JPH11501398A - βＡ４ペプチドの凝集程度の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 βＡ４ペプチドの凝集の程度を決定する方法が開示される。この方法は、タンパク質を、βＡ４ペプチドとその非凝集状態においてのみ結合できる適当な結合試剤と反応させてタンパク質結合結合試剤のある量を形成させることからなる。ついで、タンパク質結合結合試剤の量を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】 βＡ４ペプチドの凝集程度の測定方法 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、βＡ４ペプチドの凝集程度の測定方法に関し、さらに詳しくはタン パク質を適当な結合試剤と反応させ、生じる未反応結合試剤の量を測定すること によるタンパク質の検出に関する。 ２．先行技術の考察 アルツハイマー病患者の脳が、アミロイドβ−ペプチドもしくはβＡ４ペプチ ドとして知られるフラグメント、すなわちβ−アミロイド前駆体タンパク質の小 フラグメントの凝集もしくはクランプを含有することは既知である。βＡ４ペプ チドの42−マーペプチド配列は、アスパラギン酸−アラニン−グルタミン酸−フ ェニルアラニン−アルギニン−ヒスチジン−アスパラギン酸−セリン−グリシン −チロシン−グルタミン酸−バリン−ヒスチジン−ヒスチジン−グルタミン−リ ジン−ロイシン−バリン−フェニルアラニン−フェニルアラニン−アラニン−グ ルタミン酸−アスパラギン酸−バリン−グリシン−セリン−アスパラギン−リジ ン−グリシン−アラニン−イソロイシン−イソロイシン−グリシン−ロイシン− メチオニン−バリン−グリシン−グリシン−バリン−バリン−イソロイシン−ア ラニン（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩ ＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ）である。 βＡ４ペプチドならびにアルツハイマー病の一般的考察については、Dennis J ．Selko，Scientific American，1991年11月号，68〜78頁およびJoseph T.Jarre ttら，Cell，73巻，1055〜1058（1993）に言及されている。 アルツハイマー病の進行を阻止する可能性がある処置は、βＡ４ペプチドの凝 集もしくはクランプを防止する活性成分からなる薬物を使用することである。し たがって、このような活性成分または有効な化学的化合物を同定するためのスク リーニング試験が必要である。 タンパク質自体を検出するための技術には、様々なアッセイが知られている。 このようなアッセイの一つには、Bradford染色色素の使用が包含され、それはク ーマシーブリリアントブルーＧ250としても知られている。これに関しては、J.J ames Sedmakら，Analytical Biochemistry，79，544〜552（1977）に記載がある が、ここにはタンパク質のアッセイが記載されているのみで、Ａ４ペプチドが凝 集状態または遊離状態のいずれにあるかのアッセイは記載されていない。 必要かつ所望のアッセイはβＡ４ペプチドのアッセイであり、それが遊離もし くは非凝集状態にあるタンパク質から凝集状態にあるこの種のタンパク質を識別 し、この凝集状態に対する様々な化合物の作用を反映するものである。これに関 連して、H．LeVine，Protein Science，2，404−410（1993）には、チオフラビ ンＴを用いる凝集アミロイドの検出が記載されている。 図面の簡単な説明 図１はβＡ４ペプチドの非凝集程度の経時的に例示する。 図２は非凝集程度の測定可能な特性によるβＡ４ペプチドの非凝集程度を例示 する。 発明の概要 本発明はβＡ４ペプチドの凝集程度を測定する方法に関し、さらに詳しくは、 タンパク質を、その非凝集状態においてのみβＡ４ペプチドを結合可能である適 当な結合試薬と反応させ、ある量のタンパク質結合結合試剤 を形成させることからなる方法に関する。ついでタンパク質結合結合試剤の量を 測定する。 詳細な説明 アルツハイマー病患者の脳は、非アルツハイマー病患者の脳に比べて、βＡ４ ペプチドとして知られる39〜42アミノ酸のアミロイドタンパク質の存在すること が知られている。アルツハイマー病患者の脳においては、このタンパク質はクラ ンプもしくは凝集し、凝集したタンパク質が正常脳細胞の破壊に関与するものと 考えられる。致死性のクランプもしくは凝集はいったん形成すると、その形成は ほぼ不可逆的である。したがって、アルツハイマー病に考えられる処置としては βＡ４ペプチドのクランプまたは凝集を防止する化合物または薬物による患者の 処置がある。 