DE69630131T2 - Verfahren zur bestimmung des aggregationsgrades des beta a4-peptids - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des aggregationsgrades des beta a4-peptids Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Aggregationsgrades des βA4-Peptids und insbesondere zum Nachweis des Proteins durch Reaktion des Proteins mit einem geeigneten Bindungsreagens und Messen der Menge an so erhaltenem nicht umgesetztem Bindungsreagens.
  • 2. Diskussion des Standes der Technik
  • Es ist bekannt, dass das Gehirn von Patenten mit Alzheimer Krankheit Aggregate oder Klumpen eines kleinen Fragmentes des beta-amyloiden Vorläuferproteins enthält; wobei das Fragment als das amyloide beta-Peptid oder das βA4-Peptid bekannt ist. Die Sequenz des 42-mer-βA4-Peptids ist Aspartat-Alanin-Glutamat-Phenylalanin- Arginin-Histidin-Aspartat-Serin-Glycin-Tyrosin-Glutamat-Valin-Histidin-Histidin- Glutamin- Lysin-Leucin-Valin-Phenylalanin-Phenylalanin-Alanin-Glutamat-Aspartat-Valin-Glycin-Serin-Asparagin-Lysin-Glycin-Alanin-Isoleucin-Isoleucin-Glycin-Leucin-Methionin-Valin-Glycin-Glycin-Valin-Valin-Isoleucin-Alanin. (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA).
  • Zur allgemeinen Diskussion des βA4-Peptids und der Alzheimer Krankheit wird auf Dennis J. Selko, Scientific American, November 1991, 68–78 und Joseph T. Jarrett et al., Cell 73 (1993), 1055–1058 verwiesen.
  • Eine mögliche Behandlung zur Bekämpfung des Fortgangs der Alzheimer Krankheit liegt in der Verwendung eines Arzneimittels, das einen aktiven Inhaltsstoff enthält, welcher die Aggregation oder Verklumpung des βA4-Peptids verhindert. Daher wird ein Screening-Test zur Identifizierung eines derartigen aktiven Inhaltsstoffes oder wirksamen chemischen Stoffes benötigt.
  • Verschiedene Tests zum Nachweis von Proteinen an sich sind im Stand der Technik bekannt. Ein derartiger Test verwendet Bradford-Farbstoff, das auch als Coomassie-Brilliantblau G-250 bekannt ist. In diesem Zusammenhang wird auf J. James Sedmack et al., Analytical Biochemistry 79 (1977), 544–552 verwiesen. Dort wird ein Test beschrieben, ob Proteine, nicht jedoch speziell das A4-Peptid, in aggregiertem oder freiem Zustand vorliegen.
  • G. Johnson et al. offenbaren in WO95/05604, veröffentlicht am 23. Februar 1995, ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit. Das Verfahren setzt einen einzigartigen Satz an Proteinen ein, die bezüglich ihrer Konzentration in Patienten mit Alzheimer Krankheit als verändert vorgefunden wurden. Die Erfindung von Johnson et al. betrifft auch diese Proteine und entsprechende Antikörper. Kits, die im diagnostischen Test eingesetzt werden können, sind ebenfalls offenbart.
  • Erforderlich und gewünscht ist ein Test für das βA4-Peptid, der dieses Protein in aggregiertem Zustand vom freien oder nicht-aggregierten Stadium unterscheidet und die Wirkung verschiedener Wirkstoffe auf dieses Aggregationsstadium wiederspiegelt. Diesbezüglich, vgl. H. LeVine, Protein Science 2 (1993), 404–410, der den Nachweis von aggregiertem Amyloid unter Verwendung von Thioflavin T beschreibt.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 beschreibt den Grad der Nicht-Aggregation des βA4-Peptids in Abhängigkeit von der Zeit.
