sind, spezifisch vom NOG-Gen kodierte Produkte zu binden. Daher wird der Immunoassay vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierendem Immunoassay (FIA), enzymgebundenem Immunosorbent-Assay („enzyme-linked immunosorbent assay“, ELISA) mit chromogenem oder luminometrischem Nachweis und Radioimmunoassay (RIA) ausgewählt.
[0027] Besonders bevorzugte Immunoassays verwenden fluoreszenzmarkierte Antikörper. Um die Empfindlichkeit solcher Immunoassays zu erhöhen, können diese Assays auf einer metallverstärkten Fluoreszenz basieren, wie sie beispielsweise in WO 2017/046320 beschrieben ist.
[0028] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe der biologischen Flüssigkeit eine Blut-, Serum-, Plasma-, Urin- oder Speichelflüssigkeitsprobe.
[0029] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Säugetier ein Mensch, Maus, Ratte, Rind, Pferd, Katze oder Hund.
[0030] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Kits zum Bestimmen der Menge eines durch das NOG-Gen kodierten Produkts in einer biologischen Flüssigkeitsprobe zur Diagnose einer Lebererkrankung bei einem Säugetier oder zum Überwachen des Fortschritts einer Lebererkrankung oder der Behandlung einer Lebererkrankung bei einem Säugetier.
[0031] Bevorzugte Kits können Antikörper oder Fragmente davon umfassen, die an das durch das NOG-Gen kodierte Produkt binden, wobei die Antikörper oder Fragmente davon optional auf einem festen Träger immobilisiert sind, und fluoreszierend markierte Antikörper oder Fragmente davon, die an das durch das NOG-Gen kodierte Produkt binden.
[0032] Um die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens zu erhöhen, wird der feste Träger
vorzugsweise zumindest teilweise mit einem Metall, vorzugsweise mit Silber, bedeckt. Besonders bevorzugte feste Träger sind in WO 2017/046320 offenbart.
[0033] Der Kit der vorliegenden Erfindung kann ferner mindestens einen Kalibrator umfassen, der spezifische Mengen an Noggin-Protein enthält, mindestens eine Kontrolle mit einer vordefinierten Menge an Noggin-Protein und/oder mindestens einen Puffer zur Verdünnung von hochauflösenden Proben, eine enzym- oder fluorophormarkierte Noggin-spezifische Antikörperdetektionspräparation und eine Mikroplatte, die mit einem Noggin-spezifischen Fangantikörper beschichtet ist.
[0034] Die mit einem Noggin-spezifischen Fangantikörper beschichtete Mikroplatte umfasst eine Strukturoberfläche und ist zumindest teilweise mit einer Metallbeschichtung gemäß WO 2017/046320 beschichtet.
BEISPIELE
[0035] Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter veranschaulicht, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein.
[0036] BEISPIEL: [0037] Material & Methoden [0038] Patienten und Studiendesign
[0039] Einschlusskriterien für NAFLD ("nonalcoholic fatty liver disease") Patienten waren: 1) Alter >18 Jahre; 2) Ultraschallbildgebung, die Fettleber- und abnormale Leberfunktionstests für mindestens 6 Monate vor der Leberbiopsie anzeigt; und 3) Zustimmung des Patienten zur Leberbiopsie. Alters-, Geschlechts- und Körpermassenindex (BMI) - übereinstimmende Individuen wurden für die Kontrollgruppe rekrutiert, bestehend aus gesunden Individuen, die sich regelmäßig einer Überprüfung für berufliche Bedürfnisse unterzogen haben. Einschlusskriterien für die Kontrollen waren: 1) Alter >18 Jahre; 2) keine Vorgeschichte von abnormalen Leberultraschallbildern oder abnormalen Leberfunktionstests; 3) derzeit normale Leberultraschallbilder und normale Leberfunktionstests. Die Ausschlusskriterien waren für Patienten und Kontrollen gleich und zielten darauf ab, sekundäre Ursachen der Fettleber auszuschließen, einschließlich Medikamente oder Ergänzungen, die möglicherweise die NAFLD betreffen (Polyzos S, et al. Ann Hepatol. 2013;12(5):749- 757).
[0040] Die Studie war eine Ein-Zentrum-Studie, 52-wöchige, offene RCT (randomisierte kontrollierte Studie) mit aktiver Kontrollgruppe. Das RCT bestand aus dem Screening-Besuch, dem Basisbesuch („baseline visit“) und drei weiteren Besuchen während der Behandlungsphase (Besuch 2: Woche 8; Besuch 3: Woche 26; und Besuch 4: Woche 52).