アルツハイマー病の処置のための可能性がある化合物は、候補として選択され た化合物がインビトロにおいてβＡ４ペプチドの凝集を阻害するか否かを指示す るスクリーニング試験によって同定できることが発見された。 適当な結合試剤が選択される。適当な結合試剤は、非凝集アミロイドペプチド すなわちβＡ４、または凝集アミロイドペプチドのいずれかと選択的に反応する が、スクリーニングされる候補化合物とは反応せず、またその反応型、すなわち ペプチドと反応した型では、測定可能な特性例えば特定の波長における光吸収を 示す結合試剤である。適当な結合試剤の一部には、Bradford染色色素もしくはク ーマシーブリリアントブルーＧ250、コンゴーレッドおよびチオフラビンＴが包 含される。特に適当な結合試剤はBradford染色色素である。Bradford染色色素は 、クーマシーブリリアントブルーＧ250である。Bradford染色色素もしくはクー マシーブリリアントブルー染色色素は、M.Bradford，Anal.Biochem.，72，248(1 976); A.H. Reisnerら，Anal.Biochem.，64，509(1975); S．Fazukesde St.Grothら，Biochi m.Biophys.Acta ，71，377(1963); J.J.Sedmackら，Anal.Biochem.，79，544(197 7)に記載されていて、標準試剤として市販品を入手することができる（例えば、 Bio-Rad Life Science Group，Hercules，Californiaから入手可能な Protein A ssay Dye Reagent Concentrate）。この染料は非凝集βＡ４とのみ反応し、この アミロイドペプチドの凝集体とは反応しない。 Bradford染色色素は、上に述べたように、Marion M.Bradford，Analytical Bi ochemistry ，72，248〜254(1976)に0.01％（重量／容量、w／v）クーマシーブリ リアントブルーＧ250，1.7％（w/v）エタノールおよび8.5％（w/v）リン酸とし て記載されている。Bio-Rad からcatalog number 500-0006として市販されてい る Protein Assay Dye Reagent Concentrateは、25％メタノール、50％リン酸お よび25％の水に約0.04％（w/v）クーマシーブリリアントブルーＧ250を溶解した 改良バージョンのBradford染色色素である。この改良により、それはさらに安定 性が増して貯蔵寿命が長くなり、リン酸含量が減少したので生物環境汚染が低下 し、そのタンパク質結合性には悪影響は認められない。２つの標準の一方を包含 するキットの形態でも、KitI（ウシγグロブリン）catalog number 500-0001ま たはKitII（ウシ血清アルブミン）catalog number 500-0002として市販されてい る。 実施に際しては、既知濃度のアミロイドペプチド、すなわちＡ４ペプチドをそ の非凝集型で調製する。非凝集状態のβＡ４アミロイドペプチドは、慣用のペプ チドシンセサイザー、例えばMillipore 9050型ペプチドシンセサイザーを用いる ペプチド合成によって得られる。例えば、10mgのペプチドを、適当な有機溶媒、 例えばジメチルスルホキシド（DMSO）またはアセ トニトリルに適当な温度、例えば20〜25℃で溶解し、例えば2,500μＭの保存溶 液を形成させる。保存溶液は通常、リン酸緩衝食塩溶液（pH 7.4）で例えば10倍 に希釈して、例えば250μＭの対照溶液とする。対照溶液、例えば16μlの第一の アリコートを、通常リン酸緩衝食塩溶液144μlとともに採取し、通常25μlの適 当な結合試剤、例えばBradford染色色素と反応させると、これにより、結合試剤 は非凝集アミロイドタンパク質と反応し、タンパク質結合結合試剤の第一の濃度 もしくは量が形成される。結合試剤との反応は、結合試剤が非凝集タンパク質の みに選択的に結合する条件下で行われる。したがって、反応条件は使用する特定 の結合試剤およびどのような結合特性を測定するかによって指定される。例えば Bradford染色色素を用いる場合には、結合反応は通常、中性もしくはわずかに酸 性の環境下すなわち7.0〜7.4のｐＨ範囲、温度20〜25℃において、５〜15分間行 われる。 タンパク質結合結合試剤の第一の濃度もしくは量は、反応させる結合試剤が示 す特性に依存する適当な検出手段、例えばBradford染色色素の場合には波長595n mにおける例えば0.7吸光度によって測定され、第一の値X₁を与えることに留意す べきである。 対照溶液の第二のアリコートが選択される。