KR19990036439A - βΑ4 펩티드의 응집도 결정 방법 - Google Patents

βΑ4 펩티드의 응집도 결정 방법 Download PDF

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Abstract

βA4 펩티드의 응집도를 결정하는 방법이 개시되었다. 단백질이, 단지 비응집 상태에서의 βA4 펩티드와 결합 가능한 적절한 결합제와 반응하여 특정 양의 단백질 결합 결합제를 형성하는 방법을 포함한다. 이어서 단백질 결합 결합제의 양을 측정한다.

Description

βΑ4 펩티드의 응집도 결정 방법
알쯔하이머병을 앓는 환자의 뇌는, 분절이 아밀로이드 베타-펩티드 또는 βA4 펩티드라고 알려진 베타-아밀로이드 전구체 단백질의 작은 분절의 응집 또는 군집을 포함한다. βA4 펩티드의 42-머 펩티드 서열은 아스파르테이트-알라닌-글루타메이트-페닐알라닌-아르기닌-히스티딘-아스파르테이트-세린-글리신-티로신-글루타메이트-발린-히스티딘-히스티딘-글루타민-라이신-로이신-발린-페닐알라닌-페닐알라닌-알라닌-글루타메이트-아스파르테이트-발린-글리신-세린-아스파르긴-라이신-글리신-알라닌-이소로이신-이소로이신-글리신-로이신-메티오닌-발린-글리신-글리신-발린-발린-이소로이신-알라닌이다. (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA).
βA4 펩티드 및 알쯔하이머병의 일반적인 검토에 대하여 데니스 J. 셀코, Scientific American, 1991년 11월, 68-78, 및 조세프 T. 자레트 등, Cell, Vol. 73, 1055-1058 (1993)의 참고 자료가 있다.
알쯔하이머병의 진행에 대처하는 가능한 치료법은, βA4 펩티드의 응집 또는 군집을 방지하는 활성 성분을 포함하는 약물을 사용하는 것이다. 따라서, 이 활성성분 또는 유효한 화합물을 확인하는 선별 검사가 필요하다.
당업계에서는 단백질 그 자체를 검출하는 것에 대한 다양한 분석법이 있다. 한 분석법은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomasie Brilliant Blue) G250라고도 알려진 브래드포드 염료(Bradford dye)의 사용을 포함한다. 이에 관한 참고 자료는 J. 제임스 세드맥 등, Analytical Biochemistry, 79, 544-552 (1977)이 있는데, 이는 응집 상태이든 또는 유리 상태이든 A4 펩티드에 대한 것이 아니라 단백질에 대한 분석법을 설명한다.
유리 또는 비응집 상태일 때의 단백질로부터 응집 상태의 단백질을 구별해내며, 응집 상태에서 다양한 화합물의 영향을 반영하는, βA4 펩티드에 대한 분석법이 필요하며 바람직하다. 이에 대하여, H. 르빈, Protein Science, 2, 404-410 (1993)은 티오플라빈 T를 이용한 응집 아밀로이드의 검출을 설명한다.
본 발명은 βA4 펩티드의 응집 정도를 결정하는 방법, 더 구체적으로는 단백질을 적절한 결합제와 반응시키고 그 결과로 생기는 미반응 결합제의 양을 측정함으로써 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 시간에 대한 βA4 펩티드의 비응집 정도를 나타낸 것이다.
도 2는 비응집 정도의 측정 가능한 특성에 관하여 βA4 펩티드의 비응집 정도를 나타낸 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 βA4 펩티드의 응집 정도를 결정하는 방법, 더 구체적으로는, 단백질을, 단지 비응집 상태에서의 βA4 펩티드와 결합 가능한 적절한 결합제와 반응시켜서 특정 양의 단백질 결합 결합제를 형성하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이어서 단백질 결합 결합제의 양을 측정한다.
알쯔하이머병을 앓지 않는 개인의 뇌에 비하여, 알쯔하이머병 환자의 뇌는 βA4 펩티드라고 알려진 39-42개 아미노산의 아밀로이드 단백질을 갖는 것으로 알려져 있다. 단백질은 알쯔하이머병 환자 뇌안에 군집하거나 또는 응집하며, 여기서 응집된 단백질이 정상의 뇌 세포를 파괴할 지도 모른다. 일단 치사의 군집이나 응집이 형성되면, 형성물은 거의 원상으로 되돌릴 수 없다. 따라서, 알쯔하이머병의 가능한 치료법은 환자를 βA4 펩티드의 군집이나 응집을 방지하는 화합물이나 약물로 치료하는 것이다.