  • 2 beschreibt den Grad der Nicht-Aggregation des βA4-Peptids als messbares Merkmal des Grades an Nicht-Aggregation.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Aggregationsgrades des βA4-Peptids und insbesondere ein Verfahren, das die Reaktion des Proteins mit einem Bindungsagens umfasst, das das βA4-Peptid nur im nicht-aggregierten Zustand binden kann, wodurch eine Menge an βA4-Peptid gebundenem Bindungsreagens gebildet wird. Die Menge an so umgesetzten Bindungsreagens wird dann gemessen.
  • Genaue Beschreibung
  • Es ist bekannt, dass das Gehirn von Patienten mit Alzheimer Krankheit im Vergleich zum Gehirn von Menschen, die nicht unter der Alzheimer Krankheit leiden, ein amyloides Protein von 39–42 Aminosäuren aufweist, das unter der Bezeichnung βA4-Peptid bekannt ist. Dieses Protein verklumpt oder bildet Aggregate im Gehirn von Patienten mit Alzheimer Krankheit. Das aggregierte Protein mag daher für die Zerstörung normaler Hirnzellen verantwortlich sein. Sobald die abtötenden Verklumpungen oder Aggregate sich bilden, ist deren Bildung nahezu irreversibel. Demgemäss liegt eine mögliche Behandlung der Alzheimer Krankheit in der Behandlung eines Patienten mit einem Stoff oder Arzneimittel, der/das die Verklumpung oder Aggregation des βA4-Peptids verhindert.
  • Es ist berichtet worden, dass mögliche Stoffe für die Behandlung der Alzheimer Krankheit durch einen Screening-Test identifiziert werden können, der anzeigt, ob die als Kandidaten ausgewählten Stoffe die Aggregation des βA4-Peptids in vitro verhindern oder nicht.
  • Ein Bindungsreagens wird selektioniert. Das Bindungsreagens reagiert selektiv mit dem nicht aggregierten amyloiden Peptid, d. h. dem βA4-Peptid, nicht jedoch mit dem auszuwählenden in Frage kommenden Stoff und weist in der umgesetzten Form, d. h. nach Umsetzung mit dem Peptid eine nachweisbare Eigenschaft auf, z. B. eine Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge. Die Erfindung offenbart die Verwendung eines Bindungsreagens umfassend Coomassie Brilliantblau G-250. Ein besonders geeignetes Bindungsreagens ist der Bradford-Farbstoff. Der Bradford-Farbstoff ist Coomassie Brilliantblau G-250. Bradford-Farbstoff oder Coomassie-Blaufarbstoff wird von M. Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976), 248; A. H. Reisner et al., Anal. Biochem. 64 (1975), 509; S. Fazekas de St. Groth, et al. Biochim. Biophys. Acta 71 (1963), 377 und J. J. Sedmack et al., Anal. Biochem. 79 (1977), 544 beschrieben und ist käuflich als Standardreagens erwerbbar (z. B. „Protein Assay Dye Reagent"-Konzentrat von Bio-Rad Life Science Group, Hercules, Kalifornien). Dieser Farbstoff reagiert nur mit nicht-aggregiertem βA4-Peptid und nicht mit wie auch immer gearteten Aggregaten dieses amyloiden Peptids.
  • Wie vorstehend dargestellt, wurde der Bradford-Farbstoff von Marion M. Bradford in Analytical Biochemistry 72 (1976), 248–254 als 0,01% (Gew./Vol.) Coomassie Brilliantblau G-250, 1,7% (Gew./Vol.) Äthanol und 8,5% (Gew./Vol.) Phosphorsäure beschrieben. Das Proteintest-Farbstoffreagens-Konzentrat, käuflich zu erwerben von Bio-Rad unter der Katalognummer 500-0006, ist eine modifizierte Version des Bradford-Farbstoffs mit etwa 0,04 (Gew./Vol.) Coomassie Brilliantblau G-250, gelöst in 25% Methanol, 50% Phosphorsäure und 25% Wasser. Die Modifikationen belassen ihn in Folge des verminderten Anteils an Phosphorsäure stabiler, länger haltbar und biologisch weniger gefährlich, ohne dass seine Proteinbindungseigenschaften negativ beeinflusst werden. Er ist auch in der Form eines Kits nach einem von zwei Standards, nämlich Kit I (mit Rinder-Gammaglobulin), Katalognummer 500-0001 oder als Kit II (mit Rinder-Serumalbumin), Katalognummer 500-0002 verfügbar.