βＡ４の凝集は経時的に起こるの で、第二のアリコートは、適当な温度例えば約37℃において、適当な時間例えば 24〜72時間その凝集体が形成されるようにインキュベートし、ついでそれに結合 試剤を加えて非凝集アミロイドペプチドとのみ反応させて、タンパク質結合また は反応結合試剤の第二の濃度もしくは量を形成させる。アミロイドペプチドの凝 集濃度または量は結合試剤と反応せず、したがって検出も測定もされない。この 場合も、タンパク質結合結合試剤の量は、例えば適当な波長、例えばBradford染 色色素については595nmにお ける吸収スペクトルにより、室温において測定され、βＡ４の非凝集量と反応し た結合試剤の量を表す第二の値X₂が得られる。 凝集が起こると、タンパク質結合または反応結合試剤の濃度は、生じた凝集の 程度と逆に変動する。したがって、第二の値X₂は第一の値X₁より小さくなり、Ａ ４ペプチドのある程度の凝集が起こったことを指示する。 アルツハイマーの候補化合物の定量的スクリーニングの目的では、対照溶液の 第三の等しいアリコートを採取する。第三のアリコートも同じく、候補化合物の 存在下適当な条件下、例えば37℃において48時間インキュベートし、ついでそれ に適当な結合試剤例えばBradford染色色素を加え、得られた溶液または混合物を ついで、例えば慣用の分光光度計によりスペクトルを測定し、結合した結合試剤 の値を得る。候補化合物が抗−凝集作用をもたない場合は、測定されるX₃値は第 二の値X₂とほぼ等しいことになる。他方、第三の値X₃がX₂の値より30〜40％の増 加を示す場合には、その候補化合物はアミロイドペプチドの凝集を阻害する化合 物であるとみなされる。 上述のスクリーニング試験の実施に際しては、選択された結合試剤に対するア ミロイドペプチドの濃度は通常、1500〜1800（アミロイドペプチド／結合試剤） の範囲とすべきである。候補化合物に対するアミロイドペプチドの濃度は通常、 ４〜40倍（候補化合物／アミロイドペプチド）の範囲とすべきである。 凝集の程度は以下の方法により定量的に測定することができる。対照溶液の等 量アリコートを最初に様々な時間インキュベートする。時間の経過とともに凝集 の程度は増大する。結合試剤、例えばBradford染色色素を各時間後に添加し、測 定、例えばBradford染色色素については595nmの波長における吸収の測定を行う 。ついで、各時間において、凝集アミロイドタ ンパク質の非凝集アミロイドタンパク質に対する濃度または百分率を測定する。 結合試剤は非凝集タンパク質（または凝集タンパク質）を測定する。この数を新 鮮なタンパク質（非凝集，X₁）から引くことによりβ−アミロイドの凝集量が計 算され、百分率として表される。凝集ペプチド百分率の直線状の反比例プロット が、様々な時間、例えば24、48、72、96時間にわたり、典型的には図１に示すよ うに得られる。各インキュベーション時ののちに結合試剤をインキュベートした アリコートに添加する以外は同様に操作して、得られた混合物について測定を行 いＸ値を求める。これにより、凝集もしくは非凝集の間の相関は、Ｘ値に換算さ れて、スペクトルの読み、例えばBradford染色色素の波長595nmにおける吸収と の関連で、図１に例示するように確立させることができる。ついで標準プロット を非凝集の百分率に対するＸの読みから得ると、凝集の百分率は典型的には図１ に例示するように逆比例して得られる。 特定の候補化合物についてのＸ値はついで、典型的には図２に例示するように 対照との比較により凝集の阻害百分率として定量的に測定することができる。 実施例 １ β−アミロイド（βＡ４としても知られている）ペプチドを100％のジメチル スルホキシド（DMSO）に10mg／ml（または2500μM）の濃度に溶解させた。得ら れた溶液はアッセイのセットアップの直前にリン酸緩衝食塩溶液（PBS）pH 7.4 に１mg／ml（または250μM）に希釈し、Corning 96−ウエルプレートの個々のサ ンプルウエルにウエルあたり16μl（すなわち最終濃度25μM）を分配した。すべ ての処置は三重に実施した。 この実施例では、候補化合物を試験ウエルに３種の異なる濃度（250μM、500 μMおよび１mM）で添加した。各ウエルの総容量はＰＢＳで160μlとし た。非処置対照ウエルについては、β−アミロイドペプチドに化合物は添加せず 、総容量をＰＢＳで160μlとした。プレートをパラフィンでシールして37℃で48 時間インキュベートした。 インキュベーションの終了時にプレートを取り出し、25μlのBio-Radタンパク 質アッセイ色素試剤（Bradford染色色素）をサンプルを含むすべてのウエルに添 加した。標準曲線もこの時点までに新鮮な（非凝集とも考えられる）ペプチドの 吸収の評価のためにセットアップした。