[0041] Berechtigte NAFLD-Patienten wurden randomisiert, um 52 Wochen lang per os Vitamin E (400 IE/Tag in zwei gleichen Dosen; Gruppe 1) oder Spironolacton (25 mg einmal täglich) plus Vitamin E (400 IE/Tag in zwei gleichen Dosen; Gruppe 2) zu erhalten. Die Randomisierung wurde mit Excel (Microsoft Corp.) durchgeführt und die Zuordnung zur Behandlung erfolgte wie in Polyzos SA et al. beschrieben (Diabetes Obes Metab. 2017;19(12):1805-1809).
[0042] Analytische Methoden
[0043] Anthropometrische Daten (Gewicht, Größe, Taillenumfang) wurden aufgezeichnet und bei allen Besuchen wurden am Morgen (8-9 Uhr) nüchtern Serumproben entnommen. Labortests für die Leberfunktion (z.B. Aspartat-Transaminase (AST), Alanin-Transaminase (ALT), Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT)) und den Glukosestoffwechsel (z.B. Glukose, Insulin) wurden mit Standardmethoden unter Verwendung automatisierter Analysatoren durchgeführt, wie bereits beschrieben (siehe Polyzos SA et al. Diabetes Obes Metab). 2017;19(12):18051809; und Polyzos S, et al. Ann Hepatol. 2013;12(5):749-757).
[0044] Die Serumkonzentration von Noggin wurde mit einem hochempfindlichen fluoreszierenden Immunoassay auf Basis von plasmonischen Mikrotiterplatten gemessen (FluoBolt'“-Nog-
gin; Fianostics GmbH, Österreich), der das Signal von Fluoreszenzfarbstoffen, wie in Hawa G et al. beschrieben (Anal Biochem. 2018 May 15;549:39-44), um das Hundertfache erhöht. Dieser Assay weist freie, bioaktive menschliche Noggin nach, die nicht an BMPs gebunden ist. Kurz gesagt, beinhaltet das Testprotokoll: adsorptive Beschichtung des Capture-Antikörpers in 50 mM Phosphatpuffer (PBS)/ 150 mM NaCl pH 7.4, über Nacht bei 4°C, gefolgt vom Waschen mit PBS mit 0,1% Triton X-100. Die Blockade unspezifischer Bindungen wurde mit einer proprietären Lösung von FIANOSTICS erreicht, die synthetische Polymere und Mercapto-Verbindungen enthält. Nach einem weiteren Waschschritt wurden 20 ul Duplikate von Standards/Proben (Serum) zusammen mit 25 ul eines mit AlexaFluor680 markierten anti-humanen Noggin-Antikörpers über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Messungen wurden mit einem Standard-Fluoreszenzmikroplattenleser durchgeführt. Proben, die über 100 pmol/l Noggin lagen, wurden mit Assaypuffer verdünnt und erneut ausgeführt, um die Linearität des Signals zu überprüfen. Der Variationskoeffizient (CV) zwischen den Assays betrug 2-7% und der Intraassay CV 4-10%.
[0045] Die Leberbiopsie wurde bei allen NAFLD-Patienten unter Computertomographie-Leitung durchgeführt und nach den Kriterien des Clinical Research Network (Kleiner DE, et al. Hepatology) der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) interpretiert. 2005;41(6):1313-1321).
[0046] Body Mass Index (BMI), Homöostasemodell des Assessment-IR (HOMA-IR), NAFLD Leberfettwert und AST-to-Platelet Ratio Index (APRI) wurden wie zuvor beschrieben berechnet (siehe Polyzos SA et al. Diabetes Obes Metab. 2017;19(12):1805-1809). NAFLD LeberfettScore und APRI wurden zuvor aus vier nicht-invasiven Indizes der Lebersteatose und fünf nicht-invasiven Indizes der Leberfibrose ausgewählt, weil sie am besten zu den jeweiligen histologischen Ergebnissen der Baseline passten, speziell für dieses RCT.
[0047] Statistische Analyse
[0048] Kontinuierliche Daten werden als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes dargestellt (SEM). Kolmogorov-Smirnov-Test wurde verwendet, um die Normalität der Verteilungen von kontinuierlichen Variablen zu überprüfen. Im Abschnitt Fall-Kontrolle wurde Chi-Quadrat oder exakter Test nach Fischer für Vergleiche zwischen kategorischen Variablen verwendet. Der Spearman-Koeffizient (rs) wurde für bivariate Korrelationen verwendet. Unabhängige Stichproben T-Test oder Mann- Whitney-Test wurden für Vergleiche zwischen zwei Gruppen von kontinuilerlichen Variablen verwendet. Einweganalysen der Varianz (ANOVA) oder Kruskal-WallisTests wurden für Vergleiche von mehr als zwei Gruppen kontinuierlicher Variablen verwendet. Die Einweg-Analyse der Kovarianz (ANCOVA) wurde zur Anpassung an potenzielle Störfaktoren verwendet. Multiple lineare Regressionsanalysen wurden verwendet, um unabhängige Partner von Noggin zu untersuchen.