본 발명자들은 알쯔하이머병의 치료를 위한 가능한 화합물을, 후보 화합물로 선택된 화합물이 시험관내에서 βA4 펩티드의 응집을 억제하는지 안하는지를 나타내는 선별 검사에 의해 확인할 수 있음을 밝혀내었다.
적절한 결합제를 선택한다. 적절한 결합제는, 선별된 후보 화합물은 제외하고 비응집 아밀로이드 펩티드, 즉 βA4 또는 응집 아밀로이드 펩티드와 선택적으로 반응하는 것이며, 그것의 반응 형태, 즉 펩티드와 결합한 형태에서 예를 들면, 특정 파장에서의 흡광도와 같은 측정 가능한 특성을 나타내는 것이다. 몇몇의 적절한 결합제는 브래드포드 염료, 또는 쿠마시 브릴리언트 블루 G250, 콩고 레드 및 티오플라빈 T를 포함한다. 특히 적절한 결합제는 브래드포드 염료이다. 브래드포드 염료는 쿠마시 브릴리언트 블루 G250이다. 브래드포드 염료나 쿠마시 블루 염료는 M. 브래드포드, Anal. Biochem., 72, 248 (1976); A. H. 레이즈너 등, Anal. Biochem., 64, 509 (1975); S. 파주케스 드 세인트 그로쓰 등, Biochim. Biophys. Acta, 71 377 (1963) 및 J. J. 세드맥 등, Anal. Biochem, 79, 544 (1977)에서 기재되었고, 표준 시약(예를 들면, Bio-Rad Life Science Group(미국 캘리포니아 헤큘리스 소재)으로부터 입수 가능한 단백질 분석용 염료 시약 농축액(Protein Assay Dye Reagent Concentrate))으로 상업적으로 구매 가능하다. 이 염료는 오직 비응집 βA4와 반응하고 아밀로이드 펩티드의 응집물과는 반응하지 않는다.
브래드포드 염료는 상기와 같이, 마리온 M. 브래드포드에 의해서 Analytical Biochemistry, 72, 248-254 (1976)에서 0.01 % (질량/부피) (w/v) 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250, 1.7 % (w/v) 에탄올, 및 8.5 % (w/v) 인산인 것으로 기재되었다. 카탈로그 번호 500-0006인 Bio-Rad로부터 상업적으로 입수 가능한, 단백질 분석용 염료 시약 농축액은, 25 % 메탄올중에 녹아있는 약 0.04 % (w/v) 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250, 50 % 인산 및 25 % 물로 된 브래드포드 염료의 변형된 형태이다. 변형에 의해 염료는 더욱 안정되고, 더 긴 저장 수명을 갖고, 감소된 인산 함유량 때문에 생물학적으로 덜 위험하며, 염료의 단백질 결합 특성에 악영향을 끼치지 않는다. 이는 또한 두 가지 표준, 키트 I (소의 감마 글로불린) 카탈로그 번호 500-0001, 또는 키트 II (소의 혈청 알부민) 카탈로그 번호 500-0002중 한 가지의 키트 형태로 입수 가능하다.