色素はピペットで移して混合し、プレー トを速やかに2500rpmで回転させて気泡を除去した。 染料の添加15分後に、595nmにおける吸収をDynatech MR5000プレートリーダー によって読み取った。配列：グルタミン−リジン−ロイシン−バリン−スレオニ ン−スレオニン−アラニン−グルタミン酸（ＱＫＬＶＴＴＡＥ）の８−マーペプ チドである候補化合物Ａ41920ｔの添加によるβ−アミロイドの凝集の低下百分 率は非処置凝集ペプチドと処置凝集ペプチドの間の差から計算された。低下百分 率はＡ41920ｔ 250μMで48.1％，500μMで52,44％、１mM（1000μM）で32.26％ であった。 実施例 ２ １mg／ml β−アミロイド保存液16μlを含む96−ウエルプレートのウエルに過 酸化水素（30％保存液 10μl）を加えた以外は実施例１の操作を反復した。これ らのウエルにＰＢＳ 134μlを加え最終容量を160μlとした。プレートをシール して37℃で48時間インキュベートした。 インキュベーションの終了時にプレートを取り出し、25μlのBio-Radタンパク 質アッセイ色素試剤（Bradford染色色素）をサンプルを含むすべてのウエルに実 施例１と同様に添加した。この場合も標準曲線を新鮮な（非凝集とも考えられる ）ペプチドの吸収の評価に使用した。色素をピペ ットで移して混合し、プレートを速やかに 2500 rpm で回転させて気泡を除去し た。 色素の添力15分後に、595nmにおける吸収をDynatech MR5000プレートリーダー によって読み取った。凝集の量は、バックグランドを差し引き、新鮮なペプチド と過酸化水素処置β−アミロイドの読みの間の差を取り評価した。差を新鮮また は非凝集ペプチドに対する百分率で表した。凝集百分率は48時間後に97.7％であ った。 実施例 ３ グリコサミングリカン、ペントサンポリサルフェートにより過酸化水素を置換 したほかは実施例２の操作を反復した。得られた凝集の低下百分率は0.５μMで4 0.8％、５μMで57.1％，50μMで62.9％であった。 実施例 ４ プロペントフィリンとして同じく既知の１−（５′−オキソヘキシル）−３− メチル−７−プロピル−2,6−（1H,3H）−プリンジオンによりＡ41920ｔを置換 したほかは実施例１の操作を反復した。得られた凝集の低下百分率は500μMで29 .68％、１mM（もしくは1000μM）で37.4％であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年６月１１日 【補正内容】 アルツハイマー病の進行を阻止する可能性がある処置は、βＡ４ペプチドの凝 集もしくはクランプを防止する活性成分からなる薬物を使用することである。し たがって、このような活性成分または有効な化学的化合物を同定するためのスク リーニング試験が必要である。 タンパク質自体を検出するための技術には、様々なアッセイが知られている。 このようなアッセイの一つには、Bradford染色色素の使用が包含され、それはク ーマシーブリリアントブルーＧ250としても知られている。これに関しては、J.J ames Sedmakら，Analytical Biochemistry，79，544−552（1977）に記載がある が、ここにはタンパク質のアッセイが記載されているのみで、Ａ４ペプチドが凝 集状態または遊離状態のいずれにあるかのアッセイは記載されていない。 必要かつ所望のアッセイはβＡ４ペプチドのアッセイであり、それは遊離もし くは非凝集状態にあるタンパク質から凝集状態にあるこの種のタンパク質を識別 し、この凝集状態に対する様々な化合物の作用を反映するものである。これに関 連して、H．LeVine，Protein Science，2，404-410（1993）には、チオフラビン Ｔを用いる凝集アミロイドの検出が記載されている。 G.Johnsonらは、1995年2月23日に公開されたWO 95／05604号にアルツハイマー 病の診断方法を開示している。この方法はアルツハイマー病の患者で濃度に変化 が見出されているタンパク質の独特なセットを利用するものである。Johnsonら の発明はまた、これらのタンパク質およびそれらの抗体に関する。この診断試験 に使用できるキットも開示されている。 図面の簡単な説明 図１はβＡ４ペプチドの非凝集程度を経時的に例示する。 図２は非凝集程度の測定可能な特性によるβＡ４ペプチドの非凝集程度 を例示する。 発明の概要 本発明はβＡ４ペプチドの凝集程度を測定する方法に関し、さらに詳しくは、 タンパク質を、その非凝集状態においてのみβＡ４ペプチドを結合可能である適 当な結合試薬と反応させ、ある量のタンパク質結合結合試剤を形成させることか らなる方法に関する。ついでタンパク質結合結合試剤の量を測定する。 