  • In der Praxis wird eine bekannte Konzentration des amyloiden Peptids, d. h. des A4-Peptids in seiner nicht-aggregierten Form präpariert. Das βA4 amyloide Peptid ist in seiner nicht-aggregierten Form durch Peptidsynthese unter Verwendung eines üblichen Peptidsynthesegerätes erhältlich, z. B. eines Peptidsynthesegerätes Modell 9050 von MILLIPORETM . Beispielsweise werden 10 Milligramm Peptid in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Acetonitril bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 20 bis 25°C gelöst, wodurch eine Stammlösung erhalten wird, die z. B. 2500 mM sein kann. Die Stammlösung wird üblicherweise in phosphatgepufferter Saline (pH 7,4) verdünnt, wobei die Verdünnung zehnfach sein kann, wodurch eine Kontrolllösung erhalten wird, die z. B. 250 mM sein kann. Ein erstes Aliquot, z. B. 16 mL der Kontrolllösung wird, typischerweise mit 144 mL der phophatgepufferten Saline eingesetzt und mit üblicherweise 25 mL eines geeigneten Bindungsreagens, z. B. dem Bradford-Farbstoff umgesetzt. Hierdurch wird das Bindungsreagens mit dem nicht-aggregierten amyloiden Protein umgesetzt, wodurch eine erste Konzentration oder Menge von umgesetztem Bindungsreagens gebildet wird. Die Umsetzung mit dem Bindungsreagens wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das Bindungsreagens selektiv nur an das nicht-aggregierte Protein bindet. Dementsprechend werden die Reaktionsbedingungen durch das bestimmte, eingesetzte Bindungsreagens und durch die zu messende Bindungseigenschaft vorgegeben. Wenn beispielsweise der Bradford-Farbstoff eingesetzt wird, wird die Bindungsreaktion üblicherweise bei einer Temperatur von 20 bis 25°C für 5 bis 15 Minuten in einem neutralen oder schwach basischen Milieu bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,4 durchgeführt.
  • Es sollte vermerkt werden, dass die erste Konzentration oder Menge an proteingebundenem Bindungsreagens durch ein geeignetes Nachweismittel gemessen wird, das von der Eigenschaft abhängt, welche von dem umgesetzten Bindungsreagens gezeigt wird, z. B. einen Absorptionswert von 0,7 bei einer Wellenlänge von 595 nm für den Bradford-Farbstoff, wodurch ein erster Wert X1 erhalten wird.
  • Dann wird ein zweites Aliquot der Kontrolllösung ausgewählt. Da die Aggregation des βA4-Peptids über einen gewissen Zeitraum hinweg erfolgt, wird das zweite Aliquot bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise etwa 37°C, über einen geeigneten Zeitraum hinweg, z. B. 24 bis 72 Stunden inkubiert, wodurch es Aggregate bildet. Anschließend wird das Bindungsreagens zugegeben. Dieses reagiert nur mit dem nicht-aggregierten amyloiden Peptid, wodurch eine zweite Konzentration oder Menge an proteingebundenem oder umgesetztem Bindungsreagens gebildet wird. Die aggregierte Konzentration oder Menge des amyloiden Peptids reagiert nicht mit dem Bindungsreagens und wird daher nicht nachgewiesen und gemessen. Wiederum wird die Menge an proteingebundenem Bindungsreagens gemessen, beispielsweise durch Absorptionsspektroskopie bei Raumtemperatur bei einer geeigneten Wellenlänge, z. B. 595 nm beim Bradford-Farbstoff. Hierdurch wird ein zweiter Wert X2 erhalten, der die Menge an Bindungsreagens darstellt, die mit der nicht-aggregierten Menge an βA4-Peptid umgesetzt wurde.