실제로 비응집 형태의 아밀로이드 펩티드, 즉 A4 펩티드의 공지된 농도를 제조한다. 비응집 상태의 βA4 아밀로이드 펩티드를 통상적인 펩티드 합성 장치, 예를 들면 밀리포어 모델(Millipore Model) 9050 펩티드 합성 장치를 사용하여 펩티드 합성에 의하여 얻는다. 예를 들면, 펩티드 10 밀리그램을 디메틸술폭시드(DMSO) 또는 아세토니트릴과 같은 적절한 유기 용매에 적절한 온도, 예를 들면 20 내지 25 ℃에서 용해시켜서 공급 용액, 예를 들면 2,500 μM을 형성한다. 공급 용액을 전형적으로 인산염 완충 염수 (pH 7.4)에 예를 들면 10배로, 희석하여 예를 들면 250 μM의 대조 용액을 얻는다. 대조 용액의 첫 번째 부분표본, 예를 들면 16 μl을 전형적으로 인산염 완충 염수 144 μl와 함께 취하고, 전형적으로 적절한 결합제, 예를 들면 브래드포드 염료의 25 μl와 반응시키는데, 여기서 결합제는 비응집 아밀로이드 단백질과 반응하여 단백질 결합 결합제의 첫 번째 농도 또는 첫 번째 양을 형성한다. 결합제와의 반응은 결합제가 선택적으로 단지 비응집 단백질에만 결합하는 조건하에서 수행한다. 따라서, 이용되는 특정한 결합제 및 어떤 결합성이 측정되느냐에 의하여 반응 조건을 정한다. 예를 들면, 브래드포드 염료를 이용하는 경우, 중성 또는 약염기성 환경, 즉 pH 범위 7.0 내지 7.4에서, 5 내지 15 분 동안 20 내지 25 ℃의 온도에서 전형적으로 결합 반응을 수행한다.
단백질 결합 결합제의 첫 번째 농도 또는 첫 번째 양은, 예를 들면, 브래드포드 염료가 파장 595 nm에서 0.7의 흡광도를 갖는 것과 같은, 반응하는 결합제가 나타내는 특성에 따른 적절한 검출 수단에 의해 측정되어 첫 번째 측정값 X1을 제공한다는 것을 유념해야 한다.
대조 용액의 두 번째 부분표본을 선택한다. βA4의 응집이 시간이 흐름에 따라 일어난다면, 두 번째 부분표본을 예를 들면 약 37℃의 적절한 온도에서 예를 들면 24 내지 72 시간 동안의 적절한 시간 동안 배양하도록 하여 그것으로부터 응집물을 형성하며 그 후에 결합제를 가하고 결합제는 단지 비응집 아밀로이드 펩티드와 반응하여 단백질 결합 또는 단백질 반응 결합제의 두 번째 농도 및 양을 형성한다. 아밀로이드 펩티드의 응집 농도 또는 양은 결합제와 반응하지 않으므로 검출되지 않고 측정되지 않는다. 또한, 단백질 결합 결합제의 양을, 예를 들면 적절한 파장(브래드포드 염료에 대하여 595 nm)에서 흡광도 분광학에 의하여 실온에서 측정하며, 두 번째 값, 비응집 βA4의 양과 반응한 결합제의 양을 나타내는 X2를 얻는다.
응집이 일어날 때, 단백질 결합 또는 단백질 반응 결합제의 농도는 발생한 응집의 정도에 반비례한다. 따라서, 두 번째 값 X2는 A4 펩티드가 어느 정도로 응집이 일어나는지 나타내는 X1보다 더 작다.
알쯔하이머의 병 치료용 후보 화합물에 대한 정성 선별의 목적을 위해, 대조 용액의 세 번째 부분표본을 취한다. 세 번째 부분표본을 다시 후보 화합물의 존재하에서 적절한 조건, 예를 들면 37℃, 48 시간 동안에서 배양하며, 그 후 예를 들면 브래드포드 염료와 같은 적절한 결합제를 가하고 결과 용액 또는 혼합물을 예를 들면 통상적인 분광광도계로 분광학적으로 측정하여, 결합한 결합제의 값을 얻는다. 후보 화합물이 항응집 효과를 갖지 않는다면, 측정 값 X3는 두 번째 값 X2와 대략 같을 것이다. 또 한편으로, 세 번째 값 X3가 두 번째 값, X2에 대해 30 내지 40 퍼센트(30 - 40 %) 증가를 나타낸다면, 이에 따라서 후보 화합물은 아밀로이드 펩티드의 응집을 억제하는 화합물로 간주된다.