[0049] Im RCT-Bereich wurde die bidirektionale ANOVA verwendet, um Trends für Unterschiede innerhalb der Probanden, zwischen den Probanden und innerhalb der variablen*zeitlichen Interaktion, unangepasst oder angepasst (bidirektionale ANCOVA) für potenzielle Störfaktoren zu identifizieren. Die Annahme der Kugelgestalt wurde mit Mauchlys Kugelgestaltstest getestet. Die Bonferroni-Korrektur wurde, falls erforderlich, für mehrere Paarvergleiche verwendet. Die Daten der RCT wurden mittels Intention-to-Treat-Analyse analysiert.
[0050] Variablen, die nicht normalverteilt waren, wurden logarithmisch transformiert, bevor sie in Tests eingegeben wurden, die die Annahme von Normalverteilungen erfordern. Die Signifikanz wurde auf p<0,05 (zweiseitig) festgelegt. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 21.0 für Macintosh (IBM Corp., Armonk, NY) durchgeführt.
[0051] Ergebnisse [0052] Fall-Kontrollbereich
[0053] Einunddreißig Patienten mit histologisch bestätigtem NAFLD (15 mit SS, 16 mit Grenzlinie oder definitivem NASH) und 24 Kontrollen wurden in diesen Abschnitt aufgenommen. Wie speziell ausgewählt, gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen in Geschlecht, Alter,
BMI und Taillenumfang. AST, ALT, GGT, Glukose, Insulin und HOMA-IR waren zwischen den Gruppen statistisch unterschiedlich, mit höheren Trends in der NASH-Gruppe.
[0054] Die Noggin-Werte waren in der gesamten NAFLD-Gruppe (n=31; 7,4 + 1,5 pmol/l) niedriger als in der Kontrollgruppe (n=24; 13,7 + 2,7 pmol/l; p=0016). Ebenso waren die NogginWerte bei SS (5,8 + 1,5 pmol/l) und NASH (8,7 + 2,4 pmol/l) Patienten niedriger als bei den Kontrollen (13,7 + 2,7 pmol/l; p für Trend=0,040) (siehe Fig. 1A). Nach sequentieller Anpassung für Alter (Modell 1), Alter und Geschlecht (Modell 2), Alter, Geschlecht und log(ALT) (Modell 3), Alter, Geschlecht, log(ALT) und Taillenumfang (Modell 4), Alter, Geschlecht, log(ALT), Taillenumfang und log(HOMA-IR) (Modell 5) blieb log(noggin) zwischen den Gruppen signifikant unterschiedlich (Tabelle 1).
Tabelle 1. Nicht angepasste und angepasste Vergleichsdaten zwischen Patienten mit SS, Grenz- und definitivem NASH und Kontrollen.
Kontrollen SS NASH PA SrEI0r Unangepasst Log(noggin; 0.55 + 0.68 + pmol/l) 0.96 + 0.09 0.122 0.13 0.028 Modell 1 Log(noggin; 0.55 + 0.68 + pmol/l) 0.96 + 0.10 0.13? 0.12 0.030 Modell 2 Log(noggin; 0.55 + 0.68 + pmol/l) 0.95 + 0.10 0.13? 0.12 0.039 Modell 3 Log(noggin; 0.51 + 0.55 + pmol/l) 1.06 + 0.12 0.13° 0.14 0.015 Modell 4 Log(noggin; 0.50 + 0.70 + pmol/l) 1.02 + 0.11 0.13° 0.15 0.020 Modell 5 Log(noggin; 0.52 + 0.69 + pmol/l) 0.99 + 0.11 0.132 0.16 0.046
Die Daten werden als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für unangepasste Werte und als geschätzter marginaler Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für angepasste Werte dargestellt. a: p<0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe (Bonferroni Post-hocAnpassung) Modell 1: Anpassung an das Alter; Modell 2: Anpassung an Alter und Geschlecht; Modell 3: Anpassung an Alter, Geschlecht und log(ALT); Modell 4: Anpassung an Alter, Geschlecht, log(ALT) und Taillenumfang; Modell 5: Anpassung an Alter, Geschlecht, log(ALT), Taillenumfang und log(HOMA- IR).