  • Mit zunehmender Aggregationsbildung verhält sich die Konzentration des proteingebundenen oder umgesetzten Bindungsreagens invers zum Grad der vonstatten gegangenen Aggregation. Entsprechend ist der zweite Wert X2 kleiner als X1, was anzeigt, dass das A4-Peptid zu einem gewissen Grad aggregiert ist.
  • Für die Zwecke eines qualitativen Absuchens auf Alzheimer Kandidatenstoffe wird der Kontrolllösung ein drittes gleiches Aliquot entnommen. Das dritte Aliquot wird wiederum unter geeigneten Bedingungen in Gegenwart eines in Frage kommenden Stoffes, beispielsweise 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wird das geeignete Bindungsreagens, z. B. der Bradford-Farbstoff zugegeben und die so erhaltene Lösung bzw. das so erhaltene Gemisch wird, z. B. spektroskopisch mit einem üblichen Spektrophotometer vermessen, wodurch ein Wert für gebundenes Bindungsreagens erhalten wird. Sofern der Kandidatenstoff keine anti-Aggregationswirkung aufweist, wird der gemessene Wert X3 etwa gleich gross sein wie der zweite Wert X2. Falls andererseits der dritte Wert X3 eine Erhöhung gegenüber dem Wert X2 um dreißig bis vierzig Prozent (30–40%) darstellt, wird der Kandidatenstoff als Stoff betrachtet, der die Aggregation des amyloiden Peptids inhibiert.
  • Bei der Durchführung der vorstehend genannten Screening-Tests sollte sich die Konzentration von amyloidem Peptid zu ausgewähltem Bindungsreagens üblicherweise im Bereich von 1500 bis 1800 (amyloides Peptid/Bindungsreagens) bewegen. Die Konzentration von amyloidem Peptid zu Kandidatenstoff sollte sich üblicherweise im Bereich von 4- bis 40-fach (Kandidatenstoff/amyloides Peptid) bewegen.
  • Der Aggregationsgrad kann quantitativ auf folgende Weise bestimmt werden. Gleiche Aliquots der Kontrolllösung werden zunächst über verschiedene Zeiträume inkubiert. Mit der Zunahme der Zeit erhöht sich der Aggregationsgrad. Das Bindungsreagens, z. B. der Bradford-Farbstoff, wird nach jedem Zeitraum zugegeben und die entsprechende Messung gemacht, z. B. eine Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm für den Bradford-Farbstoff. Anschließend wird die Konzentration oder der Prozentsatz von aggregiertem amyloidem Protein zu nicht-aggregiertem amyloidem Protein für jeden Zeitraum bestimmt. Das Bindungsreagens misst das nicht-aggregierte (oder aggregierte) Protein. Die Menge an aggregiertem β-Amyloid wird durch Subtraktion dieser Zahl von frischem Protein (nicht aggregiert, X1) berechnet und als Prozentsatz dargestellt. Ein lineares inverses Diagramm des Prozentsatzes an aggregiertem Peptid wird über verschiedene Zeiträume hinweg erhalten, z. B. über 24, 48, 72, 96 Stunden wie typischerweise in 1 dargestellt. Das Verfahren wird wiederholt mit der Ausnahme, dass nach jeder Inkubationsperiode das Bindungsreagens zu dem inkubierten Aliquot zugegeben wird und das so erhaltene Gemisch zur Bestimmung der X-Werte vermessen wird. Eine Korrelation zwischen Aggregation oder Nicht-Aggregation kann so als X-Wert im Verhältnis zum spektroskopisch gemessenen Wert ermittelt werden, z. B. der Absorption einer Wellenlänge bei 595 nm für den Bradford-Farbstoff, wie in 1 dargestellt. Dann wird ein Standarddiagramm der X-Werte zum Prozentwert der Nicht-Aggregation erstellt, wobei der Prozentwert der Aggregation invers erhalten wird, wie in 1 in typischer Weise dargestellt.