상기의 선별 검사를 수행하면서, 선택된 결합제에 대한 아밀로이드 펩티드 농도는 전형적으로 1500 내지 1800의 범위이다. (아밀로이드 펩티드/결합제) 후보 화합물에 대한 아밀로이드 펩티드 농도는 전형적으로 4 내지 40 배 또는 곱이어야 한다. (아밀로이드 펩티드/후보 화합물)
응집 정도를 다음의 방식으로 정량적으로 측정할 수 있다. 대조 용액의 동등한 부분표본을 처음으로 다양한 시간 동안 배양한다. 시간이 증가할수록 응집 정도도 증가한다. 결합제, 예를 들면 브래드포드 염료를 각각의 시간 후에 가하고 측정을 하고, 예를 들면 브래드포드 염료에 대해서는 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 그 후에 응집 아밀로이드 단백질 대 비응집 아밀로이드 단백질의 농도 또는 비율을 각각의 시간 동안에 측정한다. 결합제는 비응집 (또는 응집) 단백질을 측정한다. β-아밀로이드의 응집량을 미처리 단백질(응집되지 않은, X1)로부터 이 숫자를 뺌으로써 계산하며 비율로서 나타낸다. 응집 펩티드 비율의 1차 역함수 도표를 다양한 시간, 예를 들면 도 1에서 전형적으로 도시하는 바와 같이 24, 48, 72, 96 시간에 대하여 얻는다. 각 배양 기간 후에 결합제를 배양된 부분표본에 가하고 결과 혼합물을 측정하여 X 값을 결정하는 것을 제외하고 과정을 반복한다. 그 것에 의하여 응집 또는 비응집 사이의 상관 관계를 이어서 X 값에 관하여, 분광학적 판독 값, 예를 들면 도 1에서 도시하는 바와 같이 브래드포드 염료에 대해 595 nm의 파장에서의 흡광도에 관하여, 설정할 수 있다. 이어서 비응집의 비율에 대한 X 판독 값의 표준 도표를 얻는데, 여기서 응집 비율을 도 1에서 전형적으로 도시된 바와 같이 역으로 얻을 수 있다.
이어서, 특정한 후보 화합물에 대한 X 값을 도 2에서 전형적으로 도시된 바와 같이, 대조 용액과의 비교에 의하여 응집의 억제 비율로 환산하여 정량적으로 측정한다.
실시예 1
β-아밀로이드(βA-4로 또한 알려진) 펩티드를 100 % 디메틸술폭시드(DMSO) 중에 10 mg/ml(또는 2500 μM)의 농도로 용해시킨다. 분석을 시작하기 바로 전에 인산염 완충 염수(PBS) pH 7.4에서 1 mg/ml(또는 250 μM) 공급 용액으로 결과 용액을 희석시키고 코닝 96-웰 판의 개개의 표본 웰에 웰 당 16 μl(즉 25 μM의 최종 농도)로 결과액을 분배한다. 모든 처리는 3회 수행한다.
이 실시예에서 후보 화합물을 세 개의 다른 농도(250 μM, 500 μM 및 1 mM)로 검사 웰에 가한다. PBS로 16 μl까지가 각 웰에서의 총 부피이다. 처리되지 않은 대조 웰에 대해서, 어떤 화합물도 β-아밀로이드 펩티드에 가하지 않고, 총 부피를 PBS로 160 μl로 만든다. 판을 파라필름으로 밀봉하고 48 시간 동안 37℃에서 배양시킨다.
배양 기간이 끝날 때, 판을 꺼내어 바이오-라드 단백질 분석용 염료 시약(브래드포드 염료) 25 μl를 모든 표본 웰에 가한다. 표준 도표를 또한 미처리(또한 비응집으로 간주된) 펩티드 흡광도의 추정치에 대해 설정한다. 염료를 피펫으로 옮겨 혼합하고 판을 2500 rpm으로 빨리 회전시켜 기포를 제거한다.
염료를 가한 15 분 후에 다이나테크 MR5000 판 판독기로, 595 nm에서 흡광도를 읽는다. 결합 서열 글루타민-라이신-로이신-발린-트레오닌-트레오닌-알리닌-글루타메이트(QKLVTTAE)의 8-머 펩티드인 후보 화합물 A41920t의 추가로 인한 β-아밀로이드 응집에서 감소 비율을 비처리 응집 펩티드 및 처리 응집 펩티드와의 차로부터 계산한다. 측정된 감소 비율은 A41920t의 250 μM로 48.1 %, 500 μM로 52.44 % 및 1 μM(또는 1000 mM)로 32.26 %이다.
실시예 2
1 mg/ml β-아밀로이드 공급 용액 16 μl이 차 있는 96-웰 판중의 웰에 과산화수소(30 % 공급 용액 10 μl)를 가하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 과정을 반복한다. 이 웰에 PBS 134 μl를 가함으로써 최종 부피를 160 μl로 만든다. 판을 밀봉하고 48 시간 동안 37℃에서 배양한다.