Abkürzungen: ALT, Alanin-Transaminase; HOMA-IR, homöostatische Modellbewertung Insulinresistenz; NASH, nicht-alkoholische Steatohepatitis; SS, einfache Steatose;.
[0055] Bei Patienten (n=31) waren die Nogginwerte zwischen den Gruppen mit unterschiedlichem Steatosegrad, Portal- und Lappenentzündung, Ballonierung und Fibrose nicht unterschiedlich.
[0056] RCT-Bereich
[0057] Einunddreißig NAFLD-Patienten (15 mit SS und 16 mit NASH) wurden zufällig der Gruppe 1 (n=17; 11 Frauen) oder der Gruppe 2 (n=14; 12 Frauen) zugeordnet. An der Baseline waren die beiden Gruppen für alle Parameter ähnlich und es gab keine Unterschiede bei Nebenwirkungen während der Behandlung.
[0058] Die Log(noggin)-Werte stiegen nach der Behandlung in beiden Gruppen gleichermaßen an (Gruppe 1; Basislinie: 0,66 + 0,13; Monat 2: 0,98 + 0,09; Monat 6: 1,03 + 0,07; Monat 12: 1,02 + 0,07 pmol/l und Gruppe 2; Basislinie 0,58 + 0,13; Monat 2: 0,82 + 0,10; Monat 6: 0,82 + 0,11; Monat 12: 0,83 + 0,11 pmol/l; Fig. 1B). Genauer gesagt, war log(noggin) zwischen den Gruppen nicht unterschiedlich (p=0,20), sondern stieg innerhalb der Gruppen im Laufe der Zeit an (p<0,001). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Gruppe*Zeit Interaktion (p=0,62). Nach Korrektur für Mehrfachvergleiche stieg log(noggin) im Monat 2 (p=0,008 im Vergleich zur Baseline) signifikant an und blieb im Monat 6 (p=0,005 im Vergleich zur Baseline) und 12 (p=0,001 im Vergleich zur Baseline) ohne weitere Erhöhung stabil (siehe Fig. 1B).
[0059] Diskussion
[0060] Niedrigere Noggin-Werte wurden erstmals in NAFLD (SS und NASH) gezeigt. Der Nogginspiegel stieg nach einer zweimonatigen Behandlung mit Vitamin E-Monotherapie oder der Kombination von Spironolacton und Vitamin E ähnlich an, vermutlich aufgrund der Wirkung von Vitamin E.
[0061] Da die Pathogenese von NAFLD multifaktoriell ist, kann eine Kombinationstherapie anstelle einer Monotherapie effektiver sein, wenn sie gleichzeitig auf mehr als einen pathogenen Faktor abzielt. Der Zusatz von Spironolacton zu Vitamin E erhöhte jedoch nicht weiter das Noggin. Obwohl das Noggin durch Vitamin E erhöht wird, war seine Veränderung nicht mit Veränderungen der Indizes der hepatischen Steatose und der Indizes verbunden, was bedeutet, dass es sie nicht beeinflusst.
[0062] Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei NAFLD-Patienten niedrigere NogginWerte beobachtet wurden als bei Kontrollbersonen, und die Noggin-Werte stiegen ähnlich an, nachdem eine kombinierte niedrig dosierte Spironolacton plus Vitamin E oder Vitamin EMonotherapie bei NAFLD-Patienten durchgeführt wurde.