  • Die X-Werte für einen bestimmten Kandidatenstoff können dann quantitativ als Prozent Inhibierung der Aggregation durch Vergleich mit der Kontrolle bestimmt werden, wie typischerweise in 2 dargestellt.
  • Beispiel 1
  • β-amyloides (auch bekannt als βA-4) Peptid wurde bei einer Konzentration von 10 mg/ml (oder 2500 μM) in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde justament vor der Zusammenstellung des Versuchsansatzes auf eine 1 mg/ml (oder 250 μM) Stammlösung in phosphatgepufferter Saline (PBS), pH 7,4 verdünnt und zu je 16 μL pro Vertiefung (d. h. in einer Endkonzentration von 25 μM) in einzelne Probenvertiefungen einer Corning-Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Alle Behandlungen wurde dreifach durchgeführt.
  • In diesem Beispiel wurde der in Frage kommende Stoff in drei verschiedenen Konzentrationen (250 μM, 500 μM und 1 mM) in die Testvertiefungen gegeben. Das Gesamtvolumen in jeder Testvertiefung wurde mit PBS auf 160 μL eingestellt. Im Falle nicht behandelter Kontrollvertiefungen wurde dem β-amyloiden Peptid kein Stoff zugegeben und das Gesamtvolumen wurde mit PBS auf 160 μL aufgefüllt. Die Platten wurden mit Parafilm versiegelt und 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
  • Am Ende der Inkubationszeit wurden die Platten herausgenommen und 25 μL des Farbreagens aus dem Bio-Rad Proteintest (Bradford-Farbstoff) wurde allen Vertiefungen mit Proben zugegeben. Auch in diesem Falle wurde eine Standardkurve zur Bestimmung der Absortion bei frischem (auch als nicht-aggregiert betrachtetem) Peptid erstellt. Der Farbstoff wurde durch Pipettieren vermischt und die Platten schnell bei 2500 UpM geschleudert, um Blasen zu entfernen.
  • Die Absorption wurde bei 595 nm in einem Dynatech MR5000 Plattenlesegerät 15 Minuten nach Zugabe des Farbstoffs gemessen. Die prozentuale Abnahme in der Aggregation des β-Amyloids aufgrund der Zugabe des Kandidatenstoffes A41920t, welcher ein 8-mer Peptid der Sequenz Glutamin-Lysin-Leucin-Valin-Threonin-Threonin-Alanin-Glutamat (QKLVTTAE) ist, wurde aus der Differenz zwischen unbehandeltem aggregiertem Peptid und dem behandelten aggregiertem Peptid berechnet. Die prozentuale Abnahme betrug 48,1% bei 250 μM A41920t, 52,44% bei 500 μM und 32,26% bei 1 mM (oder 1000 μM).
  • Beispiel 2
  • Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Wasserstoffperoxid (10 μL einer 30%igen Stammlösung) in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 16 μL der 1 mg/mL β-Amyloid Stammlösung gegeben wurde. Das Endvolumen wurde durch Zugabe von 134 μL PBS in diese Vertiefungen auf 160 μL aufgestockt. Die Platte wurde versiegelt und 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
  • Am Ende des Inkubationszeitraums wurden die Platten herausgenommen und 25 μL des Bio-Rad Proteintest-Farbstoftreagens (Bradford-Farbstoff) wurde in alle Vertiefungen mit den Proben wie in Beispiel 1 zugegeben. Wiederum wurde eine Standardkurve zur Bestimmung der Absortion bei frischem (auch als nicht-aggregiert betrachtetem) Peptid erstellt. Der Farbstoff wurde durch Pipettierung gemischt und die Platten rasch bei 2500 UpM geschleudert, um Blasen zu entfernen.