実施に際しては、既知濃度のアミロイドペプチド、すなわちＡ４ペプチドをそ の非凝集型で調製する。非凝集状態のβＡ４アミロイドペプチドは、慣用のペプ チドシンセサイザーたとえばMILLIPORE（登録商標）9050型ペプチドシンセサイ ザーを用いてペプチド合成によって得られる。例えば、10mgのペプチドを、適当 な有機溶媒たとえばジメチルスルホキシド（DMSO）またはアセトニトリルに適当 な温度、例えば20〜25℃で溶解し、例えば2,500μMの保存溶液を形成させる。保 存溶液は通常、リン酸緩衝食塩溶液（pH 7.4）で例えば10倍に希釈して、例えば 250μMの対照溶液とする。対照溶液、例えば16mlの第一のアリコートを、通常リ ン酸緩衝食塩溶液144mlとともに採取し、通常25mlの適当な結合試剤、例えばBra dford染色色素と反応させると、これにより、結合試剤は非凝集アミロイドタン パク質と反応し、タンパク質結合結合試剤の第一の濃度もしくは量が形成される 。結合試剤との反応は、結合試剤が非凝集タンパク質のみに選択的に結合する条 件下で行われる。したがって、反応条件は使用する特定の結合試剤およびどのよ うな結合特性を測定するかによって指定される。例えばBradford染色色素を用い る場合には、結合反応は通常、中性もしくはわずかに酸性の環境下すなわち7.0 〜7.4のｐＨ範囲、温度20〜25℃において、５〜15分間行われる。 タンパク質結合結合試剤の第一の濃度もしくは量は、反応させる結合試剤が示 す特性に依存する適当な検出手段、たとえばBradford染色色素の場合には波長59 5nmにおけるたとえば0.7吸光度によって測定され、第一の値X₁を与えることに留 意すべきである。 請求の範囲 １．βＡ４ペプチド（配列番号：１）の凝集の程度を測定する方法において、 (a) βＡ４ペプチドにその非凝集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤 を遊離のβＡ４ペプチドを含有するサンプルと反応させ、ある量のタンパク質結 合結合試剤サンプルを形成させ、 (b) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを測定して、存在するタンパク質結 合結合試剤の量に相関する測定値を得る ことからなる方法。 ２．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質との非結合状態とタンパク質結合状 態のスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求項１に記載の方法 。 ３．上記結合試剤がクーマシーブリリアントブルーＧ250色素からなる請求項１ に記載の方法。 ４．βＡ４ペプチド（配列番号：１）の凝集を阻害する化合物を決定する方法に おいて、 (a) 遊離のβＡ４ペプチドを含有するサンプルを、βＡ４ペプチドにその非凝 集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤とタンパク質結合結合試剤の形成 に適当な時間反応させて、ある量のタンパク質結合結合試剤サンプルを形成させ 、 (b) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを測定して、存在するタンパク質結 合結合試剤の量に相関する第一の参照測定値を得、 (c) 遊離のβＡ４ペプチドを含有する第二のサンプルを選択された候補化合物 と試験サンプルの形成に適当な時間反応させて試験サンプルを形成させ、ついで βＡ４ペプチドにその非凝集状態においてのみ結合 可能な適当な結合試剤を添加してタンパク質結合結合試剤試験サンプルのある量 を形成させ、ついで (e) 上記試験サンプルを測定して第二の参照測定値を得て、上記第一の参照測 定値と第二の参照測定値の間の差の程度を決定する ことからなる方法。 ５．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質非結合状態とタンパク質結合状態に おいてスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求項４に記載の方 法。 ６．上記結合試剤がクーマシーブリリアントブルーＧ250色素からなる請求項５ に記載の方法。 【手続補正書】 【提出日】１９９８年６月１７日 【補正内容】 １）補正書の翻訳文提出書に添付した、補正書翻訳文第１頁下から第２行の「程 度の」を「程度を」と補正します。 ２）請求の範囲を別紙のとおり補正します。 請求の範囲 １．