Dee AT 521 641 B1 2020-07-15
SECLTXT SEQUENCE LISTING <> Fianasties GmDH 120% VERFAHREN ZUR DIAGNOSE EINER LEBERERKRANKUNG <130> Z3FR-AT 1 e <170x PatentIn versten 3. R 210» 21 aRiis 332 212 PRT , HOMO Saplens <400> Met alu Ärg Cys Pro Ser Leu Giy val Thr Leu Tyr Alla Leu Val val 1 5 30 35 Val ven 6ly Leu Arg Ala Thr Pro Ala Gly Giy Gin MiS Tyr Leu HIER 20 25 30 Ile Arg Pra Ala Pro Ser Asp Asrn Leu PFO LEU Val An Leu ie Glu 35 40 45 Sr ss + His Pro Asa Pro Ile Phes Asp Pro Lys Glu LyS ASP LeU ASn Gi Thr 50 35 60 13 Leu Leu Arg Ser Leu Leit GiV Gly His Tr Asp Pro Sy ehe Mer Ala 65 70 7 Fü Yhr Ser Pro Pro clu Asb Arg Pra 6ly Gly Giy Gly Gly Alla Aa G1y 85 GO as Giy Ala Glu Asp Leu Alı Glu Leu Asp Sin Leu Leu APG Gin Arg Pro 100 105 430 Ser Gly Ala Mer Pro Ser Glu Ile LYS giy Leu Giy She Ser Glu GLy 135 320 125 Cey Alla Gin aly Lys Lys Gln Arg Leu Ser LyS Lys Leu Arg APB L)S 130 135 140 Lay Glm Met Trg LAU Trp Ser Gin Thr Phe CyS PFS Val Leu Tyr Ala 1453 150 3155 160 Trg Ash Asp Leu Gly Ser Arg FPhe Trp FO Arg Yyrr Val uıys Val Siy 165 170 173 ser Cys Phe Ser LyS Arg Ser Cys Ser wat Pro alu Giy Met Val Cys 180 185 150 Seite 1
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Claims (16)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose einer Lebererkrankung bei einem Säugetier, umfassend den Schritt des Bestimmens der Menge eines durch das NOG-Gen kodierten Produkts in einer biologischen Flüssigkeitsprobe des Säugetiers und der Diagnose einer Lebererkrankung, wenn die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe des Säugetiers von der Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts abweicht, die in einer Probe eines gesunden Säugetiers bestimmt wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Lebererkrankung diagnostiziert wird, wenn die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe des Säugetiers signifikant niedriger oder höher ist, vorzugsweise mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, niedriger oder höher, verglichen mit der Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts, die in einer Probe eines gesunden Säugetiers bestimmt wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Lebererkrankung diagnostiziert wird, wenn die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts in der Probe einer Säugetier-, vorzugsweise menschlichen Probe, niedriger als 12 pmol/l, vorzugsweise niedriger als 11 pmol/l, noch mehr bevorzugt niedriger als 10 pmol/l, noch mehr bevorzugt niedriger als 9 pmol/l ist.
4. Verfahren zum Überwachen des Fortschritts einer Lebererkrankung oder der Behandlung einer Lebererkrankung bei einem Säugetier, umfassend den Schritt des Bestimmens der Menge eines Produkts, das durch das NOG-Gen kodiert wird, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit des Säugetiers.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lebererkrankung eine hepatische Steatose (Fettlebererkrankung, FLD) ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die hepatische Steatose ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD), vorzugsweise nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) oder einfache Steatose (SS).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das durch das NOG-Gen kodierte Produkt Noggin ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Menge des durch das NOG-Gen kodierten Produkts durch einen Immunoassay, Ligandenrezeptorassay, Proteinmikroarray, Massenspektroskopieverfahren, Biosensor oder Flüssigkeitschromatographieverfahren bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Immunoassay ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierendem Immunoassay (FIA), enzymgebundenem Immunosorbentassay (ELISA) mit chromogenem oder luminometrischem Nachweis und Radioimmunoassay (RIA).
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Blut-, Serum-, Plasma-, Urin- oder Speichelflüssigkeitsprobe ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Säugetier ein Mensch, Maus, Ratte, Rind, Pferd, Katze oder Hund ist.
12. Verwendung eines Kits zum Bestimmen der Menge eines Produkts, das durch das NOGGen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit kodiert wird, zur Diagnose einer Lebererkrankung bei einem Säugetier oder zum Uberwachen des Fortschritts einer Lebererkrankung oder der Behandlung einer Lebererkrankung bei einem Säugetier.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Kit Antikörper oder Fragmente davon umfasst, die an das durch das NOG-Gen kodierte Produkt binden, wobei die Antikörper oder Fragmente davon optional auf einem festen Träger immobilisiert sind, und fluoreszierend markierte Antikörper oder Fragmente davon, die an das durch das NOG-Gen kodierte Produkt binden.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der feste Träger zumindest teilweise mit einem Metall, vorzugsweise mit Silber, bedeckt ist.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Kit ferner mindestens einen Kalibrator, der spezifische Mengen an Noggin-Protein enthält, mindestens eine Steuerung mit einer vordefinierten Menge an Noggin-Protein und/oder mindestens einen Puffer zur Verdünnung von hochauflösenden Proben, eine enzym- oder fluorophormarkierte Nogginspezifische Antikörperdetektionspräparation und eine mit einem Noggin-spezifischen Fangantikörper beschichtete Mikroplatte umfasst.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die mit einem Noggin-spezifischen Fangantikörper beschichtete Mikroplatte eine Strukturoberfläche umfasst und zumindest teilweise mit einer Metallbeschichtung bedeckt ist.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
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