  • Die Absorption bei 595 nm wurde in einem Dynatech MR5000 Plattenlesegerät 15 Minuten nach Zugabe des Farbstoffs abgelesen. Die Aggregationsmenge wurde bestimmt durch Subtraktion des Hintergrundes und Berechnung der Differenz zwischen den Werten der frischen und der Wasserstoffperoxid behandelten β-Amyloid-Proben. Die Differenz wurde bestimmt als Prozentwert über frisches oder nicht-aggregiertes Peptid. Der Prozentsatz der Aggregation war 97,7% nach 48 Stunden.
  • Beispiel 3
  • Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass anstelle von Wasserstoffperoxid Glucosaminglykan, Pentosanpolysulfat eingesetzt wurde. Der Prozentsatz an gefundener vermehrter Aggregation wurde bei 0,5 μM als 40,8%, bei 5 μM als 57,1% und bei 50 μM als 62,9% bestimmt.
  • Beispiel 4
  • Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass anstelle von A41920t 1-(5'-oxohexyl)-3-methyl-7-propyl-2,6-(1H,3H)-purindion, auch bekannt unter der Bezeichnung Propentofyllin eingesetzt wurde. Der Prozentsatz an gefundener verminderter Aggregation wurde bei 500 μM als 29,68% und bei 1 mM (oder 1000 μM) als 37,4% bestimmt.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00090001
  • Figure 00100001

Claims (2)

  1. Verfahren zur Bestimmung des Aggregationsgrads eines βA4-Peptids (SEQ ID NO: 1), umfassend: (a) Umsetzen einer Probe, die freies βA4-Peptid enthält, mit einem Bindungsreagens, umfassend einen Coomassie-Brilliant-Blue-G-250-Farbstoff, bei einer Temperatur von 20 bis 25°C für 5 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,4 zur Bildung einer Menge an nicht-aggregiertem βA4-Peptid, das an das Bindungsreagens gebunden ist; (b) Messen des umgesetzten Bindungsreagenses aus Schritt (a) zum Erhalt einer Messung, die mit der Menge an vorhandenem nicht-aggregiertem βA4-Peptid korreliert.
  2. Verfahren zur Bestimmung einer Verbindung, die die Aggregation eines βA4-Peptids (SEQ ID NO: 1) hemmt, umfassend: (a) Umsetzen der Probe, die freies βA4-Peptid enthält, mit einem Bindungsreagens, umfassend einen Coomassie-Brilliant-Blue-G-250-Farbstoff, bei einer Temperatur von 20 bis 25°C für 5 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,4 zur Bildung einer Menge an nicht aggregiertem βA4-Peptid, das an das Bindungsreagens gebunden ist; (b) Messen des umgesetzten Bindungsreagenses aus Schritt (a) zum Erhalt einer ersten Referenzmessung, die mit der Menge an vorhandenem nicht-aggregiertem βA4-Peptid korreliert; (c) Umsetzen einer zweiten Probe, die freies βA4-Peptid enthält, mit einer ausgewählten Kandidatenverbindung über einen geeigneten Zeitraum zur Bildung einer Testprobe und Hinzufügen eines Bindungsreagenses, umfassend einen Coomassie-Brilliant-Blue-G-250-Farbstoff, bei einer Temperatur von 20 bis 25°C für 5 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,4 zur Bildung einer Menge an nicht-aggregiertem βA4-Peptid, zu dem Bindungsreagens in der Testprobe; und (d) Messen der Testprobe zum Erhalt einer zweiten Referenzmessung zur Bestimmung des Unterschieds zwischen der ersten und der zweiten Referenzmessung.
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