βＡ４ペプチド（配列番号：１）の凝集の程度を測定する方法において、 (a) βＡ４ペプチドにその非凝集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤 を遊離のβＡ４ペプチドを含有するサンプルと反応させ、ある量のタンパク質結 合結合試剤サンプルを形成させ、 (b) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを測定して、存在するタンパク質結 合結合試剤の量に相関する測定値を得る ことからなる方法。 ２．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質との非結合状態とタンパク質結合状 態のスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求項１に記載の方法 。 ３．上記結合試剤がクーマシーブリリアントブルーＧ250色素からなる請求項１ に記載の方法。 ４．βＡ４ペプチド（配列番号：１）の凝集を阻害する化合物を決定する方法に おいて、 (a) 遊離のβＡ４ペプチドを含有するサンプルを、βＡ４ペプチドにその非凝 集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤とタンパク質結合結合試剤の形成 に適当な時間反応させて、ある量のタンパク質結合結合試剤サンプルを形成させ 、 (b) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを測定して、存在するタンパク質結 合結合試剤の量に相関する第一の参照測定値を得、 (c) 遊離のβＡ４ペプチドを含有する第二のサンプルを選択された候補化合物 と試験サンプルの形成に適当な時間反応させ、ついでβＡ４ペ プチドにその非凝集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤を添加してタン パク質結合結合試剤試験サンプルのある量を形成させ、ついで (d) 上記試験サンプルを測定して第二の参照測定値を得て、上記第一の参照測 定値と第二の参照測定値の間の差の程度を決定する ことからなる方法。 ５．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質非結合状態とタンパク質結合状態に おいてスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求項４に記載の方 法。 ６．上記適当な結合試剤がクーマシーブリリアントブルーＧ250色素からなる請 求項５に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リーデル，ノーバート・ジー アメリカ合衆国ニユージヤージー州07921. ベツドミンスター．テインバーブルツクド ライブ1305 (72)発明者 サハースラブデ，スデイール・アール アメリカ合衆国ニユージヤージー州07981. ホイツパニー．オールドストーンレーン３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．βＡ４ペプチドの凝集の程度を測定する方法において、 (a) βＡ４ペプチドにその非凝集状態においてのみ結合可能な適当な結合試剤 とβＡ４ペプチドを反応させ、ある量のタンパク質結合結合試剤およびある量の タンパク質非結合結合試剤を形成させ、ついで (b) 上記タンパク質結合結合試剤の量を測定する ことからなる方法。 ２．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質非結合形態とタンパク質結合状態に おいてスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求項１に記載の方 法。 ３．上記結合試剤がクーマシーブリリアントブルーＧ250色素からなる請求項１ に記載の方法。 ４．βＡ４ペプチドの凝集を阻害する化合物を決定する方法において、 (a) 遊離のβＡ４ペプチドを含有するサンプルを適当な結合試剤とタンパク質 結合結合試剤の形成に適当な時間反応させてタンパク質結合結合試剤サンプルを 形成させ、 (b) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを測定して、存在するタンパク質結 合結合試剤の量に相関する第一の参照測定値を得、 (c) 上記タンパク質結合結合試剤サンプルを選択された候補化合物と適当な時 間反応させて試験サンプルを形成させ、ついで (d) 上記試験サンプルを測定して第二の参照測定値を得、上記第一の参照測定 値と第二の参照測定値の間の差の程度を決定する ことからなる方法。 ５．上記適当な結合試剤が、そのタンパク質の遊離状態とタンパク質結合状態に おいてスペクトル特性に測定可能な差を示す結合試剤である請求 項４に記載の方法。 ６．上記結合試剤がBradford試剤からなる請求項５に載の方法。