배양 기간이 끝날 때, 판을 꺼내어 바이오-라드 단백질 분석용 염료 시약(브래드포드 염료) 25 μl를 실시예 1에서와 같이, 모든 표준 웰에 가한다. 표준 도표를 미처리(또한 비응집으로 간주된) 펩티드 흡광도의 추정치에 대해 다시 사용한다. 염료를 피펫으로 옮겨 혼합하고 판을 2500 rpm으로 빨리 회전시켜 기포를 제거한다.
염료를 가한 15 분 후에 다이나테크 MR5000 판 판독기로, 595 nm에서 흡광도를 읽는다. 배경을 제외하고 미처리 β-아밀로이드 판독 값과 과산화수소로 처리된 β-아밀로이드 판독 값 사이의 차에 의하여 응집 정도를 추정한다. 차는 미처리 또는 비응집 펩티드에 대한 비율로 표현한다. 측정된 응집 비율은 48 시간 후에 97.7 %이다.
실시예 3
과산화수소를 글리코스아민 글리칸, 펜토산 폴리술페이트로 대치하는 것을 제외하고 실시예 2의 과정을 반복한다. 측정된 응집의 증가 비율은 0.5 μM로 40.8 %, 5 μM로 57.1 %, 50 μM로 62.9 %이다.
실시예 4
A41920t를 프로펜토필린이라고도 알려진 1-(5'-옥소헥실)-3-메틸-7-프로필-2,6-(1H,3H)-퓨린디온으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 1의 과정을 반복한다. 측정된 응집 감소의 비율은 500 μM로 29.68 %, 1 mM(또는 1000 μM)로 37.4 %이다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 이름 : 훽스트 마리온 로우셀, 인크.
(B) 거리 : 피.오 박스 156300 이스트 갈브레이스 로드 2110
(C) 도시 : 신시내티
(D) 주 : 오하이오
(E) 국가 : 미국
(F) 우편 번호 (ZIP) : 45215-6300
(G) 전화 번호 : 513-948-7369
(H) FAX 번호 : 513-948-7961
(I) 텔렉스 : 214320
(ii) 발명의 명칭 : βA4 펩티드의 응집도 결정 방법
(iii) 서열수 : 1
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템 : P.C-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 패턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 # 1.30(EPO)
(vi) 선행 출원 데이타:
(A) 출원 번호: US 08/515,606
(B) 출원일: 1995. 8. 16
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A) 길이: 42 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 번호 1 :

Claims (6)

  1. (a) 단지 비응집 상태에서의 βA4 펩티드와 결합 가능한 적절한 결합제와 βA4를 반응시켜서 특정 양의 단백질 결합 결합제 및 단백질 미결합 결합제를 형성하고;
    (b) 상기의 단백질 결합 결합제의 양을 측정하는 것
    을 포함하는 βA4 펩티드의 응집도 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기의 적절한 결합제가, 그의 단백질 결합 상태의 스펙트럼 특성과 단백질 미결합 상태의 스펙트럼 특성에서의 측정 가능한 차를 나타내는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결합제가 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염료를 포함하는 것인 방법.
  4. (a) βA4 펩티드를 포함하지 않는 표본을 적절한 결합제와 적절한 시간 동안 반응시켜, 단백질 결합 결합제를 형성하여 단백질 결합 결합제 표본을 형성하고;
    (b) 상기의 단백질 결합 결합제 표본을 측정하여, 존재하는 단백질 결합 결합제의 양과 관련된 첫 번째 참조 측정치를 얻고;
    (c) 상기의 단백질 결합 결합제 표본을 선택된 후보 화합물과 적절한 시간 동안 반응시켜 검사 표본을 형성하고;
    (d) 상기의 검사 표본을 측정하여 두 번째 참조 측정치를 얻어서, 상기의 첫 번째 및 두 번째 참조 측정치 사이의 차의 정도를 결정하는 것
    을 포함하는 βA4 펩티드의 응집을 억제하는 화합물의 결정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기의 적절한 결합제가 단백질 결합 상태의 스펙트럼 특성과 단백질 미결합 상태에서의 스펙트럼 특성과의 측정 가능한 차를 나타내는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 결합제가 브래드포드 시약을 포함하는 것인 방법.
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